一、Epstein-Barr病毒膜抗原在昆虫细胞sf9中的表达、纯化及其免疫原性（论文文献综述）
李睿[1]（2018）在《基于EB病毒潜伏期膜蛋白的鼻咽癌诊治用单克隆抗体的筛选研究》文中指出鼻咽癌是我国的高发恶性肿瘤之一,发病率居耳鼻咽喉部位恶性肿瘤之首。因发病部位解剖结构复杂,鼻咽癌一般不适合手术,而是首选放射治疗。目前放射治疗对早期鼻咽癌患者的治愈率己高达90%以上,但由于早期筛查方法的局限性,大部分鼻咽癌确诊患者已发展到临床中晚期,常伴发远端转移;另外,部分鼻咽癌患者在放射治疗后容易复发。总之,此类临床晚期、转移性或复发性的鼻咽癌严重拉低患者的五年生存率。因此,探索更高效特异的鼻咽癌诊治用的生物靶标日渐成为重要的鼻咽癌研究方向。鼻咽癌与EBV关系密切,在鼻咽癌患者中EBV以II型潜伏态存在,表达一种核心蛋白EBNA1和两种重要的膜蛋白LMP1和LMP2。其中,LMP1和LMP2作为主要的癌蛋白,被认为与鼻咽癌的发生发展密切相关。自90年代起,许多研究人员己提出LMP1和LMP2可作为重要的鼻咽癌诊治用靶标蛋白,但至今未能在临床中获得有效应用。本研究拟以LMP1和LMP2作为研究对象,通过免疫原制备探索和特异性单克隆抗体的筛选鉴定,以期获得适合鼻咽癌诊治用的特异性抗体,为LMPs作为鼻咽癌诊治靶标的探索提供科学依据。本论文的第一部分旨在利用小鼠单克隆抗体筛选平台,从免疫原制备方式比较、免疫佐剂和免疫方案组合比较、抗体筛选方法比较以及抗体性能评价等方面探索LMPs相关鼻咽癌特异性诊治抗体的筛选策略。首先,通过LMPs的氨基酸序列分析确定出LMP1和LMP2各胞外区的氨基酸序列组成,采用多肽化学合成、多肽串联原核表达、全序列昆虫细胞真核表达、全序列哺乳动物细胞表达等不同方式制备出一系列LMPs免疫原,发现LMPs胞外区序列的疏水性严重影响合成肽的合成质量和重组抗原的活性。其次,利用上述制备的LMPs抗原,结合弗氏佐剂、铝佐剂、CpG佐剂以及多糖类、小分子激动剂等免疫佐剂,设计了多种免疫方案进行小鼠免疫,通过常规ELISA和条带Western Blot评价不同免疫方案下的LMPs特异性抗体应答效果,发现合成肽SPL1-3偶联组和有目的抗原表达的全细胞免疫组能诱导出LMPs特异性抗体应答,但不同免疫佐剂的免疫应答比较未见显着差异。再次,比较了全细胞裂解液和膜蛋白包被ELISA与细胞ELISA、ELISPOT以及基于多肽的流式分选等不同筛选方法,发现基于多肽的B细胞分选特异性较差,而细胞ELISA检测灵敏度高且操作方便,是适合细胞膜抗原高通量抗体筛选的最佳筛选策略。最后,对筛选到的98株LMPs抗体进行性质鉴定和应用探索,发现4株LMP1胞内区特异性单抗具有良好的天然抗原结合能力,其识别表位为首次报道;组织学分析显示anti-LMP1单抗9F2和anti-LMP2单抗3A7在免疫组化检测中有良好的灵敏度和特异性,有望成为鼻咽癌临床组织学诊断新工具;另外,发现单抗9F2转染入胞后能显着降低LMP1阳性细胞内NF-κB水平,对细胞的生长具有一定的抑制作用,显示出潜在的治疗价值。据报道,兔单抗与小鼠单抗相比,其识别的表位更加丰富,对于多肽或小分子等低免疫原性的抗原具有更好的识别能力。鉴于LMPs抗原在小鼠中的免疫原性较弱,本研究的第二部分工作旨在建立一个高效的兔单抗筛选平台,探索LMPs在实验兔中的抗体应答情况,为筛选更好的LMPs特异性单抗奠定基础。首先,确定了兔B细胞群的流式细胞分选方案。第二,构建了兔B细胞的单细胞PCR方法,抗体的轻重链基因扩增成功率为60-100%。第三,建立了兔B细胞体外刺激培养方法和最佳的兔B细胞体外培养条件,在该条件下兔B细胞体外培养阳性率（OD值>0.5）平均为38.75%。第四,构建了兔单抗体外重组表达载体pRVRCH/pRVRCL,可满足兔抗体基因在HEK293表达系统中的高效表达。第五,基于此技术平台,分别制备了特异识别戊肝病毒和轮状病毒的两种兔单克隆抗体,验证了兔单抗筛选平台的可行性,并发现实验兔较实验鼠表现出免疫应答速度更快、滴度更高,倾向于产生更高的亲和力的抗体的优越性。最后,本研究利用兔单抗筛选平台对LMPs特异性抗体应答进行了初步探索,结果显示细胞抗原和LMP2A的N端重组抗原能够在实验兔中产生明显的抗体应答,尤其是重组抗原在实验兔中的抗体应答滴度较其在实验鼠中的应答滴度提升10-100倍,为进一步筛选LMPs兔单抗奠定坚实基础。综上所述,本论文针对EB病毒潜伏期膜蛋白LMP1和LMP2的胞内和胞外区特异性抗体的筛选策略进行了全面的探索,成功获得了具有应用潜力的胞内区抗体,证实LMPs特定的合成肽和有目的抗原表达的全细胞抗原可以在小鼠体内诱导出针对LMPs膜外区的抗体应答,建立了高效的兔单克隆抗体筛选和表达平台,为LMPs相关鼻咽癌特异性诊治抗体的开发奠定了基础。
刘展,周为民,谷淑燕[2]（1996）在《Epstein-Barr病毒膜抗原在昆虫细胞sf9中的表达、纯化及其免疫原性》文中进行了进一步梳理将Epstein-Barr（EB）病毒膜抗原基因（EBV-MA）称MA1和截去穿膜区的MA基因称MA2分别插入杆状病毒表达载体pVL-941。将两种重组质粒分别与杆状病毒DNA共转染sf9细胞后获得Baculo-MA1和Baculo-MA2两种重组病毒,表达产物分别位于重组病毒感染的细胞表面或释放到细胞培养液中。免疫荧光方法检查,在感染的细胞表面表达产物与抗MA的单克隆抗体特异性地结合,SDS-PAGE显示其分子量约220kD和150kD两条带,在Baculo-MA2感染的细胞培养液中仅含220kD的蛋白。薄层扫描表明MA表达量至少占细胞总蛋白量的30%。经DEAE-Sepharose FF和Sephacryl S300 HR纯化,SDS-PAGE检测其纯度可达90%以上。经纯化的MA1和MA2分别免疫小鼠,免疫血清与B95-8细胞膜上存在的EB病毒特异的膜抗原反应,并证明具有中和抗体活性。检测某些细胞免疫指标结果表明,经MA免疫的小鼠产生特异性的ADCC活性,提高NK活性。经纯化的MA在体外能促进T细胞增殖。
李晓楠[3]（2010）在《手足口病新型疫苗的初步研究》文中研究表明手足口病（Hand,foot and mouth disease,HFMD）是由肠道病毒感染引起的一种病毒性疾病,主要病原体为新肠道病毒71型（Enterovirus 71,EV71）和柯萨奇A16型（Coxsackie A16,CA16）,EV71感染常常引发严重的中枢神经系统疾病并发症,CA16是引起心肌炎和心包炎等疾病的主要病原体。目前尚无有效治疗HFMD的药物,疫苗成为防控HFMD暴发最有效的手段之一,因此,研发安全、有效的HFMD疫苗势在必行。本文采用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）克隆EV71（中国安徽阜阳株Genbank----FJ607337）VP1和CA16（中国山东株Genbank----GQ253390）VP1基因,构建重组pFastBac HT A-EV71 VP1、pFastBac HT A-CA16 VP1和pFastBac HT B-Mel-EV71 VP1-CA16 VP1质粒,将各重组质粒转化至感受态细胞（DH10）,获得各重组Bacmid DNA转染至昆虫细胞（Sf9）,应用杆状病毒昆虫表达系统（Bacterium to Baculovirus,Bac-to-Bac）表达或分泌表达各重组蛋白,采用Ni2+离子亲和层析柱纯化各重组病毒表达产物;依据昆虫细胞偏爱密码子优化EV71 P1和EV71 3CD基因克隆至表达载体pFastBac Dual多角体蛋白启动子pPh和pP10上,构建重组pFastBac Dual EV71 P1-3CD质粒,将重组质粒与Bacmid同源重组,转染至Sf9,在Bac-to-Bac系统中利用病毒编码蛋白酶3CD切割核衣壳病毒结构蛋白P1,组装并用蔗糖密度梯度离心纯化EV71病毒样颗粒（Virus Like Particles,VLPs）;经免疫细胞化学法证实各目的蛋白在Sf9中的表达;将制备的重组单价蛋白疫苗,腹腔、滴鼻免疫Balb/c小鼠,检测免疫应答水平,取得如下结果:1.所克隆的各DNA片段均与Genbank中的相应DNA序列一致,重组EV71 VP1、CA16 VP1蛋白在Sf9中均获得表达,得到纯化重组蛋白浓度分别为0.318mg/mL和0.412mg/mL,纯度均>90%。2.重组EV71 VP1和CA16 VP1单价蛋白最佳抗原免疫剂量均为20μg;腹腔注射组中,小鼠血清特异性IgG抗体效价分别为875.43和1588.95,中和抗体效价分别为282.84和250.00,抗体亚型分布均以IgG1和IgG2b为主;CD4+/CD8+比值与对照组差异显着（P<0.05）,小鼠T淋巴细胞增殖能力增强,脾细胞IL-4分泌数量>IFN-γ分泌数量（P<0.05）;鼻腔和小肠灌洗液sIgA抗体与PBS组差异不显着（p>0.05）;重组单价蛋白疫苗均可激发一定水平的体液免疫和细胞免疫,不能诱导粘膜免疫应答,以体液免疫应答为主。3.滴鼻免疫EV71 VP1组和CA16 VP1组血清IgG效价分别为278.54和211.66,鼻腔灌洗液sIgA抗体分别为64.31和54.22,小肠灌洗液sIgA抗体分别为15.98和13.55,脾细胞中sIgA-ASCs数量增多,重组单价蛋白疫苗可诱导体液免疫应答和一定水平的粘膜免疫应答。4.利用Bac-to-Bac系统分泌表达了EV71 VP1-CA16 VP1融合蛋白,得到纯化重组蛋白浓度为0.516mg/mL,纯度>90%。5.经昆虫密码子优化的EV71 P1和EV71 3CD基因,利用Bac-to-Bac系统成功组装了EV71 VLPs,纯化了EV71 VLPs的浓度为0.817mg/mL,纯度>90%。结论:制备了重组EV71 VP1和CA16 VP1单价蛋白疫苗,在它们免疫的小鼠模型中,免疫两次均能够产生较好的体液免疫应答,也能产生一定的细胞免疫和粘膜免疫应答;构建、表达和纯化了重组EV71 VP1-CA16 VP1二价融合蛋白和EV71 VLPs。因此,本实验结果为HFMD疫苗的深入研究奠定了基础。
王硕[4]（2020）在《杆状病毒系统可溶性高效表达PCV2Cap蛋白和PCV3 Cap蛋白及其免疫原性研究》文中认为猪圆环病毒（Porcine circovirus,PCV）可侵害断奶仔猪和育肥猪并能够引发多种与猪圆环病毒相关的疾病,是当前世界养猪业的巨大威胁,严重影响着养猪业的发展与进步。随着研究发现,病毒的各个血清型对猪体的抗原性、致病性以及基因同源性存在着及其明显的差异,因此人们将猪圆环病毒划分成猪圆环病毒1型（Porcine circovirus 1,PCV1）、猪圆环病毒2型（Porcine circovirus 2,PCV2）以及猪圆环病毒3型（Porcine circovirus 3,PCV3）三种基因型。已知PCV1无致病性,而PCV2有较强的致病性,是造成猪圆环病毒相关性疾病（Porcine circovirus-as sociated diseases,PCVADs）的主要病原,其中危害最严重的是断奶仔猪多系统衰竭综合征（Postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS）,该病在我国乃至世界猪群中广泛存在,已成为一种常见病和多发病。PCV3感染可引发猪的皮炎肾病综合征、母猪繁殖障碍等,患病仔猪出现多系统炎症反应,导致器官功能紊乱,严重影响全世界的生猪养殖业的发展。由于PCV2与PCV3的衣壳蛋白氨基酸同源性低至30%,两种病毒间几乎不存在交叉免疫保护。目前,仍没有可同时预防和控制PCV2与PCV3的疫苗和药物。本研究将PCV2与PCV3的Cap蛋白利用杆状病毒表达系统融合表达,不仅有助于PCV2与PCV3的疫苗的研制,还可为研制诊断试剂盒提供蛋白。利用该系统同时表达PCV2 Cap蛋白与PCV3 Cap蛋白,并进行后续纯化及疫苗的研制,比传统方式更加安全有效,为病毒引起的相关疾病的控制和预防PCV的感染具有重要的意义。本研究共分为以下几个方面:2013-2018年山东省猪圆环病毒2型的遗传演化分析:为揭示近年来PCV2在山东省遗传演化情况,分析PCV2代表性优势毒株,为政府防控决策做进一步参考。我们分析了2013年至2018年在山东省上传到GenBank的40个PCV2基因组全序,使用MEGA V5.0软件构建全基因组进化树。系统进化树分析表明,山东省PCV2基因型的演化情况为:3种基因型共存（2a,2b,2d）,发现目前PCV2d为主要流行毒株。通过对不同基因型ORF2编码的氨基酸序列分析,发现不同基因型中存在特定的氨基酸位点,主要分布在ORF2编码的81–160位氨基酸之间。PCV2 Cap蛋白与PCV3 Cap蛋白在杆状病毒表达系统中的表达:利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统同时表达PCV2Cap和PCV3 Cap,并在重组序列前段加上一段蜂素信号肽序列便于其分泌表达。选用双启动子表达重组杆状病毒,间接免疫荧光结果显示重组杆状病毒能分别与鼠抗PCV2 Cap和鼠抗PCV3 Cap单抗特异性结合;基因组PCR鉴定结果显示,已成功扩增出与相应目的片段大小相符的特异性产物;Western-Blot鉴定可见分子量为70kD左右的蛋白条带;本实验运用杆状病毒表达系统成功表达出PCV2 Cap和PCV3 Cap蛋白,为表达融合蛋白提供新方法。重组杆状病毒的高效表达:将表达条件进行优化以促进重组蛋白高效表达。根据测定的P4代重组杆状病毒滴度结果,并分别以MOI=1,0.5,0.1感染sf9细胞,设置24h、48h、72h、96h、120h五个时间段来收获病毒液。经过实验优化后的融合蛋白获取条件为:MOI=0.1接种2.5×106个/mL的sf9细胞,接种后4天收获融合蛋白,平均表达量可达0.7mg/mL,最高表达量可达0.85mg/mL。该方法能够简单高效的表达PCV2 Cap和PCV3 Cap融合蛋白,是目前其他方法的表达量的2-8倍,极大的增加了表达效率,为进一步研制和生产PCV2、PCV3二联亚单位疫苗建立了良好的理论基础。
魏玉荣[5]（2016）在《新疆非禽类野生动物流感抗体调查与流感病毒样颗粒疫苗研究》文中研究说明A型流感病毒是真正人畜共患病原并具有高度传染性。尽管A型流感病毒有着严格的宿主范围,但是跨种传播时有发生。近年来除了人可被禽流感H5N1、H9N2和H7N9病毒感染外,还有多种动物被流感病毒感染的报道,并从猫、果子狸、老虎、狮子和红狐中分离到H5N1禽流感病毒。野生鸟类被看作是A流感病毒的主要携带者,随着其长距离跨境迁徙潜在传播并扩散病毒。新疆位于候鸟东非-西亚迁徙线,境内栖息着大量鸟类和非禽类野生动物。由于野生动物和这些迁徙的鸟类共享栖息地,野生动物存在被流感病毒感染的风险。鉴于动物流感的严重危害性及野生动物携带流感病毒的潜在威胁性,本研究中利用血凝抑制试验（HI）和竞争ELISA（c-ELISA）方法调查了新疆非禽类野生动物中流感H5、H7和H9亚型的暴露现状,为野生动物流感防控提供数据资料。A型流感病毒通过突变、重配和重组不断地适应着新宿主,疫苗是预防其暴发流行的有效手段。病毒样颗粒（virus-like particle,VLP）可通过其结构蛋白自我组装出芽形成病毒粒子,结构模拟病毒自身但是不能自我复制,确保了安全性及免疫原性。同时,因流感VLPs不依赖于鸡胚而被视为流感疫苗候选者。目的:本研究以流感病毒为研究对象,调查新疆部分非禽类野生动物中禽流感血清学数据,并利用家蚕及Bac-to-Bac杆状病毒表达系统构建流感VLPs研究其免疫原性,为流感储备疫苗研究提供数据参考。（1）了解新疆非禽类野生动物禽流感暴露现状;（2）探索以家蚕作为生物反应器生产流感VLPs;（3）探索Bac-to-Bac杆状病毒表达系统制备流感新型储备疫苗;（4）评估流感嵌合病毒样颗粒（cVLPs）免疫原性。方法:（1）采用HI及c-ELISA方法对2009年2013年采集的246份野生动物（盘羊、岩羊、鹅喉羚、牦牛、野猪、马鹿、狼、北山羊及狍子）血清样品进行禽流感病毒H5、H7及H9亚型的血清学调查。（2）构建家蚕重组杆状病毒rBmNPV（HA-M1-NA）,感染家蚕5龄幼虫及蚕蛹,经血凝抑制试验、电镜观察、小鼠免疫试验及攻毒保护评价家蚕杆状病毒表达流感VLPs免疫原性。（3）利用Bac-to-Bac表达系统构建重组杆状病毒AcMNPV（HA-M1-NA）,感染昆虫细胞Sf 9,经western blotting及免疫荧光检测目的蛋白表达、电镜观察流感VLPs、小鼠免疫后检测T细胞增殖及测定细胞因子浓度,评价Bac-to-Bac表达系统构建重组流感VLPs免疫原性。（4）将纤毛蛋白基因fliC通过基因合成嵌合于流感病毒HA基因中构建流感cVLPs,经western blotting及免疫荧光检测目的蛋白表达、电镜观察流感病毒样颗粒、小鼠免疫后检测IgG水平和测定细胞因子浓度及攻毒试验,评价流感病cVLPs免疫原性。结果:（1）新疆部分非禽类野生动物禽流感血清学调查:HI检测结果显示4.47%血清样品流感抗体阳性;狼和盘羊血清样品H7亚型抗体阳性率分别为9.09%和4.55%;鹅喉羚、狼、岩羊和盘羊血清样品H9亚型抗体阳性率分别为2.27%,27.27%,23.08%和4.55%。c-ELISA结果显示4.88%血清样品流感抗体阳性;鹅喉羚、狼、岩羊和盘羊血清阳性率分别为6.82%,36.36%,23.08%和9.09%。马鹿、野猪、北山羊、狍子和牦牛血清样品中禽流感H5、H7及H9亚型抗体均为阴性。（2）家蚕及蚕蛹能正确表达并组装具有血凝活性的流感病VLPs,获得的流感VLPs免疫小鼠之后,可诱导小鼠产生特异性抗体;攻毒保护试验结果表明获得的流感颗粒具有较强的免疫原性;肌注免疫途径效果最佳。（3）利用Bac-to-Bac表达系统成功构建重组杆状病毒AcMNPV（HA-M1-NA）,感染昆虫细胞Sf 9之后,细胞能够正确表达流感病VLPs,该VLPs免疫小鼠能诱导T细胞活化,血清中可检测到高浓度的IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ细胞因子,表明Bac-to-Bac/IC系统表达的流感VLPs可诱导Th1和Th2型免疫反应。（4）重组杆状病毒AcMNPV-HA-fliC-NA-M1,感染昆虫细胞Sf 9之后,细胞能够表达并正确组装流感cVLPs,该cVLPs免疫小鼠可诱导T细胞活化;血清中可检测到高浓度的IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ细胞因子;cVLP免疫小鼠血清中有较高水平IgG抗体,且IgG抗体亚型分布以IgG1和IgG2b为主;攻毒保护试验结果表明获得的流感cVLPs具有异源异型交叉保护性。结论:（1）一定比例新疆非禽类野生动物曾感染过禽流感病毒。鹅喉羚、狼、岩羊和盘羊血清样品H9亚型抗体阳性;狼和盘羊血清样品H7亚型抗体阳性;马鹿、野猪、北山羊、狍子和牦牛血清样品H5、H7及H9亚型抗体均为阴性。（2）家蚕杆状病毒表达系统能够表达并组装有血凝活性的流感VLPs;该VLPs免疫小鼠后可诱导产生特异性抗体;攻毒保护试验表明其具有较强的免疫原性;肌注免疫途径效果最佳。（3）Bac-to-Bac杆状病毒表达系统能表达并正确组装出具有较强免疫原性的流感VLPs,该VLPs可诱导免疫小鼠机体产生Th1和Th2型免疫反应。（4）成功制备流感cVLPs且具有较强的免疫原性,可诱导小鼠T细胞活化,血清中有高浓度的IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ细胞因子及IgG抗体。攻毒保护试验结果表明cVLPs具有异源交叉保护性。
王曼[6]（2014）在《人类肠道病毒71型与EB病毒疫苗候选抗原在毕赤酵母中的表达及免疫原性研究》文中研究表明甲基营养型毕赤酵母是目前应用最为广泛的外源蛋白表达系统之一,该表达系统具有产量高,操作简单,表达稳定及成本低等优点。毕赤酵母还具有蛋白翻译后修饰加工系统,非常适合作为真核生物蛋白的大规模生产平台。本论文主要采用毕赤酵母系统表达人肠道病毒EV71和EB病毒（Epstein-Barr virus）疫苗候选抗原,并进一步研究候选抗原的免疫原性。EV71是手足口病的主要致病原之一,能引起儿童患者严重神经系统疾病甚至死亡。由于EV71感染性强且致病率高,EV71病毒已导致手足口病疫情多次爆发。然而目前仍缺乏有效的抗病毒药物与预防疫苗。研究表明EV71衣壳蛋白VP1具有较强的免疫原性：重组VP1能够有效诱导中和抗体产生,并保护新生小鼠免于病毒致死性感染。因此VP1蛋白是具有潜力的EV71疫苗候选抗原。EBV是常见的感染人类B细胞的γ疱疹病毒,能在95%以上人群中进行慢性潜伏感染。EBV是感染性单核细胞增多症的致病原,能够诱发淋巴及上皮肿瘤。EBV的致癌性使得EBV疫苗的研制工作尤为紧迫与必要。目前EBV治疗型疫苗研究主要集中于EBV核抗原1（EBNA1）上,而预防型疫苗则主要以EBV包膜蛋白gp350为研究重点。EBNA1是在所有EBV相关恶性肿瘤中唯一表达的病毒蛋白,并在EBV潜伏感染过程中具有重要作用。研究表明EBNA1特异T细胞能够有效杀伤EBV阳性肿瘤细胞,因此EBNA1被认为是EBV相关恶性肿瘤免疫治疗的候选抗原。gp350在病毒感染过程中具有重要作用,gp350与B淋巴细胞表面2型补体受体（CR2）结合介导病毒进入和感染靶细胞。大量研究表明gp350是中和抗体的首要靶标,为EBV预防型疫苗的首要候选抗原。本论文在毕赤酵母中成功表达了VP1, EBNA1和gp350,并取得了创新性成果,研究结果主要分为以下三个部分：1.将密码子优化EV71衣壳蛋白VP1序列插入到真核表达载体中,然后将重组表达载体转化至毕赤酵母中进行诱导表达；成功获得分泌表达的重组VP1蛋白,并通过Ni-NTA亲和层析法,从培养上清中分离得到纯化VP1蛋白。以小鼠为研究对象,检测重组VP1蛋白的免疫原性及抗病毒效果。实验结果显示重组VP1能够诱导小鼠产生高水平VP1特异抗体,体外中和实验证明这些抗体具有中和EV71病毒活性。新生小鼠被动保护实验进一步证实VP1疫苗的预防保护效果。此外,VP1还能刺激淋巴细胞增殖与Th1型免疫应答反应。综上所述,毕赤酵母表达的VP1蛋白具有较好的免疫原性,能够有效诱导抗病毒抗体产生并激活免疫系统,因此重组VP1具有开发为EV71亚单位疫苗的潜力。2.通过生物信息学分析发现EBNA1抗原表位主要位于蛋白C端结构域,因此选定EBNA1截短体（ElΔGA,390-641位氨基酸）作为EBV治疗型疫苗候选抗原。通过对ElΔGA序列密码子进行优化,构建真核表达载体,并将重组载体转化至毕赤酵母中进行诱导表达。SDS-PAGE和Western杂交结果显示在毕赤酵母系统中成功表达重组ElΔGA,采用Ni-NTA亲和层析法从酵母培养上清中高效纯化ElΔGA蛋白。将纯化的ElΔGA蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠以获得多克隆抗体,Western杂交结果显示小鼠多克隆抗体能够特异识别B95-8细胞裂解液中EBNA1蛋白。重组ElΔGA能够刺激T淋巴细胞增殖和Thl型免疫应答反应,同时诱导免疫小鼠脾脏和外周血中CD4+T和CD8+T细胞显着增多。这些实验结果表明毕赤酵母表达的ElΔGA具有较强免疫原性,具有开发为EBV相关恶性肿瘤候选疫苗的潜力。3.抗原表位分析发现,gp350蛋白N端结构域含有关键中和表位,具有开发为EBV候选疫苗的潜力。在毕赤酵母系统中成功表达密码子优化的gp350蛋白N端1-443位氨基酸肽段,重组蛋白可通过一步亲和层析法得到有效纯化。本研究为重组gp350蛋白大规模生产及其抗病毒活性深入研究奠定基础。在本论文中,使用毕赤酵母系统成功表达EV71和EBV疫苗候选抗原,研究结果显示重组VP1和ElΔGA能够诱导特异抗体产生,活化免疫系统,并能够刺激细胞因子分泌及淋巴细胞增殖。这些结果表明酵母表达的候选抗原具有较强的免疫原性,并具有开发为抗病毒疫苗的潜力。
钟运华[7]（2014）在《SmD1蛋白表达与免疫原性研究及其抗体检测初步应用》文中研究说明目的：采用基因工程技术,获取原核表达和真核表达的SmmDl重组蛋白,观察两者免疫原性和抗原性的差异。探索SmD1蛋白在免疫过量的情况下,诱导抗dsDNA抗体和其它抗核抗体产生的可能性,为寻找系统性红斑狼疮的启动原及发病机理提供实验依据；最后,以昆虫细胞表达的SmD1蛋白为抗原,研制抗SmD1抗体测定酶联免疫试剂,并进行初步的应用评价。方法：以化学合成方法获得目的基因,经PCR扩增,测序正确后,分别克隆到原核表达载体pET-21a和真核表达载体pFastBacTM1上,成功构建了重组质粒pET-21a-SmD1和pFastBacTM1-SmD1。（1）原核表达：将质粒pET-21a-SmD1转化到大肠杆菌BL21,选取阳性克隆,16℃低温条件下,1mmol IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳鉴定重组蛋白,Ni-NTA亲和层析柱纯化。（2）真核表达：将质粒pFastBacTM1-SmD1转化到DH10Bac,蓝白斑筛选阳性克隆,获得重组穿梭载体Bacmid,转染昆虫细胞Sf9,接着进行重组杆状病毒的扩增,目的蛋白表达,SDS-PAGE电泳鉴定重组蛋白,Ni-NTA亲和层析柱纯化,Western blot验证。（3）免疫原性研究：将原核表达蛋白和真核表达蛋白以皮下多点注射方式免疫4周龄Balb/c雌鼠,每隔两周免疫一次,共免疫三次,在第0周、2周、5周和9周,取小鼠血清,ELISA检测抗dsDNA抗体IgG,LIA法检测ANA谱,第9周处死,取脾脏T淋巴细胞,ELISPOT检测分泌IFN-y T淋巴细胞的频数,流式细胞术检测脾T淋巴细胞亚群CD3、CD4和CD8的比例及CD3+CD4+/CD4+CD8+的比值。（4）建立检测抗SmD1抗体的间接ELISA方法,检测553例各类型自身免疫性疾病患者血清,其中230例SLE。结果：经DNA序列分析和双酶切鉴定证实了重组质粒pET-21a-SmD1和pFastBacl-SmD1构建正确,并且分别在大肠杆菌BL21和杆状病毒／昆虫细胞系统（AcMNPV/Sf9）表达成功,获得目的蛋白。经Ni-NTA亲和层析柱高效分离带HIS标签的重组蛋白SmD1,纯度大于95%。经Bradford法测定,大肠杆菌表达的重组蛋白浓度为0.62mg/mL,昆虫细胞表达的重组蛋白浓度为0.908mg/mL。免疫原性研究发现,同时期,昆虫细胞Sf9表达的SmD1蛋白诱导抗Sm抗体和抗dsDNA抗体滴度比大肠杆菌BL21表达的蛋白诱导的抗体滴度高。Sf9表达的SmD1蛋白诱导抗dsDNA抗体滴度于第二次免疫后1周（第5周）达到顶峰,之后逐渐下降,而BL21表达的SmD1蛋白诱导的抗dsDNA抗体滴度在9周之内,滴度随时间的延长不断增加。抗dsDNA抗体在各组中的差异均有统计学意义。同时,SmD1重组蛋白也会诱导IgG抗SSA/60抗体、抗SSA/52抗体、抗SSB抗体、抗Scl-70抗体和抗U1-snRNP抗体的产生。在SmDl免疫过量的情况下,原核蛋白免疫组、真核蛋白免疫组的CD4+/CD8+平衡失调,与对照组比较,CD3+CD4+值下降,CD3+CD8+值升高,CD3+CD4+/CD3+CD8+比值下降。发现原核蛋白免疫组、真核蛋白免疫组的IFN-γ分泌T细胞频数显着高于对照组,两蛋白免疫组间的差异无统计学意义。以Sf9表达的SmD1蛋白为原料研制的抗SmD1抗体定量检测酶免试剂的准确性、重复性、检测限、线性和稳定性均符合YY/T1183-2010酶联免疫吸法检测试剂行业标准。临床应用结果显示,抗SmD1抗体对SLE灵敏度为57.8%,特异性为96.4%。结论：AcMNPV-sf9表达的SmD1蛋白的免疫原性和抗原性均比大肠杆菌BL21表达的SmDl蛋白强,前者还会与抗dsDNA抗体结合,与构象表位不同有关。SmD1蛋白量的增加会出现表位扩展现象,诱导抗dsDNA抗体等多种抗核抗体的产生,提示SmmD1自身抗原量的增加可能会诱导狼疮样自身免疫病的发生。自研的抗SmD1抗体酶联免疫试剂具有良好的临床应用价值,有助于SLE的辅助诊断。
史翠萍[8]（2016）在《杆状病毒表达系统表达猪流行性腹泻病毒S1蛋白及其免疫原性的研究》文中认为猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea,PED）是全球流行的极具威胁性的猪病之一,由具有高致死率的猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起。该病在世界各地的爆发给全球养猪业造成了重大损失,但迄今为止尚无有效安全的疫苗可用。通过新手段研制PEDV疫苗十分必要。S蛋白是PEDV的主要结构抗原蛋白,由S1区和S2区组成,其中S1含有3个中和表位区域,常作为PEDV基因工程疫苗研究中最重要的一个靶蛋白。本研究拟构建S1基因的系列重组杆状病毒:rv Ac-S1、rv Ac-SP-S1、rv Ac-SP-S1-TMD、rv Ac-SP-S1-e GFP、rv Ac-SP-S1-e GFP-TMD,以实现在昆虫细胞中高效表达S1或者在重组杆状病毒表面展示S1。并将上述S1蛋白及表面展示S1的重组病毒分别作为蛋白亚单位疫苗和病毒活载体疫苗使用,初步探索两种疫苗在BALB/c小鼠模型上的免疫效果。直接荧光、间接免疫荧光、免疫印迹、免疫电镜对S1的表达定位进行分析。结果表明:rv Ac-SP-S1-e GFP和rv Ac-SP-S1-e GFP-TMD感染Sf9细胞后,S1在Sf9细胞中高效表达,且S1胞内表达量前者大于后者;S1定位于感染细胞的细胞膜附近及rv Ac-SP-S1-e GFP-TMD表面。制备S1重组蛋白免疫原及表面展示S1的重组病毒颗粒性免疫原皮下免疫小鼠。间接ELISA、微量细胞培养中和试验、脾淋巴细胞增殖试验对免疫原刺激小鼠产生的体液免疫及细胞免疫应答效果进行检测。结果表明:展示S1的重组杆状病毒免疫血清中存在特异性抗体,抗体效价达1:5000,并具有一定中和PEDV能力,中和效价达1:26。在PEDV刺激原作用下,展示S1重组杆状病毒免疫鼠的脾淋巴细胞与对照组相比增殖显着（P>0.05）。而S1重组蛋白免疫原小鼠后未取得理想效果。上述可知,表面展示S1的rv Ac-SP-S1-e GFP-TMD重组杆状病毒直接免疫小鼠可诱导产生体液及细胞免疫反应。本研究首次将PEDV CV777全长S1蛋白表达于昆虫细胞及展示于杆状病毒表面以用于PEDV疫苗研发,并取得一定初步成果,为PEDV新型疫苗的研发奠定了基础。
戴诗雨[9]（2020）在《病毒样颗粒抗原及克里米亚刚果出血热病毒Gn/Gc宿主相互作用组的研究》文中研究表明病毒样颗粒（Virus-Like Particle,VLP）是由一个或多个病毒结构蛋白组装形成的颗粒状结构,与天然病毒粒子形态、抗原性相似。VLP缺失病毒的遗传物质,没有复制和感染能力。VLP的免疫原性良好,研制快速,制备成本较低并且安全,在应对新发、突发病毒疾病的疫苗研制中具有独特优势。杆状病毒表达系统是常用的真核表达系统之一,广泛应用于蛋白功能研究,抗原及疫苗制备。我们利用杆状病毒表达系统构建了几种危害人类健康的病毒VLPs,并初步探究了其作为候选疫苗的免疫原性。寨卡病毒（Zika virus,ZIKV）是蚊传黄病毒,近年发现其感染与新生儿小头畸形有关,且能引起格林-巴利综合征等神经系统疾病。目前,对于ZIKV引起的疾病,尚无有效的疫苗和特异性治疗药物,ZIKV严重危害人类健康。我们利用杆状病毒表达系统,构建了表达ZIKV pr ME蛋白的重组病毒。经蔗糖密度梯度离心,从感染的昆虫细胞中纯化得到由ZIKV pr M蛋白和E蛋白自组装形成的ZIKV VLPs。以ZIKV pr ME VLPs免疫小鼠能够诱导小鼠产生中和抗体,及ZIKV特异的体液和细胞免疫反应,表现出良好的免疫原性,为以VLP为基础的ZIKV疫苗研发奠定了基础。我们也构建了表达ZIKV囊膜蛋白E的重组病毒,结果显示在昆虫细胞中囊膜蛋白E可以不依赖于pr M蛋白共表达组装成与ZIKV病毒粒子形态类似的VLP,并且释放到胞外。E蛋白保留膜融合活性,可以诱导合胞体形成,这一现象同样适用于包括日本脑炎病毒、登革热病毒和蜱传脑炎病毒在内的黄病毒。基于杆状病毒表达黄病毒囊膜蛋白E诱导合胞体形成的现象,我们还建立了靶向黄病毒E蛋白的抗病毒药物筛选平台。脊髓灰质炎病毒（Poliovirus,PV）是脊髓灰质炎（简称脊灰）的病原体。目前脊灰没有特异治疗方法,只能通过接种疫苗来预防。目前世界上普遍使用的脊灰疫苗有两种,即口服脊髓灰质炎减毒活疫苗（OPV）和灭活脊髓灰质炎疫苗（IPV）。自从1988年世界卫生组织（WHO）发起全球消灭脊灰行动以来,世界各国大力推广OPV的使用,2015年和2019年,WHO先后宣布Ⅱ型和Ⅲ型脊灰野病毒的消灭。在根除脊灰的最后阶段,OPV和IPV都不可避免存在安全性问题,面临着免疫策略调整的挑战,在无PV的环境下生产疫苗更安全可靠。我们利用杆状病毒表达系统共表达PV的P1和3CD蛋白,P1前体可以被3CD蛋白酶成功剪切成衣壳蛋白VP0、VP1和VP3,经过蔗糖密度梯度离心结合氯化铯密度梯度离心可以纯化出PV VLPs,与天然PV病毒颗粒的形态、大小相似。克里米亚刚果出血热病毒（Crimean-Congo Hemorrhagic Fever Virus,CCHFV）是一种高致病性病毒,可以导致克里米亚刚果出血热,一种以出血为典型特征的蜱媒自然疫源性疾病。CCHFV感染能引起人发热、出血以及多器官的功能衰竭,进而导致死亡,致死率高达30%-50%,没有有效的抗CCHFV的药物和疫苗,CCHFV是人类健康的潜在威胁。在我国病毒分类目录中,CCHFV属于第一类危害程度的病毒;在国外,CCHFV是生物安全4级的病毒。CCHFV在体外通过细胞培养进行病毒的分离和扩增较困难,极大限制了CCHFV的研究进展。我们构建重组病毒在昆虫细胞中共表达CCHFV的膜蛋白和核衣壳蛋白,或者单独表达膜蛋白。通过蔗糖密度梯度离心,成功从感染的细胞中制备出CCHFV VLPs。CCHFV病毒粒子表面是膜蛋白Gn和Gc,为了形成感染性病毒粒子,膜蛋白前体在细胞内经过复杂的剪切、加工和定位从而形成结构蛋白Gn和Gc,非结构蛋白GP160,GP85,GP38和NSm。在整个生命周期中CCHFV膜蛋白Gn和Gc在病毒入侵、膜融合、致病性、宿主选择和免疫逃逸等方面有重要作用。对CCHFV膜蛋白Gn和Gc宿主互作蛋白的研究,探索CCHFV与宿主的相互作用有利于了解CCHFV的分子生物学,找到病毒感染的关键宿主因子。为了研究CCHFV膜蛋白Gn/Gc与宿主的相互作用,我们首先制备了CCHFV膜蛋白Gn/Gc的单克隆抗体。以原核表达的Gn/Gc胞外区作为免疫原免疫小鼠,通过有限稀释法,以真核表达的Gn/Gc蛋白作为检测抗原,经ELISA方法初筛融合上清,结合蛋白免疫印迹分析和细胞免疫荧光检测。经过综合评定和比较,筛选出8株Gn单克隆化的杂交瘤细胞和10株Gc单克隆化的杂交瘤细胞。分别以不同截短形式的Gn/Gc原核表达蛋白为抗原,对融合上清的识别区段进行鉴定,最终鉴定出2株Gn单克隆抗体和1株Gc单克隆抗体及其识别的抗原表位。为了探索膜蛋白Gn/Gc的宿主互作蛋白,我们以带有Twin-strep标签的Gn或Gc作为诱饵蛋白,对样品进行细胞亲和纯化-质谱（AP-MS）鉴定。共鉴定出45个Gn或Gc相关宿主蛋白,结合生物信息学深入挖掘和分析,并通过免疫荧光等方法对质谱结果有效性进行验证。综上所述,我们利用杆状病毒表达系统成功构建了ZIKV VLPs,PV VLPs和CCHFV VLPs。对ZIKV VLPs免疫原性的初步探索表明其有良好的免疫原性,有希望成为ZIKV候选疫苗。基于杆状病毒表达的黄病毒E蛋白诱导合胞体的现象,建立了针对黄病毒E蛋白的抗病毒药物筛选平台。筛选出2株CCHFV Gn单克隆抗体和1株Gc单克隆抗体。并通过蛋白质组学和生物信息学鉴定分析了CCHFV膜蛋白Gn/Gc的宿主互作蛋白,可以促进全面地了解膜蛋白Gn/Gc与宿主的关系,对认识CCHFV感染相关过程,后续功能分析及药物靶点设计具有重要指导意义。
高景鹏[10]（2012）在《兔出血症病毒亚基因组在昆虫细胞中的表达及其免疫原性研究》文中提出兔病毒性出血症（Rabbit hemorrhagic disease, RHD）俗称“兔瘟”,是由兔出血症病毒（Rabbit hemorrhagic disease virus, RHDV）引起的一种急性、烈性、致死性传染病。兔出血症病毒的主要结构蛋白是由ORF1编码的聚合多肽裂解而来,分子量约为60ku,又被称为VP60蛋白,该蛋白是兔出血症病毒最重要的免疫原蛋白。除了VP60, RHDV基因组还编码一种分子量约为lOku的次级结构蛋白,又称为VP10蛋白。研究证实,在RHDV感染细胞中除了基因组RNA外,还存在大量的亚基因组mRNA,它们的翻译产物是病毒结构蛋白的重要来源。大量研究资料表明,RHDV基因组（包括亚基因组）的非编码区对病毒蛋白的翻译与表达具有重要调节作用,此外VP10的表达对于VP60的表达和组装还具有促进作用。鉴于此,本研究拟利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统表达RHDV的亚基因组mRNA,期望在非编码区和VP10的扶助下,高水平表达兔出血症病毒的VP60蛋白,解决单一表达VP60产量偏低的问题,为下一步研发抗RHDV感染的多肽疫苗奠定基础。首先,我们分别构建了pFast-sgRHDV （RHDV亚基组mRNA）和pFast-sgRHDV△Vp10（缺失VP10编码区的RHDV亚基组mRNA）重组载体,经过蓝白斑筛选获得穿梭质粒Bacmid-sgRHDV和Bacmid-sgRHDVAVp10,转染Sf9细胞,发现两种穿梭质粒都可以在Sf9细胞内进行增殖,并产生细胞病变。Western blot检测结果证实,含有完整亚基组mRNA基因的表达载体转染细胞后,VP60蛋白的表达量远高于缺失VP10亚基组mRNA表达染细胞后VP60蛋白表达量,这一方面证明亚基因组在昆虫细胞中能够高水平表达病毒的结构蛋白,另一方面也证明VP10确实对VP60的表达具有调节作用。电子显微镜检测结果证实,在昆虫细胞中表达的RHDV结构蛋白VP60能够自聚形成病毒样颗粒（virus like particles, VLPs）。由于VLPs类似完整的RHD病毒粒子,能够模拟病毒激发宿主的免疫系统,产生特异性抗体,同时又因为不含有病毒基因组而十分安全。因此,病毒样颗粒是研发多肽疫苗的最佳候选免疫原。本文即将昆虫细胞表达的RHDV VLPs免疫试验兔,然后检测它诱导的免疫应答水平。研究结果发现,用VLPs免疫兔子后,不但可以激发高水平的体液免疫,而且可诱导机体的细胞免疫。我们使用RHDV强毒对试验兔进行攻击,发现所有免疫兔均得到良好的保护。本试验为进一步研制安全、有效的抗RHDV感染的多肽疫苗奠定了基础,同时也为研究RHDV亚基因组的表达和调控机制提供了有益材料。
二、Epstein-Barr病毒膜抗原在昆虫细胞sf9中的表达、纯化及其免疫原性（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Epstein-Barr病毒膜抗原在昆虫细胞sf9中的表达、纯化及其免疫原性（论文提纲范文）
（1）基于EB病毒潜伏期膜蛋白的鼻咽癌诊治用单克隆抗体的筛选研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 鼻咽癌概述 |
| 1.1.1 鼻咽癌的流行病学概况 |
| 1.1.2 鼻咽癌的临床特征 |
| 1.1.3 鼻咽癌的致病因子 |
| 1.1.4 鼻咽癌的诊断 |
| 1.1.5 鼻咽癌的治疗 |
| 1.2 EB病毒简介 |
| 1.2.1 EB病毒的发现 |
| 1.2.2 EB病毒的形态和结构特征 |
| 1.2.3 EB病毒的生命周期 |
| 1.2.4 EB病毒与肿瘤 |
| 1.3 EB病毒潜伏膜蛋白研究进展 |
| 1.3.1 潜伏期膜蛋白1(LMP1) |
| 1.3.2 潜伏期膜蛋白2(LMP2) |
| 1.4 肿瘤治疗性抗体药物研究进展 |
| 1.4.1 单克隆抗体制备技术 |
| 1.4.2 抗体药物治疗肿瘤的作用机制 |
| 1.4.3 肿瘤抗体药物的靶点(胞内、胞外) |
| 1.5 本研究的目的、意义及思路 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 主要仪器 |
| 2.2 主要耗材 |
| 2.3 主要试剂 |
| 2.3.1 E.coli菌株 |
| 2.3.2 质粒 |
| 2.3.3 细胞株 |
| 2.3.4 实验动物 |
| 2.3.5 分子及细胞生物学实验用常规试剂 |
| 2.3.6 引物与多肽 |
| 2.3.7 免疫佐剂 |
| 2.3.8 其他常规试剂 |
| 2.3.9 临床标本 |
| 2.4 实验用溶液及培养基配制 |
| 2.4.1 分子生物学实验常规溶液的配制 |
| 2.4.2 细胞培养/转染用溶液的配制 |
| 2.4.3 ELISA检测用溶液 |
| 2.4.4 免疫组化相关液体的配制 |
| 2.5 实验方法 |
| 2.5.1 常规分子克隆实验方法 |
| 2.5.2 细胞生物学实验方法 |
| 2.5.3 小鼠单克隆抗体的制备与纯化 |
| 2.5.4 小鼠淋巴细胞的流式分选与检测 |
| 2.5.5 小鼠杂交瘤细胞的抗体可变区基因钓取 |
| 2.5.6 兔单抗平台相关实验 |
| 2.5.7 免疫学相关试验方法 |
| 2.5.8 其他实验方法 |
| 2.6 数据处理及统计学分析方法 |
| 第三章 结果与分析 |
| 第一部分 基于小鼠单抗筛选平台对LMPs相关抗体筛选的探索 |
| 3.1 LMPs相关的抗原研究 |
| 3.1.1 合成肽及其偶联抗原 |
| 3.1.2 原核重组表达抗原 |
| 3.1.3 真核表达系统的重组抗原 |
| 3.1.4 抗原表达细胞株 |
| 3.1.5 核酸免疫抗原的制备 |
| 3.2 LMPs胞外、胞内区抗体筛选免疫方案的制定 |
| 3.3 LMPs相关免疫效果评价 |
| 3.3.1 合成肽免疫组 |
| 3.3.2 原核表达重组抗原免疫组 |
| 3.3.3 细胞与核酸免疫组 |
| 3.4 Anti-LMPs抗体筛选方案探索 |
| 3.4.1 基于抗原表达细胞的筛选 |
| 3.4.2 基于抗原特异性记忆B细胞的流式分选 |
| 3.5 Anti-LMPs单克隆抗体的鉴定与应用 |
| 3.5.1 Anti-LMPs单克隆抗体的鉴定 |
| 3.5.2 Anti-LMPs抗体在免疫组化方面的应用 |
| 3.5.3 Anti-LMP1抗体在鼻咽癌治疗方面的初步探索 |
| 3.6 第一部分小结 |
| 第二部分 兔单抗筛选平台的建立及LMPs特异性兔单抗筛选的探索 |
| 3.7 基于兔B细胞特异性分选的兔单抗筛选平台的建立 |
| 3.7.1 兔抗原特异性B细胞染色方案制定 |
| 3.7.2 兔B细胞单细胞PCR平台的建立 |
| 3.7.3 兔B细胞体外刺激培养平台 |
| 3.7.4 抗体重组表达载体构建 |
| 3.8 兔单抗筛选平台的应用 |
| 3.9 LMPs特异性兔单克隆抗体筛选探索 |
| 3.10 第二部分小结 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 鼻咽癌特异性诊断治疗性抗体开发的必要性和重要性 |
| 4.2 多次跨膜膜蛋白特异性抗体筛选的挑战 |
| 4.3 LMPs膜内区抗体在鼻咽癌个性化诊断及治疗中的潜力 |
| 4.4 基于流式分选的兔单克隆抗体筛选平台的重要性 |
| 第五章 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 在校期间的科研成果 |
| 致谢 |
（3）手足口病新型疫苗的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 HFMD 的流行病学 |
| 1.2 EV71 和CA16 分子生物学性质 |
| 1.2.1 EV71 和CA16 病毒一般性状 |
| 1.2.2 EV71 和 CA16 病毒基因组结构及编码蛋白 |
| 1.3 EV71 和CA16 病毒增殖过程 |
| 1.3.1 病毒的吸附和脱壳 |
| 1.3.2 病毒的蛋白加工与 RNA 合成 |
| 1.3.3 病毒颗粒组装与释放 |
| 1.4 EV71 和CA16 病毒结构及其病原学特征 |
| 1.5 HFMD 的致病机理 |
| 1.6 微生物学诊断 |
| 1.6.1 病毒分离及鉴定 |
| 1.6.2 血清学实验方法诊断 |
| 1.6.3 RT-PCR、核酸杂交技术 |
| 1.7 HFMD 的药物治疗 |
| 1.7.1 免疫球蛋白 |
| 1.7.2 抗病毒药物 |
| 1.8 预防疫苗研究概况 |
| 1.8.1 灭活全病毒疫苗 |
| 1.8.2 减毒疫苗 |
| 1.8.3 重组蛋白疫苗 |
| 1.8.4 载体疫苗 |
| 1.8.5 核酸疫苗 |
| 1.8.6 转基因植物、动物疫苗 |
| 1.8.7 病毒样颗粒疫苗 |
| 1.9 杆状病毒表达载体 |
| 1.9.1 杆状病毒生物学特性 |
| 1.9.2 杆状病毒表达系统的特点 |
| 1.9.3 杆状病毒昆虫表达系统的组成 |
| 1.9.4 杆状病毒昆虫表达系统的基本原理 |
| 1.9.5 杆状病毒昆虫表达系统技术路线 |
| 1.10 本研究的目的意义 |
| 2 重组 EV71 VP1 和 CA16 VP1 蛋白疫苗的构建、表达和纯化 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 质粒、毒株和细胞 |
| 2.1.2 分子生物学实验常用试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要溶液配制 |
| 2.1.5 分子生物学分析软件 |
| 2.1.6 实验动物 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 肠道病毒 EV71 和 CA16 的培养和分离 |
| 2.2.2 提取 EV71 RNA 和 CA16 RNA |
| 2.2.3 EV71 和CA16 的RT-PCR |
| 2.2.4 引物设计与合成 |
| 2.2.5 PCR 产物与酶切产物电泳及回收 |
| 2.2.6 重组表达载体的构建 |
| 2.2.7 连接产物的转化 |
| 2.2.8 重组质粒的鉴定 |
| 2.2.9 阳性质粒同源重组 |
| 2.2.10 昆虫细胞 Sf9 培养 |
| 2.2.11 昆虫细胞 Sf9 转染 |
| 2.2.12 收获重组杆状病毒 |
| 2.2.13 PCR 鉴定重组杆状病毒 |
| 2.2.14 空斑试验测定病毒效价 |
| 2.2.15 重组杆状病毒的扩增 |
| 2.2.16 重组蛋白的表达 |
| 2.2.17 重组蛋白表达鉴定 |
| 2.2.18 AKTA 纯化仪纯化目的蛋白 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 Vero 细胞培养EV71 和CA16 病毒 |
| 2.3.2 RT-PCR 扩增EV71 VP1 和CA16 VP1 基因 |
| 2.3.3 目的片段与表达载体连接酶切鉴定 |
| 2.3.4 同源重组质粒 PCR 鉴定 |
| 2.3.5 分析重组 EV71 VP1 Bacmid DNA 和 CA16 VP1 Bacmid DNA |
| 2.3.6 重组杆粒转染昆虫细胞 Sf9 |
| 2.3.7 重组杆状病毒空斑试验 |
| 2.3.8 重组蛋白表达检测 |
| 2.3.9 Ni~(2+)亲和层析纯化表达蛋白 |
| 2.4 小结与讨论 |
| 3 重组 EV71 VP1 和 CA16 VP1 单价蛋白疫苗免疫效果的评价 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 毒株、细胞和实验动物 |
| 3.1.2 免疫学实验试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 主要试剂配制 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 肠道病毒 EV71 和 CA16 培养 |
| 3.2.2 EV71 和CA16 病毒滴度测定 |
| 3.2.3 免疫方案 |
| 3.2.4 检测抗原与佐剂吸附率 |
| 3.2.5 标本采集 |
| 3.2.6 小鼠血清 IgG 抗体及抗体亚型效价检测 |
| 3.2.7 小鼠鼻腔、局部小肠灌洗液抗体效价检测 |
| 3.2.8 小鼠血清中和抗体效价测定及病毒回滴 |
| 3.2.9 脾淋巴细胞悬液的制备 |
| 3.2.10 流式细胞分析检测 |
| 3.2.11 T 淋巴细胞增殖检测 |
| 3.2.12 检测特异性sIgA 抗体分泌细胞 |
| 3.2.13 检测脾脏细胞分泌特异性 IFN-γ和 IL-4 |
| 3.2.14 统计学方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 EV71 和CA16 病毒滴度 |
| 3.3.2 抗原与 AL(OH)3吸附率 |
| 3.3.3 最佳抗原包被浓度的确定 |
| 3.3.4 最佳免疫抗原剂量的确定 |
| 3.3.4.1 不同抗原组腹腔免疫小鼠血清 IgG 抗体效价比较 |
| 3.3.4.2 不同抗原组腹腔免疫小鼠血清中和抗体效价比较 |
| 3.3.5 重组单价蛋白疫苗体液免疫应答观察 |
| 3.3.5.1 血清特异性 IgG 抗体效价动态观察 |
| 3.3.5.2 腹腔组不同部位 IgG 与sIgA 抗体比较 |
| 3.3.5.3 滴鼻组不同部位 IgG 与sIgA 抗体的比较 |
| 3.3.6 抗体亚型的检测 |
| 3.3.7 血清特异性中和抗体效价动态观察 |
| 3.3.8 重组单价蛋白疫苗滴鼻免疫小鼠粘膜免疫应答的观察 |
| 3.3.8.1 ELISPOT 法检测sIgA 抗体分泌细胞方法的建立 |
| 3.3.8.2 特异性sIgA 抗体分泌细胞的检测 |
| 3.3.9 重组单价蛋白疫苗腹腔免疫小鼠细胞免疫应答的检测 |
| 3.3.9.1 T 淋巴细胞增殖实验检测 |
| 3.3.9.2 小鼠 T 淋巴细胞亚群流式细胞分析 |
| 3.3.9.3 特异性 IFN-γ和IL-4 分泌型细胞方法的建立 |
| 3.3.9.4 小鼠脾特异性 IFN-γ和 IL-4 分泌细胞的检测 |
| 3.3.10 重组单价蛋白疫苗腹腔免疫后相关性分析 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 4 EV71 VP1 和CA16 VP1 二价融合蛋白疫苗的制备 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 PCR 引物设计与合成 |
| 4.2.2 EV71 VP1 基因的扩增 |
| 4.2.3 EV71 VP1 PCR 产物双酶切及回收 |
| 4.2.4 表达载体双酶切及回收 |
| 4.2.5 EV71 VP1 基因与表达载体连接 |
| 4.2.6 工程菌感受态制备、转化及 PCR 鉴定 |
| 4.2.7 pFastBac HT B-EV71 VP1 质粒提取 |
| 4.2.8 扩增 CA16 VP1 基因 |
| 4.2.9 重组 pFastBac HT B-EV71 VP1 质粒与 CA16 VP1 PCR 产物双酶切、连接、转化及 PCR 鉴定 |
| 4.2.10 重组质粒的获得 |
| 4.2.11 DH10Bac 感受态的制备 |
| 4.2.12 重组质粒的转化及 PCR 鉴定 |
| 4.2.13 昆虫细胞 Sf9 贴壁(悬浮)培养 |
| 4.2.14 重组质粒转染贴壁昆虫细胞 Sf9 |
| 4.2.15 收获重组杆状病毒及提取杆状病毒 DNA PCR 鉴定 |
| 4.2.16 空斑试验测定重组病毒效价 |
| 4.2.17 重组二价融合蛋白表达的检测鉴定 |
| 4.2.18 重组蛋白的 Western-blot 检测 |
| 4.2.19 利用 AKTA 纯化仪纯化二价融合蛋白 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 PCR 扩增EV71 VP1 及CA16 VP1 基因 |
| 4.3.2 PCR 鉴定重组pFastBac HT B-EV71 VP1-CA16 VP1 质粒结果 |
| 4.3.3 重组pFastBac HT B -EV71 VP1-CA16 VP1 质粒双酶切鉴定结果 |
| 4.3.4 同源重组菌落 PCR 结果 |
| 4.3.5 分析重组 EV71 VP1-CA16 VP1 Bacmid DNA 结果 |
| 4.3.6 转染昆虫细胞 Sf9 的鉴定 |
| 4.3.7 重组 EV71 VP1-CA16 VP1 杆状病毒空斑试验结果 |
| 4.3.8 EV71 VP1-CA16 VP1 蛋白在昆虫细胞Sf9 表达的鉴定 |
| 4.4 小结与讨论 |
| 5 EV71 病毒样颗粒疫苗的制备 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 PCR 引物设计与合成 |
| 5.2.2 扩增 EV71 P1 基因 |
| 5.2.3 EV71 P1 基因PCR 产物双酶切及回收 |
| 5.2.4 重组pFastBac Dual 质粒、EV71 P1 基因双酶切及回收 |
| 5.2.5 EV71 P1 基因与供体质粒pFastBac Dual 连接 |
| 5.2.6 感受态制备、重组pFastBac Dual-EV71 P1 质粒转化及 PCR 鉴定 |
| 5.2.7 重组pFastBac Dual-EV71 P1 质粒的提取 |
| 5.2.8 扩增 EV71 3CD 基因 |
| 5.2.9 重组 pFastBac Dual-EV71 P1 质粒与 EV71 3CD 基因双酶切及回收 |
| 5.2.10 重组 pFastBac Dual-EV71 P1 质粒与 EV71 3CD 基因连接、转化及 PCR 鉴定 |
| 5.2.11 重组pFastBac Dual-EV71 P1-3CD 质粒的提取 |
| 5.2.12 DH10 Bac 感受的制备 |
| 5.2.13 重组pFastBac Dual-EV71 P1-3CD 质粒的转化 |
| 5.2.14 pFastBac Dual-EV71 P1-3CD 质粒与Bacmid 同源重组及PCR 鉴定 |
| 5.2.15 分离重组 EV71 P1-3CD Bacmid DNA |
| 5.2.16 分析重组pFastBac Dual-EV71 P1-3CD Bacmid DNA |
| 5.2.17 昆虫细胞 Sf9 贴壁(悬浮)培养 |
| 5.2.18 重组 EV71 P1-3CD Bacmid DNA 质粒转染昆虫细胞Sf9 |
| 5.2.19 收获重组 EV71 P1-3CD 杆状病毒及 PCR 鉴定 |
| 5.2.20 空斑试验测定重组 Bac-EV71 P1-3CD 病毒效价及重组杆状病毒的扩增 |
| 5.2.21 重组 Bac-EV71 P1-3CD 蛋白在昆虫细胞 Sf9 表达的检测鉴定 |
| 5.2.22 蔗糖密度梯度离心法纯化 EV71 VLPs |
| 5.2.22.1 蔗糖浓度的摸索 |
| 5.2.22.2 EV71 VLPs 的初步纯化 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 PCR 扩增EV71 P1 和EV71 3CD 基因 |
| 5.3.2 重组质粒的构建及双酶切鉴定 |
| 5.3.3 同源重组质粒 PCR 鉴定 |
| 5.3.4 分析重组 EV71 P1-3CD Bacmid DNA |
| 5.3.5 重组 EV71 P1-3CD Bacmid DNA 转染昆虫细胞Sf9 |
| 5.3.6 重组 EV71 P1-3CD 杆状病毒 DNA PCR 鉴定 |
| 5.3.7 重组 EV71 P1-3CD 杆状病毒空斑试验 |
| 5.3.8 IFA 检测重组EV71 P1-3CD 蛋白 |
| 5.3.9 蔗糖密度梯度离心法纯化 EV71 VLPs |
| 5.3.10 EV71 VLPs 的SDS-PAGE 分析及Western blot 检测 |
| 5.3.11 透射电镜观察 EV71 VLPs 形成 |
| 5.4 小结与讨论 |
| 6 全文总结 |
| 6.1 制备 HFMD 新型疫苗 |
| 6.1.1 单价重组蛋白疫苗的制备 |
| 6.1.2 二价重组融合蛋白疫苗的制备 |
| 6.1.3 EV71 VLPs 疫苗的制备 |
| 6.2 重组单价蛋白疫苗免疫效果的评价 |
| 6.2.1 重组单价蛋白疫苗体液免疫应答的评价 |
| 6.2.2 重组单价蛋白疫苗细胞免疫应答的评价 |
| 6.2.3 重组蛋白疫苗粘膜免疫应答的评价 |
| 6.3 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（4）杆状病毒系统可溶性高效表达PCV2Cap蛋白和PCV3 Cap蛋白及其免疫原性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 1 猪圆环病毒概述 |
| 1.1 猪圆环病毒1型 |
| 1.2 猪圆环病毒2型 |
| 1.3 猪圆环病毒3型 |
| 1.4 猪圆环病毒的形态与结构 |
| 1.5 猪圆环病毒的理化特性 |
| 2 猪圆环病毒的检测技术 |
| 2.1 电镜检测 |
| 2.2 原位杂交技术(ISH) |
| 2.3 免疫组化试验(IHC) |
| 2.4 环介导恒温扩增技术(LAMP) |
| 2.5 聚合酶链反应技术(PCR) |
| 2.6 PCV2 的血清学检测技术 |
| 3 猪圆环病毒疫苗的研究进展 |
| 3.1 猪圆环疫苗的分类 |
| 4 昆虫杆状病毒表达载体系统概述 |
| 4.1 Bac-to-Bac?表达载体系统的原理 |
| 4.2 昆虫杆状病毒表达载体系统的应用 |
| 4.3 基于昆虫杆状病毒表达载体系统在兽用亚单位疫苗的生产加工 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第一章 2013-2018 年山东省猪圆环病毒2 型的遗传演化分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 样本处理 |
| 1.3 全基因组提取和测序 |
| 1.4 系统发育分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 PCV2 分离株系统发育分析结果 |
| 2.2 ORF2 编码的氨基酸序列的比对与分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 PCV2Cap蛋白与PCV3Cap蛋白在杆状病毒表达系统中的表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 目的基因的扩增 |
| 2.2 重组质粒的鉴定 |
| 2.3 重组杆粒r Bacmid-H-2Cap-3Cap的鉴定 |
| 2.4 重组杆状病毒r Bac-H-2Cap-3Cap的拯救 |
| 2.5 重组杆状病毒r Bac-H-2Cap-3Cap的滴度测定 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 重组杆状病毒的免疫原性分析与高效表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 试剂的配置 |
| 1.3 方法 |
| 1.4 重组杆状病毒的高效表达 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 间接免疫荧光结果 |
| 2.2 SDS-PAGE结果分析 |
| 2.3 Westerm-Blot结果 |
| 2.4 重组杆状病毒的高效表达 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 硕士期间发表的学术论着 |
| 参与课题情况 |
（5）新疆非禽类野生动物流感抗体调查与流感病毒样颗粒疫苗研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 野生动物中流感病毒流行现状及流感疫苗研究进展 |
| 1 流感病毒的生物学特点 |
| 2 流感病毒的宿主 |
| 2.1 流感病毒在野生水禽中的流行现状 |
| 2.2 流感病毒在野猪中的流行现状 |
| 2.3 流感病毒在海洋哺乳动物中的流行现状 |
| 3 流感病毒疫苗研究现状 |
| 3.1 传统流感疫苗 |
| 3.2 流感通用或重组疫苗 |
| 3.3 流感病毒样颗粒疫苗 |
| 第二章 杆状病毒/杆状病毒表达系统研究进展 |
| 1 杆状病毒生物学特点 |
| 2 家蚕杆状病毒表达系统的研究进展 |
| 3 Bac-to-Bac杆状病毒表达系统研究进展 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第一章 新疆部分非禽类野生动物流感血清学调查 |
| 1 材料 |
| 1.1 流感HI诊断试剂 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 样品采集 |
| 1.4 血清样品处理 |
| 1.5 HI抗体检测方法 |
| 1.6 竞争ELISA |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 家蚕杆状病毒系统制备流感病毒样颗粒及免疫原性研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 酶与试剂 |
| 1.3 生化试剂 |
| 1.4 实验仪器 |
| 1.5 培养基及溶液 |
| 1.6 实验动物及实验场所 |
| 1.7 引物及基因合成及测序 |
| 2 方法 |
| 2.1 BmNPV表达含流感病毒HA、NA及M1蛋白的流感病毒样颗粒的构建 |
| 2.2 rBmNPV（HA-M1-NA）在家蚕蛹和蚕体中高效表达 |
| 2.3 流感病毒样颗粒的电镜观察 |
| 2.4 家蚕及蚕蛹表达HA-M1-NA病毒颗粒的血凝实验检测 |
| 2.5 流感病毒样颗粒的小鼠免疫试验及病毒攻毒保护试验 |
| 3 结果 |
| 3.1 流感病毒蛋白HA、NA、M1基因及IRES基因的扩增结果 |
| 3.2 含IRES序列片段的pFastBac Dual载体改造鉴定 |
| 3.3 流感病毒HA、NA及M1基因重组转移质粒的鉴定 |
| 3.4 重组病毒rBmNPV（HA-M1-NA）的鉴定 |
| 3.5 重组病毒rBmNPV（HA-M1-NA）感染昆虫细胞、家蚕和蚕蛹 |
| 3.6 流感病毒样颗粒的电镜观察 |
| 3.7 蚕蛹表达rBmNPV（HA-M1-NA）病毒颗粒的血凝试验结果 |
| 3.8 rBmNPV（HA-M1-NA）病毒颗粒免疫小鼠后抗体检测结果 |
| 3.9 rBmNPV（HA-M1-NA）病毒颗粒免疫小鼠的攻毒保护结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 Bac-to-Bac表达系统制备流感病毒样颗粒及免疫原性研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 质粒、菌种和细胞 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 培养基及溶液 |
| 1.4 设备和仪器 |
| 1.5 实验动物 |
| 1.6 引物、基因合成及测序 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 流感病毒蛋白NA和M1基因的扩增结果 |
| 3.2 含流感病毒HA、NA及M1基因重组转移质粒的鉴定 |
| 3.3 重组杆状病毒基因组的构建与鉴定 |
| 3.4 病毒样颗粒的鉴定 |
| 3.5 流感病毒样颗粒的免疫原性研究 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 流感嵌合病毒样颗粒的构建及免疫原性研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞、细菌、质粒与实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 昆虫细胞培养基 |
| 1.4 设备和仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 重组质粒的构建与鉴定 |
| 2.2 重组杆状病毒基因组的构建与鉴定 |
| 2.3 细胞转染与重组杆状病毒的获得 |
| 2.4 病毒样颗粒的表达与鉴定 |
| 2.5 病毒样颗粒的免疫原性 |
| 3 结果 |
| 3.1 流感病毒蛋白NA和M1基因的扩增结果 |
| 3.2 pfastBacDual-HA-fliC-NA及pfastBacDual-M1重组转移质粒的鉴定 |
| 3.3 重组杆状病毒基因组的构建与鉴定 |
| 3.4 病毒样颗粒的鉴定 |
| 3.5 病毒样颗粒的免疫原性 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 创新与特色 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 石河子大学博士研究生学位论文导师评阅表 |
（6）人类肠道病毒71型与EB病毒疫苗候选抗原在毕赤酵母中的表达及免疫原性研究（论文提纲范文）
| 论文创新点 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1 疫苗抗原表达系统 |
| 1.1 疫苗抗原表达系统比较 |
| 1.2 毕赤酵母表达系统 |
| 2 EV71病毒研究现状 |
| 2.1 EV71病毒 |
| 2.2 EV71与手足口病 |
| 2.3 EV71病毒预防策略 |
| 3 EBV病毒研究现状 |
| 3.1 EBV病毒 |
| 3.2 EBV与肿瘤发生 |
| 3.3 EBV及其相关疾病的防治方法 |
| 第二章 重组VP1蛋白诱导抗病毒免疫反应 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 溶液配制 |
| 1.3 VP1真核表达载体的构建 |
| 1.4 重组VP1表达菌株的构建与筛选 |
| 1.5 重组蛋白的诱导表达及纯化 |
| 1.6 BCA蛋白质定量分析 |
| 1.7 SDS-PAGE与Western blot检测 |
| 1.8 动物实验 |
| 1.9 小鼠免疫血清中IgG和IgM水平检测 |
| 1.10 小鼠脾脏淋巴细胞增殖反应检测 |
| 1.11 小鼠脾脏细胞因子检测 |
| 1.12 外周血单核细胞的分离 |
| 1.13 细胞计数 |
| 1.14 流式细胞仪检测 |
| 1.15 EV71病毒培养 |
| 1.16 蔗糖密度梯度离心法分离纯化EV71病毒 |
| 1.17 病毒中和实验 |
| 1.18 小鼠被动保护实验 |
| 1.19 统计学分析 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 VP1密码子优化 |
| 2.2 重组VP1的真核表达及纯化 |
| 2.3 VP1诱导小鼠体液免疫反应 |
| 2.4 病毒中和实验 |
| 2.5 被动保护实验 |
| 2.6 VP1刺激小鼠脾脏淋巴细胞增殖 |
| 2.7 VP1刺激细胞因子水平的变化 |
| 2.8 VP1促进小鼠脾脏和外周血T细胞的增多 |
| 3 讨论 |
| 3.1 重组VP1在毕赤酵母系统中高效表达 |
| 3.2 重组VP1诱导小鼠体液与细胞免疫应答 |
| 3.3 重组VP1作为EV71候选疫苗的应用前景 |
| 4 本章小结 |
| 第三章 毕赤酵母表达的EBV核抗原EBNA1的免疫原性研究 |
| 1 实验方法 |
| 1.1 序列优化与合成 |
| 1.2 真核表达载体的构建及鉴定 |
| 1.3 重组表达菌株的构建与筛选 |
| 1.4 重组E1△GA的真核表达和纯化 |
| 1.5 BCA蛋白定量法 |
| 1.6 细胞培养 |
| 1.7 小鼠免疫实验 |
| 1.8 ELISA检测小鼠免疫血清中IgG和IgM水平 |
| 1.9 小鼠脾脏淋巴细胞的分离与培养 |
| 1.10 淋巴细胞增殖实验 |
| 1.11 免疫小鼠脾脏细胞因子检测 |
| 1.12 外周血单核细胞的分离 |
| 1.13 细胞计数 |
| 1.14 流式细胞仪检测淋巴细胞亚群比例 |
| 1.15 统计学分析 |
| 1.16 序列提交 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 E1AGA序列优化 |
| 2.2 真核表达载体的构建与鉴定 |
| 2.3 重组E1△GA的真核表达 |
| 2.4 重组E1△GA的大量表达及纯化 |
| 2.5 重组E1△GA诱导小鼠体液免疫反应 |
| 2.6 E1△GA刺激小鼠脾脏淋巴细胞增殖 |
| 2.7 E1△GA对脾脏细胞因子水平的影响 |
| 2.8 E1△GA促进小鼠脾脏和外周血中T细胞的增多 |
| 3 讨论 |
| 3.1 在真核系统中成功大量表达E1△GA蛋白 |
| 3.2 密码子优化能够提高外源蛋白表达水平 |
| 3.3 重组E1△GA蛋白的免疫原性研究 |
| 3.4 重组E1△GA作为EBV疫苗的应用价值 |
| 4 本章小结 |
| 第四章 EBV包膜糖蛋白gp350在毕赤酵母中的表达 |
| 1 实验方法 |
| 1.1 EBV包膜糖蛋白gp350序列合成 |
| 1.2 真核表达载体pPICZαA-gp350的构建 |
| 1.3 重组表达载体的鉴定 |
| 1.4 重组gp350表达菌株的构建及鉴定 |
| 1.5 真核重组载体的诱导表达 |
| 1.6 SDS-PAGE与Western blot检测 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 gp350晶体结构与序列优化 |
| 2.2 重组表达载体的构建 |
| 2.3 重组gp350的诱导表达 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 攻博期间发表的科研成果 |
| 致谢 |
（7）SmD1蛋白表达与免疫原性研究及其抗体检测初步应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 1.1 系统性红斑狼疮及临床诊断免疫学标准 |
| 1.2 抗Sm抗体与SLE |
| 1.3 SmD1理化特性 |
| 1.4 抗SmD1抗体与SLE |
| 1.5 SLE与主要相关的自身抗体 |
| 1.6 小结 |
| 第二章 大肠杆菌SmD1蛋白表达与纯化 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 载体 |
| 2.1.4 主要溶液配制 |
| 2.1.5 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 PCR扩增目的基因 |
| 2.2.2 基因克隆与酶切鉴定 |
| 2.2.3 目的基因序列分析 |
| 2.2.4 重组蛋白的诱导表达 |
| 2.2.5 重组蛋白的纯化 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 杆状病毒/昆虫细胞SmD1蛋白表达与纯化 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 主要试剂 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.1.3 主要溶液配制 |
| 3.1.4 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 重组转移质粒pFastBac~(TM)1-SmD1的构建与鉴定 |
| 3.2.2 重组杆粒Bacmid-SmD1的构建与鉴定 |
| 3.2.3 重组杆状病毒的包装 |
| 3.2.4 目的基因表达与蛋白纯化 |
| 3.2.5 重组蛋白Western-blot |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 SmD1蛋白免疫原性研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.1.3 统计学处理 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 免疫刺激抗Sm抗体产生及动态变化 |
| 4.2.2 免疫诱导抗dsDNA抗体产生及动态变化 |
| 4.2.3 ANA谱检测结果 |
| 4.2.4 T淋巴细胞亚群分类 |
| 4.2.5 ELISPOT测定分泌IFN-γ的T淋巴细胞频数 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 抗SmD1抗体ELISA试剂盒的研制与初步应用 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验器材与试剂配制 |
| 5.1.2 研究对象 |
| 5.1.3 间接ELISA方法建立 |
| 5.1.4 正常参考值确定 |
| 5.1.5 溯源性 |
| 5.1.6 准确度 |
| 5.1.7 检测限 |
| 5.1.8 重复性 |
| 5.1.9 线性 |
| 5.1.10 热稳定性 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 最佳抗原包被浓度与样本稀释倍数选择结果 |
| 5.2.2 显色时间确定结果 |
| 5.2.3 正常参考值值确定结果 |
| 5.2.4 标准品定值与不确定度测量结果 |
| 5.2.5 准确度结果 |
| 5.2.6 检测限结果 |
| 5.2.7 重复性结果 |
| 5.2.8 线性结果 |
| 5.2.9 热稳定性结果 |
| 5.2.10 自身免疫性疾病患者血清抗SmD1抗体ELISA检测结果 |
| 5.2.11 检测SLE患者抗Sm抗体结果 |
| 5.3 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 详细摘要 |
（8）杆状病毒表达系统表达猪流行性腹泻病毒S1蛋白及其免疫原性的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 前言 |
| 1 PED的概述 |
| 2 PEDV的基因组结构和蛋白 |
| 2.1 PEDV非结构蛋白及功能 |
| 2.2 PEDV主要结构蛋白及功能 |
| 3 国内外PEDV基因工程疫苗研究进展 |
| 3.1 PEDV转基因植物疫苗 |
| 3.2 PEDV活载体疫苗 |
| 3.3 PEDV基因工程亚单位疫苗 |
| 4 杆状病毒及其在基因工程疫苗研究中的应用 |
| 4.1 杆状病毒的结构及病毒感染 |
| 4.2 杆状病毒在基因工程疫苗研究中的应用 |
| 第二章 研究方案设计 |
| 1 研究目的与意义 |
| 2 研究内容 |
| 3 技术路线 |
| 第三章 PEDV S1蛋白的原核表达、纯化及其兔多抗制备 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料、试剂与仪器 |
| 2.2 引物设计及合成 |
| 2.3 重组表达质粒pET28a-S1(231-734)的构建 |
| 2.4 His-S1(231-734)融合蛋白的诱导表达及鉴定 |
| 2.5 His-S1(231-734)融合蛋白大量表达及割胶纯化 |
| 2.6 S1多克隆抗体制备 |
| 3 结果分析 |
| 3.1 S1(231-734) 基因的PCR扩增鉴定 |
| 3.2 pET28a-S1(231-734)/TG1重组菌的鉴定 |
| 3.3 重组质粒pET28a-S1(231-734)的序列测定 |
| 3.4 pET28a-S1(231-734)/BL21(DE3)的诱导表达及Western blotting鉴定 |
| 3.5 S1蛋白纯化鉴定 |
| 3.6 S1抗血清纯化 |
| 3.7 S1抗血清效价测定和特异性分析 |
| 4 讨论 |
| 第四章 PEDV S1重组杆状病毒构建及S1蛋白在Sf9细胞中的表达鉴定 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料、试剂与仪器 |
| 2.2 引物设计及合成 |
| 2.3 S1基因的pFast BacHTB系列重组质粒构建 |
| 2.4 Bac-to-Bac系统构建重组Bacmid |
| 2.5 Sf9细胞的低温冻存、复苏及贴壁培养 |
| 2.6 P0代重组杆状病毒的制备 |
| 2.7 重组杆状病毒鉴定及滴度测定 |
| 2.8 PEDV S1融合蛋白胞内表达的Western blotting分析 |
| 2.9 重组杆状病毒增殖曲线及S1融合蛋白表达量分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 S1、SP-S1、TMD、SP-S1-TMD、eGFP基因片段扩增鉴定 |
| 3.2 重组菌的菌液PCR鉴定及重组质粒双酶切鉴定 |
| 3.3 重组质粒序列测定 |
| 3.4 重组Bacmid鉴定 |
| 3.5 细胞病变及荧光观察 |
| 3.6 重组杆状病毒的PCR鉴定 |
| 3.7 PEDV S1蛋白表达鉴定 |
| 3.8 病毒增殖曲线及S1融合蛋白表达量分析 |
| 4 讨论 |
| 第五章 S1蛋白在Sf9细胞中及在重组杆状病毒上的定位 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料、试剂与仪器 |
| 2.2 S1融合蛋白亚细胞定位 |
| 2.3 展示S1融合蛋白的重组杆状病毒颗粒的验证 |
| 3 结果分析 |
| 3.1 细胞荧光观察 |
| 3.2 间接免疫荧光分析 |
| 3.3 PEDV S1融合蛋白在杆状病毒上的表达鉴定 |
| 3.4 电镜观察 |
| 3.5 免疫电镜检测 |
| 4 讨论 |
| 第六章 S1融合蛋白及表面展示S1蛋白的杆状病毒的免疫原性分析 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料、试剂与仪器 |
| 2.2 免疫原 |
| 2.3 免疫小鼠 |
| 2.4 免疫鼠血清的效价检测 |
| 2.5 血清中和试验 |
| 2.6 脾淋巴细胞增殖 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 特异性抗体检测 |
| 3.2 血清中和试验 |
| 3.3 脾淋巴细胞增殖 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（9）病毒样颗粒抗原及克里米亚刚果出血热病毒Gn/Gc宿主相互作用组的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 病毒样颗粒疫苗的研究进展 |
| 1.1.1 病毒样颗粒疫苗的简介 |
| 1.1.2 病毒样颗粒疫苗的表达系统 |
| 1.1.3 病毒样颗粒疫苗发展面临的挑战和解决方案 |
| 1.2 寨卡病毒及其疫苗的研究进展 |
| 1.2.1 寨卡病毒的流行病学 |
| 1.2.2 寨卡病毒的分类 |
| 1.2.3 寨卡病毒结构和基因组结构 |
| 1.2.4 寨卡病毒的生命周期 |
| 1.2.5 寨卡病毒E蛋白的结构和功能研究 |
| 1.2.6 寨卡病毒疫苗的研究进展 |
| 1.3 脊髓灰质炎病毒及其疫苗的研究进展 |
| 1.3.1 脊髓灰质炎的流行现状 |
| 1.3.2 脊髓灰质炎病毒的生物学 |
| 1.3.3 脊髓灰质炎疫苗的研究进展 |
| 1.4 克里米亚刚果出血热病毒的研究进展 |
| 1.4.1 CCHFV的生物学 |
| 1.4.2 CCHFV的临床流行病学 |
| 1.4.3 CCHF的预防 |
| 1.4.4 CCHFV疫苗的研究进展 |
| 1.4.5 CCHFV单克隆抗体的研究进展 |
| 1.5 本论文的研究内容和意义 |
| 第2章 寨卡病毒样颗粒的构建和免疫原性研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 细胞、病毒与菌株 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 抗体与抗体制备 |
| 2.1.4 重组杆状病毒v Ac-Zpr ME的构建 |
| 2.1.5 ZIKV病毒蛋白的表达和鉴定 |
| 2.1.6 ZIKV病毒样颗粒和病毒粒子的纯化与检测 |
| 2.1.7 ZIKV VLPs的免疫原性评价 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 重组杆状病毒v Ac-Zpr ME的构建 |
| 2.2.2 ZIKV pr M和 E蛋白形成VLPs |
| 2.2.3 ZIKV VLPs的免疫原性研究 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 基于杆状病毒表达的VLP诱导合胞体现象的抗黄病毒药物筛选方法的建立 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 细胞、病毒、菌株与质粒 |
| 3.1.2 试剂 |
| 3.1.3 抗体与抗体纯化 |
| 3.1.4 重组杆状病毒的构建 |
| 3.1.5 质粒的构建及转染实验 |
| 3.1.6 序列比对和进化分析 |
| 3.1.7 免疫荧光分析 |
| 3.1.8 ZIKV滴度测定(空斑实验) |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 杆状病毒表达的黄病毒E蛋白诱导Sf9细胞形成合胞体 |
| 3.2.2 黄病毒E蛋白在Sf9细胞中的细胞定位研究 |
| 3.2.3 ZIKV prME和E蛋白形成VLPs |
| 3.2.4 基于杆状病毒表达的黄病毒E蛋白诱导合胞体现象的抗病毒筛选 |
| 3.2.5 AMS通过影响病毒入侵抑制黄病毒感染 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 脊髓灰质炎病毒样颗粒的构建 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 细胞与菌株 |
| 4.1.2 试剂 |
| 4.1.3 抗体与抗体制备 |
| 4.1.4 重组杆状病毒的构建 |
| 4.1.5 病毒样颗粒的纯化和鉴定 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 PVⅡP1多克隆抗体的制备和鉴定 |
| 4.2.2 重组杆状病毒的构建 |
| 4.2.3 PVⅡVP0,VP1和VP3 蛋白形成VLPs |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 克里米亚刚果出血热病毒样颗粒的构建 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 细胞、病毒与质粒 |
| 5.1.2 试剂 |
| 5.1.3 抗体 |
| 5.1.4 重组杆状病毒的构建 |
| 5.1.5 病毒样颗粒的纯化和鉴定 |
| 5.2 实验结果 |
| 5.2.1 重组杆状病毒v Ac-Gn Gc NP和 v Ac-Gn Gc的构建 |
| 5.2.2 CCHFV VLPs的纯化和鉴定 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第6章 CCHFV膜蛋白Gn/Gc单克隆抗体的制备及表位鉴定 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 菌株、质粒与细胞系 |
| 6.1.2 试剂 |
| 6.1.3 CCHFV膜蛋白Gn/Gc胞外区的诱导表达 |
| 6.1.4 单克隆抗体制备的流程 |
| 6.1.5 小鼠血清和杂交瘤细胞上清识别能力的检测 |
| 6.1.6 单克隆抗体线性识别位点的鉴定 |
| 6.2 实验结果 |
| 6.2.1 小鼠血清的检测 |
| 6.2.2 CCHFV膜蛋白Gn/Gc单克隆抗体的筛选 |
| 6.2.3 CCHFV膜蛋白Gn/Gc单克隆抗体识别表位的鉴定 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 第7章 CCHFV膜蛋白Gn/Gc宿主相互作用组的研究 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 细胞、病毒、菌株与质粒 |
| 7.1.2 试剂 |
| 7.1.3 抗体 |
| 7.1.4 细胞转染 |
| 7.1.5 免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP) |
| 7.1.6 非标定量质谱分析 |
| 7.1.7 生物信息学分析 |
| 7.1.8 免疫荧光和共聚焦实验 |
| 7.2 实验结果 |
| 7.2.1 诱饵蛋白Gn/Gc及其宿主互作蛋白的SDS-PAGE和 Western blot分析 |
| 7.2.2 膜蛋白Gn/Gc宿主互作蛋白的非标定量质谱分析 |
| 7.2.3 膜蛋白Gn/Gc宿主互作蛋白的GO和 KEGG通路富集分析 |
| 7.2.4 膜蛋白Gn/Gc宿主互作蛋白的相互作用网络分析 |
| 7.2.5 间接免疫荧光验证质谱结果 |
| 7.3 讨论 |
| 7.3.1 线粒体 |
| 7.3.2 内质网 |
| 7.3.3 细胞骨架 |
| 7.3.4 外泌体和囊泡 |
| 7.4 小结 |
| 第8章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（10）兔出血症病毒亚基因组在昆虫细胞中的表达及其免疫原性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 兔病毒性出血症概述 |
| 1.2 RHDV基因组结构及其编码蛋白功能 |
| 1.2.1 RHDV基因组结构 |
| 1.2.2 RHDV编码的蛋白 |
| 1.3 我国兔瘟流行情况简介 |
| 1.4 兔瘟疫苗 |
| 1.4.1 传统疫苗 |
| 1.4.2 基因工程疫苗 |
| 1.4.3 VLPs用作疫苗载体 |
| 1.5 杆状病毒表达系统概述 |
| 1.5.1 杆状病毒简介 |
| 1.5.2 杆状病毒表达系统简介 |
| 1.5.3 杆状病毒表达系统的原理 |
| 1.5.4 杆状病毒表达系统的发展 |
| 2 兔出血症病毒亚基因组在昆虫细胞中的表达及其免疫原性研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 生物试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 主要溶液和培养基的配制 |
| 2.1.4 引物 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 重组载体构建 |
| 2.2.2 重组穿梭质粒的制备 |
| 2.2.3 重组杆状病毒的拯救 |
| 2.2.4 RT-PCR检测VP60的mRNA |
| 2.2.5 间接免疫荧光(IFA)检测VP60的表达 |
| 2.2.6 Western blot检测VP60免疫原性 |
| 2.2.7 表达产物VLPs电镜检测 |
| 2.2.8 动物实验 |
| 2.2.9 血清ELISA检测 |
| 2.2.10 淋巴细胞增殖实验 |
| 2.2.11 细胞因子检测 |
| 2.2.12 荧光半定量PCR检测 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 重组载体鉴定结果 |
| 2.3.2 重组穿梭质粒鉴定结果 |
| 2.3.3 重组杆状病毒的拯救结果 |
| 2.3.4 RT-PCR检测VP60的mRNA检测结果 |
| 2.3.5 间接免疫荧光检测结果 |
| 2.3.6 表达产物VP60蛋白免疫原性检测结果 |
| 2.3.7 表达产物VLPs电镜检测结果 |
| 2.3.8 动物实验结果 |
| 2.3.9 血清ELISA检测结果 |
| 2.3.10 淋巴细胞检测结果 |
| 2.3.11 细胞因子检测结果 |
| 2.3.12 荧光半定量PCR检测结果 |
| 讨论与小结 |
| 论文结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
四、Epstein-Barr病毒膜抗原在昆虫细胞sf9中的表达、纯化及其免疫原性（论文参考文献）
- [1]基于EB病毒潜伏期膜蛋白的鼻咽癌诊治用单克隆抗体的筛选研究[D]. 李睿. 厦门大学, 2018(06)
- [2]Epstein-Barr病毒膜抗原在昆虫细胞sf9中的表达、纯化及其免疫原性[J]. 刘展,周为民,谷淑燕. 中华实验和临床病毒学杂志, 1996(04)
- [3]手足口病新型疫苗的初步研究[D]. 李晓楠. 内蒙古农业大学, 2010(10)
- [4]杆状病毒系统可溶性高效表达PCV2Cap蛋白和PCV3 Cap蛋白及其免疫原性研究[D]. 王硕. 山东师范大学, 2020(08)
- [5]新疆非禽类野生动物流感抗体调查与流感病毒样颗粒疫苗研究[D]. 魏玉荣. 石河子大学, 2016(02)
- [6]人类肠道病毒71型与EB病毒疫苗候选抗原在毕赤酵母中的表达及免疫原性研究[D]. 王曼. 武汉大学, 2014(01)
- [7]SmD1蛋白表达与免疫原性研究及其抗体检测初步应用[D]. 钟运华. 广州中医药大学, 2014(01)
- [8]杆状病毒表达系统表达猪流行性腹泻病毒S1蛋白及其免疫原性的研究[D]. 史翠萍. 浙江理工大学, 2016(04)
- [9]病毒样颗粒抗原及克里米亚刚果出血热病毒Gn/Gc宿主相互作用组的研究[D]. 戴诗雨. 中国科学院大学(中国科学院武汉病毒研究所), 2020(02)
- [10]兔出血症病毒亚基因组在昆虫细胞中的表达及其免疫原性研究[D]. 高景鹏. 内蒙古农业大学, 2012(08)