一、EB 病毒核抗原(EBNA)的表达与大鼠成纤维细胞转化作用的研究（论文文献综述）
张岩[1]（2019）在《EBV相关胃癌中NF-κB经典信号通路持续激活的机制研究》文中认为EB病毒（Epstein-Barr virus,EBV）属γ疱疹病毒亚科,全球成人的感染率高达90%以上,能够在宿主细胞内长期潜伏,与多种人类肿瘤的发生有关,是公认的DNA肿瘤病毒。EBV相关肿瘤中几乎所有的肿瘤细胞均可检测到EBV基因组的存在,EBV在宿主细胞中建立的潜伏感染是其重要的致癌基础,EBV通过其潜伏期基因产物影响受感染细胞的基因表达及生物学行为参与相关肿瘤的发生发展。EBV相关胃癌（EBV-associated gastric carcinoma,EBVaGC）是胃癌的一种独特亚型,是发病人数最高的EBV相关肿瘤,与EBV阴性胃癌（EBV-negative gastric carcinoma,EBVnGC）相比具有独特的临床病理特征,但其发病机制尚未完全明了。EBV编码的潜伏基因产物可参与多种细胞信号通路的传导,如NF-κB、JNK、STAT3和PI3K/AKT等,通过一系列级联反应参与宿主细胞基因和病毒基因的表达调控,诱导细胞转化、促进细胞增殖、抑制细胞的分化和凋亡,从而导致EBV相关肿瘤的发生。转录因子NF-κB是与细胞增殖、免疫反应、炎症反应和肿瘤密切相关的重要的调节因子,持续激活的NF-κB信号通路能够通过上调其下游分子的表达来诱导细胞增殖,抑制肿瘤细胞的凋亡。NF-κB信号通路在肿瘤发生发展中的重要作用在多种EBV相关肿瘤中已被阐述,但其在EBVaGC中的具体作用机制还不明确。目的:1通过检测胃癌细胞系及胃癌组织中NF-κB经典信号通路相关分子的表达及亚细胞定位,明确EBVaGC和EBVnGC中NF-κB经典信号通路的激活情况。2探讨EBV通过潜伏感染激活NF-κB经典信号通路的具体机制。3检测分析NF-κB信号通路对EBV阳性胃癌细胞增殖和凋亡等细胞生物学行为,以及EBV潜伏膜蛋白LMP1、LMP2A表达的影响。方法:1提取EBV阴性胃癌细胞系（SGC7901,BGC823,HGC27）、EBV阳性胃癌细胞系（GT38,GT39,SNU719）总RNA和总蛋白,采用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,qRT-PCR）对NF-κB信号通路相关分子（NFKBIA、TRAF1/2/3/6）的转录表达进行检测;Western blot检测并分析其蛋白表达水平;免疫荧光技术检测胃癌细胞系中p65蛋白的亚细胞定位;ELISA技术检测细胞系中NF-κB转录因子与DNA结合能力,综合判断NF-κB信号通路在胃癌细胞系中的激活情况。2免疫组化技术检测EBVaGC和EBVnGC肿瘤组织中IκBα及p65蛋白表达及亚细胞定位。3采用不同浓度的NF-κB信号通路抑制剂BAY11-7082作用EBV阳性胃癌细胞系SNU719及EBV阴性胃癌细胞系SGC7901,24h后CCK-8检测细胞存活情况。4采用流式细胞技术及Annexin-FITC试剂盒分别检测浓度为2.5μM、5μM和10μM的NF-κB信号通路抑制剂BAY11-7082作用12h后对EBV阳性胃癌细胞系GT38凋亡的影响。Western blot检测BAY11-7082、MG-132不同浓度及不同处理时间IκBα和磷酸化IκBα以及凋亡相关蛋白（Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3）的表达。5采用2.5μM,5μM,10μM浓度的BAY11-7082作用EBV阳性胃癌细胞系GT38,12h后收集细胞提取总蛋白,Western blot检测转录因子ZEB1蛋白的表达变化情况。6采用BGS特异性引物对NFKBIA基因启动子区进行扩增,该区域含有83个CpG位点,随机选取扩增条带进行TA克隆,每个样本挑选6个克隆,根据所测6个TA克隆总CpG位点中发生甲基化的比例计算甲基化率。7 PCR结合DNA测序技术检测胃癌细胞系IκBα基因突变情况。8 miRBase和rna22网站预测EBV编码的miR-BART16含有IκBα3’UTR结合位点,将IκBα3’UTR靶定序列或其突变序列分别克隆至双荧光素酶报告基因质粒,连同相应的模拟物共转染HEK293T细胞检测其荧光素酶的表达。9构建分别携带EBV潜伏膜蛋白LMP1和LMP2A编码基因的重组表达质粒,分别转染EBV阴性胃癌细胞系SGC7901,同时设置空载对照。收集转染2h、6h、24h、48h、72h的实验组细胞,并提取各组细胞总蛋白,Western blot检测相关蛋白表达的变化。设计并合成靶向LMP1编码基因的siRNA及对照序列（NC）,转染EBV阳性胃癌细胞系GT38,作用48h收集细胞,提取细胞总蛋白和总RNA,Western blot和qRT-PCR检测IκBα的表达变化。10分别转染LMP1和LMP2A重组质粒至EBV阴性胃癌细胞系SGC7901,同时设置空载对照质粒,G418筛选实验及流式细胞仪分选后建立稳定表达LMP1和LMP2A的SGC7901细胞克隆以及载体对照细胞系,Western blot检测稳定表达外源性LMP1和LMP2A的细胞克隆NF-κB信号通路相关基因的表达。11设计并合成靶向TRAF1编码基因的siRNA转染EBV阳性胃癌细胞系GT39,检测下调TRAF1表达对NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响。12采用qRT-PCR和免疫组织化学技术检测EBV阳性胃癌细胞系GT38、GT39及EBVaGC组织中miR-BART16与LMP1的相对表达水平。13在GT38和GT39细胞系中分别转染miR-BART16的模拟物、抑制物及对照序列,浓度分别为10nM,30nM和50nM,作用48 h收集细胞,提取各组细胞总RNA和总蛋白检测LMP1的表达。选取50nM浓度miR-BART16模拟物、抑制物及对照序列,分别转染GT38和GT39细胞,采用CCK-8检测转染24h,48h,72h的细胞增殖情况。14 miR-BART16模拟物与抑制物作用GT38、GT39细胞48 h,采用流式细胞技术检测对细胞凋亡的影响,同时采用PI及BrdU染色分析miR-BART16模拟物与抑制物作用后对细胞周期的影响。结果:1 EBV阳性胃癌细胞系NF-κB信号通路抑制因子NFKBIA的转录表达水平明显低于EBV阴性胃癌细胞系（P<0.005）,EBV阳性胃癌细胞系中TRAF1、TRAF3、TRAF6转录水平均高于EBV阴性胃癌细胞系,TRAF2转录水平明显低于阴性胃癌细胞系;EBV阳性胃癌细胞系中IκBα蛋白表达均较EBV阴性胃癌细胞系明显降低;而两种细胞系中磷酸化IκBα蛋白的表达则无明显差异;p65及p-p65蛋白表达亦无明显差异。EBV阳性胃癌细胞系中TRAF1蛋白表达明显高于EBV阴性胃癌细胞,而EBV阳性胃癌细胞系TRAF2、TRAF3和TRAF6蛋白的表达均低于EBV阴性胃癌细胞系。2 EBV阳性胃癌细胞系中p65蛋白的核内转位约占50%,而EBV阴性胃癌细胞系则较少检测到核内转位。EBV阳性胃癌细胞系GT38、GT39和SNU719的p65-DNA结合能力均高于EBV阴性胃癌细胞系。3 EBVaGC组织中IκBαmRNA的转录表达水平明显低于EBVnGC组织及癌旁组织,EBVaGC组织中IκBα蛋白表达较EBVnGC组织弱,而发生p65核转位的肿瘤细胞多于EBVnGC组织。4 EBV阳性胃癌细胞系SNU719对NF-κB信号通路抑制剂BAY11-7082作用的敏感性明显强于EBV阴性胃癌细胞系SGC7901。5与DMSO对照组比较,2.5μM BAY11-7082处理组SNU719细胞凋亡率无明显变化（P>0.5）,5μM和10μM处理组的细胞凋亡率明显升高,最高达51.5%,差异有显着性（P<0.001）。MG-132及BAY11-7082信号通路抑制剂作用后均能对凋亡相关蛋白的表达产生不同程度的影响。6 2.5μM浓度BAY11-7082作用细胞后ZEB1蛋白表达无明显变化（P>0.5）,5μM和10μM浓度作用后,ZEB1蛋白表达明显下调（P<0.01）。7 EBV阳性胃癌细胞系中NFKBIA基因启动子区甲基化率:GT38为0.80%,GT39为0.80%,SNU719为0.4%,均呈低甲基化状态。8 EBV阳性胃癌细胞系GT38、GT39和SNU719 NFKBIA基因第一外显子区均存在12bp的片段缺失（+615+626delCGCCCCCAGGAG）,造成4个氨基酸的丢失,而在EBV阴性胃癌细胞系未检测到该片段的缺失.9 EBV-miR-BART16不能直接影响带有h-NFKBIA-3’UTR的荧光素酶的表达,IκBα的表达不受miR-BART16的直接调控。10与载体对照组比较,转染LMP1重组表达质粒的SGC7901细胞IκBα各时间段均表达下调,72h表达量是对照组的40%,磷酸化p-IκBα表达上调,在7h表达水平最高（2.15倍）;p65总蛋白的表达较对照组降低,而磷酸化p-p65表达随作用时间上调。TRAF1表达上调,72h可达2.01倍,而TRAF2/3/6表达下调。干扰LMP1,其mRNA表达是对照组的26%,而IκBα的mRNA转录表达未见明显改变（P>0.05）,LMP1蛋白水平表达下调,IκBα蛋白表达水平则出现上调现象。11与空白对照比较,转染LMP2A重组表达质粒的SGC7901细胞IκBα各时间段均表达下调,48h下调最明显,表达量仅是对照组的29%,p-IκBα的表达上调,在72h达到最高（3.32倍）;p65总蛋白的表达较对照组降低,而p-p65表达随作用时间而上调。TRAF1表达上调,72h可达2.51倍,而TRAF2/3表达下调,TRAF6略有下调。12与空白对照比较,稳定转染LMP1/2A均能下调IκBα表达,表达量仅是对照组的67%和61%,p-IκBα的表达上调,为对照组的1.35倍和1.47倍,p65总蛋白和磷酸化蛋白的表达无明显差异,TRAF1分别上调2.15倍和1.46倍,而TRAF2/6表达下调,TRAF3表达无明显变化。13靶向TRAF1的siRNA作用EBV阳性胃癌细胞系GT39 48h和72h后,p65和IκBα总蛋白及磷酸化蛋白表达均未发生明显变化。14与GT38和GT39细胞系比较,EBVaGC组织中miRNA-BART16表达量明显高于2种EBV阳性胃癌细胞系,约为14-165倍。qRT-PCR及免疫组化技术在10例EBVaGC组织中均未检测到LMP1的表达。15与阴性对照组比较,GT38和GT39细胞系转染miR-BART16模拟物后,LMP1mRNA与蛋白表达水平均随转染浓度的增加而降低;而转染miRNA-BART16抑制物以后,LMP1 mRNA与蛋白表达水平均随转染浓度的增加而增加,呈明显的量效关系。16 miR-BART16转染GT38和GT39细胞48 h和72 h后,CCK-8检测显示其模拟物能够明显抑制细胞增殖（P<0.05）,而转染miR-BART16抑制物后,细胞增殖明显增强（P<0.05）。17在GT38和GT39细胞中转染miR-BART16模拟物及抑制物,细胞凋亡没有发生明显变化（P>0.05）;转染miR-BART16抑制物48h后,细胞周期阻滞在G2/M期,而转染模拟物后没有明显的变化。结论:1 EBV阳性胃癌的细胞系和EBVaGC组织均存在NF-κB经典信号通路的持续激活,LMP1和LMP2A的表达是该信号通路激活的重要原因。2 NF-κB信号通路的激活可促进上皮细胞间质转化相关分子及潜伏膜蛋白的表达,从而导致EBV阳性肿瘤细胞增殖,抑制其凋亡。3κBα基因第一外显子在EBV阳性胃癌细胞系存在一段12bp的缺失,造成4个氨基酸的丢失。4 EBVaGC中IκBα基因的低表达不受启动子区甲基化和miR-BART16的调控。5 miR-BART16能够在mRNA及蛋白水平下调LMP1的表达,抑制miR-BART16表达能够促进细胞增殖,诱导细胞G2/M期阻滞。
曾毅[2]（2002）在《病毒与肿瘤》文中研究指明 病毒可以通过不同机制诱发人恶性肿瘤,包括 DNA 病毒和 RNA 病毒。病毒可以直接作用于细胞基因,使其增生,最后发展成癌。另一是由于机体免疫系统受到抑制,病毒诱发细胞恶性变,形成癌症。后者例如艾滋病人由于 HIV 感染引起的免疫缺陷,很多病人易发生卡波西（Kaposi）肉瘤及淋巴瘤。另外一些病毒,
曾毅[3]（2001）在《病毒与肿瘤》文中研究说明 病毒可以通过不同机制诱发人恶性肿瘤,包括DNA病毒和RNA病毒.病毒可以直接作用于细胞基因,使其增生,最后发展成癌,另一是由于机体免疫系统受到抑制,病毒诱发细胞恶性变,形成癌症.后者例如艾滋病人由于HIV感染引起的免疫缺陷,很多病人易发生卡波西（Kaposi）肉瘤及淋巴瘤.另外一些病毒,如单纯疱疹病毒,曾被怀疑与生殖器及肛门癌症有关,这是根据血清流行病学及部分灭活的单纯疱疹病毒能使鼠细胞转化而提出的.虽然这些病毒在流产型感染时能使细胞发生突变,或细胞DNA扩增,但经过多年的研究,未能证实单纯疱疹病毒与人的肿瘤有关.另外有三类病毒:包括多瘤病毒组（BK,J,C,LPV）,腺病毒和痘类病毒（传染性温疣病毒）,不能在特定的肿瘤中经常发现,故未有肯定的结论.
徐海芹[4]（2019）在《不同类型淋巴瘤组织中EB病毒的表达及EBNA1多态性研究》文中提出目的检测100例淋巴瘤患者中潜伏膜蛋白1（LMP1）及EBV编码的小多聚腺苷酸RNA（EBER）的表达情况,筛选EBV阳性的淋巴瘤病例,为核抗原（EBNA1）基因羧基端测序做准备;同时观察LMP1与EBER的相关性及二者的表达与淋巴瘤类型的相关性,为淋巴瘤的诊断提供依据;对EBV阳性病例进行EBNA1羧基端测序分析,观察是否存在突变热点AA487及AA466-527之间的变异。方法采用免疫组化（Envision）二步法检测100例淋巴瘤组织标本中LMP1蛋白的表达情况;采用原位杂交的方法检测100例淋巴瘤组织标本中EBER的表达情况,筛选出EBV阳性病例;同时比较两种方法的敏感性;用聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）方法对EBV阳性病例进行EBNA1基因羧基端的扩增,并将扩增产物送公司进行测序分析。同时分析淋巴瘤EBV表达与预后的相关性。结果（1）从LMP1及EBER的表达率看,不同类型淋巴瘤中,仅经典型霍奇金淋巴瘤（HL）及弥漫性大B细胞淋巴瘤表达LMP1。并且经典型霍奇金淋巴瘤LMP1阳性表达率（8/17,约47%）明显高于弥漫性大B细胞淋巴瘤中LMP1的表达率（1/56,1.79%）（χ2=20.718,P<0.05）,具有统计学意义。不同类型淋巴瘤中,仅NK/T细胞淋巴瘤、经典型霍奇金淋巴瘤（HL）及弥漫性大B细胞淋巴瘤表达EBER。其余类型淋巴瘤中非肿瘤细胞可散在表达EBER。NK/T细胞淋巴瘤EBER阳性表达率最高（8/9,约89%）,霍奇金淋巴瘤EBER阳性表达率次高（10/17,约59%）,二者均明显高于弥漫性大B细胞淋巴瘤中EBER的表达率（3/56,5.36%）（χ2=32.770,χ2=21.948;均P<0.05）,具有统计学意义。原位杂交的方法检测EBER在总淋巴瘤患者中的阳性表达率（21/100,21%）明显高于免疫组化方法检测LMP1在总淋巴瘤患者中的阳性表达率（9/100,9%）（χ2=5.647,P<0.05）,具有统计学意义。（2）从LMP1及EBER表达模式看,LMP1阳性表达位于细胞膜、细胞质及核旁体,EBER阳性信号则定位于细胞核内。LMP1阳性的肿瘤细胞通常散在分布,而EBER阳性的肿瘤细胞通常呈簇状或片状分布、甚至弥漫分布,也会出现EBER阳性的非肿瘤细胞。（3）本次实验成功扩增15例具有EBER阳性细胞（包括肿瘤细胞和非肿瘤细胞）淋巴瘤EBNA1基因羧基端的部分片段,包括经典型霍奇金淋巴瘤7例、弥漫性大B细胞淋巴瘤3例、NK/T细胞淋巴瘤3例、滤泡性淋巴瘤1例和T淋巴母细胞性淋巴瘤1例。其中弥漫性大B细胞淋巴瘤、NK/T细胞淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤的扩增产物较多,这与EBER阳性结果基本一致。（4）通过对15例淋巴瘤EBNA1基因羧基端测序分析,其编码产物为AA439-555。与标准株B95-8相比,15例EBV阳性淋巴瘤组织标本中EBNA1羧基端均出现序列变异。几例具有非肿瘤细胞EBER阳性的淋巴瘤,也均出现了与以往研究相同的共有突变（突变热点AA487及AA466-527之间的变异）。而具有肿瘤细胞EBER阳性的淋巴瘤样本中除了有部分共有突变外,均出现了非共有突变。（5）由于病例数较少,EBV与预后相关性有待于大样本进一步分析。结论淋巴瘤中EBV的表达与NK/T细胞淋巴瘤、经典型霍奇金淋巴瘤密切相关,并且可以作为辅助诊断此两种淋巴瘤的依据。并且弥漫性大B细胞淋巴瘤可伴有一定比例的EBV感染。EBER原位杂交的检测方法较为敏感并且EBER的表达模式有助于淋巴瘤类型的判定。EBNA1基因羧基端扩增产物量与EBER阳性表达结果基本一致,说明EBER的表达常常伴随EBNA1的表达。本组淋巴瘤病例中,除了有部分EBNA1基因羧基端的共有突变外,均出现了非共有突变,这与以往研究不同,为探索EBV的致病机制提供一定的价值,有待于进一步研究。另外,由于病例数较少,EBV与预后相关性有待于大样本进一步分析。
韩汝晶,F.Huang,E.Kieff,曾毅[5]（1990）在《鼻咽癌病人EB病毒EBNA-2A及EBNA-LP IgG和IgA抗体的测定》文中研究指明Epstein-Barr病毒核抗原（EBNA）是EB病毒潜伏感染时表达的主要抗原之一。它与EB病毒潜伏感染和转化正常细胞引起肿瘤有关。本实验用间接免疫荧光法（IIF）,采用经EB病毒表达EBNA-2A及EBNA-LP的基因组转染的大鼠成纤维细胞作为靶细胞,测定了30例鼻咽癌（NPC）病人和30例正常人血清中的EBNA-2A及EBNA-LP的IgG和IgA抗体,结果表明,30例NPC病人的IgG/EBNA-2A抗体阳性率为100％,平均几何滴度（GMT）为1:38.9。而30例正常人的阳性率为70％,GMT为1:7.9。两者有显着性差异。在30例NPC病人IgG/EBNA-LP抗体的阳性率为87％,GMT为1:9.3。30例正常人的阳性率为67％,GMT为1:7.9。两者之间无明显差异。IgA/EBNA-2A和IgA/EBNA-LP抗体在NPC病人和正常人均为阴性。这可能是由于在NPC病人癌细胞中没有EBNA-2A和EBNA-LP这两种抗原的表达。这结果对进一步研究EB病毒与NPC发生的关系有一定意义。
罗兵[6]（2008）在《Epstein-Barr Virus（EBV）感染与胃癌发生的分子机理研究》文中研究表明第一部分EB病毒感染与胃癌发生关系的研究目的明确胃癌组织中EB病毒（Epstein-Barr Virus,EBV）潜伏期和裂解期基因的表达情况,在分子水平探讨EBV及其编码基因在胃癌发生发展中的作用。方法应用PCR-Southern杂交检测185例胃癌组织和相应癌旁组织中特异性EBV DNA,进一步用原位杂交技术检测PCR阳性标本石蜡切片组织中EBV小RNA（EBER1）的表达,以确证EBV相关胃癌（EBV-associated gastric carcinoma,EBVaGC）。应用RT-PCR和Southern杂交检测EBVaGCs组织中EBV启动子（Qp、Wp和Cp）、潜伏期基因（核抗原EBNA1和EBNA2,潜伏膜蛋白LMP1、LMP2A和LMP2B）和裂解期基因（即刻早期基因BZLF1和BRLF1,早期基因BARF1和BHRF1,晚期基因BcLF1和BLLF1）的表达。结果①185例胃癌组织中有13例为EBVaGCs（7.03%）,相应癌旁组织均为阴性,二者之间EBV检出率的差别有显着性（χ2=11.0769,P=0.0009）。统计学分析表明EBVaGCs和EBV阴性胃癌（EBV-negative gastric carcinoma,EBVnGC）在年龄、病理类型、临床分期、淋巴结转移和发病部位的差异均无显着性,P值分别为0.669,0.141,0.259,0.818,0.064,但性别之间的差异有显着性,男性EBV阳性率高于女性（χ2=3.9404,P=0.0471）。②13例EBVaGCs组织中EBV启动子Qp表达阳性而Wp和Cp均为阴性。③潜伏期基因EBNA1表达均为阳性,有5例LMP2A表达阳性,而EBNA2、LMP1和LMP2B mRNA均为阴性。④裂解期基因中即刻早期基因BZLF1有6例表达阳性,而BRLF1 mRNA均为阴性;早期基因中有6例BARF1表达阳性,2例BHRF1表达阳性;晚期基因BcLF1有7例表达阳性,而BLLF1 mRNA均为阴性。结论①EBV感染与胃癌的发生发展有一定相关性,EBVaGC好发于男性,但EBV感染与胃癌病人年龄、病理类型、临床分期、淋巴结转移和发病部位无明显相关性。②EBVaGC组织中病毒潜伏状态为Ⅰ型潜伏或介于Ⅰ和Ⅱ型潜伏之间的独特类型。③部分EBVaGC组织中可检测到EBV裂解期基因的表达,早期基因BARF1和BHRF1在胃癌发生和发展过程中可能发挥重要作用,但EBV部分裂解期基因发生的机制以及在胃癌发生发展过程中的作用有待进一步研究。第二部分EB病毒对人胃癌细胞系HSC-39感染的研究目的探讨EB病毒（Epstein-Barr virus,EBV）对人胃癌细胞系的感染作用和感染机制。方法采用Akata和P3HR-1 EBV毒株分别感染人胃印戒细胞癌细胞系HSC-39,有限稀释法对感染细胞进行克隆。对感染的亲代细胞及细胞克隆进行下述检测:免疫荧光检测EBV核抗原（EBNA）、原位杂交检测EBV小RNA1（EBER1）以及PCR-Southern检测EBV基因组以确证EBV感染。镜下观察细胞形态学变化,MTT法和细胞软琼脂试验检测细胞增生能力。Western印迹检测EBV核抗原（EBNA）1、EBNA2、潜伏膜蛋白（LMP）1、ZEBRA和早期抗原D（EA-D）的表达;RT-PCR和Southern杂交检测EBNA2、LMP1、LMP2A和EBNA启动子Qp、Wp、Cp的表达。流式细胞技术（FACS）和RT-PCR检测CD21分子的表达。结果①HSC-39细胞对两种EBV毒株均易感,感染的亲代细胞及细胞克隆均可检测到EBV EBNA及EBER1的表达,所有EBNA阳性克隆及部分阴性克隆中均检测到EBV DNA。②两种EBV毒株感染的细胞克隆表现出不同的形态学特征及生长方式。③EBV感染的亲代细胞及大部分细胞克隆表达EBNA1,但不表达EBNA2、LMP1和LMP2A;EBNA启动子Qp表达阳性,而启动子Cp、Wp未见表达。亲代细胞及所有细胞克隆未观察到裂解感染。④未感染的HSC-39细胞及P3HR-1感染的细胞克隆CD21表达阴性,而Akata EBV感染的部分细胞克隆CD21 mRNA呈低水平表达。结论①HSC-39细胞对两种EBV毒株均易感,EBV感染可改变HSC-39的细胞表型,且不同EBV毒株对其影响不同,提示印戒细胞癌细胞系可用作EBV感染的靶细胞。②EBV可通过CD21受体非依赖途径感染HSC-39细胞。第三部分LMP1沉默对AP-1信号转导通路的影响目的探讨LMP1沉默对AP-1信号转导通路及其下游与细胞转化,增殖,分化和凋亡相关因子的影响。方法应用50nM靶向LMP1功能区编码序列的siRNA649转染EBV阳性的胃癌上皮细胞GT38,采用Hoechst 33258和透射电镜技术检测GT38细胞凋亡情况;RT-PCR方法检测LMP1沉默对c-Jun,survivin,CDK4和MMP9的mRNA转录表达的影响;免疫组化方法检测survivin蛋白表达的改变;Western Blotting检测对c-Jun,JunB和CDK4蛋白表达的影响。结果①Western blotting结果显示,与细胞对照比较,转染siRNA649后48h未检测到LMP1的表达,转染后72和96h时LMP1的表达减弱。②Hochest 33258染色可见siRNA649作用后的GT38细胞发生凋亡,透射电镜观察到GT38细胞线粒体空泡化,染色质固缩;而转染非特异性对照siRNA的GT38细胞未观察到上述改变。③RT-PCR、Western Blotting以及免疫组化检测结果显示:与GT38细胞对照比较,LMP1特异性沉默后,c-Jun,survivin,JunB和MMP9表达水平降低,CDK4表达上调。结论靶向LMP1功能区编码序列的siRNA6可有效干扰LMP1的表达,LMP1特异性沉默可影响AP-1及其下游相关因子的表达,进而抑制细胞增殖,促进细胞调亡。
刘洋[7]（2012）在《手机辐射致癌效应的细胞生物学研究》文中认为随着科学技术的迅猛发展和对无线通信的需求日益增加，手机已经被广泛使用并且极大地提高了人们的生活质量。与此同时，手机辐射作为可能危害人体健康的新的环境污染因素也引起了人们的关注。为了防护它对人类健康的负面影响，科学家们从流行病学、体内实验和体外实验等方面进行了深入的研究，然而，迄今为止还没有一个具有说服力的证据能够证明手机辐射与癌症发生之间可能存在的联系。本课题从细胞生物学角度对手机辐射的致癌效应进行了研究。首先是手机辐射对Raji细胞中EB病毒早期抗原的诱导作用。Raji细胞是携带有潜伏状态EB病毒的细胞系，正常情况下只表达EB病毒核抗原（EBNA）。在受到外界物理或化学因素刺激时，可以表达EB病毒早期抗原（EBV-EA）在内的多种抗原。实验中将Raji细胞分为四组，每组3瓶。其中A组和B组为非辐照组，C组和D组为辐照组，每天在细胞培养箱中使用通话状态手机辐照4小时。进行辐照实验时，将细胞培养瓶的几何中心置于手机天线的正上方，细胞培养瓶底与手机表面距离为1mm。根据SPEAG DASY5测试系统的测量结果显示，辐照手机的SAR值为0.020mw/g（1g取平均）。辐照实验共进行4周，在每次进行免疫组化检测前，使用终浓度为1ng/mL的TPA作用B组和D组细胞48小时。在每周辐照实验后，收集各组细胞，进行细胞免疫组化检测。实验结果表明，手机辐射能够诱导EBV-EA表达，在促癌剂TPA的作用下，这种诱导作用更为明显。其次本课题还研究了手机辐射对NIH/3T3细胞的转化作用。NIH/3T3细胞体外培养恶性转化系统对环境中的致癌物或促癌物较为敏感，是一种筛选致癌物或促癌物的经典方法。辐照实验采用连续辐照和间隙辐照两种方式进行。在累计40天每天12小时的连续辐照实验中，手机辐射对NIH/3T3细胞的形态和生长速率没有产生明显的影响，但是在细胞粘附性实验中发现，手机辐射能够增加NIH/3T3细胞对DB Matrigel胶的粘附性。而在累计16天的间歇辐照实验中（辐照50分钟间断10分钟，每天重复10次），使用单细胞凝胶电泳技术未能检测出由手机辐射引起的DNA损伤，但是TPA与手机辐射共同对细胞DNA造成的损伤作用比TPA单一因素作用更为明显。本实验结果表明，手机辐射能够诱导Raji细胞中EBV-EA表达。而在另一个实验中，虽然NIH/3T3细胞在形态和增殖方面没有明显变化，但手机辐射与TPA共同作用时与TPA组相比有明显的DNA损伤作用。本研究为揭示手机辐射与癌症发生之间可能存在的联系提供了依据。
李睿[8]（2018）在《基于EB病毒潜伏期膜蛋白的鼻咽癌诊治用单克隆抗体的筛选研究》文中指出鼻咽癌是我国的高发恶性肿瘤之一,发病率居耳鼻咽喉部位恶性肿瘤之首。因发病部位解剖结构复杂,鼻咽癌一般不适合手术,而是首选放射治疗。目前放射治疗对早期鼻咽癌患者的治愈率己高达90%以上,但由于早期筛查方法的局限性,大部分鼻咽癌确诊患者已发展到临床中晚期,常伴发远端转移;另外,部分鼻咽癌患者在放射治疗后容易复发。总之,此类临床晚期、转移性或复发性的鼻咽癌严重拉低患者的五年生存率。因此,探索更高效特异的鼻咽癌诊治用的生物靶标日渐成为重要的鼻咽癌研究方向。鼻咽癌与EBV关系密切,在鼻咽癌患者中EBV以II型潜伏态存在,表达一种核心蛋白EBNA1和两种重要的膜蛋白LMP1和LMP2。其中,LMP1和LMP2作为主要的癌蛋白,被认为与鼻咽癌的发生发展密切相关。自90年代起,许多研究人员己提出LMP1和LMP2可作为重要的鼻咽癌诊治用靶标蛋白,但至今未能在临床中获得有效应用。本研究拟以LMP1和LMP2作为研究对象,通过免疫原制备探索和特异性单克隆抗体的筛选鉴定,以期获得适合鼻咽癌诊治用的特异性抗体,为LMPs作为鼻咽癌诊治靶标的探索提供科学依据。本论文的第一部分旨在利用小鼠单克隆抗体筛选平台,从免疫原制备方式比较、免疫佐剂和免疫方案组合比较、抗体筛选方法比较以及抗体性能评价等方面探索LMPs相关鼻咽癌特异性诊治抗体的筛选策略。首先,通过LMPs的氨基酸序列分析确定出LMP1和LMP2各胞外区的氨基酸序列组成,采用多肽化学合成、多肽串联原核表达、全序列昆虫细胞真核表达、全序列哺乳动物细胞表达等不同方式制备出一系列LMPs免疫原,发现LMPs胞外区序列的疏水性严重影响合成肽的合成质量和重组抗原的活性。其次,利用上述制备的LMPs抗原,结合弗氏佐剂、铝佐剂、CpG佐剂以及多糖类、小分子激动剂等免疫佐剂,设计了多种免疫方案进行小鼠免疫,通过常规ELISA和条带Western Blot评价不同免疫方案下的LMPs特异性抗体应答效果,发现合成肽SPL1-3偶联组和有目的抗原表达的全细胞免疫组能诱导出LMPs特异性抗体应答,但不同免疫佐剂的免疫应答比较未见显着差异。再次,比较了全细胞裂解液和膜蛋白包被ELISA与细胞ELISA、ELISPOT以及基于多肽的流式分选等不同筛选方法,发现基于多肽的B细胞分选特异性较差,而细胞ELISA检测灵敏度高且操作方便,是适合细胞膜抗原高通量抗体筛选的最佳筛选策略。最后,对筛选到的98株LMPs抗体进行性质鉴定和应用探索,发现4株LMP1胞内区特异性单抗具有良好的天然抗原结合能力,其识别表位为首次报道;组织学分析显示anti-LMP1单抗9F2和anti-LMP2单抗3A7在免疫组化检测中有良好的灵敏度和特异性,有望成为鼻咽癌临床组织学诊断新工具;另外,发现单抗9F2转染入胞后能显着降低LMP1阳性细胞内NF-κB水平,对细胞的生长具有一定的抑制作用,显示出潜在的治疗价值。据报道,兔单抗与小鼠单抗相比,其识别的表位更加丰富,对于多肽或小分子等低免疫原性的抗原具有更好的识别能力。鉴于LMPs抗原在小鼠中的免疫原性较弱,本研究的第二部分工作旨在建立一个高效的兔单抗筛选平台,探索LMPs在实验兔中的抗体应答情况,为筛选更好的LMPs特异性单抗奠定基础。首先,确定了兔B细胞群的流式细胞分选方案。第二,构建了兔B细胞的单细胞PCR方法,抗体的轻重链基因扩增成功率为60-100%。第三,建立了兔B细胞体外刺激培养方法和最佳的兔B细胞体外培养条件,在该条件下兔B细胞体外培养阳性率（OD值>0.5）平均为38.75%。第四,构建了兔单抗体外重组表达载体pRVRCH/pRVRCL,可满足兔抗体基因在HEK293表达系统中的高效表达。第五,基于此技术平台,分别制备了特异识别戊肝病毒和轮状病毒的两种兔单克隆抗体,验证了兔单抗筛选平台的可行性,并发现实验兔较实验鼠表现出免疫应答速度更快、滴度更高,倾向于产生更高的亲和力的抗体的优越性。最后,本研究利用兔单抗筛选平台对LMPs特异性抗体应答进行了初步探索,结果显示细胞抗原和LMP2A的N端重组抗原能够在实验兔中产生明显的抗体应答,尤其是重组抗原在实验兔中的抗体应答滴度较其在实验鼠中的应答滴度提升10-100倍,为进一步筛选LMPs兔单抗奠定坚实基础。综上所述,本论文针对EB病毒潜伏期膜蛋白LMP1和LMP2的胞内和胞外区特异性抗体的筛选策略进行了全面的探索,成功获得了具有应用潜力的胞内区抗体,证实LMPs特定的合成肽和有目的抗原表达的全细胞抗原可以在小鼠体内诱导出针对LMPs膜外区的抗体应答,建立了高效的兔单克隆抗体筛选和表达平台,为LMPs相关鼻咽癌特异性诊治抗体的开发奠定了基础。
王露[9]（2019）在《EBV相关传染性单核细胞增多症患者血清外泌体病毒相关成份初步探讨》文中研究指明目的:探讨EB病毒相关传染性单核细胞增多症（Epstern-Barr Virus Association Infectious Mononucleosis,EBV-IM）患者血清外泌体中EBV-DNA载量和EB病毒衣壳抗原（viral capsid antigen,VCA）、核抗原-1（nuclear antigen-1,EBNA-1）、核抗原-2（nuclear antigen-2,EBNA-2）、潜伏膜蛋白-1（latent membrane protein-1,LMP-1）、糖蛋白350（glycoprotein 350,gp350）等病毒蛋白表达水平,为EBV-IM的发病机制研究提供一些新思路。方法:选取我院住院患者检测EBV-CA-IgM（+）且临床确诊为EBV-IM的患者18例,为实验组;EBV-CA-IgM（-）/EBV-CA-IgG（+）且临床诊断非EBV-IM的患者13例,为对照组。收集两组患者外周血血清,采用差速离心法分离以上两组患者血清中的外泌体,并用Western blot和透射电子显微镜（transmission electron microscopy,TEM）技术鉴定外泌体;采用实时荧光定量PCR（fluorescence quantitative PCR,FQ-PCR）检测血清外泌体中EBV-DNA载量;采用酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测血清外泌体中EBV-CA、EBNA-1、EBNA-2、LMP-1、gp350等病毒蛋白表达水平;用SPSS 20.0统计软件和相关统计学方法分析实验数据。结果:（1）本实验成功分离出两组受检对象血清中的外泌体。该外泌体通过TEM观察为大小较均一,形态呈杯口状或圆盘状,直径约30150 nm的小囊泡,同时采用Western blot检测到外泌体标志性蛋白CD63的表达进一步证实为外泌体。（2）血清外泌体中EBV-DNA载量检测结果显示:实验组受检人数为18例,检出率为55.56%,对照组受检人数13例,未检出;实验组EBV-DNA载量检出率明显高于对照组,差异有统计学意义（2χ=10.661,P<0.05）。（3）两组血清外泌体中EBV-CA、EBNA-1、EBNA-2、LMP-1及gp350等病毒蛋白表达水平结果如下:实验组血清外泌体中的EBV-CA、EBNA-1、EBNA-2、LMP-1及gp350等病毒蛋白表达水平结果用中位数（下四分位数,上四分位数）显示分别为0.21055（0,0.45925）、0.4541（0,0.49605）、0.2157（0,0.465525）、0.4442（0,0.484425）、0（0,0.451425）;对照组分别为0.59（0.0364,0.6099）、0.0052（0,0.55035）、0.5983（0.04935,0.63195）、0.5236（0.04195,0.56975）、0.5837（0.0292,0.6108）;其中两组间EBV-CA、EBNA-2、LMP-1及gp350等病毒蛋白表达水平差异有统计学意义（P<0.05）,两组间EBNA1的表达水平差异无统计学意义（P>0.05）。结论:（1）血清外泌体中EBV-DNA载量的检测可能对EBV-IM的诊断有一定的价值;（2）实验组和对照组的血清外泌体中EB病毒相关组分存在明显差异,其意义有待进一步探讨。
杨星[10]（2013）在《秦巴山区精神发育迟滞患者家系人群B淋巴细胞永生细胞库的建立及影响因素初探》文中认为精神发育迟滞（Mental retardation, MR）是一类神经与精神疾病,在人群中发病率为1-3%,带给患者、家庭及社会沉重的经济与精神负担。发病因素涉及环境和遗传因素,对其致病机理研究方兴未艾。用EB病毒体外转化人外周血B淋巴细胞,建立永生细胞库,可以源源不断的为各种复杂的遗传性疾病致病机理研究提供大量材料（细胞、DNA和蛋白质）,可扩大和保存一些珍贵的遗传资源,为进一步研究致病机理和干预奠定基础。本研究在知情同意的原则下,收集了141例精神发育迟滞患者及家系成员外周血样品,利用EB病毒体外转化技术,将MR家系人群外周血B淋巴细胞转化为类淋巴母细胞系,建立永生细胞库。建系成功后,采用遗传学方法对其进行鉴定。结果发现,淋巴母细胞系能够表达EB病毒基因,可连续传代,扩大培养,并且保持了成熟B淋巴细胞的生物学特性。对建库成功后的细胞株进行了复苏和传代培养,结果发现在传到第17代时,细胞生长速度开始变慢,经半定量RT-PCR检测,我们发现cyclin D1、cdc2、p53和c-myc基因的表达出现异常,推测其可能是导致细胞传代过程中增殖速度发生变化的主要原因。
二、EB 病毒核抗原(EBNA)的表达与大鼠成纤维细胞转化作用的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、EB 病毒核抗原(EBNA)的表达与大鼠成纤维细胞转化作用的研究（论文提纲范文）
（1）EBV相关胃癌中NF-κB经典信号通路持续激活的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 NF-κB经典信号通路在EBV相关胃癌中持续激活的机制研究 |
| 材料与方法 |
| 1 仪器、试剂和耗材 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂和耗材 |
| 1.3 常用试剂配制 |
| 2 胃癌细胞系及组织标本的选择 |
| 2.1 细胞系选择 |
| 2.2 胃癌组织标本选择 |
| 3 细胞处理 |
| 3.1 实验前准备 |
| 3.2 细胞复苏 |
| 3.3 培养液的更换 |
| 3.4 细胞传代 |
| 4 NFKBIA基因启动子区甲基化状态检测 |
| 4.1 细胞系DNA的提取 |
| 4.2 DNA样本焦亚硫酸盐修饰 |
| 4.3 亚硫酸盐基因组测序 |
| 5 NFKBIA及相关基因mRNA检测 |
| 5.1 细胞系RNA提取 |
| 5.2 新鲜组织标本RNA的提取 |
| 5.3 cDNA的合成 |
| 5.4 实时荧光定量PCR |
| 5.5 qRT-PCR结果数据分析 |
| 6 IκBα及相关蛋白检测 |
| 6.1 细胞系总蛋白的提取及浓度测量 |
| 6.2 Western blot检测细胞系蛋白表达情况 |
| 6.3 免疫荧光技术检测胃癌细胞系中蛋白亚定位 |
| 6.4 石蜡切片免疫组织化学染色(SP法)检测胃癌组织中蛋白的表达 |
| 6.5 免疫组织化学染色结果分析 |
| 6.6 通路抑制剂作用后检测蛋白表达及核定位变化 |
| 7 细胞增殖能力检测(CCK8 试剂盒) |
| 8 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 9 LMP1和LMP2A过表达细胞系的建立 |
| 9.1 载体构建 |
| 9.2 菌液培养 |
| 9.3 质粒提取 |
| 9.4 重组质粒pcDNA3.1-LMP1和pcDNA3.1-LMP2A 转染胃癌细胞系SGC7901细胞 |
| 10 siRNA及 miRNA转染 |
| 11 双荧光素酶报告基因检测 |
| 11.1 h-NFKBIA载体构建 |
| 11.2 细胞转染操作步骤 |
| 11.3 检测实验操作步骤 |
| 12 细胞核蛋白与浆蛋白提取 |
| 13 NF-κB p65 转录因子试剂盒p65-DNA结合能力检测 |
| 14 EBV-DNA拷贝数相对及绝对定量 |
| 14.1 EBV DNA相对拷贝数检测 |
| 14.2 EBV DNA绝对拷贝数检测 |
| 15 统计学和图像分析 |
| 结果 |
| 1 qRT-PCR检测胃癌细胞系中NF-κB经典信号通路相关基因的转录表达 |
| 2 胃癌细胞系中NFKBIA(IκBα)及相关基因的蛋白表达 |
| 3 胃癌细胞系TRAF1/2/3/6 蛋白表达 |
| 4 NFKBIA甲基化状态检测结果 |
| 5 p65 蛋白在胃癌细胞系中的亚定位 |
| 6 ELISA检测胃癌细胞系NF-κB转录因子活性 |
| 7 IκBα及相关基因在胃癌组织中的表达 |
| 8 NF-κB经典信号通路对EBV阳性胃癌细胞增殖、凋亡的影响 |
| 8.1 抑制NF-κB信号通路对胃癌细胞增殖的影响 |
| 8.2 抑制NF-κB信号通路对EBVaGC凋亡的影响 |
| 9 抑制NF-κB信号通路对ZEB1 表达的影响 |
| 9.1 EBV阳性和阴性胃癌细胞系细胞系ZEB1的表达 |
| 9.2 BAY11-7082对ZEB1 表达的影响 |
| 10 抑制NF-κB信号通路对EBVaGC潜伏膜蛋白LMP1、LMP2A的影响 |
| 11 胃癌细胞系NFKBIA基因变异检测 |
| 12 EBV编码的miRNA-BART16对IκBα表达的影响 |
| 13 LMP1对NF-κB信号通路的调控作用 |
| 14 LMP2A对 NF-κB信号通路的调控作用 |
| 15 稳定转染LMP1及LMP2A对 NF-κB信号通路的调控作用 |
| 16 干扰TRAF1对NF-κB信号通路的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 EBV编码miR-BART16 通过靶定LMP1调节肿瘤细胞增殖 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1 仪器、试剂和耗材 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂和耗材 |
| 1.3 常用试剂配制 |
| 2 细胞培养 |
| 3 RNA的提取 |
| 4 miRNA的实时荧光定量检测 |
| 5 细胞增殖能力检测 |
| 6 细胞周期检测 |
| 6.1 碘化丙啶染色分析 |
| 6.2 溴脱氧尿苷(BrdU)细胞周期检测 |
| 7 统计学分析 |
| 结果 |
| 1 EBVaGC细胞系及胃癌组织中miRNA-BART16与LMP1 的相对表达量 |
| 2 miRNA-BART16 能够调控LMP1 的表达 |
| 3 miR-BART16 对细胞增殖的影响 |
| 4 miRNA-BART16 对细胞凋亡的影响 |
| 5 miR-BART16 对细胞周期的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的学术成果 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
（4）不同类型淋巴瘤组织中EB病毒的表达及EBNA1多态性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 统计学分析 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间发表文章及科研情况 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
（5）鼻咽癌病人EB病毒EBNA-2A及EBNA-LP IgG和IgA抗体的测定（论文提纲范文）
| 材料和方法 |
| (一)细胞片的制备 |
| (二)血清 |
| (三)间接免疫荧光法(IIF)测定IgG/EBNA-2A和IgG/EBNA-LP抗体 |
| (四)葡萄球菌A蛋白(SPA)吸附被测血清 |
| (五)用IIF检测Ig A/EBNA-2A和IgA/EBNA-LP |
| 结果 |
| 一、EBNA-2A IgG和IgA抗体的测定 |
| 二、EBNA-LP IgG和IgA抗体测定 |
| 讨论 |
（6）Epstein-Barr Virus（EBV）感染与胃癌发生的分子机理研究（论文提纲范文）
| 第一部分 EB病毒相关胃癌组织中病毒基因表达的研究 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 第一章 材料与方法 |
| 1.1 仪器、试剂和耗材 |
| 1.1.1 主要仪器 |
| 1.1.2 主要试剂和耗材 |
| 1.2 研究对象 |
| 1.3 核酸提取 |
| 1.3.1 单细胞悬液的制备 |
| 1.3.2 组织细胞DNA提取 |
| 1.3.3 组织总RNA提取 |
| 1.4 PCR-Southern杂交检测EBV基因组 |
| 1.5 原位杂交检测EBV EBER1的表达 |
| 1.6 EBV核抗原家族基因启动子、潜伏期基因、裂解期基因的RT-PCR检测 |
| 1.6.1 引物和探针的设计合成 |
| 1.6.2 寡核苷酸探针标记 |
| 1.6.3 cDNA合成 |
| 1.6.4 PCR扩增 |
| 1.6.5 PCR产物转膜 |
| 1.6.6 Southern blotting |
| 1.7 实验结果的统计学分析 |
| 第二章 结果 |
| 2.1 胃癌组织和相应癌旁组织中EBV基因组及EBER1的检测 |
| 2.2 EBV感染与病人临床病理特征的关系 |
| 2.3 EBVaGC组织中病毒基因表达的RT-PCR分析结果 |
| 2.3.1 EBV核抗原家族基因启动子的表达 |
| 2.3.2 EBV潜伏期基因的表达 |
| 2.3.3 EBV裂解期基因的表达 |
| 第三章 讨论 |
| 3.1 EBV感染与胃癌的关系 |
| 3.2 EBV潜伏期基因的表达 |
| 3.3 EBV裂解期基因的表达 |
| 附表 |
| 参考文献 |
| 第二部分:EB病毒对人胃癌细胞系HSC-39感染的研究 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 第一章 材料和方法 |
| 1.1 仪器、试剂和耗材 |
| 1.1.1 主要仪器 |
| 1.1.2 主要试剂和耗材 |
| 1.2 细胞 |
| 1.3 靶细胞的感染 |
| 1.3.1 无细胞病毒株的制备 |
| 1.3.2 病毒接种 |
| 1.4 免疫荧光检测 |
| 1.4.1 抗补体免疫荧光法检测EBV核抗原(EBNA) |
| 1.4.2 间接免疫荧光法检测EBV早期抗原EA-D |
| 1.5 原位杂交检测EBV编码小RNA1(EBER1) |
| 1.5.1 地高辛标记探针 |
| 1.5.2 原位杂交 |
| 1.6 PCR-Southern检测EBV DNA |
| 1.6.1 感染细胞DNA的提取 |
| 1.6.2 EBV基因组特异性引物合成 |
| 1.6.3 EBVBamH Ⅰ-片段的PCR扩增 |
| 1.6.4 PCR产物转膜 |
| 1.6.5 Southern blotting |
| 1.7 MTT法检测细胞增生 |
| 1.8 软琼脂培养检测细胞克隆形成率 |
| 1.9 Western blotting检测EBV编码蛋白表达 |
| 1.9.1 蛋白质的提取 |
| 1.9.2 Western blotting检测EBV编码蛋白的表达 |
| 1.10 RT-PCR分析 |
| 1.11 HSC-39细胞及感染细胞克隆中CD21的检测 |
| 1.11.1 流式细胞技术(FACS)分析HSC-39细胞CD21受体的表达 |
| 1.11.2 RT-PCR检测HSC-39细胞及感染细胞克隆中CD21mRNA |
| 第二章 结果 |
| 2.1 EBV对HSC-39细胞的感染 |
| 2.2 Akata和P3HR-1 EBV感染对HSC-39形态及生长的影响 |
| 2.3 Akata和P3HR-1感染细胞中EBV基因的表达 |
| 2.4 HSC-39细胞及感染细胞克隆中CD21受体的表达 |
| 第三章 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 LMPI沉默对AP-1信号转导通路的影响 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 第一章 材料和方法 |
| 1.1 仪器、试剂和耗材 |
| 1.2 siRNA的转染 |
| 1.3 RNAi效应的检测 |
| 1.4 半定量RT-PCR检测C-jun,survivin,CDK4和MMP9mRNA转录表达 |
| 1.5 Western Blotting检测c-jun,junB和CDK4的表达 |
| 1.6 免疫组化检测survivin表达 |
| 1.7 统计学分析 |
| 第二章 结果 |
| 2.1 siRNA作用对LMP1蛋白表达的影响 |
| 2.2 Hochest33258染色观察细胞凋亡 |
| 2.3 透射电镜观察细胞超微结构的变化 |
| 2.4 LMP1沉默对C-Jun,CDK4,survivin和MMP9mRNA表达的影响 |
| 2.5 Western Blotting检测siRNA作用对c-jun,junB和CDK4蛋白表达的影响水平 |
| 2.6 细胞免疫组化检测siRNA作用后survivin表达水平 |
| 第三章 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 研究成果 |
| 致谢 |
（7）手机辐射致癌效应的细胞生物学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 手机辐射的生物效应机理 |
| 1.1.1 微波辐射的热效应机理 |
| 1.1.2 微波辐射的非热效应机理 |
| 1.2 国内外研究进展 |
| 1.2.1 流行病学研究 |
| 1.2.2 体内实验研究 |
| 1.2.3 体外实验研究 |
| 1.3 研究内容 |
| 第2章 辐照实验设计 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 辐照手机SAR值测量 |
| 2.2.2 细胞培养材料对电磁辐射的屏蔽性测试 |
| 2.2.3 细胞培养箱改造 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 辐照手机SAR值测量结果 |
| 2.3.2 细胞培养瓶对电磁辐射的屏蔽性测试结果 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 手机辐射对RAJI细胞中EB病毒早期抗原的诱导 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 细胞培养 |
| 3.2.2 辐照实验 |
| 3.2.3 细胞免疫组化检测 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 手机辐射对NIH/3T3细胞的转化作用研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 细胞培养 |
| 4.2.2 辐照实验 |
| 4.2.3 绘制细胞生长曲线 |
| 4.2.4 细胞基质粘附性实验 |
| 4.2.5 细胞DNA损伤检测 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 细胞生长曲线 |
| 4.3.2 细胞基质粘附性检测结果 |
| 4.3.3 DNA损伤检测结果 |
| 4.4 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间所发表的学术论文 |
| 致谢 |
（8）基于EB病毒潜伏期膜蛋白的鼻咽癌诊治用单克隆抗体的筛选研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 鼻咽癌概述 |
| 1.1.1 鼻咽癌的流行病学概况 |
| 1.1.2 鼻咽癌的临床特征 |
| 1.1.3 鼻咽癌的致病因子 |
| 1.1.4 鼻咽癌的诊断 |
| 1.1.5 鼻咽癌的治疗 |
| 1.2 EB病毒简介 |
| 1.2.1 EB病毒的发现 |
| 1.2.2 EB病毒的形态和结构特征 |
| 1.2.3 EB病毒的生命周期 |
| 1.2.4 EB病毒与肿瘤 |
| 1.3 EB病毒潜伏膜蛋白研究进展 |
| 1.3.1 潜伏期膜蛋白1(LMP1) |
| 1.3.2 潜伏期膜蛋白2(LMP2) |
| 1.4 肿瘤治疗性抗体药物研究进展 |
| 1.4.1 单克隆抗体制备技术 |
| 1.4.2 抗体药物治疗肿瘤的作用机制 |
| 1.4.3 肿瘤抗体药物的靶点(胞内、胞外) |
| 1.5 本研究的目的、意义及思路 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 主要仪器 |
| 2.2 主要耗材 |
| 2.3 主要试剂 |
| 2.3.1 E.coli菌株 |
| 2.3.2 质粒 |
| 2.3.3 细胞株 |
| 2.3.4 实验动物 |
| 2.3.5 分子及细胞生物学实验用常规试剂 |
| 2.3.6 引物与多肽 |
| 2.3.7 免疫佐剂 |
| 2.3.8 其他常规试剂 |
| 2.3.9 临床标本 |
| 2.4 实验用溶液及培养基配制 |
| 2.4.1 分子生物学实验常规溶液的配制 |
| 2.4.2 细胞培养/转染用溶液的配制 |
| 2.4.3 ELISA检测用溶液 |
| 2.4.4 免疫组化相关液体的配制 |
| 2.5 实验方法 |
| 2.5.1 常规分子克隆实验方法 |
| 2.5.2 细胞生物学实验方法 |
| 2.5.3 小鼠单克隆抗体的制备与纯化 |
| 2.5.4 小鼠淋巴细胞的流式分选与检测 |
| 2.5.5 小鼠杂交瘤细胞的抗体可变区基因钓取 |
| 2.5.6 兔单抗平台相关实验 |
| 2.5.7 免疫学相关试验方法 |
| 2.5.8 其他实验方法 |
| 2.6 数据处理及统计学分析方法 |
| 第三章 结果与分析 |
| 第一部分 基于小鼠单抗筛选平台对LMPs相关抗体筛选的探索 |
| 3.1 LMPs相关的抗原研究 |
| 3.1.1 合成肽及其偶联抗原 |
| 3.1.2 原核重组表达抗原 |
| 3.1.3 真核表达系统的重组抗原 |
| 3.1.4 抗原表达细胞株 |
| 3.1.5 核酸免疫抗原的制备 |
| 3.2 LMPs胞外、胞内区抗体筛选免疫方案的制定 |
| 3.3 LMPs相关免疫效果评价 |
| 3.3.1 合成肽免疫组 |
| 3.3.2 原核表达重组抗原免疫组 |
| 3.3.3 细胞与核酸免疫组 |
| 3.4 Anti-LMPs抗体筛选方案探索 |
| 3.4.1 基于抗原表达细胞的筛选 |
| 3.4.2 基于抗原特异性记忆B细胞的流式分选 |
| 3.5 Anti-LMPs单克隆抗体的鉴定与应用 |
| 3.5.1 Anti-LMPs单克隆抗体的鉴定 |
| 3.5.2 Anti-LMPs抗体在免疫组化方面的应用 |
| 3.5.3 Anti-LMP1抗体在鼻咽癌治疗方面的初步探索 |
| 3.6 第一部分小结 |
| 第二部分 兔单抗筛选平台的建立及LMPs特异性兔单抗筛选的探索 |
| 3.7 基于兔B细胞特异性分选的兔单抗筛选平台的建立 |
| 3.7.1 兔抗原特异性B细胞染色方案制定 |
| 3.7.2 兔B细胞单细胞PCR平台的建立 |
| 3.7.3 兔B细胞体外刺激培养平台 |
| 3.7.4 抗体重组表达载体构建 |
| 3.8 兔单抗筛选平台的应用 |
| 3.9 LMPs特异性兔单克隆抗体筛选探索 |
| 3.10 第二部分小结 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 鼻咽癌特异性诊断治疗性抗体开发的必要性和重要性 |
| 4.2 多次跨膜膜蛋白特异性抗体筛选的挑战 |
| 4.3 LMPs膜内区抗体在鼻咽癌个性化诊断及治疗中的潜力 |
| 4.4 基于流式分选的兔单克隆抗体筛选平台的重要性 |
| 第五章 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 在校期间的科研成果 |
| 致谢 |
（9）EBV相关传染性单核细胞增多症患者血清外泌体病毒相关成份初步探讨（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要缩略语英文索引 |
| 第1章 前言 |
| 第2章 实验材料 |
| 2.1 主要实验试剂 |
| 2.2 主要实验仪器与器材 |
| 2.3 主要溶液配制 |
| 第3章 实验方法 |
| 3.1 研究对象纳入与分组 |
| 3.2 提取两组受检对象的外周血淋巴细胞 |
| 3.3 血清的收集 |
| 3.4 外泌体的分离与鉴定 |
| 3.5 Western blot 检测外泌体标志性蛋白 CD63 的表达 |
| 3.6 FQ-PCR 检测两组受检对象外周血淋巴细胞、血清外泌体中EBV-DNA 载量 |
| 3.7 ELISA 检测两组受检对象血清外泌体中的 EBV-CA、EBNA-1、EBNA-2、LMP-1 及 gp350 等病毒蛋白表达 |
| 3.8 统计学处理 |
| 第4章 实验结果 |
| 4.1 血清外泌体的鉴定 |
| 4.2 FQ-PCR 检测两组受检对象外周血淋巴细胞和血清外泌体中EBV-DNA 载量 |
| 4.3 ELISA 检测两组受检对象血清外泌体中的 EBV-CA、EBNA-1、EBNA-2、LMP-1 及 gp350 等病毒蛋白表达 |
| 第5章 讨论 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 硕士期间发表的论文 |
| 致谢 |
（10）秦巴山区精神发育迟滞患者家系人群B淋巴细胞永生细胞库的建立及影响因素初探（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 EB病毒转化B淋巴细胞机制 |
| 1.1 B淋巴细胞的发育及EB病毒简介 |
| 1.1.1 B淋巴细胞的发育 |
| 1.1.2 EB病毒简介 |
| 1.2 EB病毒感染宿主细胞 |
| 1.2.1 EB病毒感染宿主细胞的方式和途径 |
| 1.2.2 EB病毒基因组及其在宿主细胞内的存在形式 |
| 1.2.3 EB病毒表达的潜伏蛋白及其作用 |
| 1.3 EB病毒转化B淋巴细胞的机制 |
| 1.3.1 受体学说 |
| 1.3.2 端粒、端粒酶及细胞永生化 |
| 第二章 秦巴山区MR患者外周血B细胞永生细胞库的建立及鉴定 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验试剂 |
| 2.2.2 实验材料及仪器设备 |
| 2.2.3 引物的设计与合成 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 人外周血B淋巴母细胞样细胞系的建立 |
| 2.3.2 LCLs的Total RNA的提取及反转录 |
| 2.3.3 染色体核型检测 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 EB病毒转化的淋巴母细胞样细胞系在光镜下的形态 |
| 2.4.2 Total RNA的提取结果 |
| 2.4.3 LCLs的LMP-1基因的表达检测结果 |
| 2.4.4 核型分析结果 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 影响EBV转化B细胞的因素初探 |
| 3.1 研究对象 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 目的基因与内参基因的选取 |
| 3.4 半定量RT-PCR方法检测具体步骤 |
| 3.4.1 5代、10代和20代细胞Total RNA的提取及反转录 |
| 3.4.2 目的基因及内参基因的PCR过程 |
| 3.4.3 半定量RT-PCR检测结果 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 影响建库成功的因素 |
| 3.5.2 半定量RT-PCR检测结果分析 |
| 第四章 展望 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 中英文缩写全称对照 |
| 致谢 |
四、EB 病毒核抗原(EBNA)的表达与大鼠成纤维细胞转化作用的研究（论文参考文献）
- [1]EBV相关胃癌中NF-κB经典信号通路持续激活的机制研究[D]. 张岩. 青岛大学, 2019(07)
- [2]病毒与肿瘤[J]. 曾毅. 科学技术与工程, 2002(01)
- [3]病毒与肿瘤[A]. 曾毅. 中国科协2001年学术年会分会场特邀报告汇编, 2001
- [4]不同类型淋巴瘤组织中EB病毒的表达及EBNA1多态性研究[D]. 徐海芹. 内蒙古医科大学, 2019(03)
- [5]鼻咽癌病人EB病毒EBNA-2A及EBNA-LP IgG和IgA抗体的测定[J]. 韩汝晶,F.Huang,E.Kieff,曾毅. 病毒学报, 1990(03)
- [6]Epstein-Barr Virus（EBV）感染与胃癌发生的分子机理研究[D]. 罗兵. 青岛大学, 2008(07)
- [7]手机辐射致癌效应的细胞生物学研究[D]. 刘洋. 北京工业大学, 2012(01)
- [8]基于EB病毒潜伏期膜蛋白的鼻咽癌诊治用单克隆抗体的筛选研究[D]. 李睿. 厦门大学, 2018(06)
- [9]EBV相关传染性单核细胞增多症患者血清外泌体病毒相关成份初步探讨[D]. 王露. 南华大学, 2019(01)
- [10]秦巴山区精神发育迟滞患者家系人群B淋巴细胞永生细胞库的建立及影响因素初探[D]. 杨星. 西北大学, 2013(S1)