一、蛋白质的化学切割（论文文献综述）
黄栋梁[1]（2020）在《发展S-棕榈酰化膜蛋白化学合成新方法及多肽改造新策略用于膜蛋白功能的调控》文中提出蛋白质化学合成能够在原子尺度上操控多肽/蛋白质结构,获得其他方法难以获取的蛋白质样品,例如D型蛋白质、非天然结构的多肽/蛋白质以及位点特异性的翻译后修饰蛋白质等,其已经广泛应用于生物化学、生物物理和生物医学等研究领域。目前,使用化学合成方法已经制备了大量重要的水溶性蛋白,例如翻译后修饰核小体、糖基化促红细胞生成素（EPO）和镜像DNA聚合酶等。除了水溶性蛋白,膜蛋白也重要,它参与很多重要的生理进程,包括信号传导、分子运输、酶催化、免疫响应和细胞凋亡等,是重要的药物作用靶标。但合成获取的膜蛋白却很少,这是因为膜蛋白非常疏水,因此它的化学合成非常困难。为了促进膜蛋白的化学合成,科学家们发展了一系列新方法和新策略,包括外加增溶试剂、提高温度和修饰可脱除增溶标签（特别是可脱除骨架修饰（Removable Backbone Modification,RBM）策略）等。值得一提的是,RBM 策略通过在主链骨架上安装增溶标签后,可使跨膜肽/膜蛋白的性质跟水溶性蛋白类似,易于其分析、分离、连接和质谱表征等,实现了中小型膜蛋白的高效制备。尽管目前膜蛋白化学合成已有不少研究进展,但其仍存在许多问题有待解决,包括:1)如何实现更加复杂的膜蛋白样品的制备,例如S-棕榈酰化膜蛋白（S-palmitoylation,S-Palm）?2)如何有效地使用多片段连接策略制备更大更复杂的膜蛋白样品?3)如何获得高特异性靶向调控膜蛋白功能的活性多肽,并研究其相互作用机理?针对这些问题,本论文:1)发展了基于新型自环化酚羟基保护基γ-氨基丁酸（GABA）的第三代可移除骨架修饰策略（RBMGABA）。它能够高效制备S-Palm跨膜肽片段;其次,基于新一代可移除骨架修饰策略辅助的丝氨酸连接（Remo vable-Backbone-Mod ificat ion-Assisted Ser/Thr Ligation,RBMGABA-assisted STL）技术,实现了天然结构的 S-Palm跨膜肽片段的高效连接。另外,由于S-Palm与自然化学连接（Native Chemical Ligation,NCL）方法不兼容,所以S-Palm的制备是使用非NCL方法制备的经典案例,此工作首次证明了开发非NCL方法的必要性。2)开发了 N-to-C顺序的NCL和STL结合策略（NCL-STL）。该策略并非简单地将STL和NCL结合起来,其关键在于发展了一种新的1,3-丙二硫醇（1,3-Propanedithiol,PDT）保护的水杨醛（Salicylaldehyde,SAL）酯（SALPDT）结构,能够与NCL兼容。并且在NCL反应完成后,该结构还能被N-氯代丁二酰亚胺（NCS）/硝酸银（AgNO3）活化为有STL反应活性的SAL-酯。NCL-STL策略结合了基于多肽酰肼的NCL方便高效的优点和STL与S-Palm兼容的优点,保证了 133个氨基酸的S-Palm IFITM3蛋白的顺利获取。该研究拓展了在官能团兼容性方面的认知,同时说明发展新化学解决蛋白质化学合成领域困难的重要性。3)将多肽二硫键替换为不可还原的硫醚键的新策略,是一种更加普适且有效的方法,可用于检测富含二硫键多肽与其受体间是否存在二硫键交换作用。该策略的关键是在SPPS中并入含有硫醚键的二氨基二酸,即将不可还原的硫醚键位点特异性地并入铁调素（Hepcidin）中。最终,这些Hepcidin类似物及minihepcidins的功能研究显示:Hepcidin与其受体膜铁转运蛋白（Ferroportin）间不需要分子间二硫键交换作用。该研究为后续药物开发指明了方向,为其他富含二硫键多肽与其受体间相互作用的研究提供了一种更加有效的解决方案。
王建华[2]（2019）在《新型羧基和氨基交联剂的开发以及在基于质谱的蛋白质结构分析中的应用》文中认为化学交联结合质谱技术（CXMS技术）是近年发展起来的一种研究蛋白质结构以及蛋白-蛋白相互作用的新方法。由于它比传统方法检测迅速、对样品纯度要求较低,并且可以确定蛋白相互作用的界面信息,因此得到科研人员的广泛应用。设计开发新型的化学交联剂一直是推动CXMS技术发展的重要环节之一,也是本论文的目标。在本研究中,通过与化学家的合作,我开发了两个系列的新型交联剂:一种是包含重氮基团的羧基交联剂（Diazoker）;另一种是包含邻苯二甲醛基团的氨基交联剂（DOPA）。目前CXMS中最广泛应用的交联剂仅限于靶向氨基的NHS酯交联剂,由于它们主要靶向赖氨酸的侧链氨基和蛋白N端的氨基,因此获得的交联信息非常有限。而酸性氨基酸即谷氨酸和天冬氨酸在蛋白质中的比例总共占12.2%,并且酸性氨基酸属于极性氨基酸,大多分布在蛋白的表面或者蛋白的相互作用界面,因此,成功开发靶向羧基的化学交联剂将会大大扩大CXMS的应用范围。但是由于羧基在水溶液中表现出较弱的亲核能力,因此开发出在生理条件下具有较高选择性和反应活性的交联剂比较困难。本研究中,我们开发了一类包含重氮基团的羧基交联剂,我们称之为Diazokers（或统称为Diazoker）,与之前报道的羧基交联剂PDH相比，Diazoker在反应时不需要加入缩合剂,并且在生理条件下具有比较高的反应活性和选择性。在充分优化了 Diazoker的交联反应条件后,我选择了具有15.6埃聚乙二醇中间臂的Diazoker 1作为代表。用九个标准蛋白样品进行测试,Diazoker 1在每个蛋白中平均鉴定到73对交联肽段对,与交联剂PDH相比,发现Diazoker 1鉴定的结果与晶体结构的吻合性更高。用更复杂的样品即十个标准蛋白的混合物检测Diazoker 1和PDH,分别鉴定到75和76对交联肽段对。经分析发现,Diazoker 1和PDH交联的酸性氨基酸位点有很好的互补性,Diazoker 1更倾向于交联相对较少暴露于溶剂中的酸性残基。Diazoker 1对现有化学交联剂进行了补充,丰富了 CXMS的分析工具。与常用的NHS酯交联剂如DSS和BS3一样,DOPA在生理条件下选择性地与赖氨酸残基反应。然而,DOPA具有两个独特的优点:一是不水解,二是具有更快的反应速率。我用具有微弱相互作用的蛋白复合物HPr/EIN和EIIA/EIIB作为研究模型,发现新交联剂DOPA2可以比DSS更好地固定微弱的或者瞬时的蛋白-蛋白相互作用。我还发现DOPA即使在低温、低pH值、高浓度变性剂如8 M尿素或者6 M盐酸胍存在下也能很好地进行反应。我用蛋白RINaseA作为研究模型,用新的交联剂DOPA2捕获到了蛋白变性过程中的结构变化信息。因此该工作不仅为CXMS鉴定弱相互作用蛋白提供了有力工具,并且将CXMS引入新的应用领域,比如蛋白质折叠或者去折叠过程中折叠中间体的研究。
张洁,刘春丽,李欣,张媛,韩碧莹,赵跃芳[3]（2020）在《交联质谱技术研究进展》文中指出交联质谱技术（XL-MS）是蛋白质化学交联与质谱技术相结合的新技术,在蛋白质复合物结构解析以及生物体系中蛋白质相互作用研究中发挥着重要作用。综述了交联质谱技术的工作流程、在蛋白质结构及蛋白质相互作用研究取得的重要成果以及面临的主要挑战,介绍了目前常用的化学交联剂、交联质谱数据解析存在的问题以及主要搜索引擎。尽管交联质谱技术还在发展中,但其将成为解决生物学问题的重要手段。
张丹丹[4]（2020）在《蛋白质的超灵敏荧光检测方法研究》文中进行了进一步梳理蛋白质是细胞及机体生物功能的主要承担者,包括复制基因组信息、调节转录、传递信号、提供结构、催化反应和运输分子。蛋白质几乎参与到机体生命活动的各个方面,并在人类的新陈代谢、生长发育和机体衰老过程中发挥重要作用。研究表明,当机体发生严重病变甚至癌变时,发挥相应功能的某些蛋白质表现出明显的表达或功能异常。因而,发展一系列能够超灵敏分析检测与肿瘤等重大疾病密切相关的蛋白质方法,对临床疾病的早期诊断、针对性治疗、药物研发筛选以及相应的分子机制研究方面大有裨益。研究发现,具有相应诊断和治疗意义的蛋白质在细胞内通常是痕量存在的,同时生物体内其它活性蛋白质对目标蛋白的检测存在干扰,因此这些蛋白质的分析检测方法要求必须具有很高的灵敏度和很好的特异性。目前,常规的蛋白质检测方法包括质谱法（Mass Spectrometry）、蛋白免疫印迹法（western blot,WB）、酶联免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）、荧光法（Fluorescence Assay）和电化学法（Electrochemical Assay）等。其中,荧光分析法以特异性强、灵敏度高和操作简单等优势得到了众多研究者的青睐。近年来,以信号扩增技术为基础构建的蛋白质高灵敏检测方法为生物样本中的蛋白质分析提供了有利手段。基于此,本研究着眼于利用信号放大技术,选择表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）、Argonaute 2（Ago2）、组蛋白脱乙酰酶（histone deacetylase,HDAC）/蛋白酪氨酸磷酸酶1 B（protein tyrosine phosphatase 1B,PTP1B）以及黏蛋白1（mucin 1,MUC1）为分析模型,构建了一系列新型的荧光分析生物传感器,实现蛋白质的超灵敏检测。具体的研究内容如下:1、构建一种基于目标蛋白EGFR诱导的双SDA与T7核酸外切酶辅助的信号循环放大检测荧光方法。该方法涉及两个阶段的链置换扩增（strand displacement amplification,SDA）与T7核酸外切酶（T7 exonuclease,T7 exo）辅助的酶促扩增。当目标蛋白EGFR存在时,第一个链置换扩增反应（SDA 1）在KF聚合酶和Nt.BbvCI核酸内切酶的辅助下被启动。随着SDA 1反应的进行可以启动第二个链置换扩增反应（SDA 2）,两个链置换扩增反应累计生成大量报告寡核苷酸（report probe）。同时被不断循环利用的EGFR可以循环启动SDA1和SDA2,源源不断的生成reporter probe。因此,在T7核酸外切酶作用下,大量的双链DNA Taqman probe-reporter probe不断地杂交-消化,从而产生强烈的荧光信号。该方法的检测下限低至0.16 fM,同时可以实际应用于肺癌细胞内源性EGFR的灵敏检测,实现癌2、发展了一种基于双信号放大的DNAzyme荧光生物传感器超灵敏检测Ago2。首先设计了一条可以和Ago2识别结合的指导RNA（guide RNA,gRNA）,二者结合形成的RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complexes,RSIC）,具有识别并切割底物sRNA的活性。在Ago2存在时,可以诱导底物sRNA发生切割并产生游离的RCA引物,从而触发RCA反应以生成大量的8-17 DNAzyme,最终这些8-17 DNAzyme可以循环切割信号探针达到增强荧光信号的目的。该方法的检测限为0.35 pM。此外,该方法可用于测定Ago2抑制剂,同时可以准确测定HeLa细胞提取物的内源Ago2活性,检出限为3个HeLa细胞,在Ago2相关的基础研究和临床应用中具有巨大的应用潜力。3、设计了一种基于肽模板化-纳米金（AuNPs）结构介导的荧光生物传感器,用于同时检测多种翻译后修饰（Posttranslational modification,PTM）酶活性。分别设计了多肽1FITC/biotin和多肽2 Cy5/biotin修饰的肽链,多肽1序列中赖氨酸被乙酰化修饰,多肽2序列中丝氨酸被磷酸化修饰。多肽底物通过链霉亲和素和生物素的特异性结合,能够快速自组装到AuNPs的表面。HDAC的存在可以去除多肽1中赖氨酸ε-氨基上的乙酰基,随后可被胞内蛋白酶rLys-C裂解（它特异性裂解赖氨酸残基的C端,但不能识别乙酰化的赖氨酸残基）,导致FITC标记的多肽片段从纳米传感器上解离,从而恢复FITC荧光。类似地,PTP1B的存在可促进多肽2中酪氨酸残基磷酸基的去除,随后可被蛋白酶CPY水解（它可特异性消化多肽底物C端的肽键）,导致Cy5标记的多肽片段从纳米传感器上释放,从而恢复了Cy5荧光。因此,增强的FITC和Cy5荧光可分别用于HDAC和PTP1B的准确定量。该方法灵敏度高,HDAC的检测限为28 pm,PTP1B的检测限为0.8 pM,可用于筛选PTM酶抑制剂和检测癌细胞提取物中的PTM酶。4、研发一种基于发夹锁定DNAzyme探针的纳米金（AuNPs）传感器用于细胞中蛋白质MUC1的荧光信号放大检测。该方法构建基于AuNPs的DNA马达用于检测蛋白质,DNA马达由Mg2+依赖的DNAzyme,AuNPs和DNAzyme底物3部分组成。AuNPs作为支架构成DNAzyme的三维轨道,AuNPs表面DNAzyme的高密度结合增强了DNAzyme底物在三维轨道的移动。当加入靶蛋白质MUC1并和适配体结合后,激活DNA马达系统。再加入Mg2+,发生切割反应,荧光基团释放,根据荧光强度的变化来检测蛋白质含量的高低。同时DNAzyme底物分离并与另一个DNAzyme杂交结合,不断循环可以实现信号放大。此方法实现了DNAzyme底物沿AuNPs的自主移动及对MUC1的超灵敏检测。该方法的检测限可达0.36 fg/mL,并在血清样品中展现良好的回收效率。
萨仁高娃[5]（2020）在《百里香精油与海藻酸盐复合涂膜防控鲜切水果食源性病原微生物作用机制的研究》文中研究指明鲜切果蔬是新鲜果蔬经过分级、整理、清洗、切分、去心（核）、修整、保鲜和包装等加工程序而制成的即食、即用食品,具有“方便、新鲜、营养、安全”的特点,鲜切加工产生的下脚料还可统一回收再综合利用,具有减少生活垃圾的环保特点。然而,鲜切加工使果蔬失去原有的保护组织且受到机械伤害,增加了果蔬对微生物的敏感性,尤其是食源性病原微生物的污染,存在较大的安全风险,制约鲜切产业的发展。植物精油具有天然性、挥发性和抑菌广谱性等特点,广泛应用于食品的抑菌保鲜。但植物精油在鲜切果蔬保鲜中应用的研究报道较少,尤其是抑菌机制不明,制约了植物精油在鲜切果蔬中的有效应用。本研究筛选了抑菌效果最佳的植物精油并探究其抑菌机制,分析了植物精油与海藻酸盐复合涂膜对鲜切水果品质与安全性的影响,旨在为鲜切果蔬的加工、生产、流通环节的安全性提供技术支撑。论文的研究结果如下:1.筛选抑菌效果最佳的植物精油。选择15种常用的植物精油,即百里香、肉桂、牛至、柠檬草、薄荷、迷迭香（2种）、丁香、桉树、薰衣草、茶树、艾纳、缬草、苍术和珊瑚姜,以4种食源性病原微生物为抑菌对象,即单核细胞增生性李斯特菌（以下简称单增李斯特菌）、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌O157:H7,通过测定植物精油抑菌圈直径和最低抑菌浓度（MIC）,并绘制植物精油作用下食源性病原微生物的生长曲线,筛选抑菌效果最佳的植物精油。结果表明,百里香、肉桂和牛至精油抑制单增李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌O157:H7的抑菌圈直径范围分别是14.07-23.60、13.07-24.00和12.27-21.87 mm,均为中敏-高敏。其它12种精油的抑菌圈直径的范围是6.00-14.40 mm,均为低敏-中敏或无抑菌作用。百里香、肉桂和牛至精油抑制4种食源性病原微生物的MIC分别为0.31、0.63和0.63-1.25 μL/mL。MIC、2MIC和4MIC的百里香、肉桂和牛至精油处理抑制了4种食源性病原微生物的生长。1/2MIC和1/4MIC的3种精油中,百里香精油抑制4种食源性病原微生物生长的延滞期最长,稳定期的抑制率最高。百里香精油的抑菌效果最佳。2.从蛋白质水平解析百里香精油抑制单增李斯特菌的作用机制。通过气相色谱质谱联用法分析百里香精油的挥发性成分,并以单增李斯特菌为目标菌,对精油处理的单增李斯特菌进行扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）观察,同时对两种不同浓度的百里香精油,即Treatment-1(0.28 μL/mL和Treatment-2（0.31 μL/mL）处理的单增李斯特菌进行TMT标记定量蛋白质组学的分析。结果表明,百里香精油中含有28种成分,酚类物质含量最高,其中百里香酚占47.23%,对甲苯酚占20.37%,2,6-二甲基苯酚占16.26%。SEM和TEM观察表明,百里香精油处理后单增李斯特菌细胞出现变形、褶皱和破裂等变化,细胞完整性丧失。Treatment-1 vs Control鉴定出差异表达蛋白质100个,其中57个上调和43个下调,上调和下调蛋白质比例分别为57%和43%,蛋白质上调比例较高表明Treatment-1可能诱发单增李斯特菌的应激表达,Treatment-2 vs Control鉴定出差异表达蛋白质745个,其中220个上调和525个下调,上调和下调蛋白质比例分别为30%和70%,蛋白质下调比例较高表明Treatment-2可能干扰单增李斯特菌的应激表达和正常生理代谢。通过对差异表达蛋白质进行GO富集分析、KEGG通路富集分析和蛋白质相互作用网络分析,建立了百里香精油抑制单增李斯特菌的作用机制:百里香精油分子通过渗透方式穿过单增李斯特菌的细胞壁而进入细胞膜,并与之融合,细胞膜的透性和完整性受到破坏,酚类物质干扰单增李斯特菌的能量代谢以及遗传信息的转录、翻译、RNA降解和DNA修复等加工过程,降低了细胞运动性和细菌耐药性,抑制了单增李斯特菌的生长。3.考察百里香精油与海藻酸盐复合涂膜（TOAC）对鲜切苹果品质与安全性的影响。以鲜切苹果为实验材料,以百里香精油与海藻酸盐复合涂膜为保鲜剂,研究了4℃下不同浓度百里香精油（0.05%、0.35%和0.65%,v/v）的涂膜对鲜切苹果呼吸速率、失重率、硬度、色泽和感官品质的影响,分析了TOAC处理鲜切苹果细菌总数、大肠菌群菌落数、霉菌和酵母菌菌落数、乳酸菌菌落数的变化,研究了TOAC处理对人工接种的单增李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌O157:H7的抑制效果,以未处理和海藻酸盐可食性涂膜单独处理的鲜切苹果分别作为空白和对照。结果表明,0.05%百里香精油的涂膜处理显着抑制了贮藏期间鲜切苹果呼吸速率的升高,有效保持了失重率、硬度、色泽等品质指标,感官评价均为5分以上（p<0.05）。TOAC抑制了鲜切苹果上背景微生物及人工接种的4种食源性病原微生物的生长。4.考察百里香精油与海藻酸盐复合涂膜对鲜切哈密瓜品质与安全性的影响。以鲜切哈密瓜为实验材料,以百里香精油与海藻酸盐复合涂膜为保鲜剂,其方法同鲜切苹果。结果表明,0.05%百里香精油的涂膜处理抑制了鲜切哈密瓜呼吸速率的升高,有效保持了品质指标。TOAC处理抑制了鲜切哈密瓜上背景微生物及食源性病原微生物的生长。本论文初步解明了百里香精油抑制单增李斯特菌的作用机制,研发出了防控鲜切水果食源性病原微生物的百里香精油与海藻酸盐复合涂膜保鲜剂,该保鲜剂可在鲜切果蔬包装、贮藏、流通、销售等全过程中有效控制食源性病原微生物,同时还可有效保持鲜切果蔬的良好品质。
吴申杰[6]（2018）在《早老素及其古菌同源蛋白的生化研究与相互作用蛋白鉴定》文中进行了进一步梳理早老素（presenilin,PS）是阿尔兹海默症（Alzheimer’s disease,AD）发病中的关键致病基因,在早老素基因上目前已知有超过200个家族性阿尔兹海默症（Familial Alzheimer’s disease,FAD）致病突变位点。早老素是膜内天冬氨酸蛋白酶复合体γ-分泌酶（γ-secretase）的催化亚基,与其他三个组分Aph-1,Pen-2和nicastrin（NCT）一起组装为成熟的γ-分泌酶。γ-分泌酶对淀粉样前体蛋白（APP,amyloid precursor protein）具有切割活性,产生的?淀粉样多肽（Aβ）是病人脑内淀粉样沉淀的主要成分。本文的第一部分选取了早老素的古菌同源蛋白（presenilin archaeal homologue,PSH）作为研究对象,研究了其对底物APP C99的切割特性。我们发现,PSH与γ-分泌酶一样,可以将APP C99剪切成不同长度的Aβ42,Aβ40,Aβ38肽段,并且Aβ42/Aβ40的比例几乎与γ-分泌酶一致。针对γ-分泌酶的抑制剂可以特异性地抑制PSH对底物APP C99的切割。已知的γ-分泌酶活性调节剂同样可以调节PSH产生的Aβ42/Aβ40比例。抑制剂与PSH的复合物晶体结构鉴定出了抑制剂小分子结合于两个天冬氨酸催化残基之间。我们的工作表明,PSH可以精确表现出人源γ-分泌酶的APP的切割特征,是研究γ-分泌酶的酶学活性和开发筛选γ-分泌酶活性调节剂的有力工具。本文的第二部分工作直接以人源早老素PS1为研究对象,通过鉴定γ-分泌酶组分之外的PS相互作用蛋白,来研究PS潜在的其他致病途径。质谱分析暗示,进化上保守的膜蛋白Bax抑制蛋白-1（Bax-inhibitor 1,BI1）能够和PS1蛋白相互作用,我们将其命名为PS1-BI1复合物。BI1可以结合单独形式存在的PS1全长蛋白,而不与组装成熟的γ-分泌酶中的PS1结合。等摩尔浓度的PS1-BI1复合物对γ-分泌酶活性几乎不影响,而150倍摩尔浓度过量的PS1-BI1复合物可以抑制γ-分泌酶对底物APP C99的切割。荧光共定位分析显示,体内环境下的BI1和PS1蛋白结合在一起,而与γ-分泌酶相互分离。这些结果证明了BI1是PS1全新的相互作用蛋白,暗示了PS1作为γ-分泌酶活性组分之外的功能,为研究阿尔兹海默症提供了新的思路。
刘富裕,郭庆梅[7]（2019）在《激光显微切割技术在药用植物学研究中的应用》文中研究指明激光显微切割技术是最近发展起来的一种新兴技术,它结合激光与显微镜的功能,主要用于分离复杂组织中的单一细胞及类群,从而为更精确地了解药用植物提供一定的技术支持。本综述概述了现有的激光显微切割技术及其在组织化学定位、分子生物学、植物生长调控以及与微生物相互作用等方面的应用。
苗蒙[8]（2019）在《RNA病毒与宿主蛋白相互作用机制的研究》文中研究指明RNA病毒是一类遗传物质由RNA组成的病毒,在自然界中RNA病毒的数量及其庞大,其基因组及转录复制极具多样性。许多人类、动物以及植物的严重疾病都是由RNA病毒感染引起的,对其进行深入研究不仅能够帮助我们加深对RNA病毒本身的理解,更能够对RNA病毒引起的相关疾病的诊断和治疗提供理论基础。病毒感染并寄生于宿主细胞,病毒需要不断的适应和改变宿主细胞的环境以帮助自身完成复制、装配、释放子代病毒粒子或潜伏感染的生命过程。而另一方面,宿主细胞为了抵御病毒的入侵,会做出多种反应,包括以启动抗病毒通路或凋亡通路等方式来达到清除病毒的目的。在这一过程中,大部分都是通过蛋白与蛋白之间的相互作用来完成的。因此研究病毒感染过程中病毒与宿主细胞蛋白之间的发生的相互作用十分必要的。在针对RNA病毒与宿主细胞组蛋白的相互作用研究中,我们还利用人类肠道病毒71型（EV71）感染人横纹肌肉瘤细胞（RD）,研究组蛋白修饰以及表观遗传调控机制在病毒感染过程中发挥的功能。我们发现宿主细胞的组蛋白H3在EV71病毒感染时发生了N末端蛋白酶切割现象,通过质谱策略我们鉴定到了组蛋白H3发生切割的位点并同时鉴定到了组蛋白上各种修饰发生的变化。在进一步研究中我们发现,组蛋白H3的N末端切割是由EV71病毒编码的蛋白酶3C介导的,3C蛋白酶可以进入细胞核并通过和组蛋白H3相互作用的方式来完成切割反应。同时我们通过真核纯化的方法得到了纯化的3C蛋白以及其酶活性突变3C蛋白,并在体外进行了组蛋白H3的切割实验,结果显示3C蛋白在体外同样可以切割组蛋白H3,而突变的3C蛋白不能进行切割反应。这些研究表明,EV71病毒能通过其编码的3C蛋白酶所介导的组蛋白H3的N端切割,达到改变组蛋白的目的,有可能是一种病毒调控宿主基因表达的新机制,将对病毒本身的复制以及宿主细胞产生全面影响。在针对登革病毒感染宿主细胞的蛋白质组学研究中,我们使用稳定同位素双甲基化肽段标记方法以及TiO2富集磷酸化肽段方法,通过色谱分析对肽段进行分级分离,运用定量蛋白质组学技术,我们对2型登革病毒（DENV-2）感染人类红白血病K562细胞系所诱导的宿主细胞整体蛋白质表达以及蛋白质磷酸化翻译后修饰进行了研究。一共定量到了2263个蛋白以及799个磷酸化蛋白和2440个磷酸化修饰位点。其中有321个显着差异表达蛋白、189个显着差异磷酸化蛋白以及501个差异磷酸化修饰位点。通过生物信息学分析工具对质谱结果进行分析,包括蛋白功能分类分析、生物学过程分析和蛋白相互作用网络分析。我们发现了在登革病毒感染过程中被显着富集的生物学过程,包括RNA剪切（RNA splicing）、细胞大分子生物合成（Cellular macromolecule biosynthetic process）、mRNA加工（mRNA processing）、转录调控（Regulation of transcription）。在进一步的蛋白相互作用分析中,我们发现了HDAC1、BID、EIF3E、GRB2、SAP18等几个蛋白在被富集的通路中处于蛋白相互作用网络的中心,并进一步通过免疫印迹法对这几个靶蛋白进行表达水平验证。
袁明,瞿礼嘉,王小菁,钱前,杨维才,王台,孔宏智,蒋高明,种康[9]（2014）在《2013年中国植物科学若干领域重要研究进展》文中认为2013年中国植物科学研究继续快速发展。中国科学家在植物科学多个领域中取得了大量的原创性、高水平研究成果,包括水稻（Oryza sativa）株型调控的激素信号转导机制、水稻育性的遗传调控机理、重要物种的基因组解析、植物天然免疫分子机制的结构生物学研究以及植物生态与环境生物学等。该文对2013年中国本土植物生命科学若干领域取得的重要研究进展进行了概括性评述,旨在全面追踪当前中国植物科学领域发展的最新前沿和热点事件,并展现我国科学家所取得的杰出成就。
高聪[10]（2019）在《大肠杆菌碳代谢流的调控方法及其在有机酸生产中的应用》文中进行了进一步梳理微生物细胞工厂可以利用廉价生物质生产多样的化学品,其合成能力的指标,如产量、产量和生产强度往往取决于胞内代谢流的流量、流向和流速。因此,调控碳代谢流是构建高效微生物细胞工厂的关键。在提高微生物化学品合成能力的过程中,普遍存在合成路径中碳流量调控精度低、细胞生长和产品合成之间的碳流分布难以平衡、调控工具的智能性、时效性和通用性差等问题。本论文以E.coli为研究模型,从合成生物学和系统代谢工程的角度,提出了体外模块优化整合CRISPRi、动态统合加工、蛋白酶为基础基因回路等策略,有效提高了苹果酸、木糖酸、莽草酸等有机酸的生产指标。主要结果如下:1.以E.coli B0013为出发菌株,通过体外构建、模块优化苹果酸非循环氧化乙醛酸合成路径,获得了五种路径酶的最适催化比例;利用基因组合敲除的方式,构建了一株能积累5.30 g L-1苹果酸的底盘工程菌株E.coli B0044;通过筛选、组装靶向路径酶的不同抑制强度的向导RNA,并利用CRISPRi技术对路径酶进行理性调控,获得了最优工程菌株E.coli B0047。最终通过补料分批发酵生产36 g L-1苹果酸,得率为0.74 mol mol-1葡萄糖。2.通过筛选不同来源的木聚糖降解酶和木糖转运蛋白,并进一步模块优化,获得了具有高效木聚糖利用能力的E.coli;进一步的,经过整合、优化群体感应QS系统和重组酶Cre系统,构建了一个细胞密度依赖型的新型动态调控开关,展示出良好的可调性和可移植性;最终通过组合上述两个系统,提出了微生物动态统合生物加工技术。利用该技术,工程E.coli以20 g L-1木聚糖为底物分别生产出16.8 g L-1木糖酸,11.8 g L-1木糖醇和3.2 g L-1莽草酸。3.通过组合蛋白酶和蛋白降解信号,构建了两种基本的蛋白调控单元。两个调控单元的最大调控倍数均超过20倍,展示出良好的可调性和特异性;在此基础上,GPP控制靶蛋白的表达,SPP控制蛋白酶的表达,设计出转换时间分布于7-10 h的pbDRC分子生物开关;同时表达两种具有正交切割活性的蛋白酶（TEVp,TVMVp）或者利用蛋白酶的级联降解,构建出pbI分子生物开关;使用三种具有正交切割活性的蛋白酶（TEVp,TVMVp,SuMMVp）级联降解,首次在蛋白水平构建出震荡周期为90 min,具有生物功能的振荡器pbO。4.以莽草酸激酶为靶点,研究了pbDRC对菌株在不添加芳香族氨基酸和诱导剂的无机盐培养基中生产莽草酸的影响。在摇瓶水平,最优菌株E.coli DS7的莽草酸产量达2.14 g L-1;补料分批发酵,72 h可以积累12.6 g L-1莽草酸,比摇瓶水平提高了5.9倍,得率达0.19 g g-1葡萄糖;在其他E.coli中测试pbDRC,莽草酸产量分别较对照组提升7-43倍;在基因组水平上引入pbDRC,莽草酸产量分别较对照组提升4-9倍,且未积累乙酸。5.以PTS系统为靶点,研究了pbI对缓解碳代谢阻遏的影响。利用逆变器可以改变菌株对葡萄糖利用情况。最佳的诱导剂添加时间是6 h,在此条件下,当底物含20 g L-1葡萄糖和10 g L-1木糖时,含有逆变器的菌株可以积累4.25 g L-1木糖酸,较对照组的2.37g L-1产量,提高了1.79倍。6.以酯水解酶为靶点,研究了利用pbO调控双酶级联反应速率对生产木糖酸的影响。在摇瓶水平上,含有pbO系统的菌株较对照组木糖酸产量提高2.02倍;且在胞外pH=4的情况下,保持了胞内的pH稳态;相较于对照组,含有pbO的菌株单位菌落形成单位提高了两个数量级;经过发酵条件优化,在TB培养基,37°C条件下,木糖酸的摇瓶产量达13.1 g L-1;经补料分批发酵,木糖酸的生产强度达到7.12 g L-1 h-1,产量达199.4 g L-1。
二、蛋白质的化学切割（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、蛋白质的化学切割（论文提纲范文）
（1）发展S-棕榈酰化膜蛋白化学合成新方法及多肽改造新策略用于膜蛋白功能的调控（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 化学合成膜蛋白的研究进展 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 外部因素 |
| 1.2.1 温度 |
| 1.2.2 pH |
| 1.2.3 溶剂 |
| 1.2.4 盐类 |
| 1.2.5 去垢剂 |
| 1.2.6 离子液体 |
| 1.3 内部修饰:主链酰胺键保护基 |
| 1.3.1 伪脯氨酸 |
| 1.3.2 异肽 |
| 1.3.3 邻羟基苄基结构 |
| 1.3.4 邻巯基苄基结构 |
| 1.3.5 甲氧基苄基结构 |
| 1.3.6 非苄基结构 |
| 1.4 内部修饰:短肽增溶标签 |
| 1.4.1 多肽C端 |
| 1.4.2 多肽N端 |
| 1.4.3 多肽侧链 |
| 1.5 内部修饰:多肽骨架修饰增溶标签 |
| 1.5.1 Gly骨架 |
| 1.5.2 任意氨基酸骨架 |
| 1.6 结果与展望 |
| 第2章 通过可移除骨架修饰辅助的丝氨酸连接方法化学合成天然的S-棕桐酰化膜蛋白 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.2 结果与讨论 |
| 2.2.1 直接通过Fmoc SPPS方法化学合成S-Palm SLN |
| 2.2.2 发展RBM~(GABA)-assisted STL方法用于化学合成S-Palm SLN |
| 2.2.3 使用RBM~(GABA)-assisted STL方法化学合成S-Palm M2 |
| 2.3 结论 |
| 2.4 实验部分 |
| 2.4.1 材料仪器及通用合成策略 |
| 2.4.2 直接通过Fmoc SPPS方法合成S-Palm SLN 1 |
| 2.4.3 通过RBM~(GABA)辅助的STL反应化学合成S-Palm SLN |
| 2.4.4 基于RBM~(GABA)辅助的STL化学合成S-Palm M2 |
| 第3章 使用新的丙二硫醇保护水杨醛的硫缩舅发展了N-to-C顺序的NCL和STL结合策略 |
| 3.1 研究背景 |
| 3.2 结果与讨论 |
| 3.2.1 SAL-酯或SAL缩氨基脲(SAL~(~(SCA)_))酯不能用于N-to-C顺序的NCL-STL反应 |
| 3.2.2 发现可活化的新的S,S-1,3-丙二硫缩醛(SAL~(~(PDT)))酯 |
| 3.2.3 使用新发展的SAL~(~(PDT))-ester介导N-to-C顺序NCL和STL结合的连接策略 |
| 3.2.4 使用新的NCL-STL方法化学合成S-Palm M2离子通道蛋白 |
| 3.2.5 使用新的NCL-STL方法化学合成S-Palm IFITM3 |
| 3.3 结论 |
| 3.4 实验部分 |
| 3.4.1 材料仪器及通用合成策略 |
| 3.4.2 使用N-to-C顺序的NCL-STL方法连接模型肽 |
| 3.4.3 发现新的可活化肽SAL~(~(PDT))-ester |
| 3.4.4 SAL~(PDT)-ester介导的N-to-C顺序的NCL和STL结合的连接方法 |
| 3.4.5 通过NCL-STL方法化学合成S-Palm M2 |
| 3.4.6 通过NCL-STL法合成S-palm IFITM3 |
| 第4章 不可还原的硫醚键替代二硫键显示铁调素与其受体膜铁转运蛋白间的相互作用无需二硫键交换 |
| 4.1 研究背景 |
| 4.2 结果与讨论 |
| 4.3 结论 |
| 4.4 实验部分 |
| 4.4.1 材料仪器及合成方法 |
| 4.4.2 S-C键和C-S键的二氨基二酸的合成 |
| 4.4.3 合成Hepcidin |
| 4.4.4 合成Hepcidin二硫键类似物 |
| 4.4.5 合成minihepcidins |
| 4.4.6 Ferroportin内在化实验 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果 |
（2）新型羧基和氨基交联剂的开发以及在基于质谱的蛋白质结构分析中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 交联质谱技术概述 |
| 1.1.2 交联质谱技术基础 |
| 1.1.2.1 交联产物种类 |
| 1.1.2.2 交联剂的种类 |
| 1.1.2.3 交联样品制备 |
| 1.1.2.4 检测交联产物的质谱方法 |
| 1.1.2.5 体内交联反应 |
| 1.1.2.6 内源性的蛋白交联 |
| 1.1.2.7 交联数据分析 |
| 1.1.3 交联质谱技术的研究挑战 |
| 1.1.4 交联质谱技术的解决方案 |
| 1.1.4.1 同位素标记 |
| 1.1.4.2 荧光标记 |
| 1.1.4.3 可切割的交联剂 |
| 1.1.4.4 可富集交联剂 |
| 1.1.5 交联质谱技术的应用 |
| 1.1.5.1 交联质谱技术在蛋白质结构研究中的应用 |
| 1.1.5.2 交联质谱技术在蛋白质相互作用研究中的应用 |
| 1.2 本研究的目的和意义 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 化学试剂 |
| 2.1.2 实验材料 |
| 2.1.3 常用仪器 |
| 2.2 蛋白样品的制备 |
| 2.2.1 GST蛋白的纯化 |
| 2.2.2 大肠杆菌70S核糖体的纯化 |
| 2.2.3 酿酒酵母外切体的纯化 |
| 2.2.4 标准蛋白混合物的制备 |
| 2.2.5 其他蛋白样品的介绍 |
| 2.3 基于羧基交联剂Diazoker的交联反应 |
| 2.3.1 合成肽段的交联 |
| 2.3.2 用蛋白BSA优化Diazoker交联反应 |
| 2.3.3 简单样品的交联 |
| 2.3.4 复杂样品的交联 |
| 2.3.4.1 八个标准蛋白混合物的交联 |
| 2.3.4.2 十个标准蛋白混合物的交联 |
| 2.4 基于氨基交联剂DOPA的交联反应 |
| 2.4.1 合成肽段的交联 |
| 2.4.2 用蛋白BSA优化DOPA交联反应 |
| 2.4.3 简单样品的交联 |
| 2.4.4 复杂样品的交联 |
| 2.4.4.1 十个标准蛋白混合物的交联 |
| 2.4.4.2 CNGP蛋白复合物的交联 |
| 2.4.4.3 70S核糖体的交联 |
| 2.4.4.4 酵母外切体的交联 |
| 2.4.5 弱相互作用蛋白复合物的交联 |
| 2.4.5.1 蛋白复合物HPr/EIN的交联 |
| 2.4.5.2 蛋白复合物EIIA/EIIB的交联 |
| 2.4.6 蛋白结构处于不同状态下的交联 |
| 2.4.6.1 蛋白BSA处于不同状态下的交联 |
| 2.4.6.2 蛋白RNase A处于不同状态下的交联 |
| 2.5 质谱蛋白样品制备 |
| 2.5.1 蛋白溶液酶解 |
| 2.5.2 蛋白胶内酶解 |
| 2.6 LC-MS/MS方法 |
| 2.6.1 色谱柱的制备 |
| 2.6.2 高效液相色谱方法 |
| 2.6.3 质谱方法 |
| 2.7 数据分析 |
| 2.7.1 交联肽段鉴定 |
| 2.7.2 交联鉴定结果的分析 |
| 第三章 实验结果与分析 |
| 3.1 新型羧基交联剂Diazoker的开发 |
| 3.1.1 筛选结构最优的羧基交联剂 |
| 3.1.1.1 交联剂在MS2中碎裂规律分析 |
| 3.1.1.2 Diazoker 1反应效率和反应特异性分析 |
| 3.1.2 Diazoker交联条件的优化 |
| 3.1.3 Diazoker 1在简单样品中的应用 |
| 3.1.3.1 Diazoker 1和羧基交联剂PDH交联性能分析 |
| 3.1.3.2 Diazoker 1和羧基交联剂PDH交联位点分析 |
| 3.1.3.3 Diazoker 1和羧基交联剂PDH交联位点与晶体结构的比较 |
| 3.1.4 Diazoker 1在复杂样品中的应用 |
| 3.2 新型氨基交联剂DOPA的开发 |
| 3.2.1 一系列新型氨基交联剂DOPA |
| 3.2.2 DOPA的反应特异性分析 |
| 3.2.3 DOPA交联条件的优化 |
| 3.2.3.1 DOPA反应浓度优化 |
| 3.2.3.2 DOPA2反应时间优化 |
| 3.2.3.3 DOPA2反应缓冲液的优化 |
| 3.2.3.4 DOPA2反应终止试剂的筛选 |
| 3.2.4 DOPA在简单样品中的应用 |
| 3.2.5 DOPA在复杂样品中的应用 |
| 3.2.5.1 CNGP、70S核糖体、酵母外切体的CXMS分析 |
| 3.2.5.2 十个标准蛋白混合物的CXMS分析 |
| 3.2.6 DOPA2在弱相互作用蛋白复合物中的应用 |
| 3.2.7 DOPA2在研究蛋白结构动态变化过程中的应用 |
| 3.2.7.1 DOPA2在低温和变性条件下的反应效率分析 |
| 3.2.7.2 蛋白RNaseA处于不同状态下的CXMS分析 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 论文发表 |
（3）交联质谱技术研究进展（论文提纲范文）
| 1 交联质谱技术的工作流程 |
| 2 交联质谱技术的主要应用 |
| 2.1 蛋白质结构的研究 |
| 2.2 蛋白质相互作用的鉴定 |
| 3 交联质谱技术应用的主要挑战 |
| 3.1 交联剂 |
| 3.2 质谱数据采集以及谱图解析 |
| 4 展望 |
（4）蛋白质的超灵敏荧光检测方法研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 蛋白质简介 |
| 1.2 蛋白质分析检测方法研究 |
| 1.2.1 基于抗原抗体的免疫分析法 |
| 1.2.2 基于特异性核酸适配体的分析法 |
| 1.2.3 基于DNA末端连接保护小分子的分析法 |
| 1.3 基于荧光信号放大的蛋白质检测技术 |
| 1.3.1 无扩增的荧光信号放大检测技术 |
| 1.3.2 基于扩增的荧光信号放大检测技术 |
| 1.4 本论文研究内容 |
| 第二章 基于SDA及 T7 外切酶介导的信号扩增用于检测表皮生长因子受体 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 试剂与材料 |
| 2.2.2 DNA探针的制备 |
| 2.2.3 EGFR诱导的链置换扩增循环反应 |
| 2.2.4 荧光值的测定及数据分析 |
| 2.2.5 细胞培养和细胞提取物制备 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 EGFR检测的原理 |
| 2.3.2 方案原理的可行性验证 |
| 2.3.3 优化反应条件 |
| 2.3.4 灵敏度分析 |
| 2.3.5 特异性分析 |
| 2.3.6 实际样品分析 |
| 2.4 结论 |
| 第三章 基于双信号放大的DNAZYME生物传感器超灵敏检测ARGONAUTE |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 试剂与材料 |
| 3.2.2 Ago2 引发的切割反应 |
| 3.2.3 基于8-17 DNAzyme的 RCA反应 |
| 3.2.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 3.2.5 荧光值的测定及数据分析 |
| 3.2.6 抑制剂的分析 |
| 3.2.7 细胞培养和细胞提取物制备 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 Ago2 检测的原理 |
| 3.3.2 方案原理的可行性验证 |
| 3.3.3 反应条件的优化 |
| 3.3.4 灵敏度分析 |
| 3.3.5 特异性分析 |
| 3.3.6 抑制剂分析 |
| 3.3.7 细胞中Ago2 的检测 |
| 3.4 结论 |
| 第四章 基于肽模板化-纳米金结构介导的生物传感器用于翻译后修饰蛋白酶的同时检测 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 试剂与材料 |
| 4.2.2 肽模板化AuNPs的制备 |
| 4.2.3 HDAC和 PTP1B酶活性的测定及数据分析 |
| 4.2.4 单分子检测和数据方法 |
| 4.2.5 细胞培养和细胞提取物制备 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 HDAC和 PTP1B酶活性分析的原理 |
| 4.3.2 可行性的验证 |
| 4.3.3 优化反应条件 |
| 4.3.4 灵敏度分析 |
| 4.3.5 特异性分析 |
| 4.3.6 动力学分析 |
| 4.3.7 抑制剂分析 |
| 4.3.8 实际样品分析 |
| 4.4 结论 |
| 第五章 基于发夹锁定DNAZYME探针的AUNP传感器用于检测MUC |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 试剂与材料 |
| 5.2.2 发夹锁定DNAzyme修饰AuNPs的制备 |
| 5.2.3 Mg~(2+)依赖的发夹锁定DNAzyme探针自切割循环信号放大 |
| 5.2.4 荧光光谱测量和电泳分析 |
| 5.2.5 血清样品中MUC1 的检测 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 MUC1 检测的原理 |
| 5.3.2 发夹锁定 DNAzyme 探针修饰的 AuNPs 的表征可行性的验证 |
| 5.3.3 方案原理可行性的验证 |
| 5.3.4 优化反应条件 |
| 5.3.5 灵敏度分析 |
| 5.3.6 特异性分析 |
| 5.3.7 实际样品分析 |
| 5.4 结论 |
| 第六章 总结与展望 |
| 6.1 总结 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（5）百里香精油与海藻酸盐复合涂膜防控鲜切水果食源性病原微生物作用机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要缩略词/符号表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 鲜切果蔬 |
| 1.1.1 鲜切果蔬的定义 |
| 1.1.2 鲜切果蔬生理生化变化 |
| 1.1.3 鲜切果蔬污染的微生物种类 |
| 1.2 食源性病原微生物及其危害 |
| 1.2.1 食源性病原微生物 |
| 1.2.2 食源性病原微生物污染果蔬引起食源性疾病的发生 |
| 1.3 鲜切果蔬食源性病原微生物防控技术 |
| 1.3.1 物理防控技术 |
| 1.3.2 化学防控技术 |
| 1.3.3 生物防控技术 |
| 1.3.4 综合防控技术 |
| 1.4 天然抑菌剂—植物精油 |
| 1.4.1 植物精油的主要成分及其抑菌活性 |
| 1.4.2 植物精油抑制食源性病原微生物的作用机制 |
| 1.5 可食性涂膜在鲜切果蔬保鲜中的应用 |
| 1.5.1 鲜切果蔬可食性涂膜种类 |
| 1.5.2 鲜切果蔬可食性复合涂膜的活性成分 |
| 1.6 植物精油可食性复合涂膜在鲜切果蔬保鲜中的应用 |
| 1.7 论文的研究意义及内容 |
| 1.7.1 论文的研究意义 |
| 1.7.2 论文的研究内容 |
| 2 15种植物精油对食源性病原微生物的抑制效果 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 实验仪器与试剂 |
| 2.2.2 植物精油 |
| 2.2.3 实验菌株 |
| 2.2.4 植物精油对食源性病原微生物抑菌圈的测定 |
| 2.2.5 植物精油对食源性病原微生物MIC的测定 |
| 2.2.6 植物精油处理食源性病原微生物生长曲线的绘制 |
| 2.2.7 统计学分析 |
| 2.3 实验结果与讨论 |
| 2.3.1 植物精油对食源性病原微生物的抑菌圈直径 |
| 2.3.2 植物精油对食源性病原微生物的MIC |
| 2.3.3 植物精油处理食源性病原微生物的生长曲线 |
| 2.4 本章小结 |
| 3 百里香精油抑制单增李斯特菌的作用机制 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.2.1 实验仪器与试剂 |
| 3.2.2 实验菌株 |
| 3.2.3 百里香精油挥发性物质分析 |
| 3.2.4 百里香精油处理单增李斯特菌的扫描电子显微镜观察 |
| 3.2.5 百里香精油处理单增李斯特菌的透射电子显微镜观察 |
| 3.2.6 百里香精油处理单增李斯特菌的TMT标记定量蛋白质组学分析 |
| 3.3 实验结果与讨论 |
| 3.3.1 百里香精油的挥发性物质 |
| 3.3.2 百里香精油处理单增李斯特菌的扫描电子显微镜观察结果 |
| 3.3.3 百里香精油处理单增李斯特菌的透射电子显微镜观察结果 |
| 3.3.4 百里香精油处理单增李斯特菌蛋白质的定量 |
| 3.3.5 百里香精油处理单增李斯特菌蛋白质的SDS-PAGE |
| 3.3.6 百里香精油处理单增李斯特菌蛋白质的鉴定及定量结果 |
| 3.3.7 百里香精油处理单增李斯特菌蛋白质的聚类分析 |
| 3.3.8 百里香精油处理单增李斯特菌差异表达蛋白质的GO富集分析 |
| 3.3.9 百里香精油处理单增李斯特菌差异表达蛋白质的KEGG通路富集分析 |
| 3.3.10 百里香精油处理单增李斯特菌差异表达蛋白质的PPI网络分析 |
| 3.3.11 百里香精油对单增李斯特菌重要KEGG通路的影响 |
| 3.3.12 百里香精油抑制单增李斯特菌的作用机制 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 TOAC对鲜切苹果品质与安全性的影响 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与方法 |
| 4.2.1 实验仪器与试剂 |
| 4.2.2 实验样品 |
| 4.2.3 实验菌株 |
| 4.2.4 海藻酸钠可食性涂膜制备 |
| 4.2.5 食源性病原微生物菌液制备 |
| 4.2.6 鲜切苹果涂膜处理 |
| 4.2.7 鲜切苹果呼吸速率的测定 |
| 4.2.8 鲜切苹果失重率、硬度和色泽指标的测定 |
| 4.2.9 鲜切苹果品质的感官评价 |
| 4.2.10 鲜切苹果背景微生物和食源性病原微生物分析 |
| 4.2.11 统计学分析 |
| 4.3 实验结果与讨论 |
| 4.3.1 鲜切苹果呼吸速率、失重率和硬度 |
| 4.3.2 鲜切苹果色泽和外观 |
| 4.3.3 鲜切苹果品质的感官评价 |
| 4.3.4 鲜切苹果背景微生物和食源性病原微生物分析 |
| 4.4 本章小结 |
| 5 TOAC对鲜切哈密瓜品质与安全性的影响 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与方法 |
| 5.2.1 实验仪器与试剂 |
| 5.2.2 实验样品 |
| 5.2.3 实验菌株 |
| 5.2.4 海藻酸钠可食性涂膜制备 |
| 5.2.5 食源性病原微生物菌液制备 |
| 5.2.6 鲜切哈密瓜涂膜处理 |
| 5.2.7 鲜切哈密瓜呼吸速率的测定 |
| 5.2.8 鲜切哈密瓜失重率、硬度和色泽指标的测定 |
| 5.2.9 鲜切哈密瓜品质的感官评价 |
| 5.2.10 鲜切哈密瓜背景微生物和食源性病原微生物分析 |
| 5.2.11 统计学分析 |
| 5.3 实验结果与讨论 |
| 5.3.1 鲜切哈密瓜呼吸速率、失重率和硬度 |
| 5.3.2 鲜切哈密瓜色泽和外观 |
| 5.3.3 鲜切哈密瓜品质的感官评价 |
| 5.3.4 鲜切哈密瓜背景微生物和食源性病原微生物分析 |
| 5.4 本章小结 |
| 6 结论、创新点与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录A 显着性差异表达蛋白质结果统计 |
| 作者简介 |
| 攻读博士学位期间参与的科研项目及科研成果 |
| 致谢 |
（6）早老素及其古菌同源蛋白的生化研究与相互作用蛋白鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要英文缩略词对照表 |
| 第1章 引言 |
| 1.1 早老素的发现与结构 |
| 1.1.1 早老素的发现 |
| 1.1.2 早老素与γ-分泌酶 |
| 1.1.3 早老素古菌同源蛋白PSH |
| 1.1.4 早老素/γ-分泌酶的结构 |
| 1.2 早老素的功能与致病机制 |
| 1.2.1 淀粉样沉淀级联假说 |
| 1.2.2 早老素假说 |
| 1.2.3 其他致病假说 |
| 1.2.4 早老素的功能多样性 |
| 1.2.5 早老素/γ-分泌酶相互作用蛋白 |
| 1.3 本文研究的主要目的与内容 |
| 1.3.1 PSH对底物切割的生化机制与结构基础 |
| 1.3.2 早老素相互作用蛋白的鉴定 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验仪器 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 常用配方 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 分子克隆 |
| 2.2.2 蛋白质的表达与纯化 |
| 2.2.3 蛋白质的结晶与结构解析 |
| 2.2.4 酶切实验与活性检测 |
| 2.2.5 蛋白质质谱鉴定 |
| 2.2.6 荧光共聚焦显微技术 |
| 第3章 早老素古菌同源蛋白PSH的生化研究 |
| 3.1 PSH酶切反应体系的建立 |
| 3.1.1 PSH蛋白酶的表达与纯化 |
| 3.1.2 酶切底物APP C99 的序列设计 |
| 3.1.3 酶切底物APP C99 的表达与纯化 |
| 3.1.4 PSH具有切割APP C99 的γ-分泌酶活性 |
| 3.2 PSH在底物APP C99 上酶切位点的鉴定 |
| 3.2.1 PSH在底物APP C99 上的第一步切割位点 |
| 3.2.2 PSH在底物APP C99 上的最终切割位点 |
| 3.3 PSH与γ-分泌酶切割偏好性的比较研究 |
| 3.3.1 γ-分泌酶的表达与纯化 |
| 3.3.2 AlphLISA检测体系的建立 |
| 3.3.3 γ-分泌酶活性调节剂对PSH活性的调节 |
| 3.4 PSH上对应致病突变对酶切结果的影响 |
| 3.4.1 保守突变位点的选取 |
| 3.4.2 突变体蛋白的酶切结果比较 |
| 3.5 结合γ-分泌酶抑制剂JC-1的PSH晶体结构 |
| 3.5.1 抑制剂的筛选 |
| 3.5.2 PSH与抑制剂JC-1 的共结晶 |
| 3.5.3 JC-1 电子密度的确证 |
| 3.5.4 JC-1对PSH活性抑制的机制 |
| 3.6 结果小结 |
| 第4章 早老素相互作用蛋白的鉴定 |
| 4.1 早老素全长蛋白PS1 的纯化及质谱鉴定 |
| 4.1.1 PS1 蛋白的单独表达纯化 |
| 4.1.2 质谱结果的分析 |
| 4.1.3 潜在相互作用蛋白BI1 简介 |
| 4.2 PS1与BI1 的相互作用验证 |
| 4.2.1 PS1与BI1 在细胞内分布的一致性 |
| 4.2.2 PS1与BI1 的免疫共沉淀检测 |
| 4.2.3 基于分子筛检测PS1与BI1 在体外的相互作用 |
| 4.3 PS1-BI1 复合物的活性检测 |
| 4.3.1 PS1-BI1 的表达与纯化 |
| 4.3.2 体外条件下的PS1-BI1 不具备γ-分泌酶活性 |
| 4.3.3 单独BI1 蛋白的表达与纯化 |
| 4.3.4 BI1 对γ-分泌酶活性的影响 |
| 4.4 PS1与BI1 相互作用的生化特征 |
| 4.4.1 γ-分泌酶中的PS1 不能免疫共沉淀BI |
| 4.4.2 γ-分泌酶中的PS1与BI1 在细胞内具有不同的定位 |
| 4.4.3 若干PS1 上突变位点对PS1-BI1 相互作用影响的检测 |
| 4.4.4 PS2 能够免疫共沉淀BI |
| 4.4.5 PS1-BI1 样品的负染电镜观察 |
| 4.5 结果小结 |
| 第5章 总结与展望 |
| 5.1 早老素古菌同源蛋白PSH生化研究的总结及展望 |
| 5.2 早老素相互作用蛋白鉴定的总结及展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果 |
（7）激光显微切割技术在药用植物学研究中的应用（论文提纲范文）
| 1 激光显微切割技术 |
| 1.1 一般操作流程 |
| 1.1.1 试样制备 |
| 1.1.2 显微切割 |
| 1.1.3 后续实验 |
| 2 在植物学中的应用 |
| 2.1 组织化学定位 |
| 2.1.1 黄酮类化合物组织化学定位 |
| 2.1.2 皂苷类化合物组织化学定位 |
| 2.1.3 生物碱类化合物组织化学定位 |
| 2.1.4 多糖类化合物组织化学定位 |
| 2.1.5 萜类化合物组织化学定位分析 |
| 2.1.6 挥发油组织化学定位分析 |
| 2.2 分子生物学 |
| 2.2.1 基因片段微切割 |
| 2.2.2 蛋白质组学 |
| 2.2.3 转录物分析 |
| 2.3 生长调控 |
| 2.4 植物与微生物作用 |
| 3 问题与展望 |
（8）RNA病毒与宿主蛋白相互作用机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 RNA病毒研究进展 |
| 1.1.1 RNA病毒的分类 |
| 1.1.2 RNA病毒研究的意义 |
| 1.2 RNA病毒与宿主组蛋白相互作用研究进展 |
| 1.2.2 组蛋白翻译后修饰及基因表达 |
| 1.2.3 RNA病毒与宿主组蛋白相互作用研究进展 |
| 1.3 RNA病毒感染与宿主细胞蛋白质组学研究进展 |
| 1.3.1 基于质谱技术的蛋白质组学 |
| 1.3.2 RNA病毒感染与宿主细胞蛋白质组学研究进展 |
| 2 EV71 病毒与宿主组蛋白H3 相互作用机制的研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与实验方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.1.1 病毒感染性克隆 |
| 2.2.1.2 载体、菌株及细胞 |
| 2.2.1.3 工具酶、抗体及试剂盒 |
| 2.2.1.4 主要化学药品、试剂及溶液 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.2.2.1 感染性c DNA克隆拯救病毒 |
| 2.2.2.2 空斑方法测定病毒滴度 |
| 2.2.2.3 病毒感染及转染细胞样品制备 |
| 2.2.2.4 细胞内组蛋白提取 |
| 2.2.2.5 BCA方法测定蛋白浓度 |
| 2.2.2.6 Bottom-up质谱样品制备 |
| 2.2.2.7 Middle-down质谱样品制备 |
| 2.2.2.8 Western blot分析 |
| 2.2.2.9 免疫荧光显微共聚焦检测分析 |
| 2.2.2.10 细胞核质分离样品制备 |
| 2.2.2.11 质粒及突变质粒构建 |
| 2.2.2.12 重组蛋白的表达与纯化 |
| 2.2.2.13 体外切割反应 |
| 2.2.2.14 免疫共沉淀 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 EV71病毒感染可以切割组蛋白H |
| 2.3.2 组蛋白H3 的切割位点在K18和K27 之间 |
| 2.3.3 Middle-down质谱确定组蛋白H3 切割位点 |
| 2.3.4 Bottom-up质谱确定组蛋白H3 N端尾巴上的修饰变化 |
| 2.3.5 EV71 病毒感染可以在细胞核内检测到3C蛋白酶 |
| 2.3.6 过表达带NLS标签的3C可以切割组蛋白H |
| 2.3.7 重组蛋白3C可以在体外切割组蛋白H3 |
| 2.3.8 免疫共沉淀实验发现3C可以和组蛋白H3 相互作用 |
| 2.4 讨论 |
| 3 登革病毒感染宿主细胞蛋白质组的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与实验方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.1.1 病毒 |
| 3.2.1.2 细胞 |
| 3.2.1.3 抗体 |
| 3.2.1.4 主要化学药品、试剂及溶液 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.2.2.1 登革病毒扩增及浓缩 |
| 3.2.2.2 空斑方法测定病毒滴度 |
| 3.2.2.3 病毒感染细胞样品制备 |
| 3.2.2.4 蛋白酶解 |
| 3.2.2.5 双甲基化标记 |
| 3.2.2.6 脱盐处理 |
| 3.2.2.7 肽段分级分离 |
| 3.2.2.8 磷酸化富集 |
| 3.2.2.9 LC-MS/MS分析 |
| 3.2.2.10 生物信息学分析 |
| 3.2.2.11 Western blot分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 蛋白表达组和磷酸化蛋白质组的鉴定及定量分析 |
| 3.3.2 显着变化蛋白基因聚类分析 |
| 3.3.3 显着变化蛋白生物学过程分析 |
| 3.3.4 显着变化蛋白相互作用网络分析 |
| 3.4 讨论 |
| 研究总结 |
| 参考文献 |
| 附表 |
| 博士在读期间发表或待发表论文 |
| 致谢 |
（9）2013年中国植物科学若干领域重要研究进展（论文提纲范文）
| 1 植物发育、代谢与生殖的遗传调控 |
| 1.1 植物发育遗传调控 |
| 1.2 植物代谢遗传调控 |
| 1.3 植物生殖遗传调控 |
| 1.4 水稻农艺性状的遗传调控 |
| 2 蛋白质组学分析 |
| 3 叶绿体发育和光形态建成 |
| 3.1 叶绿体和光合作用 |
| 3.2 光形态建成和信号转导 |
| 4 植物激素与信号转导 |
| 4.1 细胞分裂素 |
| 4.2 独脚金内酯和油菜素内酯 |
| 4.3 乙烯和生长素 |
| 4.4 赤霉素和脱落酸 |
| 4.5 茉莉酸 |
| 4.6 激素互作 |
| 5 植物抗性与信号转导 |
| 6 表观遗传调控和RNA代谢 |
| 6.1 DNA甲基化和组蛋白修饰 |
| 6.2 RNA代谢和蛋白质修饰 |
| 7 细胞骨架与物质运输 |
| 7.1 细胞骨架及其结合蛋白 |
| 7.2 细胞结构和物质运输 |
| 8 营养的转运及胁迫适应 |
| 8.1 磷的转运及胁迫适应 |
| 8.2 氮的转运及胁迫适应 |
| 8.3 离子吸收及信号转导 |
| 8.4 其它营养元素 |
| 9 环境胁迫与适应 |
| 9.1 干旱和盐胁迫 |
| 9.2 温度胁迫 |
| 9.3 氧化胁迫 |
| 9.4 重金属胁迫 |
| 9.5 其它环境胁迫 |
| 1 0 植物系统进化 |
| 1 0.1 分子进化、比较基因组学和进化发育生物学 |
| 1 0.2 植物系统学与生物地理学 |
| 1 1 植物生态与环境生物学 |
（10）大肠杆菌碳代谢流的调控方法及其在有机酸生产中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 微生物细胞工厂的构建与应用前景 |
| 1.1.1 代谢路径的设计 |
| 1.1.2 代谢路径的构建 |
| 1.1.3 代谢路径的评估 |
| 1.1.4 代谢路径的优化 |
| 1.2 代谢路径的调控靶点 |
| 1.2.1 代谢流量调控 |
| 1.2.2 代谢流向调控 |
| 1.2.3 代谢流速调控 |
| 1.3 基因回路工程的应用 |
| 1.3.1 自动重排代谢流 |
| 1.3.2 加速表型进化 |
| 1.3.3 补偿细胞负荷 |
| 1.3.4 控制群体异质性 |
| 1.4 本论文主要研究内容 |
| 1.4.1 碳代谢流调控面临的科学问题 |
| 1.4.2 本论文的主要研究内容 |
| 第二章 体外模块优化整合CRISPRi调控碳流平衡 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 菌株与质粒 |
| 2.2.2 试剂与仪器 |
| 2.2.3 培养基与培养条件 |
| 2.2.4 制作电转化感受态 |
| 2.2.5 酶的表达和纯化 |
| 2.2.6 酶活测定 |
| 2.2.7 荧光密度测定 |
| 2.2.8 分批补料发酵 |
| 2.2.9 检测方法 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 乙醛酸合成路径的设计与体外构建 |
| 2.3.2 乙醛酸体外路径的评估及优化 |
| 2.3.3 苹果酸合成菌株的构建 |
| 2.3.4 CRISPR干扰技术优化路径酶表达水平 |
| 2.3.5 体内优化效果验证及发酵放大实验 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 动态统合生物加工(DCBP)提高碳流得率 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 菌株与质粒 |
| 3.2.2 试剂与仪器 |
| 3.2.3 培养基与培养条件 |
| 3.2.4 蛋白胶分析 |
| 3.2.5 荧光强度表征 |
| 3.2.6 莽草酸激酶活性测定 |
| 3.2.7 分析方法 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 DCBP的设计与构建 |
| 3.3.2 DCBP在木糖酸生产中的应用 |
| 3.3.3 DCBP在木糖醇生产中的应用 |
| 3.3.4 DCBP在莽草酸生产中的应用 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 蛋白酶为基础的基因回路构建 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 菌株与质粒 |
| 4.2.2 试剂与仪器 |
| 4.2.3 培养基与培养条件 |
| 4.2.4 细胞荧光密度表征 |
| 4.2.5 单细胞延时拍摄 |
| 4.2.6 动力学实验 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 蛋白酶为基础的基本蛋白调控单元的设计 |
| 4.3.2 蛋白调控单元为基础的动态开关构建 |
| 4.3.3 蛋白调控单元为基础的逆变器构建 |
| 4.3.4 蛋白调控单元为基础的振荡器构建 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 蛋白基因回路调控碳流分布 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 菌株与质粒 |
| 5.2.2 试剂与仪器 |
| 5.2.3 培养基与培养条件 |
| 5.2.4 莽草酸激酶活性测定 |
| 5.2.5 菌株活性和活细胞数测定 |
| 5.2.6 胞内pH测定 |
| 5.2.7 化合物浓度测定 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 动态调控系统在莽草酸生产中的应用 |
| 5.3.2 逆变器对混合糖发酵生产木糖酸的影响 |
| 5.3.3 蛋白振荡器调控酯水解酶的振荡表达用于木糖酸生产 |
| 5.4 小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 论文创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 Ⅰ作者在攻读博士学位期间发表的论文 |
| 附录 Ⅱ:表 |
四、蛋白质的化学切割（论文参考文献）
- [1]发展S-棕榈酰化膜蛋白化学合成新方法及多肽改造新策略用于膜蛋白功能的调控[D]. 黄栋梁. 中国科学技术大学, 2020(01)
- [2]新型羧基和氨基交联剂的开发以及在基于质谱的蛋白质结构分析中的应用[D]. 王建华. 北京协和医学院, 2019(02)
- [3]交联质谱技术研究进展[J]. 张洁,刘春丽,李欣,张媛,韩碧莹,赵跃芳. 化学与生物工程, 2020(11)
- [4]蛋白质的超灵敏荧光检测方法研究[D]. 张丹丹. 山东师范大学, 2020(08)
- [5]百里香精油与海藻酸盐复合涂膜防控鲜切水果食源性病原微生物作用机制的研究[D]. 萨仁高娃. 大连理工大学, 2020(01)
- [6]早老素及其古菌同源蛋白的生化研究与相互作用蛋白鉴定[D]. 吴申杰. 清华大学, 2018(04)
- [7]激光显微切割技术在药用植物学研究中的应用[J]. 刘富裕,郭庆梅. 植物生理学报, 2019(11)
- [8]RNA病毒与宿主蛋白相互作用机制的研究[D]. 苗蒙. 武汉大学, 2019(06)
- [9]2013年中国植物科学若干领域重要研究进展[J]. 袁明,瞿礼嘉,王小菁,钱前,杨维才,王台,孔宏智,蒋高明,种康. 植物学报, 2014(04)
- [10]大肠杆菌碳代谢流的调控方法及其在有机酸生产中的应用[D]. 高聪. 江南大学, 2019(05)