在感染疱疹病毒的细胞表面观察到的颗粒

在感染疱疹病毒的细胞表面观察到的颗粒

一、PARTICLES OBSERVED ON THE SURFACE OF CELLS INFECTED WITH HERPESVIRUSES(论文文献综述)

万伟玮[1](2020)在《抗沙粒病毒小分子药物的高通量筛选及Ⅰ型疱疹病毒感染细胞的蛋白质组学研究》文中指出沙粒病毒是一类有囊膜包裹的负链分节RNA病毒,其多个成员如瓜纳瑞托病毒(Guanarito virus,GTOV)、胡宁病毒(Junin virus,JUNV)、拉沙病毒(Lassa virus,LASV)、Lujo病毒(Lujo virus,LUJV)、马秋波病毒(Machupo virus,MACV)、萨比亚病毒(Sabia virus,SABV)、和白水河病毒(Whitewater Arroyo virus,WWAV)在西非和南美等地区流行,可以导致感染者出现出血热等症状,严重威胁人类健康。目前临床上除了广谱的抗病毒药物利巴韦林,没有FDA批准的特异性针对沙粒病毒的疫苗及药物,然而利巴韦林的治疗效果有限并且有较大的副作用。因此,迫切需要通过各种研究手段来寻找新的抗沙粒病毒药物。在本课题中,我们构建了低致病性沙粒病毒淋巴细胞脉络从脑膜炎病毒(Lymphocytic choriomeningitis virus,LCMV)的反向遗传操作系统,并利用该系统拯救出带e GFP的重组LCMV病毒,随后我们利用含1018种小分子化合物的FDA成药库对重组LCMV进行了抗病毒活性筛选,发现霉酚酸、氯法齐明、贝尼地平、达拉菲尼和阿帕替尼具备较强的抗LCMV活性。其中贝尼地平的抗LCMV活性最强,在Vero细胞上IC50=0.548μM、CC50=113.8μM、SI=207.66,并且在动物水平也展现了一定的抗LCMV活性。贝尼地平是一种二氢吡啶类钙离子通道抑制剂,在临床上可以用于治疗高血压和缺血性心脏病,同时也有血管保护和肾脏保护作用。进一步的功能研究表明,贝尼地平主要靶向LCMV入侵宿主细胞的膜融合过程。将LCMV在含有贝尼地平的培养基中多次传代获得了适应性突变的病毒,对病毒基因组测序发现了位于GPC上的突变D414A,并通过反向遗传学操作系统拯救出了适应性突变病毒株LCMV GPC-D414A,其GP2上D414A突变导致突变病毒对贝尼地平的抑制作用产生抗性。同时,贝尼地平对D414A突变的LCMV GPC介导的膜融合过程也失去了抑制效果,暗示贝尼地平可能通过与GP2上的D414位点直接或间接的相互作用,影响了GPC在低p H条件下的构象改变,从而抑制了病毒的膜融合;这一位点发生突变之后,贝尼地平与GPC的相互作用受阻,GPC的膜融合可以正常进行。此外我们还发现其它二氢吡啶类钙离子通道抑制剂对LCMV也具有抑制效果,并且LCMV GPC-D414A同样对这些药物的抑制作用存在抗性,这一结果表明这些二氢吡啶类钙离子通道抑制剂的抗病毒机制与贝尼地平类似。与此同时,我们发现霉酚酸、氯法齐明、达拉菲尼和阿帕替尼对新型冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-Co V-2)也具有抑制效果,其中霉酚酸的IC50=0.101μM、CC50>100μM、SI>1000。霉酚酸是细胞内IMPDH(Inosine monophosphate dehydrogenase)抑制剂,能够降低细胞内鸟嘌呤核苷水平从而影响GTP的合成并抑制病毒的复制。我们发现通过向细胞培养基中额外添加鸟嘌呤核苷,可以缓解霉酚酸对LCMV和SARS-Co V-2两种病毒的抑制。霉酚酸、氯法齐明、贝尼地平、达拉菲尼和阿帕替尼都是FDA批准的药物,其临床安全性较为可靠,有望快速应用于沙粒病毒和SARS-Co V-2的临床治疗。HSV-1是一种在人类宿主中广泛携带的双链DNA病毒,感染人群可以终身携带病毒并且周期性的发病,在免疫力低下的情况下可能出现严重的症状。为了研究该病毒与宿主细胞的相互作用机制,本课题使用基于质谱的定量蛋白质组学的方法分析了宿主细胞HEK 293T感染HSV-1后蛋白质组的变化。我们总共鉴定到了6607个宿主蛋白,其中498个蛋白的表达受到调控。使用RNAi敲降的方法,我们发现了三个宿主蛋白IFITM3(IFN-inducible transmembrane protein 3)、CHCHD2(Coiled-coil-helix-coiled-coil-helix domain containing 2)和TRIM27(Tripartite motif-containing protein 27)可以抑制病毒复制。通过生物信息学分析,我们鉴定到了一批参与HSV-1感染的宿主细胞信号通路,从系统的角度探究了HSV-1感染对宿主细胞的影响。

李道群[2](2019)在《人类疱疹病毒8型潜伏感染树鼩动物模型的建立及环境影响研究》文中指出卡波西肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)又称人类疱疹病毒8型(Human herpesvirus 8,HHV-8)属于γ疱疹病毒亚科猴疱疹病毒属。KSHV是人类重要的DNA肿瘤病毒,它是诱发卡波西氏肉瘤(Kaposi’s Sarcoma,KS)、原发性渗出淋巴瘤(Primary Effusion Lymphoma,PEL)、多中心卡斯特曼病(Multicentric Castleman’s Disease,MCD)和炎症细胞因子综合症(KSHV inflammatory cytokine syndrome,KICS)及共感染HIV/AIDS患者高度致瘤死亡的重要病原体。全球每年KSHV新发感染癌症肿瘤患者病例可达34000例。特别是在撒哈拉以南非洲地区,KSHV感染率高达95%并引起超过50%的HIV/AIDS患者死亡。KSHV可以感染多种人源细胞,包括内皮起源细胞、淋巴细胞、上皮细胞和成纤维细胞等。KSHV感染动物模型是研究KSHV潜伏和裂解感染转换、感染组织细胞嗜性、KS致癌与机体免疫应答机制,及开发疫苗和筛选治疗药物必要技术平台。虽然KSHV感染的免疫缺陷小鼠和绒猴的动物模型已成功建立,但仍存在与人类物种差异大和价格昂贵等诸多问题,建立合适的KSHV感染动物模型是当前亟待解决的关键问题。树鼩属低等灵长类动物,与人类进化关系较为密切,已被广泛的应用于人类病毒性疾病研究。因此,我们用树鼩作为感染对象,从体内外不同水平建立KSHV感染树鼩的动物模型。本研究利用iSLK.219病毒株细胞培养体系,培养获得rKSHV.219重组病毒。采用胶原酶和胰酶消化法分离出原代肝窦内皮细胞、真皮成纤维细胞、肾上皮细胞、血管内皮细胞、肺上皮细胞和外周血淋巴细胞树鼩六种原代细胞,经鉴定后进行体外培养。用KSHV感染树鼩原代细胞,经荧光观察和流式细胞仪检测发现,KSHV病毒能够高效感染树鼩原代肾上皮细胞(GFP表达比率达97%),对其他原代细胞的感染性依次为:树鼩原代肾上皮细胞(TSKEC)>HEK293T(TSKEC vs HEK293T,p<0.05)>树鼩原代肝窦内皮细胞(TSKEC vs TSLSE,p<0.01)>树鼩原代肺上皮细胞(TSKEC vs TSLEC,p<0.05)>树鼩原代血管内皮细胞(TSKEC vs TSVEC,p<0.001)>树鼩原代真皮成纤维细胞(TSKEC vs TSSFC,p<0.001)>树鼩外周血淋巴细胞(TSKEC vs TSPBMC,p<0.001)。与啮齿类大鼠和兔原代肾细胞对KSHV病毒易感性相比较,树鼩原代肾上皮细胞具有显着的种属优势。对感染的树鼩肾上皮细胞感染特性研究表明,TSKEC胞内病毒粒子在感染24 h后其病毒复制、蛋白表达和病毒滴度达到最大值。对感染TSKEC进行细胞传代培养和病毒检测发现,KSHV可以长期潜伏感染原代TSKEC,每个代次都有LANA蛋白表达,而裂解期蛋白ORF26仅可在早期P0和P1代表达。进而,我们选用3-5月子代幼龄树鼩经尾静脉注射接种KSHV病毒(5×107GFU/只)。在长达119 d的感染观察时间内,树鼩血液以及树鼩各组织均可检测到病毒DNA、mRNA和病毒特异性蛋白的表达,并在分离培养的淋巴细胞中观察到GFP荧光。组织病理检测显示,感染树鼩的脾脏、肺和肝脏组织中均发现淋巴细胞浸润、灶性聚集,肺泡壁增厚,肝细胞水肿和坏死现象。免疫组化检测结果表明,LANA或ORF62蛋白在脾、肺、肝和肾中表达,主要以潜伏感染LANA蛋白表达为主,表明KSHV可以在树鼩建立潜伏感染。对树鼩体内抗病毒相关炎症因子检测发现,树鼩机体内免疫排斥相关炎症因子呈现上升趋势,IFN-γ整体呈现上升趋势(增加了1000倍),而与KSHV致病性相关IL-6和IL-8炎症因子也增加了近百倍,说明KSHV感染可以引起树鼩体内强烈的抗病毒免疫应答反应。综上所述,树鼩可以支持KSHV潜伏感染和病毒复制,为进一步建立KSHV感染的树鼩疾病模型奠定了研究基础。

郑智航[3](2020)在《基于病毒全蛋白组序列筛选T细胞表位研发新型寨卡病毒T细胞疫苗》文中研究表明寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)是一种通过蚊媒传播的黄病毒,属于黄病毒科黄病毒属,在热带、亚热带地区广泛流行。自1947年在乌干达寨卡森林首次被发现以来,在全球范围内60多年都未曾爆发流行。2007年,ZIKV在太平洋西部的雅浦岛首次爆发后,引起了部分关注;但直到2015年南美洲ZIKV疫情爆发,才受到了国际社会的广泛关注。基于该病毒对全球公共卫生安全造成的重大威胁,2016年ZIKV感染被正式列为全球公共卫生紧急事件,针对它的研究也不断深入。ZIKV表面覆盖包膜,内部核衣壳组成二十面体结构,其基因组为大小约11kb的正义单链RNA。被ZIKV感染后,患者症状一般较轻,包括发热、斑疹、关节痛和结膜炎等,也有研究发现,它与神经系统疾病(如格林-巴利综合征)存在必要关联;更严重的是,先天性ZIKV感染可能导致严重的临床疾病,包括骨骼异常、眼睛视觉病变、小头畸形、脑积水等。ZIKV可能存在的垂直传播、性传播、血液传播等诸多传播途径,也导致ZIKV的防治更为艰难,更易造成严重的公共卫生危机。在ZIKV引起了国际社会的广泛关注后,其疫苗研发也进入了“快车道”。目前,正在研发的ZIKV疫苗种类主要包括减毒活疫苗、灭活疫苗、核酸疫苗、重组疫苗等。而这些正在研发的疫苗都专注于诱导中和性抗体的产生,抗体能够通过中和病毒颗粒近而抑制病毒的复制,但所产生的抗体虽然可能有保护性,但也可能导致病毒感染过程中的抗体依赖性增强(antibody dependent enhancement,ADE)反应的发生。有实验证据显示,ZIKV的抗体能够在体外实验模型中协助登革病毒增强对机体或细胞的感染(ADE),反之亦然。有报道发现ZIKV感染过程中的T细胞反应发挥着重要作用,ZIKV的记忆性CD4+和CD8+T细胞反应在动物模型中被证实具有针对ZIKV的保护作用,而T细胞反应本身没有ADE发生的可能性。本课题通过开发具有保护性,且无ADE风险的T细胞疫苗,研究T细胞疫苗预防病毒感染的可行性以及有效性,进而探究T细胞反应在ZIKV感染过程中所发挥的作用,以及T细胞疫苗在ZIKV感染过程中提供保护作用的机制。ZIKV T细胞表位的确定对T细胞疫苗及T细胞免疫研究有重要作用,因此本课题首先着重于在ZIKV感染小鼠中T细胞表位的确定。我们针对ZIKV的蛋白序列,设计并合成了427条重叠多肽,每条为18个氨基酸长,相邻多肽间重叠10个氨基酸,覆盖病毒蛋白序列全长。利用IFN-γELISPOT试剂盒,我们检测出了63条阳性肽段。通过FACS进一步分析不同T细胞亚群被ZIKV肽段刺激起的细胞因子分泌量,最终确定了11条包含CD4+T细胞表位的肽段,以及19条包含CD8+T细胞表位的肽段。其中7条肽段位于结构蛋白上,21条肽段位于非结构蛋白上。为了聚焦T细胞疫苗、避免抗体反应的干扰,我们利用从非结构蛋白中选择的包含T细胞表位的肽段构建了3种ZIKV T细胞疫苗,包括仅含CD4+T细胞表位的肽段NS2A(95-112),NS2B(13-30),NS2B(37-54),NS2B(93-110),NS3(43-60)。仅含CD8+T细胞表位的肽段NS1(263-280),NS4A(66-83),NS4B(36-53),NS4B(76-93),NS4B(84-101),以及包含CD4+T细胞表位肽段NS2A(95-112),NS2B(13-30),NS2B(37-54),NS2B(93-110),NS3(43-60)与包含CD8+T细胞表位肽段NS1(263-280),NS4A(66-83),NS4B(36-53),NS4B(76-93),NS4B(84-101)的混合。然后我们通过ZIKV感染免疫后的小鼠以验证三种ZIKV T细胞疫苗的保护效果,发现三种ZIKV T细胞疫苗都能给被感染的小鼠提供保护,且同时包含CD4+与CD8+T细胞表位肽段疫苗能提供最佳保护。我们也同时发现ZIKV T细胞疫苗对于清除眼睛、脾脏、肝脏组织内的病毒有很好的效果。通过中和实验、ADE实验,我们确认利用这些T细胞表位肽段进行多次免疫后,在急性感染期既没有中和性抗体的产生,也没有ADE。在进一步的体内杀伤试验中,发现接种了这三种肽段疫苗的小鼠体内均可杀伤用相应肽段共孵育过的靶细胞。同时接种包含CD4+和CD8+T细胞表位肽段疫苗的小鼠表现出最佳的体内杀伤率,达到40.6%的特异性杀伤率。而那些单独使用CD4+或CD8+T细胞表位疫苗免疫的小鼠则分别有24.5%或19.1%的特异性T细胞杀伤率。这些数据表明,由T细胞表位疫苗产生的保护作用,部分是由T细胞介导的细胞毒作用。并且这种保护作用不依赖中和抗体,所以没有诱导ADE的风险。因此,T细胞表位具有开发前景。我们也尝试T细胞疫苗与传统抗体疫苗的组合以提供更好的疫苗功效。尤其是在黄病毒疫苗领域,通过增强保护性的T细胞免疫可以抑制体内ADE的风险,是个值得探讨的问题。在这里,我们设计了ZIKV T细胞肽段疫苗和E80蛋白疫苗的组合免疫方案,我们发现联合免疫后的小鼠在感染后的第3天,所有疫苗接种组的病毒血症水平均显着降低至检测阈值(25 PFU/ml)。但是,在仅用E80免疫的小鼠中,血液中所检测到的病毒RNA(包括血液中细胞内的病毒RNA)却并未显着降低。相反,用CD4+或CD8+T细胞疫苗免疫的小鼠血液中的病毒RNA明显降低。在感染后第7天同样观察到了这种差异。这些数据提示CD4+或CD8+T细胞疫苗的加入能够提高E80蛋白疫苗的功效。综上,本次研究首先证实了ZIKV感染在小鼠中可以引起强烈而广泛的T细胞应答,并鉴定出一系列新颖的CD4+和CD8+T细胞表位,且发现其中一些表位可以激活细胞毒性T细胞作用。随后,使用这些新鉴定的带有免疫优势表位的肽段,我们开发出一种新型ZIKV T细胞备选疫苗,证明该疫苗可赋予接种疫苗的小鼠抗ZIKV感染的能力。我们也发现与单独接种任何一种疫苗相比,T细胞表位疫苗和E80重组蛋白疫苗的联合使用可以提供更好的保护。这些结果将为开发基于CD4+和CD8+T细胞表位的ZIKV T细胞疫苗提供理论基础和先导产品。并且该发现也有助于打破其他病毒的T细胞疫苗研发的固有思路,具有重要的借鉴意义。

邹依地[4](2019)在《抗单纯疱疹病毒包膜糖蛋白中和抗体的筛选鉴定及其中和效果评估》文中研究说明单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus,HSV)又称为人疱疹病毒(Human herpesvirus,HHV),属于疱疹病毒科α病毒亚科,是一种在全球范围内广泛流行的病毒。HSV有两个血清型:Ⅰ型单纯疱疹病毒(HSV-1)和Ⅱ型单纯疱疹病毒(HSV-2)。人类为HSV的主要宿主,根据WHO的相关数据,2012年,HSV-1的全球感染人数超过37亿(0-49岁),HSV-2 的感染人数超过了 4.17亿(15-49岁)。HSV在上皮细胞建立感染后,可以侵袭患者不同的组织和器官,造成不同程度的损伤。HSV-1可以引起患者产生口唇疱疹,还能导致结膜炎、角膜炎等眼部疾病,是结膜炎致盲的首要病因。此外,HSV-1还具有神经嗜性,可以感染患者脑部造成脑炎等。HSV-2是复发性生殖器疱疹的主要病因,其可以潜伏在患者的三叉神经节或骶神经根神经节,造成机体的反复感染。HIV患者、接受器官移植或放化疗的病人,由于免疫系统较为脆弱,如果在患病期间或手术治疗期间感染HSV-2或遭受疾病复发,可以引发肺炎、脑炎等系统性疾病。HSV-2还能通过母婴传播等途径感染新生儿,导致新生儿疱疹,如果不及时干预治疗,患儿死亡率高达80%。近年来,流行病学研究发现,HSV-2的感染还可以显着提高HIV的感染风险。HSV的入胞以及释放等过程,均需要表达于其包膜上的多种糖蛋白与细胞表面多种受体的相互作用。在这些包膜糖蛋白中,gB、gC首先与宿主细胞的丝状伪足通过电荷产生相互作用,为病毒沿着细胞表明运动并与细胞表明受体结合奠定基础。当gD与相关受体结合后,产生相应的构象变化,导致gL从gH/gL复合物中解离和gH的活化。活化的gH进一步激活gB,最终导致病毒与细胞的半融合状态,介导病毒衣壳的入胞。HSV在全球范围内的广泛流行,造成了较为严重的社会和经济问题。目前的抗病毒治疗远不能满足患者的需求,因此亟需开发相关的疫苗以及新型的治疗性药物。单克隆抗体是研究靶蛋白功能和结构、病毒与宿主相互作用的重要工具,单克隆抗体还可以开发成极富前景的治疗性药物。鉴于HSV包膜糖蛋白在病毒复制、感染中扮演的重要角色,针对HSV包膜糖蛋白制备相应的单克隆抗体,具有良好的理论基础和开发前景。本研究旨在筛选到对HSV-1和HSV-2具有交叉中和活性的单克隆抗体,并在体内外评估其中和效果。在此基础上,对其中和作用机制和识别的特异性表位进行初步探索。为此,开展了以下工作:本研究首先通过HSV-1/2混合免疫的方式,筛选到了 14株抗HSV包膜糖蛋白的单克隆抗体。在随后的实验中我们证实,其中两株能识别天然形式gD的单克隆抗体4A3和8H2对HSV-1和HSV-2具有高水平的交叉中和活性的。在体外实验中,中和抗体4A3和8H2可以阻断HSV-1和HSV-2胞间扩散,还可以通过干扰HSV-2与宿主细胞的吸附过程发挥中和作用。在体内实验中,中和抗体4A3对感染致死剂量HSV-2的小鼠具有良好的保护效果。最后,本研究还对这两株单克隆抗体的中和作用机制以及抗体识别的表位进行了初步的探索。综上所述,本研究证明了识别天然构象gD的单克隆中和抗体4A3和8H2在体外对HSV-1和HSV-2具有高水平的交叉中和活性。同时还证明了,中和抗体4A3对HSV-2致死剂量攻毒的BALB/C小鼠具有良好的保护效果。本研究筛选到的这两株中和抗体或具有潜在临床转化的价值,也为开发HSV1/2交叉广谱疫苗设计和抗原表位的分析提供一定的指导。

于乾龙[5](2019)在《苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒GP64蛋白的结构与功能关系研究》文中认为杆状病毒是一类感染昆虫的双链大分子DNA病毒,通常产生出芽型病毒(budded virions,BV)和包涵型病毒(occlusion-derived virions,ODV)两类形态不同的病毒粒子。苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)BV的主要囊膜蛋白GP64属于第三类病毒膜融合蛋白家族,该家族代表性成员还包括水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)G蛋白和单纯疱疹病毒(herpes simplex virus type 1,HSV-1)gB等。目前,已解析的AcMNPV GP64在低pH条件下的三级结构包含五个结构域(domain I-V,简称DI-DV),但其中性pH条件下的三级结构以及低pH诱导的构象变化分子机制尚不清楚。本文针对AcMNPV GP64的DI与DV之间可能的相互作用以及晶体结构仍未被完全解析的DIV开展了结构与功能关系研究,取得的主要结果如下:一、DI与DV的结构与功能关系结构分析表明,GP64 DV与DI中邻近融合环2(fusion loop 2)的两个区域存在多个可能的相互作用位点。氨基酸序列比对分析显示,这些相互作用位点及其邻近的氨基酸残基比较保守。采用丙氨酸替换的方法对DI和DV中保守性较高或参与相互作用的24个氨基酸进行单点或双点突变。结果分析发现,DI与DV中氨基酸之间形成的分子内相互作用不是GP64表达、多聚体形成、细胞膜定位及膜融合功能所必需,但是参与相互作用的单个氨基酸对GP64膜融合功能却具有重要意义,其中DV区域内的4个氨基酸残基(G438、W439、T452和T456)对膜融合的起始及后续融合孔的形成或扩大具有重要作用。进一步研究发现,G438与W439可能参与维持GP64融合前构象的形成或稳定。二、DIV的结构与功能关系结构分析表明,DIV由两个平行的loop(loop 1-2)组成,其中loop2内的第394398位氨基酸残基在已有的三级结构中缺失。分子内位点相互作用分析显示,在DIV内可能存在12个氨基酸之间的相互作用,主要分布在三个区域:1)顶部区域的N384-Y388;2)中部区域,由7个氨基酸形成包含位于loop1内的N381-N385、N381-K389、N385-K389和位于loop2内的D398-S400、D398-Q401以及连接loop1与loop2的N381-Q401、N381-I403、N385-W393、K389-W393的9个相互作用;3)底部区域,包括连接loop1与loop2的T379-F405以及位于loop2内的D404-S406。氨基酸序列分析表明,这些相互作用位点及其邻近氨基酸在GP64蛋白家族中高度保守。采用丙氨酸替换对DIV中保守的氨基酸及其形成的相互作用进行突变,发现所有位点的突变不影响GP64的表达及三聚体形成,但突变效应主要表现为:1.在转染质粒表达突变体的条件下,D404A、N407A不影响GP64在细胞表面的定位,却显着抑制融合孔的扩大;而另外5个保守位点(Y388、E390、G391、R392、W393)的氨基酸突变显着降低了GP64在细胞膜的定位并完全抑制膜融合起始;在重组bacmid表达各个突变体的条件下,E390A与G391A诱导形成较小的细胞融合嵌合体并抑制病毒入侵但不抑制病毒出芽释放。2.在双点突变中,T379/F405A、N385/K389A、D398/S400A、D398/Q401A不影响GP64的功能,而N381/Q401A、N381/I403A、D404/S406A抑制融合孔的扩大,N381/N385A、N381/K389A、N384/Y388A、N385/W393A、K389/W393A则抑制膜融合起始。此外,在重组bacmid表达突变体条件下,N381/K389A抑制病毒入侵但不抑制病毒出芽释放。3.特性类似的氨基酸取代突变体(Y388F、Y388W、E390D、R392H、R392K、W393F、W393Y)中,只有Y388F、E390D、W393Y诱导细胞融合,而其余4个突变体在细胞表面的定位显着下降。结构分析显示,在上述突变中,Y388A或N384/Y388A突变消除了N384-Y388的相互作用;而W393控制DIV的构象,丙氨酸替换W393导致DIV构象显着变化,突出表现为loop1内的S386、I387与loop2内的N396邻近并形成相互作用促使loop2顶部区域向蛋白中心偏移大约2.5?;另外,N381/K389A消除了N381-K389、N385-K389、N381-Q401、N381-I403的相互作用,而N381/I403A则消除了N381-Q401、N381-I403的相互作用,揭示破坏loop1与loop2之间的互作影响GP64的转运及其膜融合功能。最后,N381-N385、N385-K389与上述相互作用之间在维持DIV构象中具有冗余功能,消除这些相互作用后,DIV构象由于局部氨基酸的邻近形成新的相互作用(如A381-V394、A389-R392)协助其余的相互作用仍维持稳定。总之,我们的研究结果表明,DV结构域内的G438与W439以及DIV结构域内的N381、Y388、E390、G391、R392、W393及其与邻近氨酸酸形成的分子内相互作用在维持GP64中性pH条件下的三级结构及诱导膜融合的起始和融合孔扩大过程中具有关键调控作用。根据已获得的部分第三类病毒膜融合蛋白的融合前及融合后结构,我们提出了GP64可能的构象变化机制。

刘升[6](2020)在《三种新发再发病毒入侵与组装机制研究》文中提出过去二十多年来,新发再发病毒性传染病在世界各地频繁爆发,例如埃博拉病毒(Ebola virus,EBOV)、黄热病毒(Yellow fever virus,YFV)、非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)以及新型冠状病毒(2019 novel coronavirus,2019-nCoV)等导致的疫情,造成巨大的人员伤亡和经济损失。病毒需要感染特定的宿主细胞才能完成其生命周期,这个过程涉及多个步骤:粘附、入侵、复制、组装和释放。其中,进入宿主细胞内部是病毒生命周期的起点,而正确的组装过程对于形成具有侵染力的病毒粒子至关重要。因此,揭示病毒的入侵与组装过程是全面了解病毒感染、传播和致病机理的基础,也是预防和治疗相关病毒性疾病的重要理论依据。本论文基于冷冻电镜技术研究三种代表性的新发再发病毒的入侵与组装机制。首先,我们关注了给中国猪肉市场造成巨大经济损失的非洲猪瘟病毒。非洲猪瘟病毒作为非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)的唯一成员,是一个拥有复杂多层结构的大型双链DNA病毒(直径约250 nm)。由于庞大的病毒颗粒本身具有较大结构柔性,这给全病毒粒子的高分辨率结构解析提出了巨大挑战。为了解决这一难题,我们利用针对大病毒颗粒开发的分块重构算法(Block-based reconstruction)成功获得了 4.6 A近原子分辨率的病毒衣壳(Capsid)结构。基于衣壳结构以及深入的生物信息学分析,我们鉴定出了多种关键的衣壳蛋白,包括8280 个主要衣壳蛋白(Major capsid protein,MCP)p72,60 个五邻体蛋白(Penton protein)以及至少8340个包含三种不同类型的次要衣壳蛋白(Minor capsid protein)。其中p72是病毒衣壳最主要的成分,以三聚体形式分布在二十面体衣壳外层的平面内;五邻体蛋白构成了衣壳的顶点(Vertex)以协助二十面体组装;三种次要衣壳蛋白位于衣壳内部并形成网络结构,像“胶水”一样连接着相邻的壳粒(Capsomer),从而稳定整个衣壳结构。这些精细的结构信息增加了我们对于非洲猪瘟病毒粒子的基本构成和组装机制的理解,为后续针对这一病毒的生物学特性研究以及相关抗病毒策略研发奠定了基础。其次,我们聚焦于肠道病毒(Enterovirus,EV)的入侵机制,以B型肠道病毒(EV-B)作为对象展开研究。B型肠道病毒是小RNA病毒科(Picornaviridae)肠道病毒属(Enterovirus)的主要成员,是引起儿童脑炎等严重疾病的病原体。虽然B型肠道病毒在细胞表面的粘附受体(Attachment receptor)CD55已被鉴定出来,但是受体介导病毒入侵的具体过程,特别是其脱衣壳(Uncoating)的触发因素仍不清楚。首先,我们基于CRISPR-Cas9文库筛选鉴定出了人类新生儿Fc受体(Human neonatal Fc receptor,FcRn)是大多数B型肠道病毒的一个通用受体。随后,我们选取B型肠道病毒中毒力较强的埃可病毒6(Echovirus 6,Echo 6)作为模型,利用表面装饰了 FcRn的脂质体在体外重现了病毒的脱衣壳过程。为了进一步理解病毒与受体相互作用的分子基础,我们分别解析了 Echo 6病毒粒子及其与粘附受体CD55或脱衣壳受体FcRn结合的复合体在中性和酸性条件下的一系列高分辨率结构。这些结构系统地展示了两种受体对于病毒入侵的不同作用机制。FcRn通过其FCGRT亚基与病毒颗粒上特殊的“峡谷”(canyon)区域结合,而CD55则结合在“峡谷”外的区域。作为粘附受体,CD55并未引起病毒颗粒的明显构象变化。而脱衣壳受体FcRn则会在酸性条件下触发“峡谷”下方的“口袋因子”(Pocket factor)高效释放以起始病毒脱衣壳过程。这项研究建立了肠道病毒利用两种受体入侵细胞的系统理论,为针对病毒入侵过程设计阻断药物提供了理论依据。最后,针对在巴西等美洲国家流行的黄热病疫情,我们对其病原体——黄热病毒粒子的结构进行了研究。黄热病毒是黄病毒科(Flaviviridae),黄病毒属(Flavivirus)的代表成员,可引起黄疸、出血热等严重疾病。黄热病毒颗粒表面只有一种囊膜蛋白E(Envelope protein),负责病毒入侵宿主细胞的整个过程,目前其受体分子仍然未知。利用冷冻电镜单颗粒重构技术,我们解析了黄热病毒减毒疫苗株(YF17D)近原子分辨率三维结构。通过结构分析,我们发现黄热病毒E蛋白具有不同于其他黄病毒的独特组装界面,以此来稳定病毒粒子结构,并且我们鉴定出了若干关键氨基酸位点可能进一步提高病毒粒子的稳定性。此外,我们还发现黄热病毒E蛋白上的150-loop区缺乏在其它黄病毒中高度保守的糖基化位点。这一位点对于一些相关病毒的受体识别具有关键作用,从而可能影响病毒的宿主嗜性(host tropism)和毒力。这些发现为理解黄热病毒粒子的稳定性和致病力提供了新的结构基础,对于疫苗改造和开发新型治疗手段以及病毒特异性检测工具具有重要指导意义。综上所述,我们通过结构生物学和生化细胞实验手段研究了三种新发再发传染性病毒的入侵和组装机制,为新型抗病毒药物和治疗方法的研发提供了坚实基础。

李龙[7](2019)在《和厚朴酚抗疱疹病毒的作用机制研究与STAT3在MHV68感染中的作用分析》文中研究指明疱疹病毒家族是一种能够在宿主体内建立终身潜伏感染的重要病原体。目前疱疹病毒感染在全球人群中的血清阳性率在20%95%,发病率在发展中国家可能会更高。例如全球超过三分之二的人都感染了单纯疱疹病毒(HSV),超过90%的人群都感染了巨细胞病毒(HCMV),一半以上的人群感染了EB病毒(EBV)或则卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)。疱疹病毒在人体内原发性感染或者周期性的重激活都会导致不同的临床疾病,包括口唇疱疹、疱疹性角膜炎、疱疹性脑炎、淋巴瘤、卡波西肉瘤等。在免疫力低下的人群感染疱疹病毒后会导致更为严重的结果,如不可恢复性神经损伤、失明、甚至死亡。目前临床上除了水痘-带状疱疹病毒具有预防性疫苗,大部分疱疹病毒包括HSV-1、KSHV等均无有效的疫苗。临床上治疗用的药物大部分是针对疱疹病毒的DNA聚合酶发挥出抗病毒作用,无法规避耐药性毒株的出现,并且这些抗病毒药物具有较大副作用。因此,继续寻找新的抗疱疹病毒药物就显得很有意义。本研究主要包括两部分工作,第一部分是探究中草药活性成分和厚朴酚抗疱疹病毒作用及其作用机制。第二部分工作初步探究了STAT3与MHV68从头感染之间的关系。中草药活性成分和厚朴酚是一种具有多种药理学活性的新木质素,能够发挥着抗肿瘤、抗炎症、抗血栓形成、抗微生物感染等功能,然而其在抗病毒感染方面的研究却非常有限。本文通过融合表达了荧光蛋白基因的重组病毒包括HSV-1-GFP、KSHV-RGB-BAC16、MHV68-H2b-YFP等构建方便检测的疱疹病毒感染模型。借助于荧光显微镜观察、实时定量PCR技术和蛋白免疫印迹技术等首次发现和厚朴酚具有抗疱疹病毒的作用,不仅可以抑制人的阿尔法型疱疹病毒(HSV-1)和伽马型疱疹病毒(KSHV),也可以抗小鼠疱疹病毒(MHV68)。初步结果显示和厚朴酚抗HSV-1是通过抑制DNA复制,基因表达,病毒颗粒产生,并且对于病毒的入侵过程没有影响。疱疹病毒感染和宿主因子之间存在着密切关系,这对于抗疱疹病毒治疗非常有意义。STAT3具有信号转导和转录激活双功能,在病毒感染过程作用复杂。事实上,许多药物活性成分可以通过抑制STAT3信号通路中的靶点发挥作用。和厚朴酚是否由此影响疱疹病毒的从头感染尚未可知,在解决这个问题之前我们首先想探究清楚STAT3信号通路和MHV68从头感染的关系。在本文的第二部分我们发现抑制了JAK-STAT3信号通路可以导致MHV68感染能力下降,并构建过表达STAT3的小鼠胚胎成纤维母细胞系,为研究STAT3与MHV68感染提供了方便。结果过表达STAT3与STAT3C(STAT3持续性激活形式)均能够显着增加MHV68感染;并促进其重激活。这两部分原创性的研究描述了一种潜在的抗疱疹病毒感染药物和厚朴酚及其作用机制。初步探究STAT3可以增强MHV68从头感染,促进MHV68重激活。这将为探究MHV68感染和宿主转录因子STAT3之间相互影响的分子机制奠定基础;也为进一步探究和厚朴酚抗疱疹病毒作用机制铺平道路。

郑路平[8](2019)在《人成纤维细胞N-连接糖基化在人巨细胞病毒感染进程中的作用及机制研究》文中研究表明目的与意义:蛋白糖基化修饰作为生物体主要的翻译后修饰方式之一,其在生命活动各种生理生化进程中均发挥重要作用。N-连接糖基化作为糖基化的主要修饰方式,已证实广泛参与细胞与细胞、细胞与病毒之间的相互作用。同时,病毒N-连接糖蛋白的合成也需要依靠宿主细胞的蛋白合成及翻译后修饰体系。因此,N-连接糖基化与病毒感染进程的各个环节均密切相关。人巨细胞病毒(hCMV)是一种普遍存在的β疱疹病毒,在国内外人群中呈高度血清阳性。它会导致免疫功能低下的患者,如移植受者,新生儿和获得性免疫缺陷综合征(艾滋病)患者的发病率和死亡率显着提高。但目前尚没有有效的hCMV疫苗,同时商业化的抗病毒药物则具有显着的毒副作用。HCMV具有广泛的细胞感染极性,其可以感染多种细胞类型,包括成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞和巨噬细胞。由于hCMV在成纤维细胞中可获得较高滴度的病毒颗粒且其在胞内的生命周期也研究的较为透彻,因此成纤维细胞是研究hCMV感染、复制及释放进程良好的细胞模型。1.成纤维细胞表面蛋白高度N-糖基化,这些N-糖链在hCMV早期感染进程中的作用和机制还不清楚。稳定的病毒-宿主结合和侵入进程被认为是病毒感染早期的关键步骤,并可能成为防治hCMV感染的关键节点。宿主细胞糖基化涉及多种病毒感染,不同聚糖的结构决定了与病毒的相互作用类型和宿主细胞对病毒的易感性。N-和O-连接糖基化是细胞两种主要的糖基化形式,N-糖基化作为细胞表面膜蛋白广泛存在的糖基化形式,可以设想其将在病毒结合和侵入宿主细胞进程中发挥重要作用。HCMV结合和侵入进程涉及其与成纤维细胞表面受体之间的复杂相互作用。研究表明表皮生长因子受体(EGFR)、血小板衍生生长因子-α受体(PDGFR-α)和整合素家族成员可作为hCMV受体介导病毒的侵入进程。同时这些介导hCMV侵入成纤维细胞的蛋白受体均被高度N-糖基化修饰。因此,通过研究成纤维细胞表面蛋白的N-糖基化及其对hCMV早期感染进程的影响和机制将有可能找到早期预防hCMV感染的生物靶点。2.同时,成纤维细胞作为hCMV主要的宿主细胞之一,其N-糖加工体系对于hCMV的复制和释放的影响亦需要重点研究。衣霉素tunicamycin(TM)为放线菌产生的核苷酸抗生素。可阻断糖蛋白合成第一步中UDP-N-乙酰葡糖胺和多萜醇磷酸之间的反应,从而抑制所有N-连接糖蛋白的合成。其在作用浓度较高时可最终引起内质网应激反应(ER stress)。目前已证明TM可抑制具有被膜(envelope,含糖蛋白)的病毒的增殖。这一作用机理则是通过糖链加工系统受损导致宿主细胞N-连接糖蛋白糖链合成抑制,进而借助宿主糖蛋白合成体系的被膜病毒由于无法产生具有正确糖链结构的蛋白从而导致病毒蛋白合成和组装受到抑制。而hCMV则是典型的被膜病毒,其被膜糖蛋白的合成依赖于宿主细胞的糖蛋白合成体系。因此理论上可以假设TM将对hCMV整个生命活动产生影响,但目前尚未有研究TM对hCMV复制和释放的影响的报道。鉴于以上,本研究另一个主要的目的即是探究TM引起的宿主N-糖合成系统受损对于hCMV复制和释放的作用。通过这部分研究将有可能将TM或毒副作用更小的TM衍生物作为治疗hCMV感染的潜在药物候选。本课题将病毒学及糖生物学有机结合起来,形成多学科交叉的研究方法和体系;各学科的理论和技术相互渗透、互为支撑,以保证课题具有一定的可行性和创新性。本研究将首次对人成纤维细胞N-连接糖基化水平与hCMV侵入宿主进程之间的关系作为研究重点进行阐述;同时也是首次研究hCMV感染成纤维细胞后TM干预对于该病毒复制及释放的影响。通过以上研究,本论文将探讨成纤维细胞感染hCMV前后宿主表面N-连接糖糖基化及胞内N-糖合成体系对于hCMV从宿主结合、侵入到感染后的复制及释放的影响和机制,以期进一步完善hCMV的感染和发病机制并为寻找更为有效的防治hCMV提供合理科学的策略和潜在生物学靶点。实验方法:(1)本实验将MRC-5和WI-38两种成纤维细胞作为实验对象。分别利用细胞N-糖抑制剂衣霉素、糖苷酶PNGase F、凝集素以及N-乙酰氨基葡萄糖转移酶I(GnT I)基因沉默等预处理成纤维细胞,以去除或封闭细胞表面N-糖,之后hCMV感染细胞,并于感染后不同时间分别进行细胞病变效应(CPE)、病毒基因拷贝数及病毒即刻早期蛋白表达检测等手段验证成纤维细胞表面N-连接糖基化对于病毒早期感染的影响。(2)抗体标记hCMV被膜蛋白,通过定量PCR、细胞免疫荧光和流式细胞术实验分别检测细胞N-糖基化水平变化前后病毒的贴附和侵入情况;之后利用western blot检测病毒侵入细胞相关信号通路分子表达和免疫共沉淀实验来验证细胞表面hCMV受体和配体相互作用。(3)先将hCMV感染成纤维细胞,之后在感染后不同时间点加入TM进行药物治疗,检测TM于hCMV感染成纤维细胞不同时间后其胞内总蛋白N-连接糖基化变化;之后分别形态学、QPCR,western blot检测TM于hCMV感染成纤维细胞不同时间后其细胞病变效应、hCMV基因拷贝数以及即刻早期、早期和晚期蛋白的表达,研究TM对于hCMV复制的影响。同时检测上述各组感染72 h后胞外培养液中hCMV基因拷贝数以及释放的病毒颗粒的毒性滴度,以研究TM对于hCMV病毒颗粒组装及释放的作用。结果:(1)不同去N-连接糖基化方式预处理成纤维细胞均可显着减少细胞N-连接糖基化表达水平。(2)人成纤维细胞N-糖减少后再感染hCMV,其噬斑形成、基因拷贝数及即刻早期蛋白表达均显着降低。(3)人成纤维细胞N-连接糖基化缺失后显着抑制了hCMV侵入,但不影响病毒与成纤维细胞的结合。(4)人成纤维细胞hCMV受体EGFR及整合素β3表面N-糖减少后显着抑制了二者与hCMV表面糖蛋白gB和gH的相互作用,同时β3-src信号通路亦被显着抑制。(5)成纤维细胞感染hCMV后,再加入TM可以减少胞内总蛋白N-连接糖基化水平并显着抑制hCMV基因拷贝数以及病毒即刻早期蛋白IE、早期蛋白UL44及晚期蛋白UL99的表达。(6)TM处理引发的成纤维细胞N-连接糖基化的减少抑制了hCMV的释放进程。结论:通过以上实验结果证实成纤维细胞N-糖对于hCMV感染是必需的,细胞表面N-糖参与hCMV早期感染成纤维细胞进程。成纤维细胞表面的N-糖不影响hCMV结合成纤维细胞,但显着抑制了hCMV的侵入。该现象的机制可能为成纤维细胞的hCMV受体EGFR、β3通过其表面N-糖与病毒配体相互作用,从而介导受体自身及下游侵入相关信号通路的激活,继而引发细胞膜融合及细胞骨架结构重排促进hCMV侵入成纤维细胞。最后,通过实验验证发现TM处理感染hCMV的成纤维细胞后,其可以显着抑制病毒的复制和释放。其机制可能是TM通过抑制宿主细胞N-糖合成系统的功能从而导致hCMV复制及新生病毒颗粒蛋白合成异常造成的。综上所述,细胞表面N-糖可以作为预防hCMV早期感染的重要生物学靶点,而TM及其衍生物则可能成为治疗hCMV感染的新型药物。

孙乐强[9](2018)在《嗜神经病毒神经嗜性和毒性比较》文中研究指明嗜神经病毒是一类对神经系统高度敏感的病毒,多种嗜神经病毒具有严格的神经嗜性,并且在感染后能够沿特定方向跨突触传播。随着基因工程和反向遗传学技术的迅速发展,嗜神经病毒被改造为多种形式的环路标记工具,用以解析中枢神经系统的神经环路连接网络。而且可结合钙离子指示蛋白、光遗传和化学遗传工具特异性地监测和操纵神经环路的活性,对神经环路的功能进行研究。嗜神经病毒在神经元内的转运方向具有一定的偏好性。单纯疱疹病毒(HSV)的HSV129毒株和水泡性口炎病毒(VSV)主要以顺行方向转运,被作为神经环路顺向标记工具。狂犬病毒(RABV),犬腺病毒2型(CAV),伪狂犬病毒(PRV)的bartha株和逆行标记的腺相关病毒rAAV2-retro沿轴突逆行转运,被改造用于神经环路的逆向标记。根据病毒的复制能力分为不跨突触的标记病毒和跨多级突触的标记病毒。不跨突触的标记病毒为复制缺陷型病毒,如G蛋白缺失的狂犬病毒(RABV-SAD-?G),E1蛋白缺失的犬腺病毒(CAV2)和rAAV2-retro,用以标记注射位点的一级环路连接。跨多级突触的标记病毒为复制完整型病毒,包括PRV的bartha株、RABV的固定毒株、HSV的H129毒株,随着病毒的复制,可跨突触标记核团的多级环路。如此繁多的病毒标记工具,使科研工作者能够更全面的解析大脑的神经连接以及信号传递模式。在不同的研究中该如何准确的选择有效的病毒工具,依赖于我们对不同病毒特性的了解。不同来源的标记病毒具有不同特性,包括病毒结构、基因组、受体蛋白、复制包装等过程,病毒只能够入侵表达对应受体蛋白的神经元,进入神经元后通过与宿主蛋白的相互作用,完成病毒的复制、包装等过程。神经网络由种类繁多的神经元构成,不同类型的神经元的基因表达各不相同。以上病毒与宿主之间的差异可能会导致嗜神经病毒对不同类群的神经元具有不同的神经嗜性,造成神经环路标记的不一致。然而,目前对不同示踪病毒的神经嗜性比较,及其在环路标记的影响并没有系统的研究报道。本课题对目前常用的跨多级示踪病毒和不跨突触的示踪的病毒的神经嗜性和毒性进行系统的分析比较,为神经环路标记工具的合理应用提供参考。1.多级逆行示踪病毒神经嗜性比较将表达绿色荧光蛋白的RABV的固定毒来源的CVS-B2c-EGFP和PRV Bartha株来源的PRV-152(EGFP)分别注射在小鼠的腘淋巴结。病毒粒子被支配淋巴结的神经末吸收后沿神经纤维逆行标记支配淋巴结的神经元,随着病毒的复制和跨突触感染,大脑内的高级神经连接网络被标记。通过全脑切片成像,对两种病毒标记的神经元的核团位置和数量进行分析比较,结果显示通过以上两种逆向标记病毒绘制的神经环路存在差异。2.单级逆行示踪病毒神经嗜性比较将几种常用的复制缺陷型病毒SAD-?G、rAAV2-retro、CAV2-Cre以及一种化学示踪剂green retrobeads分别注射在鼠脑的相同核团,标记注射位点的一级输入环路。通过全脑切片、成像,对不同病毒标记的神经元的核团和数量进行统计分析。结果发现不同病毒标记的神经环路并不完全一致。进一步通过Cre/Lox重组酶系统放大荧光蛋白信号排除不同病毒荧光蛋白表达差异;通过混合注射,排除注射误差后,依然能够观察到标记差异。这说明不同的标记病毒对大脑内的神经元类群存在嗜性偏好。在对下丘脑的环路进行标记时,rAAV2-retro更倾向于标记皮层,而SAD-?G倾向于标记下丘脑和基底神经节。3.病毒神经嗜性差异机制的初步探索病毒利用细胞膜上的受体感染进入神经元,不同类型的病毒只识别并结合其对应的特异受体蛋白。而且大脑内的神经元种类繁多、功能各异,基因表达必定存在差异。因此,我们推测病毒具有神经嗜性差异的重要因素是神经元轴突末梢的病毒受体表达不均一,从而造成病毒对不同类群的神经元具有选择性。我们在RABV不敏感的神经元过表达禽白血病病毒受体(TVA)后,能够明显提高对应配体EnvA(禽白血病病毒囊膜蛋白)假包装的狂犬病毒的感染性。这说明神经元表达对应病毒受体后,能够提高该病毒的神经嗜性。为了进一步探索决定神经嗜性的分子机制,我们建立了鼠脑神经元的单细胞分离方法,分离SAD-?G和rAAV2-retro标记的神经元,并进行单细胞测序。对22群SAD-?G标记的神经元和21群rAAV2-retro标记的神经元的转录组进行分析,推测造成两种病毒神经嗜性差异的分子机制。4.示踪病毒的毒性比较示踪病毒注射后由于病毒的感染和基因的表达势必会对脑组织产生一定的毒性。我们首先通过组织RNA-seq对注射位点和逆标记位点组织的转录组进行测序,分析病毒标记对脑组织基因表达的影响。结果显示病毒标记诱导大量免疫相关基因的表达,SAD-?G对注射位点和逆标记位点的基因表达的改变比rAAV2-retro更显着。进而通过免疫组织化学染色观察到SAD-?G标记后在注射位点和逆标记位点出现小胶质细胞的大量激活,rAAV2-retro仅在注射位点引起小胶质细胞的激活,而在逆标记位点并未出现明显的激活现象。同时我们还发现SAD-?G逆标记会引起催产素基因的高表达。5.多种示踪病毒联合应用标记高级神经环路通过以上研究我们发现,不同来源的示踪病毒的神经嗜性存在差异。我们利用病毒的神经嗜性差异,对多种单级示踪病毒联合应用,提出解析特定核团的二级输入环路策略。本研究通过比较不同嗜神经病毒对大脑内神经元的感染特性,确定嗜神经病毒对大脑内的神经元存在嗜性差异,并且通过单细胞测序分析造成病毒神经嗜性差异的分子机制。同时比较了不同嗜神经病毒改造的神经环路标记工具在脑组织内产生的毒性反应。以上研究为嗜神经病毒感染机制研究提供新的思路,同时也为嗜神经病毒在神经环路中的正确应用提供参考。

程继帅[10](2020)在《HVEM在单纯疱疹病毒1型感染中的作用研究》文中提出HSV-1病毒感染是一个在全球范围内广泛传播的病毒性传染病,其可以引起机体多种疱疹性疾病。目前,仅能通过抗病毒药物如阿昔洛韦等部分控制病毒感染症状,但这类药物不能预防疱疹病毒的原发感染,也不能控制病毒的潜伏感染和复发性感染,并且易产生耐药性。鉴于目前尚不清楚HSV-1复杂的感染机制和致病机制以及HSV-1感染后机体的免疫机制,因此HSV-1疫苗的研发以及治疗药物的开发面临巨大的挑战。已有研究表明,HSV-1感染宿主细胞后,其糖蛋白和DNA可被宿主受体识别,进而启动机体的固有免疫应答,随后激活机体的体液免疫应答和细胞免疫应答。HVEM作为HSV-1病毒进入细胞的糖蛋白gD受体,在多种免疫细胞,尤其是在对免疫反应具有重要调控作用的树突状细胞表面均有分布,因此,HVEM在HSV-1病毒感染过程中是否参与了机体抗疱疹病毒感染的保护性免疫应答尚不清楚,其在固有免疫、特异性抗体和细胞免疫应答中的作用亦有待研究。本研究第一部分利用HVEM基因敲除C57BL/6小鼠(HVEM-/-小鼠)及其野生型小鼠(C57BL/6,HVEM+/+),比较两种小鼠经不同方式感染HSV-1病毒株McKrae后在临床表现、病理变化以及病毒载量方面的差异。结果显示,经肌肉注射方式感染后HVEM-/-、鼠和C57BL/6小鼠在临床表现、病理变化以及病毒载量方面无明显的差异,而经皮内注射方式感染后HVEM-/-小鼠和C57BL/6小鼠在临床表现、病理变化以及病毒载量方面均有明显的差异。HSV-1病毒感染宿主的受体需求可能取决于其感染途径。鉴于这一明显的差异,我们对感染后小鼠的树突状细胞进行转录组学测序分析。结果显示,HSV-1感染后,HVEM-/-小鼠和C57BL/6小鼠树突状细胞中基因表达差异明显,特别是感染7天后。HSV-1 McKrae株感染后,HVEM-/-、鼠树突状细胞表现出明显的细胞自噬、NF-κB信号通路和IFN-I分泌的抑制以及T细胞增殖和活化的增强。在转录组学测序结果的基础上,我们利用实验室前期构建的u17、u141和LAT基因部分敲除的HSV-1病毒突变株M3免疫小鼠后再经皮肤感染HSV-1野生型毒株McKrae,比较感染后小鼠的临床表现、病理变化、病毒载量、中和抗体反应以及特异性细胞反应。结果显示,突变株M3免疫后,HVEM-/-小鼠未检测到B细胞中和抗体反应,但检测到特异性IFN-γ和IL-4细胞反应,且特异性IL-4细胞反应趋势与野生型小鼠相似,而特异性IFN-γ细胞反应趋势与野生型小鼠相反。免疫后小鼠经皮内注射感染HSV-1野毒株McKrae时,HVEM-/-小鼠和C57BL/6小鼠均未表现明显的病理变化和临床症状,且神经系统组织的病毒载量明显下降。感染后,HVEM-/-小鼠表现特异性IFN-γ和IL-4细胞反应,且随着感染时间的推移逐渐增强,而C57BL/6小鼠恰恰相反。综上所述,在HSV-1感染过程中,由于HVEM在介导病毒进入多种免疫细胞过程的重要作用,HVEM在调控宿主免疫系统抗HSV-1感染中发挥了特定功能的作用。HVEM作为免疫信号分子参与机体的免疫反应所具有的生理功能,通过调控细胞自噬、NF-κB信号通路以及T细胞的增殖分化调节宿主的固有免疫应答和适应性免疫应答所发挥的多种能力,形成了 HSV-1对免疫系统的综合作用以及免疫系统在此前提下形成的抗HSV-1免疫反应特征,对这一机理的认识将有助于HSV-1药物及疫苗的研究。因此,本研究结果为阐明HSV-1感染过程的机制以及感染后机体的免疫应答机制提供了理论基础,为HSV-1疫苗及治疗药物的研究提供了新的思路。

二、PARTICLES OBSERVED ON THE SURFACE OF CELLS INFECTED WITH HERPESVIRUSES(论文开题报告)

(1)论文研究背景及目的

此处内容要求:

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例:

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

(2)本文研究方法

调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、PARTICLES OBSERVED ON THE SURFACE OF CELLS INFECTED WITH HERPESVIRUSES(论文提纲范文)

(1)抗沙粒病毒小分子药物的高通量筛选及Ⅰ型疱疹病毒感染细胞的蛋白质组学研究(论文提纲范文)

摘要
abstract
第一章 引言
    1.1 沙粒病毒的发现及分类
    1.2 沙粒病毒的结构和编码的蛋白
        1.2.1 沙粒病毒颗粒的结构
        1.2.2 沙粒病毒基因组的结构
        1.2.3 沙粒病毒的核蛋白NP
        1.2.4 沙粒病毒RNA依赖的RNA聚合酶L
        1.2.5 沙粒病毒的基质蛋白Z
        1.2.6 沙粒病毒的膜蛋白GPC
    1.3 沙粒病毒的生命周期
    1.4 沙粒病毒流行病学及临床特征
    1.5 沙粒病毒的动物模型
        1.5.1 旧世界沙粒病毒的动物模型
        1.5.2 新世界沙粒病毒的动物模型
    1.6 沙粒病毒的药物和抗体研究进展
        1.6.1 抑制沙粒病毒复制的药物研究进展
        1.6.2 沙粒病毒进入抑制剂研究进展
        1.6.3 多肽类药物的研究进展
        1.6.4 沙粒病毒疫苗的研究进展
    1.7 Ⅰ型单纯疱疹病毒简介
第二章 FDA批准的小分子药物库的抗病毒药物筛选
    2.1 实验材料,实验仪器与实验方法
        2.1.1 实验材料
        2.1.2 实验仪器
        2.1.3 质粒的构建
        2.1.4 LCMV及其重组病毒的拯救与扩增
        2.1.5 VSV假病毒的包装
        2.1.6 SARS-Co V-2 病毒的获得
        2.1.7 免疫噬斑印记法检测LCMV的滴度
        2.1.8 LCMV NP蛋白小鼠和家兔抗血清的制备
        2.1.9 MTT法检测细胞活力
        2.1.10 实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,q RT-PCR)
        2.1.11 病毒与宿主细胞的结合与内化
        2.1.12 细胞膜融合模型
        2.1.13 迷你基因组复制系统
        2.1.14 LCMV出芽能力检测
        2.1.15 Western blot印记法检测目的蛋白
        2.1.16 动物实验
        2.1.17 筛选药物适应性突变病毒
        2.1.18 免疫荧光染色法(Immunofluorescence assay,IFA)
    2.2 实验结果
        2.2.1 利用重组e GFP的 LCMV筛选FDA批准的小分子药物库
        2.2.2 筛选得到的抗病毒药物的IC50、CC50和SI值
        2.2.3 五种抗病毒药物的作用阶段
        2.2.4 贝尼地平的抗病毒机制
        2.2.5 具有耐药性的突变位点的发现
        2.2.6 贝尼地平能够抑制LCMV在小鼠体内的复制
        2.2.7 贝尼地平在沙粒病毒中具有广谱的抗病毒效果
        2.2.8 其它二氢吡啶类药物抑制LCMV的作用与贝尼地平相似
        2.2.9 霉酚酸、阿帕替尼、达拉菲尼和氯法齐明对新冠病毒的抑制作用
        2.2.10 额外添加鸟嘌呤核苷中和霉酚酸的抗病毒作用
    2.3 讨论
    2.4 总结与展望
第三章 HSV-1 感染的HEK293T细胞定量蛋白质组学分析
    3.1 实验材料,实验仪器与实验方法
        3.1.1 实验材料
        3.1.2 实验仪器
        3.1.3 质谱样品的SILAC标记
        3.1.4 细胞核蛋白与胞浆蛋白的提取
        3.1.5 蛋白的提取和消化
        3.1.6 液相色谱质谱联用(LC-MS/MS)分析
        3.1.7 蛋白的鉴定与定量
        3.1.8 GO聚类分析
        3.1.9 siRNA转染细胞
        3.1.10 病毒基因组DNA和宿主细胞基因表达的检测
    3.2 实验结果
        3.2.1 HSV-1 感染HEK293T细胞的定量蛋白质组学分析的样品准备
        3.2.2 质谱获得的定量蛋白质组数据的处理
        3.2.3 WB和 qRT-PCR法验证MS分析得到的差异蛋白
        3.2.4 通过GO分析鉴定被HSV-1感染影响的生命过程
        3.2.5 IFITM3、CHCHD2 和TRIM27 对病毒复制的作用
    3.3 讨论
    3.4 总结与展望
参考文献
附录
致谢
作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果

(2)人类疱疹病毒8型潜伏感染树鼩动物模型的建立及环境影响研究(论文提纲范文)

摘要
Abstract
英文缩写词表
第一章 绪论
    1.1 卡波西肉瘤相关疱疹病毒的流行与危害
    1.2 KSHV传播的环境因素
        1.2.1 地理因素
        1.2.2 人群因素
        1.2.3 环境因素
    1.3 KSHV病原生物学
        1.3.1 KSHV传染源
        1.3.2 KSHV传播方式
        1.3.3 KSHV易感人群
        1.3.4 KSHV临床症状
        1.3.5 KSHV的诊断和治疗
        1.3.6 KSHV的预防和控制
    1.4 KSHV流行病学
        1.4.1 KSHV的发现和分类
        1.4.2 KSHV的病毒粒子结构
        1.4.3 KSHV基因组结构特征及编码蛋白
        1.4.4 KSHV的生命周期及感染特点
    1.5 KSHV感染动物模型的研究应用
        1.5.1 裸鼠模型
        1.5.2 免疫缺陷小鼠模型
        1.5.3 人源化小鼠模型
        1.5.4 绒猴模型
    1.6 树鼩生物学特性及应用
        1.6.1 树鼩生物学地位
        1.6.2 树鼩在医学领域的研究应用
        1.6.3 树鼩在病毒感染的研究应用
    1.7 本研究的目的和意义及技术路线
        1.7.1 研究的目的和意义
        1.7.2 研究技术路线
第二章 树鼩原代细胞的分离培养及鉴定
    2.1 引言
    2.2 实验材料和方法
        2.2.1 实验动物
        2.2.2 主要试剂
        2.2.3 主要仪器
        2.2.4 实验方法
    2.3 结果
        2.3.1 树鼩原代细胞的培养结果
        2.3.2 树鼩原代细胞的形态学和免疫荧光鉴定结果
        2.3.3 树鼩原代细胞的增殖曲线测定结果
    2.4 讨论
    2.5 小结
第三章 KSHV感染树鼩原代细胞易感性筛选及肾上皮细胞感染特性研究
    3.1 引言
    3.2 实验材料与方法
        3.2.1 实验材料
        3.2.2 主要试剂
        3.2.3 主要仪器
        3.2.4 实验方法
    3.3 结果
        3.3.1 iSLK.219 病毒细胞株的培养及r KSHV.219 病毒滴度检测
        3.3.2 KSHV感染树鼩六种原代细胞结果
        3.3.3 KSHV感染不同物种来源的原代肾细胞结果
        3.3.4 KSHV对树鼩原代肾上皮细胞最佳感染复数的探究结果
        3.3.5 KSHV感染树鼩原代肾上皮细胞特性的研究
    3.4 讨论
    3.5 小结
第四章 KSHV感染树鼩动物特性的研究
    4.1 引言
    4.2 材料与方法
        4.2.1 实验材料
        4.2.2 实验试剂
        4.2.3 主要仪器设备
        4.2.4 实验方法
    4.3 数据处理
    4.4 实验结果与分析
        4.4.1 KSHV感染树鼩血液定性和定量检测结果
        4.4.2 KSHV感染树鼩外周血淋巴细胞荧光表达结果
        4.4.3 KSHV感染树鼩组织定量检测结果
        4.4.4 KSHV感染树鼩组织中病毒m RNA表达结果
        4.4.5 KSHV感染树鼩组织病毒蛋白表达的结果
        4.4.6 KSHV感染树鼩各组织器官HE和 IHC检测结果
        4.4.7 KSHV感染树鼩抗病毒免疫反应因子的检测结果
    4.5 讨论
    4.6 本章小结
第五章 结论与展望
    5.1 结论
        5.1.1 KSHV感染树鼩原代细胞和肾上皮细胞的研究
        5.1.2 KSHV潜伏感染树鼩动物模型的研究
    5.2 本研究的创新点
    5.3 展望
致谢
参考文献
附录A 攻读博士期间发表论文目录

(3)基于病毒全蛋白组序列筛选T细胞表位研发新型寨卡病毒T细胞疫苗(论文提纲范文)

摘要
abstract
第一章 引言
    1.1 寨卡病毒的流行概况
        1.1.1 寨卡病毒的发现及传播
        1.1.2 寨卡病毒的全球流行
    1.2 寨卡病毒的临床特征和发病机制
        1.2.1 寨卡病毒的临床特征
        1.2.2 寨卡病毒的细胞感染机制
    1.3 疫苗的保护机制
    1.4 寨卡病毒疫苗的研究现状
        1.4.1 灭活疫苗
        1.4.2 减毒疫苗
        1.4.3 核酸疫苗
        1.4.4 重组疫苗
    1.5 T细胞反应在寨卡病毒感染过程中的作用
        1.5.1 T细胞在寨卡病毒感染小鼠过程中的作用
        1.5.2 T 细胞在寨卡病毒感染人过程中的作用
    1.6 研究设计与拟解决的问题
第二章 材料与方法
    2.1 肽段的设计与合成
    2.2 细胞的培养、传代以及冻存
    2.3 病毒培养及滴度测定
        2.3.1 病毒培养
        2.3.2 病毒滴度测定
    2.4 Balb/c小鼠病毒感染模型的建立
    2.5 细胞因子检测
        2.5.1 通过ELISPOT对 IFN-γ分泌量的检测
        2.5.2 通过FACS对 IFN-γ、IL-2 分泌量的检测
    2.6 寨卡病毒中和试验
    2.7 体外检测抗体依赖的增强感染作用
    2.8 T细胞体内杀伤实验小鼠模型的建立
        2.8.1 T细胞体内杀伤实验
        2.8.2 样品的处理及数据的检测、分析
    2.9 病毒拷贝的核酸检测法
        2.9.1 检测样本RNA的抽提
        2.9.2 通过qRT-PCR法检测病毒拷贝
    2.10 数据的处理及分析
第三章 结果
    3.1 寨卡病毒全蛋白组的T细胞表位筛选
        3.1.1 寨卡病毒感染的Balb/c小鼠能被刺激起强而广的T细胞反应
        3.1.2 寨卡病毒T细胞表位的MHC限制性
    3.2 寨卡病毒特异性的 T 细胞反应介导体内细胞毒作用
    3.3 CpG 佐剂比铝佐剂能更好的激活 CD8+ T 细胞反应
    3.4 肽段免疫的小鼠能对寨卡病毒的感染提供保护作用
        3.4.1 肽段免疫策略以及免疫原性检测
        3.4.2 肽段免疫诱导的保护性检测
        3.4.3 肽段免疫通过T细胞杀伤提供保护作用
    3.5 寨卡病毒亚单位疫苗与T细胞疫苗联合使用的协同作用分析
第四章 结论与讨论
    4.1 课题结论及其意义
    4.2 可以通过IFN-γELISPOT高效筛选T细胞表位
    4.3 肽段免疫中CD8+T 细胞表位肽段的弱免疫原性
    4.4 T细胞反应在避免ADE过程中发挥作用
    4.5 进一步提高多表位疫苗免疫原性的可能方法
参考文献
附录
致谢
作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果

(4)抗单纯疱疹病毒包膜糖蛋白中和抗体的筛选鉴定及其中和效果评估(论文提纲范文)

摘要
Abstract
Abbreviations
第一章 前言
    1、单纯疱疹病毒
        1.1 单纯疱疹病毒的流行病学特征
        1.2 单纯疱疹病毒的结构组成
    2、单纯疱疹病毒主要的包膜糖蛋白及其功能
        2.1 介导单纯疱疹病毒入胞的主要糖蛋白
        2.2 单纯疱疹病毒与细胞的吸附作用
        2.3 单纯疱疹病毒与细胞表面受体的结合
        2.4 单纯疱疹病毒相关信号转导
        2.5 单纯疱疹病毒的入胞模型
    3、单纯疱疹病毒的裂解感染与潜伏感染
        3.1 单纯疱疹病毒的裂解感染
        3.2 单纯疱疹病毒的潜伏感染
    4、抗单纯疱疹病毒的治疗方式
    5、本研究的设计思路、目的和意义
第二章 材料与方法
    1、材料
        1.1 主要设备
        1.2 主要试剂与耗材
        1.3 菌株、质粒、细胞株、病毒株
        1.4 分子及细胞生物学常规试剂
        1.5 常用液体及培养基配制
    2、方法
        2.1 分子生物学常规实验方法
        2.2 蛋白质常规实验方法
        2.3 细胞生物学常规实验方法
        2.4 单纯疱疹病毒培养及滴度测定
        2.5 单克隆抗体的筛选和制备
        2.6 动物实验一般方法
        2.7 数据处理方法及统计分析
第三章 结果与分析
    1、抗HSV包膜糖蛋白单克隆抗体的制备
        1.1 HSV-1/HSV-2的培养、纯化与滴度测定
        1.2. 抗HSV包膜糖蛋白单克隆抗体的筛选
        1.3 第一部分小结
    2、抗HSV包膜糖蛋白中和抗体的筛选与鉴定
        2.1 抗HSV包膜糖蛋白中和抗体的筛选
        2.2 抗HSV包膜糖蛋白中和抗体的鉴定
        2.3 第二部分小结
    3、抗HSV包膜糖蛋白单克隆抗体体内外治疗效果评估
        3.1 抗HSV包膜糖蛋白中和抗体体外保护效果评估
        3.2 抗HSV包膜糖蛋白中和抗体对HSV胞间扩散的阻断评估
        3.3 抗HSV包膜糖蛋白中和抗体体内保护效果评估
        3.4 第三部分小结
    4、抗HSV包膜糖蛋白单克隆抗体中和作用机制初步探索
        4.1 抗HSV包膜糖蛋白中和抗体对HSV与细胞吸附的影响
        4.2 抗HSV包膜糖蛋白中和抗体识别表位初步探索
        4.3 第四部分小结
第四章 讨论
    1、单纯疱疹病毒的潜伏感染与疾病复发
    2、单纯疱疹病毒与溶瘤病毒
小结与展望
参考文献
致谢
附录

(5)苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒GP64蛋白的结构与功能关系研究(论文提纲范文)

摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
    1.1 生物学膜融合及病毒膜融合蛋白
        1.1.1 生物学膜融合
        1.1.2 病毒感染介导的膜融合
        1.1.3 病毒膜融合蛋白
    1.2 杆状病毒简介
        1.2.1 杆状病毒结构类型
        1.2.2 杆状病毒分类
        1.2.3 杆状病毒粒子
        1.2.4 杆状病毒的侵染过程
        1.2.5 杆状病毒的感染周期
        1.2.6 杆状病毒基因表达时相
        1.2.7 杆状病毒主要膜融合蛋白
        1.2.8 杆状病毒的应用
    1.3 杆状病毒膜融合蛋白GP64 的研究进展
        1.3.1 GP64在BV感染过程中的作用
        1.3.2 GP64 蛋白的三级结构
        1.3.3 GP64 的结构与功能关系
    1.4 研究目的及意义
第二章 GP64 结构域Ⅰ与结构域Ⅴ的结构与功能关系分析
    2.1 材料与设备
        2.1.1 细胞、菌株和质粒
        2.1.2 培养基
        2.1.3 生化试剂及相关溶液
        2.1.4 主要仪器设备
    2.2 实验方法
        2.2.1 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备
        2.2.2 聚合酶链式反应
        2.2.3 目的片段的分离回收
        2.2.4 限制性内切酶酶切反应
        2.2.5 连接反应
        2.2.6 化学法转化
        2.2.7 克隆子的筛选
        2.2.8 质粒DNA的提取
        2.2.9 序列测定和分析
        2.2.10 甘油菌的保存
        2.2.11 GP64 突变体瞬时表达质粒的构建
        2.2.12 瞬时表达质粒转染Sf9 细胞
        2.2.13 蛋白质免疫印迹
        2.2.14 细胞表面酶联免疫吸附
        2.2.15 细胞-细胞融合实验及膜融合活性计算
        2.2.16 半融合及融合孔形成检测
    2.3 结果
        2.3.1 GP64 结构域Ⅰ与 Ⅴ的氨基酸特征分析
        2.3.2 GP64 结构域Ⅰ与 Ⅴ突变体基因的克隆及瞬时表达质粒的构建
        2.3.3 GP64 结构域Ⅰ与 Ⅴ突变体蛋白的表达分析
        2.3.4 GP64 结构域Ⅰ与 Ⅴ突变体蛋白的细胞表面定位分析
        2.3.5 GP64 结构域Ⅰ与 Ⅴ突变体蛋白的膜融合活性分析
        2.3.6 GP64 结构域Ⅰ与 Ⅴ突变体蛋白诱导半融合及融合孔形成分析
        2.3.7 GP64 结构域Ⅰ与 Ⅴ突变体蛋白在低pH条件下的构象变化分析
    2.4 讨论
第三章 GP64 结构域Ⅳ的结构与功能关系分析
    3.1 材料和设备
        3.1.1 材料及试剂
        3.1.2 主要仪器设备
    3.2 方法
        3.2.1 GP64 突变体瞬时表达质粒的构建
        3.2.2 蛋白免疫印迹
        3.2.3 细胞表面酶联免疫吸附
        3.2.4 细胞-细胞融合实验及膜融合活性计算
        3.2.5 半融合及融合孔形成检测
        3.2.6 DH10Bac(gp64~(ko))感受态细胞的制备
        3.2.7 重组病毒bacmid的构建
        3.2.8 病毒bacmid的电击转化
        3.2.9 病毒bacmid转染Sf9 细胞
        3.2.10 病毒感染Sf9 细胞及病毒的扩增
        3.2.11 病毒滴度测定
        3.2.12 病毒生长曲线测定
        3.2.13 病毒与细胞结合及病毒入侵分析
        3.2.14 病毒出芽释放分析
    3.3 结果
        3.3.1 GP64 结构域Ⅳ的氨基酸特征分析
        3.3.2 GP64 结构域Ⅳ突变体的克隆及瞬时表达质粒的构建
        3.3.3 GP64 突变体蛋白结构域Ⅳ的结构分析
        3.3.4 GP64 结构域Ⅳ突变体蛋白的表达分析
        3.3.5 GP64 结构域Ⅳ突变体蛋白的细胞膜表面定位分析
        3.3.6 GP64 结构域Ⅳ突变体蛋白的膜融合活性分析
        3.3.7 GP64 结构域Ⅳ突变体蛋白诱导半融合及融合孔形成分析
        3.3.8 GP64 结构域Ⅳ突变体蛋白在低pH条件下的构象变化分析
        3.3.9 表达GP64 及其突变体基因的重组bacmid的构建
        3.3.10 GP64 结构域Ⅳ氨基酸突变对BV产生的影响分析
        3.3.11 病毒感染条件下GP64 突变体的融合活性及构象变化分析
        3.3.12 E390A,G391A,N381/K389A显着影响病毒入侵
        3.3.13 E390A,G391A,N381/K389A对病毒释放没有显着影响
        3.3.14 GP64 氨基酸保守性替换突变对融合活性及BV产生的影响分析
    3.4 讨论
第四章 总结
    4.1 主要结论
    4.2 展望
    4.3 创新点
参考文献
附录1 克隆GP64 突变体的PCR引物
附录2 杆状病毒GP64 氨基酸序列比对
致谢
作者简介

(6)三种新发再发病毒入侵与组装机制研究(论文提纲范文)

摘要
ABSTRACT
第1章 绪论
    1.1 非洲猪瘟病毒研究背景简介
        1.1.1 非洲猪瘟病毒的分类和流行性分析
        1.1.2 非洲猪瘟病毒的形态和结构特征
        1.1.3 非洲猪瘟病毒的入侵与组装机制简介
        1.1.4 非洲猪瘟病毒粒子蛋白质组成情况简介
        1.1.5 非洲猪瘟病毒疫苗研发前景
        1.1.6 针对大病毒颗粒开发的分块重构算法
    1.2 肠道病毒研究背景简介
        1.2.1 肠道病毒的致病性和分类情况简介
        1.2.2 肠道病毒的基因组及颗粒结构特征
        1.2.3 肠道病毒的生命周期简介
        1.2.4 肠道病毒的脱衣壳机制简介
        1.2.5 B型肠道病毒的功能性受体发现历程
    1.3 黄病毒研究背景简介
        1.3.1 黄病毒分类以及致病性情况简介
        1.3.2 黄病毒基因组及颗粒结构特征简介
        1.3.3 黄病毒的膜融合过程简介
        1.3.4 黄病毒的生命周期简介
        1.3.5 黄热病毒的流行性分析
        1.3.6 黄热病毒的致病机制简介
        1.3.7 黄热病毒的结构研究进展
        1.3.8 黄热病毒疫苗株的作用机理和安全性讨论
第2章 非洲猪瘟病毒组装机制研究
    2.1 前言
    2.2 实验材料
        2.2.1 实验仪器及设备
        2.2.2 商品化耗材及试剂
        2.2.3 实验试剂及配方
        2.2.4 病毒培养细胞系
    2.3 实验方法与步骤
        2.3.1 ASFV的培养与扩增
        2.3.2 ASFV的纯化
        2.3.3 电镜负染检测ASFV病毒粒子的纯度与状态
        2.3.4 ASFV冷冻样品制备
        2.3.5 ASFV颗粒数据收集
        2.3.6 冷冻电镜数据处理和三维重构
        2.3.7 模型和密度图说明
    2.4 实验结果与讨论
        2.4.1 ASFV病毒粒子的培养与纯化
        2.4.2 ASFV冷冻电镜制样与数据处理
        2.4.3 ASFV完整病毒粒子三维结构
        2.4.4 ASFV衣壳整体三维结构
        2.4.5 ASFV主要衣壳蛋白p72的结构特征
        2.4.6 ASFV五邻体蛋白和次要衣壳蛋白的鉴定及结构特征
        2.4.7 ASFV与其他大型DNA病毒的比较
    2.5 小结与展望
第3章 埃可病毒入侵机制研究
    3.1 前言
    3.2 实验材料
        3.2.1 实验仪器及设备
        3.2.2 商品化耗材及试剂
        3.2.3 细胞系
    3.3 实验方法与步骤
        3.3.1 Echo 6的培养与纯化
        3.3.2 Echo 6纯化效果的电镜负染检测
        3.3.3 Echo 6及其受体复合物冷冻制样
        3.3.4 Echo 6及其受体复合物冷冻样品数据收集
        3.3.5 冷冻电镜数据处理
        3.3.6 模型搭建和结构精修
        3.3.7 结构分析与作图
        3.3.8 受体装饰的脂质体制备
        3.3.9 受体装饰的脂质体与Echo 6的孵育实验
    3.4 实验结果与讨论
        3.4.1 Echo 6的纯化与样品检查
        3.4.2 Echo 6与CD55或FcRn的共孵育条件摸索
        3.4.3 Echo 6及其受体复合物冷冻制样、数据收集及结构解析
        3.4.4 Echo 6及其受体复合物的结构剖析
        3.4.5 Echo 6-FcRn以及Echo 6-CD55复合物分子间相互作用分析
        3.4.6 CD55与不同肠道病毒复合物电镜结构比较
        3.4.7 受体装饰的脂质体实验
    3.5 小结与展望
第4章 黄热病毒冷冻电镜结构研究
    4.1 前言
    4.2 实验材料
        4.2.1 实验仪器及设备
        4.2.2 商品化耗材及试剂
        4.2.3 实验试剂及配方
        4.2.4 细胞系
    4.3 实验方法与步骤
        4.3.1 YF_17D的培养与扩增
        4.3.2 YF_17D的纯化
        4.3.3 负染电镜检测YF_17D的纯度和浓度
        4.3.4 YF_17D冷冻制样与数据收集
        4.3.5 YF_17D数据处理
        4.3.6 模型搭建和精修
        4.3.7 热稳定性试验
        4.3.8 黄病毒E和M蛋白的保守性分析
        4.3.9 基于结构的系统进化树分析
    4.4 实验结果与讨论
        4.4.1 YF_17D的纯化和样品检查
        4.4.2 YF_17D冷冻样品制备、数据处理以及模型搭建
        4.4.3 YF_17D成熟病毒颗粒的整体结构
        4.4.4 YF_17D在低pH条件下的颗粒形态
        4.4.5 YF_17DE蛋白组装的相互作用界面分析
        4.4.6 疫苗株YF_17D与野毒株CNYF01的稳定性差异
        4.4.7 YF_17D E蛋白上无糖基化修饰的150-loop的独特构象
        4.4.8 不同黄病毒E蛋白结构比较
    4.5 小结与展望
参考文献
致谢
在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果

(7)和厚朴酚抗疱疹病毒的作用机制研究与STAT3在MHV68感染中的作用分析(论文提纲范文)

摘要
Abstract
第一部分 和厚朴酚抗疱疹病毒的作用机制研究
    第一章 引言
        1.1 和厚朴酚简介
        1.2 和厚朴酚的药理学功能
        1.2.1 和厚朴酚的抗炎反应
        1.2.2 和厚朴酚的抗氧化功能
        1.2.3 和厚朴酚的抗癌功能
        1.2.4 和厚朴酚的神经保护作用
        1.2.5 和厚朴酚抗微生物感染
        1.2.6 和厚朴酚的抗病毒功能
        1.3 和厚朴酚与STAT3 信号通路
        1.4 疱疹病毒简介
        1.4.1 单纯疱疹病毒1
        1.4.2 卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒
        1.4.3 小鼠疱疹病毒68
        1.4.4 疱疹病毒感染的治疗方法
        1.5 研究内容
    第二章 材料与方法
        2.1 细胞株与毒株
        2.1.1 细胞株
        2.1.2 毒株
        2.2 主要器材和商业化试剂
        2.2.1 实验仪器
        2.2.2 普通试剂
        2.3 实验方法
        2.3.1 病毒学操作技术
        2.3.2 细胞支原体检测和清除
        2.3.3 TCID50 测定病毒滴度
        2.3.4 蛋白质样品检测
        2.3.5 细胞全RNA的抽提和反转录
        2.3.6 实时荧光定量PCR
        2.3.7 蛋白与免疫荧光半定量分析
        2.3.8 CCK8 细胞活力检测
        2.3.9 数据统计分析
    第三章 实验结果
        3.1 和厚朴酚能够抑制I型单纯疱疹病毒感染
        3.2 和厚朴酚能够抑制HSV-1的DNA复制和基因表达
        3.3 和厚朴酚对HSV-1 病毒入侵没有影响
        3.4 和厚朴酚抑制HSV-1 病毒的产生
        3.5 和厚朴酚能够增强阿昔洛韦的抗病毒作用
        3.6 和厚朴酚可以抑制卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒的感染
        3.7 和厚朴酚抑制小鼠疱疹病毒68 的感染
    第四章 讨论与展望
        4.1 疱疹病毒感染与治疗
        4.2 和厚朴酚抗疱疹病毒感染
        4.3 和厚朴酚抗病毒研究的不足之处
        4.4 和厚朴酚抗病毒研究展望
    第五章 结论
第二部分 STAT3在MHV68 感染中的作用分析
    第一章 引言
        1.1 信号转导和转录激活因子(STATs)
        1.2 信号转导和转录激活因子3(STAT3)
        1.2.1 STAT3 简介
        1.2.2 STAT3 的结构
        1.2.3 STAT3 信号通路以及调控
        1.2.4 STAT3 的生物学功能
        1.2.5 开发靶向STAT3 的药物治疗
        1.3 小鼠疱疹病毒
        1.4 研究内容
    第二章 材料与方法
        2.1 材料与仪器
        2.1.1 细胞与毒株
        2.1.2 质粒
        2.1.3 抗体
        2.1.4 其他试剂
        2.1.5 主要实验仪器
        2.2 实验方法
        2.2.1 MEF细胞的分离与永生化
        2.2.2 慢病毒转导
        2.2.3 常规微生物操作技术
        2.2.4 常规细胞技术
    第三章 实验结果
        3.1 抑制JAK-STAT3 信号通路可以下调MHV68 的从头感染
        3.2 构建稳定表达STAT3和STAT3C的 MEF细胞系
        3.3 过表达STAT3 能增强MHV68 的感染
        3.4 过表达STAT3 能够上调MHV68 基因的表达
        3.5 过表达STAT3 促进MHV68 重激活
    第四章 讨论与展望
        4.1 STAT3 的激活可以促进MHV68 感染
        4.2 STAT3 过表达会促进MHV68 重激活
        4.3 MHV68 感染不会导致STAT3 持续性激活
        4.4 MHV68 感染与STAT3 的关系研究展望
    第五章 结论
附录Ⅰ 引物列表
附录Ⅱ 缩略词表
参考文献
专业综述:中草药活性成分和厚朴酚研究进展
    参考文献
致谢
个人简历

(8)人成纤维细胞N-连接糖基化在人巨细胞病毒感染进程中的作用及机制研究(论文提纲范文)

中文摘要
英文摘要
第一部分 去N-糖基化预处理所致的成纤维细胞N-糖缺失抑制hCMV早期感染进程
    (一)前言
    (二)材料和方法
        1.材料
        1.1 细胞
        1.2 主要试剂
        2.实验仪器
        3.主要溶液配制
        4.实验方法
    (三)结果
        1.去N-糖基化预处理降低人成纤维细胞的N-糖表达
        2.人成纤维细胞N-糖缺失抑制h CMV的感染
    (四)讨论
    (五)结论
    参考文献
第二部分 成纤维细胞N-连接糖基化介导hCMV侵入及其机制研究
    (一)前言
    (二)材料和方法
        1.材料
        1.1 细胞
        1.2 主要试剂
        2.实验仪器
        3.主要溶液配制
        4.实验方法
    (三)结果
        1.人成纤维细胞N-连接糖基化介导hCMV侵入
        2.人成纤维细胞hCMV受体表面N-糖链介导hCMV侵入
    (四)讨论
    (五)结论
    参考文献
第三部分 衣霉素通过干预成纤维细胞N-糖合成系统抑制hCMV的复制和释放
    (一)前言
    (二)材料和方法
        1.材料
        1.1 细胞
        1.2 主要试剂
        2.实验仪器
        3.主要溶液配制
        4.实验方法
    (三)结果
        1.TM处理所致的成纤维细胞N-糖缺失抑制hCMV复制
        2.TM处理所致的成纤维细胞N-糖缺失抑制hCMV释放进程
    (四)讨论
    (五)结论
    参考文献
综述
    参考文献
攻读学位期间发表文章情况
致谢

(9)嗜神经病毒神经嗜性和毒性比较(论文提纲范文)

摘要
Abstract
缩略语表
第一章 文献综述
    1.1 神经环路解析的重要示踪工具
        1.1.1 疱疹病毒
        1.1.2 狂犬病毒
        1.1.3 水泡性口炎病毒
        1.1.4 逆转录病毒
        1.1.5 腺相关病毒
        1.1.6 腺病毒
        1.1.7 森林脑炎病毒和辛德毕斯病毒
    1.2 嗜神经病毒在神经环路研究中的优势及应用
    1.3 嗜神经病毒在环路研究中的弊端
第二章 本研究的目的与意义
第三章 材料和方法
    3.1 试验材料
        3.1.1 病毒、菌株、细胞和实验动物
        3.1.2 载体与质粒
        3.1.3 工具酶及主要试剂
        3.1.4 细胞培养产品
        3.1.5 实验设备
        3.1.6 相关软件
        3.1.7 培养基及缓冲液的配制
    3.2 实验方法
        3.2.1 质粒的构建
        3.2.2 细胞系传代
        3.2.3 病毒制备方法
        3.2.4 免疫组织化学实验
        3.2.5 小鼠脑部神经环路标记及鉴定
        3.2.6 鼠脑脑区的图像配准、计数和统计分析
        3.2.7 小鼠神经元的单细胞分离
        3.2.8 单细胞转录组建库测序
        3.2.9 鼠脑组织测序
第四章 示踪病毒神经嗜性比较
    4.1 逆向跨多级示踪病毒神经嗜性比较
        4.1.1 CVS-B2c-EGFP病毒的扩增
        4.1.2 PRV-152 病毒的扩增浓缩
        4.1.3 CVS-B2c-EGFP和 PRV-152 多级环路标记比较
    4.2 单级逆向示踪病毒神经嗜性比较
        4.2.1 逆向单级示踪病毒PRV-?TK-NLS-EGFP构建
        4.2.2 RABV逆向单级标记病毒的扩增和浓缩
        4.2.3 rAAV2-retro-YFP、SAD-?G-GFP脑内环路标记差异
        4.2.4 表达Cre重组酶的示踪病毒神经嗜性比较
        4.2.5 rAAV2-retro-Cre和 SAD-?G-EGFP混合注射进行环路标记
    4.3 本章小结
第五章 病毒神经嗜性差异的机制探索
    5.1 TVA的表达能够增强EnvA假包装RAVB神经嗜性
    5.2 单细胞测序分析造成病毒神经嗜性差异的分子机制
        5.2.1 神经元单细胞分离方法的建立
        5.2.2 病毒标记神经元的转录组测序
        5.2.3 病毒标记神经元类型分析
        5.2.4 已报道的RABV潜在受体在两种病毒标记神经元的表达分析
        5.2.5 造成病毒嗜性差异的膜蛋白的初步筛选
    5.3 本章小结
第六章 嗜神经病毒对脑组织的毒性比较
    6.1 rAAV2-retro和 SAD-?G对标记组织基因表达谱的影响
    6.2 rAAV2-retro和 SAD-?G标记组织内小胶质细胞的激活
    6.3 SAD-?G影响下丘脑催产素的表达
    6.4 本章小结
第七章 嗜神经病毒在神经环路标记中的应用
    7.1 绘制LHA的神经环路输入网络
    7.2 二级输入环路示踪
    7.3 本章小结
第八章 讨论
    8.1 嗜神经病毒神经嗜性差异
    8.2 嗜神经病毒神经嗜性差异分子机制探索
    8.3 嗜神经病毒标记工具毒性
    8.4 嗜神经病毒在环路标记中的综合应用
参考文献
致谢
附录

(10)HVEM在单纯疱疹病毒1型感染中的作用研究(论文提纲范文)

摘要
Abstract
前言
    HSV-1 概述及其主要生物学特性
    HSV-1 的结构及生物学特征
    HSV-1 进入宿主细胞的过程
    HSV-1 感染与宿主免疫应答
    HVEM 受体与其配体
    HSV-1 突变株M3
    研究思路及技术路线
第一章 HSV-1经不同途径感染HVEM~(-/-)小鼠的研究
    1 实验材料与方法
        1.1 材料
        1.1.1 实验动物
        1.1.2 病毒和细胞
        1.1.3 引物
        1.1.4 主要试剂
        1.1.5 主要仪器和耗材
        1.1.6 主要溶液及配制
        1.2 方法
        1.2.1 构建基因敲除小鼠
        1.2.2 细胞培养
        1.2.3 病毒培养
        1.2.4 病毒载量检测标准品制备
        1.2.5 小鼠的病毒感染
        1.2.6 小鼠感染后的临床症状观察
        1.2.7 组织病理分析
        1.2.8 组织病毒载量的检测
        1.3 数据分析软件和数据库
    2 结果与分析
        2.1 McKrae感染HVEM~(-/-)和C57BL/6小鼠后的临床表现
        2.2 McKrae感染HVEM~(-/-)6和C57BL/小鼠后的组织病理分析
        2.3 McKrae感染C57BL/6和HVEM~(-/-)小鼠后的组织病毒载量分析
    3 讨论
第二章 HSV-1感染后树突状细胞的转录组学分析
    1 实验材料与方法
        1.1 材料
        1.1.1 引物
        1.1.2 主要试剂
        1.1.3 主要仪器及耗材
        1.2 方法
        1.2.1 脾脏树突状细胞的分离纯化
        1.2.2 细胞总RNA的提取
        1.2.3 Smart-seq测序检测
        1.2.4 Smart-seq数据分析
        1.3 数据分析软件和数据库
    2 结果与分析
        2.1 感染McKrae后树突状细胞相关基因的表达差异分析
        2.1.1 HVEM~(-/-)小鼠和C57BL/6小鼠差异基因总体情况
        2.1.2 HVEM~(-/-)小鼠和C57BL/6小鼠差异基因GO富集分析
        2.1.3 HVEM~(-/-)小鼠和C57BL/6小鼠差异基因KEGG分析
        2.1.4 HVEM~(-/-)小鼠和C57BL/6小鼠差异基因Pathway分析
        2.2 Smart-seq测序分析结果的验证
    3 讨论
第三章 HVEM在HSV-1感染中的作用研究
    1 实验材料与方法
        1.1 材料
        1.1.1 病毒
        1.1.2 抗原多肽
        1.1.3 主要试剂和商品化溶液
        1.1.4 主要仪器
        1.1.5 主要耗材
        1.2 方法
        1.2.1 小鼠的免疫和病毒感染
        1.2.2 特异性刺激T细胞的ELISpot检测
        1.2.2.1 小鼠脾脏淋巴细胞分离
        1.2.2.2 特异性刺激T细胞的ELISpot布板
        1.2.2.3 特异性刺激T细胞的ELISpot显色反应
        1.2.3 中和抗体检测
    2 结果与分析
        2.1 突变株M3诱导HVEM~(-/-)小鼠与C57BL/6小鼠的免疫反应
        2.2 突变株M3免疫后HVEM~(-/-)小鼠与C57BL/6小鼠组织病毒载量
        2.3 McKrae感染突变株M3免疫HVEM~(-/-)小鼠与C57BL/6小鼠后的临床表现
        2.4 McKrae感染突变株M3免疫HVEM~(-/-)小鼠与C57BL/6小鼠后的组织病理变化
        2.5 McKrae感染突变株M3免疫HVEM~(-/-)小鼠与C57BL/6小鼠后的组织病毒载量
        2.6 McKrae感染突变株M3免疫HVEM~(-/-)小鼠与C57BL/6小鼠后诱导的免疫反应
    3 讨论
总结
参考文献
论文综述 HVEM在单纯疱疹病毒I型眼部感染中的研究
    参考文献
缩略词表
致谢
研究生个人简历

四、PARTICLES OBSERVED ON THE SURFACE OF CELLS INFECTED WITH HERPESVIRUSES(论文参考文献)

  • [1]抗沙粒病毒小分子药物的高通量筛选及Ⅰ型疱疹病毒感染细胞的蛋白质组学研究[D]. 万伟玮. 中国科学院大学(中国科学院武汉病毒研究所), 2020(02)
  • [2]人类疱疹病毒8型潜伏感染树鼩动物模型的建立及环境影响研究[D]. 李道群. 昆明理工大学, 2019(06)
  • [3]基于病毒全蛋白组序列筛选T细胞表位研发新型寨卡病毒T细胞疫苗[D]. 郑智航. 中国科学院大学(中国科学院上海巴斯德研究所), 2020(08)
  • [4]抗单纯疱疹病毒包膜糖蛋白中和抗体的筛选鉴定及其中和效果评估[D]. 邹依地. 厦门大学, 2019(10)
  • [5]苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒GP64蛋白的结构与功能关系研究[D]. 于乾龙. 西北农林科技大学, 2019
  • [6]三种新发再发病毒入侵与组装机制研究[D]. 刘升. 中国科学技术大学, 2020(01)
  • [7]和厚朴酚抗疱疹病毒的作用机制研究与STAT3在MHV68感染中的作用分析[D]. 李龙. 中国科学院大学(中国科学院上海巴斯德研究所), 2019(07)
  • [8]人成纤维细胞N-连接糖基化在人巨细胞病毒感染进程中的作用及机制研究[D]. 郑路平. 大连医科大学, 2019(04)
  • [9]嗜神经病毒神经嗜性和毒性比较[D]. 孙乐强. 华中农业大学, 2018(01)
  • [10]HVEM在单纯疱疹病毒1型感染中的作用研究[D]. 程继帅. 北京协和医学院, 2020(05)

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在感染疱疹病毒的细胞表面观察到的颗粒
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