一、鸭冠状病毒肠炎免疫试验（论文文献综述）
方敏,李莉,李恒宇,盛湲[1]（2021）在《CRISPR/Cas9 技术在乳腺癌研究领域的应用及进展》文中进行了进一步梳理乳腺癌是全球女性最高发的恶性肿瘤,不同类型的乳腺癌在临床及分子水平上具有高度异质性,且治疗方式不同。如何选择精准的治疗方案,及逆转治疗后的耐药将成为今后进一步改善乳腺癌预后的关键。CRISPR/Cas9技术作为一种强大的基因编辑工具,可以针对各个层面的基因突变进行靶向编辑,不仅可以检测药物靶点及耐药靶点,还能用于基因治疗,现已大规模应用于各种细胞系和动物模型中。现就CRISPR/Cas9技术在乳腺癌研究中的应用情况、研究进展及存在问题进行综述。
张传美,张路宾,刘佳卉,赵辉,马清霞,杨海燕,单虎[2]（2021）在《水貂冠状病毒研究进展》文中指出水貂冠状病毒（Mink coronavirus,MCoV）属于冠状病毒科α冠状病毒属的成员,通常会引起以卡他性腹泻为主要症状的水貂流行性卡他性胃肠炎（Mink epizootic catarrhal gastroenteritis,ECG）。该病已在各国许多貂场暴发,给养貂业造成巨大经济损失。本文总结了自1975年报道ECG以来,水貂冠状病毒的研究进展,包括MCoV的基因组结构、遗传进化分析、受体特点及ECG的诊断及防治,以期引起人们对水貂冠状病毒的重视,为水貂冠状病毒病的防控提供参考。
吕海峰[3]（2021）在《犬冠状病毒M蛋白单克隆抗体的制备及其在胶体金检测试纸条上的应用》文中研究表明犬冠状病毒（Canine CoronavirusCCoV）是一种有囊膜的、单链正股RNA病毒。CCoV感染可导致幼犬胃肠炎的典型临床症状,如食欲不振、腹泻和呕吐等,发病率和死亡率较高。CCoV基因组全长约30 kb,3’端编码4种结构蛋白,分别为刺突蛋白（S）,包膜蛋白（E）,膜蛋白（M）和核衣壳蛋白（N）。M蛋白是一种膜结构糖蛋白,在包膜蛋白中含量最高,是病毒组装和形成的关键成分,含有B细胞识别表位。编码M蛋白的基因高度保守,与其他冠状病毒的M基因同源性较低,因此,M蛋白成为犬冠状病毒检测和诊断的主要靶标之一。犬胃肠炎可由多种病原体引起,包括病毒、细菌或寄生虫。最常见的病毒性肠炎病原体除了冠状病毒（CCoV）,还有犬细小病毒（CPV）,犬腺病毒2型（CAV-2）、犬瘟热病毒（CDV）等。因此,快速的病毒学检测对控制犬病毒性肠炎疾病至关重要。为了研制出适用于犬冠状病毒快速诊断的胶体金免疫层析试纸条,本研究制备筛选了 2株犬冠状病毒M蛋白特异单抗杂交瘤细胞,对不同单抗IgG亚类的纯化方法进行了比较,建立了犬冠状病毒胶体金免疫层析试纸条的制备工艺,该试纸条具有良好的特异性和较高的敏感性。本文内容包括以下三个部分:1、犬冠状病毒M蛋白单抗隆抗体的制备及其生物学特性鉴定为制备抗犬冠状病毒（CCoV）特异单克隆抗体,用纯化的CCoV为抗原4次免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞用聚乙二醇（PEG1500）进行细胞融合,通过间接免疫荧光试验（IFA）筛选抗体阳性杂交瘤细胞。经三次克隆化,获得2株能稳定分泌抗CCoV M蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为2H11、2G3,其抗体效价在体外连续传代40代稳定。单抗Ig亚类鉴定结果表明,2H11单抗为IgG3,2G3单抗为IgG1亚类。IFA和Western blot分析均表明,2H11、2G3单抗特异识别CCoV M蛋白（28-32 kDa）。2H11、2G3杂交瘤培养上清的IFA效价均为1:1000,ELISA效价均≥1:105。单抗特异性试验结果表明,这些单克隆抗体与犬瘟热病毒（CDV）、犬细小病毒（CPV）、犬腺病毒（CAV）、犬副流感病毒（CPIV）等均无交叉反应。CCoV M蛋白特异单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立,为CCoV鉴定和相关诊断方法的建立奠定了坚实的基础。2、小鼠腹水单克隆抗体纯化方法的比较研究为了纯化小鼠腹水中的单抗隆抗体,分三个批次,制备了 2G3、2H11两株杂交瘤的小鼠腹水。分别采用饱和硫酸铵沉淀法、辛酸-硫酸铵法、亲和层析、超离透析法对两株单抗进行纯化处理,分析对比蛋白浓度、纯度、效价以及回收率。结果表明不同Ig亚类的单抗,适用的纯化方法不同。2G3单抗（IgG1亚类）最适纯化方法为亲和层析,虽然亲和层析法回收率较低,但纯度高。2H11单抗属于IgG3亚类,辛酸处理导致IgG3破坏,亲和层析时蛋白G亲和柱与IgG3结合不紧密,结果洗脱下来的单抗蛋白浓度和抗体效价低,因此,辛酸-硫酸铵法、亲和层析法不适合2H11单抗的纯化。2H11单抗最适纯化方法选择为超离透析法。3、犬冠状病毒胶体金免疫层析检测试纸条的制备为了制备胶体金免疫层析试纸条,采用柠檬酸三钠还原法制备出20 nm胶体金颗粒,选择单抗2G3作为金标抗体标记胶体金,经过优化,金标最佳pH为9.0,最佳蛋白浓度为100 μg/mL。单抗2H11作为检测抗体,以1mg/mL的浓度包被于NC膜上作为检测线（T线）,兔抗鼠IgG作为质控抗体,以1 mg/mL浓度包被于NC膜上作为质控线（C线）。特异性试验证明,试纸条与CDV、CAV、CPIV和CPV等无交叉反应;敏感性试验表明,试纸条可以检测到CCoV含量至少达到102.8TCID50/mL。对临床粪便样本的检测,实验室制备的试纸条与进口试纸条的检测符合率为1 00%。本研究成功制备了检测CCoV的胶体金免疫层析试纸条,对早期诊断、预防和控制CCoV具有重要的应用价值。
张昆[4]（2021）在《胞内劳森菌抗原候选蛋白表达及ELISA方法建立》文中研究表明胞内劳森菌（Lawsonia intracelluaris,LI）属于脱硫弧菌科,是一种严格的胞内致病菌,微需氧环境中生长,革兰氏染色为阴性,抗酸染色为阳性,形态上呈弯曲状、逗点状或杆状,长约1.25μm-1.75μm,宽约0.25μm-0.43μm。LI主要寄生于猪回肠上皮细胞,引起猪增生性回肠炎（porcine proliferative ileitis,又名增生性肠病,proliferative enteropathy）,导致猪生长缓慢,给养猪业带来了巨大的经济损失。自1931年于猪肠腺瘤样病变组织中首次发现LI以来,已先后证实该菌能自然感染马、犬、仓鼠、兔、狐狸、猫、羊、鹿、鸵鸟、鸡等动物。LI感染发生在世界各养猪国家,如美国、加拿大、澳大利亚、欧洲、巴西、日本、韩国、中国。目前用于检测LI的方法有聚合和梅链式反应（PCR）、间接免疫荧光试验（IFA）、免疫过氧化物单细胞试验（IMPA）、酶联免疫吸附试验（ELISA）,但由于我国对该病研究几乎空白,国内尚无可应用的检测试剂盒,本研究根据生产实际需要,建立一种用于检测LI的间接ELISA方法,为猪增生性肠炎的检测和流行病学调查提供技术支撑。本研究根据免疫蛋白质组学研究的文献报道结果（Obradovic,et al,2019）,选取胞内劳森菌鞭毛相关蛋白（LI0641、LI0570、LI0710）、opp A蛋白LI0169、外膜蛋白LI0841、效应蛋白LI1035和膜转运蛋白LI1153作为候选蛋白。成功构建重组质粒p ET32-LI0641、p ET32a-LI0570、p ET32ɑ-LI0710、p ET32ɑ-LI0841、p ET32ɑ-LI0169、p ET32ɑ-LI1153、p ET32ɑ-LI1035,并转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞内,经IPTG诱导表达并通过镍柱纯化,SDS-PAGE电泳鉴定候选蛋白成功表达且纯化效果较好,并用抗E.coli血清对重组蛋白进行沉淀纯化,之后测定各重组蛋白浓度分别为2.41 mg/ml、2.57 mg/ml、3.24 mg/ml、2.04 mg/ml、2.32 mg/ml、2.67 mg/ml、1.52mg/ml。将获取的7种重组蛋白先经Western blot试验验证其反应原性,其中r LI0570、r LI0710、r LI0841、r LI1035具有反应原性,之后通过IFA验证这四种蛋白的免疫原性,结果显示均具有免疫原性。后续结合生物信息学分析r LI0841蛋白与其它病原无抗原表位交叉且反应原性较好,选取r LI0841蛋白作为包被抗原创建检测LI的间接ELISA方法。通过对间接ELISA基本优化,确定最佳条件;之后特异验证该重组抗原与其它病原（放线杆菌、副猪嗜血杆菌、冠状病毒、猪传染性胃肠炎病毒、大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌、链球菌、支原体等）阳性血清无交叉反应,表现较高的特异性性;敏感性实验结果显示,分别在血清稀释度度为1:800和1:1600表现阳性,展现较高的敏感性。创建的间接ELISA进行重复性实验,批内变异系数小于5.2%,批间变异系数小于5%,具有较好的重复性。用建立的间接ELISA方法检测SPF级小鼠血清阳性率为0;检测甘肃兰州和江苏邳州两个猪场阳性率分别为15%和22%。结果表明,本研究成功建立可检测血清抗胞内劳森氏菌抗体的间接ELISA方法,为胞内劳森菌血清流行病学调查及临床检查提供有力工具。
苏明俊[5]（2021）在《PEDVN蛋白通过p53-DREAM信号通路介导宿主细胞S期阻滞的分子机制》文中研究表明猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起猪的一种急性、高度接触性肠道传染病,给我国养猪业带来严重危害。尽管PEDV疫苗在我国广泛应用,PED仍然频繁发生。因此,PEDV防控相关的基础研究十分必要。病毒与宿主长期相互作用过程中,能通过介导宿主细胞周期阻滞创造有利于病毒复制的细胞微环境。由此可见,阐明病毒调控细胞周期阻滞的机制,能为抗病毒设计提供理论基础。目前,PEDV等冠状病毒的N蛋白能诱导细胞周期阻滞,但其机制尚未明晰。本研究对PEDV N蛋白介导细胞周期阻滞的机制进行了研究,进一步探索了基于该机制的抗病毒药物。研究内容包括以下四个方面:1.PEDV N蛋白介导Vero E6细胞S期阻滞的确证以及对病毒复制的影响为明确PEDV N蛋白对细胞周期的调控作用,将N蛋白在非同步化Vero E6细胞和血清饥饿法介导的G0/G1期、胸苷介导的S期、诺考达唑介导的G2/M期同步化的Vero E6细胞中分别过表达,对细胞周期和病毒滴度进行检测与分析。结果显示,在非同步化细胞中,不同浓度N蛋白组的S期细胞占比分别为22.91%（1.0μg/m L）、29.66%（2.5μg/m L）和36.38%（4.5μg/m L）,均显着高于对照组（21.68%）,N蛋白浓度与S期细胞数量正相关;在N蛋白（4.5μg/m L）过表达的G0/G1期、S期、G2/M期同步化细胞中,S期细胞占比分别为32.07%、58.50%和25.50%,均显着高于对照组（14.08%、49.56%和8.30%）（P<0.01）。在非同步化细胞中,PEDV滴度（48 hpi）为5.45 log10 TCID50/m L,显着高于对照组(4.67 log10 TCID50/m L)（P<0.01）;在同步化细胞中,PEDV滴度（48 hpi）为5.54 log10 TCID50/m L,显着高于对照组(4.77 log10 TCID50/m L)（P<0.01）。上述结果证明,PEDV N蛋白能介导Vero E6细胞发生S期阻滞,S期阻滞增强PEDV复制。2.PEDV N蛋白介导Vero E6细胞S期阻滞分子机制研究为揭示PEDV N蛋白诱导细胞S期阻滞的机制,本研究利用活细胞成像系统、免疫共沉淀（Co-IP）和N蛋白截短突变体构建等方法,探索了p53-DREAM信号通路在PEDV N蛋白介导细胞S期阻滞中潜在的作用。结果显示,在N蛋白过表达的Vero E6细胞中p53表达水平显着升高（P<0.01）;利用p53抑制剂PFT-α处理细胞后,在N蛋白过表达的Vero E6细胞中S期细胞占比和PEDV滴度均显着下降（P<0.05）。PEDV N蛋白能显着上调p21表达、抑制p130磷酸化、下调E2F4和cyclin A表达（P<0.01）;同时,PFT-α能拮抗N蛋白对p21、p130、E2F4和cyclin A的调控作用（P<0.05）。这些数据证明,PEDV N蛋白通过激活p53-DREAM信号通路介导Vero E6细胞发生S期阻滞。进一步研究显示,N蛋白与p53在Vero E6细胞核中存在共定位,维持p53在细胞核中高水平表达;N蛋白介导细胞S期阻滞依赖于N蛋白与p53核共定位以及N蛋白的核定位信号S71NWHFYYLGTGPHADLRYRT90。进一步证实,N蛋白与p53存在直接相互作用,关键氨基酸区域是S171RGNSQNRGNNQGRGASQNRGGNN194(NS171-N194),其中,G183RG185为核心氨基酸位点。N蛋白突变体Nmut(R183RR185)与p53相互作用显着减弱,介导细胞周期S期阻滞显着下降（32.79%）（P<0.01）;在Nmut过表达的Vero E6细胞中,PEDV滴度(5.38 log10 TCID50/m L)显着低于对照组(5.67 log10 TCID50/m L)（P<0.05）。上述结果证明,PEDV N蛋白入核后通过NS171-N194区域与p53直接相互作用,维持p53高水平表达,进而激活p53-DREAM信号通路,介导Vero E6细胞发生S期阻滞。3.基于PEDV N蛋白介导S期阻滞机制的抗病毒药物设计为获得能干预PEDV N蛋白介导细胞周期S期阻滞的小分子药物,本研究利用分子对接技术筛选能靶向结合N蛋白S171-N194区域的小分子化合物,进一步评价筛选的小分子化合物抗病毒作用。分子对接分析显示,金丝桃苷（Hyperoside）与PEDV N蛋白具有较强的结合力,“-CDOCKER ENERGY”和“-CDOCKER INTERACTION ENERGY”值分别为24.47和49.57。生物膜干涉技术（BLI）分析显示,金丝桃苷与N蛋白具有特异性结合作用,呈现浓度依赖性。金丝桃苷能拮抗N蛋白与p53相互作用（P<0.05）,干预N蛋白介导Vero E6细胞S期阻滞（P<0.05）。金丝桃苷处理组中PEDV滴度为5.13 log10TCID50/m L,显着低于对照组(5.63 log10 TCID50/m L)（P<0.05）。上述结果表明,基于N蛋白调控细胞周期机制设计的小分子药物金丝桃苷,能够拮抗PEDV N蛋白与p53相互作用,干预N蛋白介导细胞周期S期阻滞,进而抑制PEDV复制。4.PEDV N蛋白介导S期阻滞分子机制在仔猪肠道细胞IPEC-J2上验证由于Vero E6细胞是PEDV非本宿主的易感细胞,本研究进一步在猪肠道细胞IPEC-J2中对PEDV N蛋白介导的细胞周期阻滞机制进行了验证。结果显示,在过表达N蛋白的IPEC-J2细胞中,S期细胞占比（40.94%）显着高于对照组（37.57%）（P<0.01）,PEDV复制显着增强（P<0.05）。进一步研究证实,PEDV N蛋白与猪源p53存在直接相互作用;在表达Nmut的IPEC-J2细胞中,S期细胞占比（37.57%）显着低于对照组（40.94%）（P<0.05）;金丝桃苷显着降低IPEC-J2 S期细胞占比（P<0.05）,抑制PEDV复制（P<0.05）。上述结果表明,PEDV N蛋白介导IPEC-J2细胞周期S期阻滞的分子机制与Vero E6细胞一致。综上所述,PEDV N蛋白进入细胞核后,通过自身NS171-N194区域与p53相互作用,激活p53-DREAM信号通路,从而诱导宿主细胞S期阻滞,为PEDV复制创造了有利的细胞微环境。基于PEDV N蛋白介导的细胞周期阻滞机制设计的小分子药物金丝桃苷,能通过靶向拮抗N蛋白与p53相互作用,干预N蛋白介导细胞周期S期阻滞,进而抑制PEDV复制。本研究揭示了PEDV N蛋白调控宿主细胞周期的一个新机制,为PEDV等冠状病毒的抗病毒策略提供了新思路。
郝云峰[6]（2021）在《犬冠状病毒S蛋白抗原多表位基因的重组表达及rSP-ELISA方法的建立》文中提出犬冠状病毒（canine coronavirus,CCo V）是引起犬胃肠道疾病的一种常见病原,特别是在与其他肠道病原体共同感染时,患犬的死亡率明显增加,严重影响犬业的健康发展。近年来,高致病性犬冠状病毒感染病例大幅增加,抗体阳性率也逐年上升。犬冠状病毒基因组结构蛋白主要包括膜蛋白M、棘突蛋白S、小包膜蛋白E、核衣壳蛋白N,其中S蛋白是一种可诱导宿主免疫细胞产生中和抗体的结构蛋白,有调节与宿主细胞受体结合的作用,引发病毒和细胞膜的融合,它是细胞向性和致病性的重要决定因素。S蛋白较大,整体表达较为不易,本研究通过构建犬冠状病毒S蛋白抗原多表位基因的重组质粒,表达获得了具有较强中和活性的重组S蛋白,并在此基础上建立了间接ELISA（r SP-ELISA）检测方法,旨在监测犬类的中和抗体水平,为犬冠状病毒病的防治、抗体水平的监测及后续相关研究奠定基础。利用生物信息学方法对CCoV的S蛋白的B细胞和T细胞线性抗原表位进行分析,从中筛选出4个优势B细胞表位和1个T细胞表位,将优势表位通过基因洗牌的方式进行重组,获得4种不同组合方式。将不同抗原表位通过linker、spacer柔性肽连接,密码子优化后进行全基因合成,并将其克隆到pET-28α原核表达载体中,成功构建了4个多表位重组质粒,分别命名pET28α-S1、pET28α-S2、pET28α-S3、pET28α-S4。再将其分别转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,在37℃条件下,使用1mmol/L IPTG诱导8 h,4个重组质粒均成功表达了重组蛋白。采用Ni-NTA亲和层析柱对4个重组蛋白进行纯化,并经Western blot及液相质谱鉴定蛋白表达正确。将重组蛋白分别乳化后免疫6周龄Balb/c雌性小鼠,三免后14天采血制备鼠源多抗血清,血清中和试验结果表明,pET28α-S1蛋白组血清中和效价最高,达1:178,能更好地诱导机体产生中和抗体。应用纯化的pET28α-S1蛋白包被96孔板,建立了犬冠状病毒间接ELISA抗体检测方法（r SPELISA）,该方法的最佳抗原包被浓度为2μg/m L,待检血清最佳稀释度为1:200,酶标二抗的稀释度为1:10000,孵育时间为60 min,最适封闭液为5%脱脂乳,最佳底物显色时间为10 min;通过临界值的计算确定,当S/P≥0.2395判为阳性。重复性试验结果表明,r SP-ELISA方法批内、批间的重复变异系数均低于10%,表明该检测方法的重复性良好;特异性结果显示,该方法与CDV、CPV、FCV阳性血清均未发生特异性反应;敏感性试验结果显示,该方法检测阳性血清灵敏度可达1:800。应用该方法对临床采集的64份犬血清进行检测,结果显示阳性率为82.81%,与免疫层析法符合率达98.44%。
雷从从[7]（2021）在《猪δ冠状病毒（PDCoV）快速检测方法及单克隆抗体的制备研究》文中进行了进一步梳理猪δ冠状病毒病主要由猪德尔塔冠状病毒（PORCINE DELTACORONAVIRUS,PDCOV）引起的一种肠源性、接触性、传染性疾病。各个日龄阶段的猪均易感,主要侵害5～21日龄的哺乳仔猪,仔猪感染后出现腹泻、呕吐等急性临床症状,死亡率高达100%。PDCOV感染后的临床症状、病理变化及流行病学与猪流行性腹泻病毒（PORCINE EPIDEMIC DIARRHEA VIRUS,PEDV）极为相似,且常发生混合感染,通过临床症状难以进行确诊,必须借助实验室检测方法才可鉴别诊断。核衣壳蛋白（NUCLEOCAPSID,N）是PDCOV的结构蛋白,且具有高度保守性,机体感染PDCOV后针对N蛋白产生的抗体最早,持续时间长,产生的抗体量也最多,N蛋白是建立免疫学方法的首选抗原。基于特异性单克隆抗体的免疫分析方法在建立特异性强、灵敏度高、重复性好的诊断试剂盒的应用上发挥重要作用,被广泛应用于疾病诊断、食品安全检测等领域中,当前国内外尚未有可用于猪δ冠状病毒诊断的商用试剂。因此,建立PEDV、PDCOV二重TAQMANMGB FQ-PCR鉴别检测方法、基于重组N蛋白（R N）建立间接ELISA检测方法及研制抗PDCOV N蛋白的单克隆抗体对于PDCOV的临床诊断和防控具有重要意义。本研究建立了PEDV、PDCOV二重TAQMANMGB FQ-PCR检测方法;将转化N蛋白基因进行重组融合表达和纯化,建立了基于重组N蛋白（RN蛋白）的间接ELISA抗体检测方法;以PEG 2000为融合剂将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,通过建立的间接ELISA抗体检测方法经过4～5次筛选得到阳性克隆,制备抗PDCOV N蛋白的单克隆抗体并进行鉴定。试验结果如下:1.PEDV、PDCOV二重TAQMANMGB FQ-PCR方法的建立根据GENE BANK中收录的已知PEDV和PDCOV基因序列,用MEG ALIGN对PEDV M基因和PDCOV N基因进行比对分析,设计两对引物和TAQMAN-MGB探针对,优化最佳引物、探针浓度及反应条件,建立PEDV和PDCOV二重TAQMANMGB FQ-PCR检测方法,并进行特异性、敏感性、重复性试验及临床实验,结果显示:PGEM-PEDV标准曲线的循环阈值（CT）与模板浓度具有良好的线性关系,相关系数为0.998,拷贝数（X）与CT值之间的线性关系表达式为CT=﹣3.374 LGX+35.47;PGEM-PDCOV标准曲线的循环阈值（CT）与模板浓度具有良好的线性关系,相关系数为0.998,拷贝数（X）与CT值之间的线性关系表达式为CT=﹣3.543 LGX+35.5。该方法对PEDV和PDCOV检出的灵敏度均可达101COPIES/μL,表明灵敏度高;该方法可特异性的检测出PEDV、PDCOV阳性样品,而对TGEV、SADS、PRO V阳性样品及PEDV、PDCOV阴性样品无特异性扩增反应,表明特异性强;该方法组内、组间重复性变异系数均小于1.5%,表明重复性好;用建立的该方法对临床90份小肠组织样品进行检测,结果显示:16份为PEDV阳性,15份为PDCOV阳性,PEDV和PDCOV双阳性为6份,而普通PCR检测出13份PEDV阳性,12份PDCOV阳性,PEDV和PDCOV双阳性为4份,表明建立的FQ-PCR方法检出率较普通PCR高。因此,本研究建立的PEDV和PDCOV二重TAQMANMGB FQ-PCR检测方法可为以上两种疫病的快速检测诊断提供方法。2.PDCOV N基因的重组表达及基于RN蛋白间接ELISA检测方法的建立本研究将PDCOV N基因扩增并克隆到PET 32A（+）载体上,经过诱导表达、纯化得到RN蛋白。优化最佳包被条件、血清稀释度、封闭条件、二抗稀释度,建立基于R N蛋白的间接ELISA检测方法,经过特异性、敏感性、重复性及临床血清样品检测,结果显示:本研究成功扩增了长度1029BP N基因,表达的RN蛋白约为60K D,WESTERN BLOT结果表明该RN蛋白具有良好反应原性。RN蛋白最佳包被浓度为2μG/M L;血清最佳稀释度为1:100,作用时间1 H;羊抗猪HRP-IG G最适稀释度为1:5000,作用时间为30 MIN;TMB最佳显色时间为10 MIN。该方法可检出PDCOV阳性血清样品,而与TGEV、PRO V、SADS、PEDV阳性血清样品及PDCOV阴性血清样品无反应,表明特异性强;用建立的间接ELISA检测方法检出的5份阳性样品最高稀释倍数与中和实验基本相同,表明该方法敏感性好。批内、批间变异系数均小于10%,表明该方法重复性好。选取临床92份血清样品与中和实验结果做比较,两者符合率为93.3%。因此,本研究通过重组表达PDCOV N蛋白建立基于RN蛋白的间接ELISA血清学检测方法,为PDCOV监测及临床诊断提供了灵敏、特异且高效的工具。3.PDCOV N蛋白单克隆抗体的制备本研究用灭活并纯化的PDCOV细胞培养毒为抗原免疫纯系BALB/C小鼠,通过杂交瘤细胞技术将免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,用有限稀释法进行亚克隆并用建立的间接ELISA检测方法进行筛选,同时鉴定单抗亚型,最终筛选出1株亚型为IGG且能稳定分泌抗PDCOV N蛋白单抗的杂交瘤细胞株1A4。将杂交瘤细胞扩大培养,收集腹水后对其进行纯化,经过稳定性、特异性、阻断性检测,结果显示:1A4单抗特异性好,可特异性与PDCOV抗原反应,而与PRO V、PEDV、SVA、SADS、TGEV等抗原均不发生交叉反应;稳定性好,经过7次连续传代后,其效价依然可达到1:128000;有一定的阻断性,能够被PDCOV诱导的特异性阳性血清有效阻断。制备的抗PDCOV N蛋白的单克隆抗体,为进一步建立基于RN蛋白单抗的阻断ELISA及应用于临床快速检测的胶体金检测试纸条等方法奠定了基础。
孙颖[8]（2021）在《抗猪传染性胃肠炎病毒流行毒株鹌鹑卵黄抗体的研制》文中研究说明猪传染性胃肠炎（Transmissible gastroenteritis,TGE）是由猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus,TGEV）引起的一种急性、接触性传染病。TGEV对仔猪的危害尤为严重,导致小肠黏膜上皮细胞发生变性、坏死,造成水和电解质代谢紊乱、营养吸收障碍,引起仔猪严重腹泻、脱水和营养流失,患猪死亡率极高。疫苗免疫接种是目前防控TGE的主要手段,通过对怀孕母猪进行免疫接种,初生仔猪吸吮初乳而获得被动保护,但在生产中的实际效果并不十分理想;加上毒株的不断变异,造成疫苗免疫抗体不能给仔猪提供完全的免疫保护等,生产中对TGE的防控变得更加困难,使得本病在一些地区的猪场呈现暴发,造成的损失巨大。对TGE的防控实践中,通过注射或服用抗TGEV特异性抗体,获得了较好效果,其中卵黄抗体（Immunoglobulin of yolk,IgY）是一种重要的抗体产品。IgY具有来源方便、制备较为简单、价格相对低廉和效果良好的优点,在动物疫病防治中得到广泛使用。本研究对TGEV分离株进行增殖后制备灭活疫苗,免疫产蛋鹌鹑,提取抗TGEV IgY,通过对获得的特异性IgY的抗TGEV作用、特异性效价、稳定性等进行研究,获得了一种抗TGEV流行毒株的鹌鹑源卵黄抗体,为进一步临床应用提供了基础材料。本研究获得了以下结果:1.TGEV分离株在PK-15细胞中24 h病毒滴度最高。将TGEV分离株接种PK-15细胞,测定接毒后96 h内TGEV增殖曲线。结果显示,细胞在接毒后16 h出现典型细胞病变作用（Cytopathic effect,CPE）,24 h病毒滴度达到峰值(TCID50为10-7.3/m L),能满足制备疫苗的需要。2.TGEV分离株属流行毒株。克隆获得了TGEV分离株的N和S基因并进行序列分析,结果显示TGEV分离株属于Purdue like group分支,与国内雅安和哈尔滨的分离株SY-C和HE-1株亲缘关系最近,属于流行毒株。3.建立了TGEV抗体间接ELISA检测方法。TGEV S蛋白C抗原位点蛋白最佳包被浓度1.5μg/m L,样品最佳稀释度1:200,酶标抗体稀释度1:2000,孵育时间为20 min。当OD450值≥0.15时,判定结果为阳性。4.制备灭活免疫原接种鹌鹑获得高免蛋。制备了弗氏佐剂TGEV油包水型灭活苗。接种80只产蛋鹌鹑,收集血清及高免蛋。利用SDS-PAGE电泳分离抗体蛋白,结果显示IgY重链约为70 k Da,轻链约为28 k Da。分离纯化了特异性的抗TGEV流行毒株IgY。5.获得了纯度及效价高、制备简单、适于大量生产的抗TGEV流行毒株鹌鹑IgY。检测TGEV IgY的效价及特异性,结果显示第3次免疫后1周,抗体水平达到峰值(OD450为2.219)。商品苗对照组抗体的消长趋势与试验组一致,至免疫后第7周达到峰值(OD450为2.100)。说明制备的TGEV流行毒株灭活疫苗具有良好的免疫原性。IgY中和效价为1:109,比血清IgG抗体效价峰值（1:120）的出现滞后5～7 d。Western blot阳性条带的最大抗体稀释度为1:16000。IgY在70℃下及p H位于4.0～10.0区间时效价稳定;IgY在6 h内对胃蛋白酶具有一定抵抗力。
刘玉秀,黄柏成,田克恭[9]（2020）在《猫冠状病毒分子进化、免疫病理机制和疫苗研究进展》文中研究说明猫冠状病毒（Feline coronavirus, FCoV）具有2种血清型（I型和II型）,又分为2种生物型或病理型,一种是猫肠道冠状病毒（Feline enteric coronavirus, FECV）,主要引起轻度到重度肠炎;另一种是猫传染性腹膜炎病毒（Feline infectious peritonitis virus, FIPV）,主要引起感染猫腹膜炎、眼膜炎及神经症状等。FIPV被认为是FECV缺失突变体,
纪海旺,孙晓荣,孙科[10]（2020）在《犬冠状病毒研究进展》文中认为2020年2月,我国香港报道了新冠肺炎（COVID-19）患者家养的宠物犬感染了新型冠状病毒（SARS-CoV-2）,这引起了人们对犬冠状病毒的关注。为有助于人们全面了解犬冠状病毒,做好犬冠状病毒病防治,本文从病原学与流行病学、临床症状以及诊断和防治措施等方面进行了综述。犬冠状病毒在犬群中广泛存在,主要包括α冠状病毒属的犬肠炎冠状病毒和β冠状病毒属的犬呼吸道冠状病毒。犬冠状病毒致病性不强,引起的临床症状通常较轻,但对幼犬或与犬细小病毒、犬瘟热病毒等发生混合感染时,会引起较严重症状,且易发生突变,产生新的变异毒株,具有致病性增强的风险。目前,犬冠状病毒检测方法主要包括病原学检测、血清学检测以及RT-PCR、qRT-PCR、纳米PCR等分子生物学检测。犬冠状病毒感染的防治主要通过疫苗免疫以及科学饲养管理、卫生消毒和对症治疗等综合措施。虽然犬可感染SARS-CoV-2,但尚不清楚感染犬是否可将病毒再传染给其他动物或人类。因此,应加强犬冠状病毒的病原生态学研究和监测预警。
二、鸭冠状病毒肠炎免疫试验（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、鸭冠状病毒肠炎免疫试验（论文提纲范文）
（1）CRISPR/Cas9 技术在乳腺癌研究领域的应用及进展（论文提纲范文）
| 1 CRISPR/Cas9系统及CRISPR/Cas9高通量文库 |
| 2 药物靶点及耐药的研究 |
| 3 基因治疗中的应用 |
| 3.1 致癌基因层面 |
| 3.2 DNA修复层面 |
| 3.3 逆转耐药性层面 |
| 3.4 免疫治疗层面 |
| 3.5 其他 |
| 4 存在问题及展望 |
（2）水貂冠状病毒研究进展（论文提纲范文）
| 1 MCoV病原学 |
| 1.1 基因组结构 |
| 1.2 遗传进化 |
| 1.3 受体特点 |
| 2 ECG的诊断 |
| 2.1 电镜检查 |
| 2.2 病毒分离鉴定 |
| 2.3 酶联免疫吸附试验（ELISA) |
| 2.4 PCR检测 |
| 3 ECG的防治 |
| 4 小结与展望 |
| 4.1 水貂可作为研究CoV的动物模型 |
| 4.2 MCoV的公共卫生意义 |
（3）犬冠状病毒M蛋白单克隆抗体的制备及其在胶体金检测试纸条上的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第1章 犬冠状病毒研究进展 |
| 前言 |
| 1.1 犬冠状病毒分类地位 |
| 1.2 病毒形态与结构 |
| 1.3 基因组结构 |
| 1.4 病毒感染的临床表现及病理变化 |
| 1.5 治疗与预防 |
| 1.6 犬冠状病毒诊断技术 |
| 1.7 免疫胶体金检测技术及其在兽医领域的应用 |
| 1.8 本研究的目的和意义 |
| 第2章 犬冠状病毒M蛋白单抗隆抗体的制备及其生物学特性鉴定 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 毒株 |
| 1.1.2 细胞 |
| 1.1.3 试剂和仪器 |
| 1.1.4 试剂配制 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 结果与分析 |
| 1.4 讨论 |
| 第3章 小鼠腹水单克隆抗体纯化方法的比较研究 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 结果与分析 |
| 1.4 讨论 |
| 第4章 犬冠状病毒胶体金免疫层析检测试纸条的制备 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 结果与分析 |
| 1.4 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（4）胞内劳森菌抗原候选蛋白表达及ELISA方法建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 猪增生性肠炎概述 |
| 1.1.1 胞内劳森氏菌病原学 |
| 1.1.2 流行特点 |
| 1.1.3 致病机制 |
| 1.1.4 临床症状 |
| 1.1.5 病理变化 |
| 1.1.6 检测方法 |
| 1.1.7 防控 |
| 1.2 立题目的与意义 |
| 第二章 胞内劳森氏菌抗原候选蛋白表达及纯化与复性 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌种、载体和细胞 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 实验室仪器设备 |
| 2.1.4 主要溶液及培养基配制 |
| 2.2 方法及步骤 |
| 2.2.1 胞内劳森氏菌抗原候选蛋白的筛选 |
| 2.2.2 引物设计及合成 |
| 2.2.3 基因组提取 |
| 2.2.4 目的序列PCR扩增 |
| 2.2.5 重组质粒的构建 |
| 2.2.6 重组质粒酶切鉴定及测序 |
| 2.2.7 阳性菌液的获取 |
| 2.2.8 重组蛋白诱导表达及鉴定 |
| 2.2.9 重组蛋白的纯化及复性 |
| 2.2.10 Western blot试验鉴定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 抗原候选蛋白的生物学分析 |
| 2.3.2 目的基因的扩增 |
| 2.3.3 重组质粒的构建 |
| 2.3.4 重组蛋白表达及鉴定 |
| 2.3.5 重组蛋白的纯化及复性 |
| 2.3.6 重组蛋白的Western blot鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 胞内劳森氏菌重组蛋白鉴定及免疫活性分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 菌种和细胞 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 实验室仪器设备 |
| 3.1.4 实验动物 |
| 3.2 实验方法与步骤 |
| 3.2.1 兔阳性血清获取 |
| 3.2.2 鼠阳性血清获取 |
| 3.2.3 重组蛋白抗原性分析 |
| 3.2.4 多克隆抗体制备 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 兔阳性血清制备 |
| 3.3.2 鼠阳性血清制备 |
| 3.3.3 重组蛋白验证及抗原性分析 |
| 3.3.4 重组蛋白多克隆抗体制备 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 胞内劳森氏菌间接ELISA方法的建立及应用 |
| 4.1 鼠间接ELISA方法的建立及应用 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法与步骤 |
| 4.1.3 结果 |
| 4.1.4 讨论 |
| 4.2 猪血清中抗LI抗体检测的间接ELISA方法建立及应用 |
| 4.2.1 材料 |
| 4.2.2 方法与步骤 |
| 4.2.3 结果 |
| 4.2.4 讨论 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（5）PEDVN蛋白通过p53-DREAM信号通路介导宿主细胞S期阻滞的分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语表 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 PED的概述 |
| 1.1.1 流行病学 |
| 1.1.2 临床症状及病理变化 |
| 1.1.3 PEDV生物学特性 |
| 1.2 细胞周期调控的研究进展 |
| 1.2.1 细胞周期的概述 |
| 1.2.2 细胞周期的调控 |
| 1.3 p53 与细胞周期 |
| 1.3.1 p53 与细胞周期调控 |
| 1.3.2 p53-DREAM与细胞周期调控 |
| 1.4 冠状病毒感染与细胞周期 |
| 1.4.1 冠状病毒感染与细胞周期调控 |
| 1.4.2 冠状病毒N蛋白与细胞周期调控 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病毒、菌株、细胞 |
| 2.1.2 血清、载体 |
| 2.1.3 抗体 |
| 2.1.4 试剂 |
| 2.1.5 试剂配方 |
| 2.1.6 仪器设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 RNA 的提取及c DNA 的合成 |
| 2.2.2 基因扩增 |
| 2.2.3 重组质粒的构建及大量制备 |
| 2.2.4 原核表达、纯化及去标签化 |
| 2.2.5 细胞培养 |
| 2.2.6 细胞转染 |
| 2.2.7 间接免疫荧光(IFA) |
| 2.2.8 Western blotting |
| 2.2.9 流式细胞术 |
| 2.2.10 细胞周期同步化 |
| 2.2.11 接种病毒及TCID50 检测 |
| 2.2.12 免疫共沉淀(Co-IP) |
| 2.2.13 激光共聚焦 |
| 2.2.14 重组慢病毒的构建 |
| 2.2.15 分子对接分析 |
| 2.2.16 生物膜干涉技术(BLI)分析 |
| 2.2.17 实时荧光定量PCR(q RT-PCR) |
| 2.2.18 数据分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 PEDV N蛋白介导Vero E6 细胞S期阻滞确证以及对病毒复制的影响 |
| 3.1.1 PEDV N蛋白介导Vero E6 细胞S期阻滞的确证 |
| 3.1.2 PEDV N蛋白介导Vero E6 细胞S期阻滞对PEDV复制的影响 |
| 3.2 PEDV N蛋白介导Vero E6 细胞S期阻滞分子机制研究 |
| 3.2.1 PEDV N蛋白通过激活p53-DREAM信号通路引起Vero E6 细胞S期阻滞 |
| 3.2.2 PEDV N 蛋白诱导Vero E6 细胞S期阻滞依赖于N 蛋白和p53 核共定位 |
| 3.2.3 PEDV N蛋白通过与p53 相互作用介导Vero E6 细胞S期阻滞 |
| 3.3 基于PEDV N蛋白介导S期阻滞机制的抗病毒药物设计 |
| 3.3.1 抑制PEDV N蛋白与p53 相互作用小分子药物的筛选 |
| 3.3.2 筛选的小分子药物拮抗PEDV N蛋白介导Vero E6 细胞S期阻滞的确证 |
| 3.3.3 金丝桃苷对PEDV复制抑制作用 |
| 3.4 PEDV N蛋白介导S期阻滞分子机制在仔猪肠道细胞IPEC-J2 上验证 |
| 3.4.1 PEDV N蛋白对IPEC-J2 细胞S期阻滞的确证以及对病毒复制的影响 |
| 3.4.2 PEDV N蛋白通过p53-DREAM信号通路介导IPEC-J2 细胞S期阻滞的验证 |
| 3.4.3 金丝桃苷拮抗PEDV N蛋白介导IPEC-J2 细胞S期阻滞抑制病毒复制的验证 |
| 4 讨论 |
| 全文结论 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）犬冠状病毒S蛋白抗原多表位基因的重组表达及rSP-ELISA方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 犬冠状病毒概述 |
| 1.1.1 分类及简介 |
| 1.1.2 流行病学及临床、病理表现 |
| 1.1.3 基因组与蛋白结构 |
| 1.1.4 S基因与S蛋白 |
| 1.2 诊断技术 |
| 1.2.1 病原学诊断技术 |
| 1.2.2 血清学诊断技术 |
| 1.3 利用生物信息学分析抗原表位 |
| 1.3.1 基因洗牌技术 |
| 1.3.2 蛋白结构模拟 |
| 1.4 研究目的及意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞、病毒和血清 |
| 2.1.2 菌株和质粒 |
| 2.1.3 试验动物 |
| 2.1.4 主要试剂及耗材 |
| 2.1.5 实验仪器设备 |
| 2.1.6 主要试剂配制 |
| 2.2 主要实验方法 |
| 2.2.1 S蛋白及表位生物信息学分析与筛选 |
| 2.2.2 目的基因的全基因合成及质粒的构建 |
| 2.2.3 质粒转化及小量表达 |
| 2.2.4 目的蛋白的原核表达与纯化 |
| 2.2.5 鼠抗血清的制备 |
| 2.2.6 鼠源抗血清的特异性检测 |
| 2.2.7 血清中和试验 |
| 2.2.8 间接ELISA方法的建立 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 B细胞线性表位分析 |
| 3.2 B细胞线性表位基因洗牌重组 |
| 3.2.1 重组表位的二级结构分析及生物学特性分析 |
| 3.2.2 Pymol生物学软件模拟结果 |
| 3.3 重组质粒的构建及双酶切鉴定 |
| 3.4 目的蛋白的原核诱导表达及纯化 |
| 3.4.1 SDS-PAGE分析诱导表达蛋白 |
| 3.4.2 Western blot鉴定目的蛋白 |
| 3.4.3 SDS-PAGE分析纯化目的蛋白 |
| 3.4.4 液相色谱-质谱联用鉴定目的蛋白 |
| 3.5 鼠源抗血清特异性检测 |
| 3.6 血清中和试验结果 |
| 3.7 间接ELISA检测抗体方法的评价结果与分析 |
| 3.7.1 最佳实验条件的筛选 |
| 3.7.2 临界值的确定 |
| 3.7.3 重复性试验结果 |
| 3.7.4 特异性试验结果 |
| 3.7.5 敏感性试验结果 |
| 3.7.6 临床样本检测结果 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 S蛋白抗原表位分析筛选 |
| 4.2 重组蛋白rSP的表达与纯化 |
| 4.3 基于重组蛋白rSP-ELISA方法的建立 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录A 质粒信息 |
| 附录B |
| 附录C 质谱结果 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（7）猪δ冠状病毒（PDCoV）快速检测方法及单克隆抗体的制备研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 猪δ冠状病毒病研究进展 |
| 1.1 猪δ冠状病毒(PDCoV)概述 |
| 1.1.1 冠状病毒分类 |
| 1.1.2 PDCoV病原特征及基因结构 |
| 1.1.3 PDCoV的分离培养 |
| 1.2 临床症状 |
| 1.3 病理变化 |
| 1.3.1 眼观病理变化 |
| 1.3.2 镜检病理变化 |
| 1.4 PDCoV在不同国家的流行情况 |
| 1.4.1 PDCoV在香港及中国大陆流行情况 |
| 1.4.2 PDCoV在美国的流行情况 |
| 1.4.3 PDCoV在韩国的流行情况 |
| 1.4.4 PDCoV在泰国的流行情况 |
| 1.5 猪δ冠状病毒的诊断方法 |
| 1.5.1 RT-PCR检测方法 |
| 1.5.2 荧光定量PCR检测方法 |
| 1.5.3 血清学检测 |
| 1.5.4 免疫荧光染色、免疫组织化和原位杂交 |
| 1.6 本研究目的意义 |
| 试验研究 |
| 第二章 鉴别PEDV、PDCoV二重TaqManMGB FQ-PCR方法的建立 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 样品及菌株 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 常用溶液及其配制 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 引物及探针的设计与合成 |
| 2.2.2 PEDV、PDCoV标准品的制备 |
| 2.2.3 鉴别PEDV、PDCoV二重TaqManMGB FQ-PCR方法反应条件的优化 |
| 2.2.4 标准曲线的建立及敏感性实验 |
| 2.2.5 特异性试验 |
| 2.2.6 重复性试验 |
| 2.2.7 临床应用实验 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 PEDV、PDCoV阳性标准品的制备 |
| 2.3.2 重组阳性质粒拷贝数的计算 |
| 2.3.3 鉴别PEDV、PDCoV二重TaqManMGB FQ-PCR方法反应体系与反应条件的优化 |
| 2.3.4 标准曲线的建立、敏感性试验和判定标准的确立 |
| 2.3.5 特异性实验 |
| 2.3.6 重复性实验 |
| 2.3.7 临床应用实验 |
| 2.4 讨论与分析 |
| 第三章 PDCoV N 蛋白重组表达及基于rN 蛋白间接ELISA检测方法的建立 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 病毒与血清样品 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 常用溶液及其配制 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 PDCoV N基因扩增、克隆及鉴定· |
| 3.2.2 PDCoV N基因的重组表达、纯化和活性鉴定 |
| 3.2.3 基于rN蛋白间接ELISA方法的建立 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 PDCoV N基因的PCR扩增、克隆及鉴定 |
| 3.3.2 rN基因的诱导表达、纯化和活性鉴定 |
| 3.3.3 间接ELISA方法的优化 |
| 3.4 讨论与分析 |
| 第四章 PDCoV N蛋白单克隆抗体的制备 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 实验室常用的主要试剂 |
| 4.1.2 实验室常用的主要仪器 |
| 4.1.3 细胞、实验动物、血清 |
| 4.1.4 常用溶液及其配制 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 免疫抗原的制备 |
| 4.2.2 免疫小鼠 |
| 4.2.3 免疫小鼠血清效价的检测 |
| 4.2.4 杂交瘤细胞株的制备 |
| 4.2.5 单克隆抗体特异性检测 |
| 4.2.6 单克隆抗体稳定性检测 |
| 4.2.7 腹水的制备及纯化 |
| 4.2.8 腹水的效价测定 |
| 4.2.9 腹水的特异性检测 |
| 4.2.10 腹水的稳定性检测 |
| 4.2.11 腹水阻断性检测 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 PDCoV全病毒免疫小鼠血清效价检测结果 |
| 4.3.2 杂交瘤细胞株的建立 |
| 4.3.3 单克隆抗体亚型的鉴定 |
| 4.3.4 单克隆抗体特异性检测 |
| 4.3.5 单克隆抗体稳定性检测 |
| 4.3.6 腹水纯化结果 |
| 4.3.7 腹水效价检测结果 |
| 4.3.8 腹水特异性检测 |
| 4.3.9 腹水稳定性检测 |
| 4.3.10 腹水阻断性检测 |
| 4.4 讨论与分析 |
| 结论 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）抗猪传染性胃肠炎病毒流行毒株鹌鹑卵黄抗体的研制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 猪传染性胃肠炎防控及卵黄抗体研究进展 |
| 1.1 猪传染性胃肠炎的研究概况 |
| 1.1.1 猪传染性胃肠炎及猪传染性胃肠炎病毒 |
| 1.1.2 传染性胃肠炎的流行病学 |
| 1.1.3 猪传染性胃肠炎的防控 |
| 1.2 卵黄抗体及其应用 |
| 1.2.1 卵黄抗体的结构和功能 |
| 1.2.2 卵黄抗体的提取和制备方法 |
| 1.2.3 卵黄抗体的应用 |
| 1.2.4 鹌鹑用于生产卵黄抗体的可行性 |
| 1.3 研究的目的与意义 |
| 试验研究 |
| 第二章 猪传染性胃肠炎病毒分离株的分析及抗体检测ELISA方法的建立 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞、病毒及血清 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 TGEV分离株生长曲线和病毒滴度测定 |
| 2.2.2 TGEV分离株遗传变异分析 |
| 2.2.3 检测 TGEV 抗体 ELISA 方法的建立 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 TGEV分离株的鉴定与滴度测定 |
| 2.3.2 TGEV分离株的基因变异分析 |
| 2.3.3 建立TGEV抗体检测ELISA方法 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 抗猪传染性胃肠炎病毒流行毒株鹌鹑卵黄抗体的提取和抗病毒活性检测 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 细胞、病毒和动物 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 猪传染性胃肠炎病毒流行毒株灭活疫苗的制备及检验 |
| 3.2.2 产蛋鹌鹑免疫及高免蛋黄的初步收集 |
| 3.2.3 卵黄抗体的提取及纯化 |
| 3.2.4 卵黄抗体的理化特性及纯度检验 |
| 3.2.5 抗猪传染性胃肠炎卵黄抗体的效价测定 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 TGEV分离株灭活疫苗检验 |
| 3.3.2 卵黄抗体提取方法的优化 |
| 3.3.3 卵黄抗体抗TGEV效价的检测 |
| 3.3.4 卵黄抗体对TGEV的中和效价 |
| 3.3.5 卵黄抗体的理化特性及安全性检验 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 本文的创新点 |
| 参考文献 |
| 附录A 缩略词及中英文对照表 （Abbreviation Index） |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）猫冠状病毒分子进化、免疫病理机制和疫苗研究进展（论文提纲范文）
| 1 猫冠状病毒基因组 |
| 2 猫冠状病毒血清型 |
| 3 猫冠状病毒生物型 |
| 4 发病机制 |
| 5 猫冠状病毒感染疫苗接种的风险与效益评价 |
| 6 展望 |
（10）犬冠状病毒研究进展（论文提纲范文）
| 1 病原学与流行病学 |
| 2 临床症状及病理变化 |
| 3 实验室诊断 |
| 3.1 病原学检测 |
| 3.2 血清学检测 |
| 3.3 分子生物学检测 |
| 3.3.1 RT-PCR |
| 3.3.2 实时荧光定量RT-PCR(q RT-PCR) |
| 3.3.3 纳米PCR(nano RT-PCR) |
| 4 防治措施 |
| 5 结语 |
四、鸭冠状病毒肠炎免疫试验（论文参考文献）
- [1]CRISPR/Cas9 技术在乳腺癌研究领域的应用及进展[J]. 方敏,李莉,李恒宇,盛湲. 世界临床药物, 2021(12)
- [2]水貂冠状病毒研究进展[J]. 张传美,张路宾,刘佳卉,赵辉,马清霞,杨海燕,单虎. 病毒学报, 2021(04)
- [3]犬冠状病毒M蛋白单克隆抗体的制备及其在胶体金检测试纸条上的应用[D]. 吕海峰. 扬州大学, 2021
- [4]胞内劳森菌抗原候选蛋白表达及ELISA方法建立[D]. 张昆. 中国农业科学院, 2021(09)
- [5]PEDVN蛋白通过p53-DREAM信号通路介导宿主细胞S期阻滞的分子机制[D]. 苏明俊. 黑龙江八一农垦大学, 2021(01)
- [6]犬冠状病毒S蛋白抗原多表位基因的重组表达及rSP-ELISA方法的建立[D]. 郝云峰. 中国农业科学院, 2021
- [7]猪δ冠状病毒（PDCoV）快速检测方法及单克隆抗体的制备研究[D]. 雷从从. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [8]抗猪传染性胃肠炎病毒流行毒株鹌鹑卵黄抗体的研制[D]. 孙颖. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [9]猫冠状病毒分子进化、免疫病理机制和疫苗研究进展[J]. 刘玉秀,黄柏成,田克恭. 中国兽医杂志, 2020(11)
- [10]犬冠状病毒研究进展[J]. 纪海旺,孙晓荣,孙科. 中国动物检疫, 2020(10)