一、沙门氏菌鞭毛蛋白的提纯与鉴定（论文文献综述）
曹军平,焦新安,杜元钊,刘秀梵,张如宽[1]（1996）在《沙门氏菌鞭毛蛋白的提纯与鉴定》文中指出经半固体诱导，用Ｍ－肉汤培养沙门氏菌，离心收集细菌，将其悬浮于ＰＨ２．０溶液中，室温缓慢振荡３０分钟．再经差速离心取上清液用１ＮＮａＯＨ溶液调ｐＨ至７．２左右。经硫酸铵沉淀，过ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ－３００柱，收集第一峰。电镜观察、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等电聚焦试验及ＥＬＩＳＡ试验结果均表明提纯的鞭毛蛋白纯度高。
萨仁高娃[2]（2020）在《百里香精油与海藻酸盐复合涂膜防控鲜切水果食源性病原微生物作用机制的研究》文中提出鲜切果蔬是新鲜果蔬经过分级、整理、清洗、切分、去心（核）、修整、保鲜和包装等加工程序而制成的即食、即用食品,具有“方便、新鲜、营养、安全”的特点,鲜切加工产生的下脚料还可统一回收再综合利用,具有减少生活垃圾的环保特点。然而,鲜切加工使果蔬失去原有的保护组织且受到机械伤害,增加了果蔬对微生物的敏感性,尤其是食源性病原微生物的污染,存在较大的安全风险,制约鲜切产业的发展。植物精油具有天然性、挥发性和抑菌广谱性等特点,广泛应用于食品的抑菌保鲜。但植物精油在鲜切果蔬保鲜中应用的研究报道较少,尤其是抑菌机制不明,制约了植物精油在鲜切果蔬中的有效应用。本研究筛选了抑菌效果最佳的植物精油并探究其抑菌机制,分析了植物精油与海藻酸盐复合涂膜对鲜切水果品质与安全性的影响,旨在为鲜切果蔬的加工、生产、流通环节的安全性提供技术支撑。论文的研究结果如下:1.筛选抑菌效果最佳的植物精油。选择15种常用的植物精油,即百里香、肉桂、牛至、柠檬草、薄荷、迷迭香（2种）、丁香、桉树、薰衣草、茶树、艾纳、缬草、苍术和珊瑚姜,以4种食源性病原微生物为抑菌对象,即单核细胞增生性李斯特菌（以下简称单增李斯特菌）、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌O157:H7,通过测定植物精油抑菌圈直径和最低抑菌浓度（MIC）,并绘制植物精油作用下食源性病原微生物的生长曲线,筛选抑菌效果最佳的植物精油。结果表明,百里香、肉桂和牛至精油抑制单增李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌O157:H7的抑菌圈直径范围分别是14.07-23.60、13.07-24.00和12.27-21.87 mm,均为中敏-高敏。其它12种精油的抑菌圈直径的范围是6.00-14.40 mm,均为低敏-中敏或无抑菌作用。百里香、肉桂和牛至精油抑制4种食源性病原微生物的MIC分别为0.31、0.63和0.63-1.25 μL/mL。MIC、2MIC和4MIC的百里香、肉桂和牛至精油处理抑制了4种食源性病原微生物的生长。1/2MIC和1/4MIC的3种精油中,百里香精油抑制4种食源性病原微生物生长的延滞期最长,稳定期的抑制率最高。百里香精油的抑菌效果最佳。2.从蛋白质水平解析百里香精油抑制单增李斯特菌的作用机制。通过气相色谱质谱联用法分析百里香精油的挥发性成分,并以单增李斯特菌为目标菌,对精油处理的单增李斯特菌进行扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）观察,同时对两种不同浓度的百里香精油,即Treatment-1(0.28 μL/mL和Treatment-2（0.31 μL/mL）处理的单增李斯特菌进行TMT标记定量蛋白质组学的分析。结果表明,百里香精油中含有28种成分,酚类物质含量最高,其中百里香酚占47.23%,对甲苯酚占20.37%,2,6-二甲基苯酚占16.26%。SEM和TEM观察表明,百里香精油处理后单增李斯特菌细胞出现变形、褶皱和破裂等变化,细胞完整性丧失。Treatment-1 vs Control鉴定出差异表达蛋白质100个,其中57个上调和43个下调,上调和下调蛋白质比例分别为57%和43%,蛋白质上调比例较高表明Treatment-1可能诱发单增李斯特菌的应激表达,Treatment-2 vs Control鉴定出差异表达蛋白质745个,其中220个上调和525个下调,上调和下调蛋白质比例分别为30%和70%,蛋白质下调比例较高表明Treatment-2可能干扰单增李斯特菌的应激表达和正常生理代谢。通过对差异表达蛋白质进行GO富集分析、KEGG通路富集分析和蛋白质相互作用网络分析,建立了百里香精油抑制单增李斯特菌的作用机制:百里香精油分子通过渗透方式穿过单增李斯特菌的细胞壁而进入细胞膜,并与之融合,细胞膜的透性和完整性受到破坏,酚类物质干扰单增李斯特菌的能量代谢以及遗传信息的转录、翻译、RNA降解和DNA修复等加工过程,降低了细胞运动性和细菌耐药性,抑制了单增李斯特菌的生长。3.考察百里香精油与海藻酸盐复合涂膜（TOAC）对鲜切苹果品质与安全性的影响。以鲜切苹果为实验材料,以百里香精油与海藻酸盐复合涂膜为保鲜剂,研究了4℃下不同浓度百里香精油（0.05%、0.35%和0.65%,v/v）的涂膜对鲜切苹果呼吸速率、失重率、硬度、色泽和感官品质的影响,分析了TOAC处理鲜切苹果细菌总数、大肠菌群菌落数、霉菌和酵母菌菌落数、乳酸菌菌落数的变化,研究了TOAC处理对人工接种的单增李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌O157:H7的抑制效果,以未处理和海藻酸盐可食性涂膜单独处理的鲜切苹果分别作为空白和对照。结果表明,0.05%百里香精油的涂膜处理显着抑制了贮藏期间鲜切苹果呼吸速率的升高,有效保持了失重率、硬度、色泽等品质指标,感官评价均为5分以上（p<0.05）。TOAC抑制了鲜切苹果上背景微生物及人工接种的4种食源性病原微生物的生长。4.考察百里香精油与海藻酸盐复合涂膜对鲜切哈密瓜品质与安全性的影响。以鲜切哈密瓜为实验材料,以百里香精油与海藻酸盐复合涂膜为保鲜剂,其方法同鲜切苹果。结果表明,0.05%百里香精油的涂膜处理抑制了鲜切哈密瓜呼吸速率的升高,有效保持了品质指标。TOAC处理抑制了鲜切哈密瓜上背景微生物及食源性病原微生物的生长。本论文初步解明了百里香精油抑制单增李斯特菌的作用机制,研发出了防控鲜切水果食源性病原微生物的百里香精油与海藻酸盐复合涂膜保鲜剂,该保鲜剂可在鲜切果蔬包装、贮藏、流通、销售等全过程中有效控制食源性病原微生物,同时还可有效保持鲜切果蔬的良好品质。
杨梦露[3]（2018）在《植物乳杆菌HD-23细菌素基因plnE和plnF的原核表达及抑菌机理研究》文中研究说明细菌素（Bacteriocin）是由不同种类的细菌通过核糖体合成机制产生的一类具有抑菌活性的多肽或蛋白质。许多乳酸菌产生的细菌素有非常广泛的抑菌谱,在食品保藏中有很好的应用前景。将细菌素应用在食品工业中可以减少化学防腐剂的添加,减少热处理强度,更自然的保存食物并且丰富其感官和营养特性。本研究中分离得到一株产细菌素且活性强的植物乳杆菌HD-23,优化其发酵培养基;将原核表达得到的细菌素PlnEF用于抑制鼠伤寒沙门氏菌SL1344,研究其基本的抑菌机理;探究PlnEF在鼠伤寒沙门氏菌SL1344细胞膜上可能的细菌素受体,主要结果如下:1产细菌素乳酸菌的分离鉴定从各地采集的自制泡菜水、豆豉、自酿酸奶、腐乳、腊鱼中分离出80株在MRS平板上有明显透明溶钙圈的疑似乳酸菌。复筛采用抑菌试验,对抑菌物质进行生物学特性鉴定后筛选出一株产细菌素活性最强的菌株,分子生物学鉴定后命名为植物乳杆菌HD-23。2响应面优化玉米粉培养基成分玉米作为我国粮食发展的支撑性作物,将其作为培养基成分是对粮食资源的合理利用,并且能降低细菌素生产成本,适应工业上低成本高产量的需求。对玉米粉培养基成分进行响应面优化,抑菌试验以抑菌圈直径为响应值,得到最优的培养基成分为8 g/l玉米粉、3.13 g/l葡萄糖、1.22 g/l蛋白胨、0.57g/l乙酸钠、10 g/l牛肉膏、1 g/l酵母粉、2 g/l柠檬酸氢二铵、0.4 g/l碳酸氢二钾、0.58g/l硫酸镁、0.25 g/l硫酸锰、1 ml/l吐温-80。3细菌素基因plnE和pln F的原核表达及纯化使用同源重组酶的方法诱导载体质粒pET-32a与目的扩增产物重组,重组质粒经两次转化后构建pET-32a-plnE-E.coli BL21和pET-32a-plnF-E.coli BL21表达菌株。经Ni-NTA亲和层析柱,超滤以及肠激酶酶切后获得纯的PlnE肽（3.6 kDa）和PlnF肽（3.7 kDa）。抑菌谱测定显示细菌素PlnEF对革兰氏阳性、阴性菌均有抑菌作用。4细菌素PlnEF作用鼠伤寒沙门氏菌SL1344抑菌机理以纯化后的细菌素PlnEF作用于鼠伤寒沙门氏菌SL1344,测得其细胞裂解率随PlnEF添加量的增加而增加。正常情况下,胞外各物质含量很少,经细菌素处理后发现胞外ATP、乳酸脱氢酶、紫外吸收物质都有明显的增加。结果表明细菌素PlnEF通过使鼠伤寒沙门氏菌SL1344胞内物质泄露,从而导致细胞死亡。5细菌素PlnEF对鼠伤寒沙门氏菌SL1344作用结合位点的研究使用细菌素PlnEF处理鼠伤寒沙门氏菌SL1344,同时提取细菌素处理和未处理的的细胞膜蛋白进行双向电泳,谱图分析电泳图上缺失的蛋白斑点,通过MALDI-TOF-MS测得可能产生影响的蛋白为磷酸甘油酸激酶（PGK）蛋白。用λ-red技术对PGK基因完整的开放阅读框进行敲除,验证细菌素PlnEF可能通过该蛋白对鼠伤寒沙门氏菌SL1344造成影响,使细胞死亡。本论文筛选出一株产细菌素活性较好的植物乳杆菌HD-23,将玉米粉添加至MRS培养基成分中发酵HD-23产细菌素,合理利用粮食资源,符合工业化生产需要。将细菌素基因plnEF同源重组到工程菌中,获得纯的细菌素PlnEF。鼠伤寒沙门氏菌SL1344为全基因组测序菌株,将其作为目标菌,有效的研究了细菌素PlnEF对该菌的抑菌机理是导致胞内物质泄露,从而使细胞死亡。本试验中还探究了PlnEF在鼠伤寒沙门氏菌SL1344细胞膜受影响的为磷酸甘油酸激酶蛋白,并采用基因敲除的方法进行验证。本研究中针对纯细菌素PlnEF的试验为二肽细菌素的深入研究提供了一定的基础。
陈明[4]（2012）在《鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白FliC的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备》文中研究指明沙门氏菌是一种人畜共患病病原菌,可导致食物中毒,对人类健康造成很大的威胁。本论文通过扩增沙门氏菌fliC基因,构建pET28a-fliC重组子,实现沙门氏菌fliC基因在大肠杆菌中的高效表达,将纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,获得多克隆抗体,并对抗血清的效价和特异性进行检测,为后续利用该多抗建立沙门氏菌ELISA快速检测方法奠定基础。本文分三部分进行研究阐述：1鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白基因fliC的克隆及其在E.coli中的表达通过PCR方法从鼠伤寒沙门氏菌中扩增出fliC基因,连接到原核表达载体pET28a（+）上,构建pET-28a（+）-fliC重组质粒,然后转化至大肠杆菌BL21（DE3）pLysS,通过酶切鉴定和测序验证后加入IPTG诱导蛋白的表达。实验结果表明,PCR产物与预期的目的基因大小相吻合；构建的重组质粒经酶切鉴定和测序鉴定表明重组质粒构建成功；经IPTG诱导的重组蛋白分子量为55KD,与预期目标蛋白大小相吻合。2鼠伤寒沙门氏菌Ⅰ相鞭毛蛋白的纯化及鉴定用镍金属离子亲和层析对鞭毛融合蛋白进行纯化,然后通过SDS-PAGE检测蛋白纯度和分子量,并通过BCA法和Western-blot分别检测蛋白浓度和蛋白的特异性。实验结果表明,经Ni-NTA纯化的蛋白纯度较高,分子量与目的蛋白相符,经Western-blot分析,表达产物可与抗His-tag单抗在55KD处产生特异性结合,表明表达产物中确实含有His-tag标签,进一步证明表达出的蛋白为目的蛋白。3FliC多克隆抗体的制备将纯化的鞭毛蛋白免疫小鼠,制备抗血清,并用间接ELISA法测定抗体的效价和特异性。实验结果表明,纯化的表达产物能刺激小鼠产生特异性抗体,抗体效价均大于1：32000,并具有较好的特异性和一定的属内广谱性,为后续利用该多抗建立沙门氏菌ELISA决速检测方法奠定了基础。
焦新安,徐卫平,曹军平,潘志明,张国强,高崧,吴长新,文其乙,张如宽,刘秀梵[5]（1998）在《沙门氏菌鞭毛蛋白共同抗原的诊断价值探讨》文中研究指明用肠炎、鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白分别免疫56日龄ICR小鼠，经间接ELISA和直接凝集试验测定证实．产生了血清分型H抗原的抗体，亦产生了针对鞭毛蛋白共同抗原组分的抗体。同时，用灭活全菌抗原免疫3日龄伊莎鸡，经单抗CB8＋de7竞争ELISA测定，灭活肠炎、鼠伤寒沙门氏菌免疫组同样测出较高滴度共同抗原表位的抗体。进一步用都柏林、鼠伤寒和肠炎沙门氏菌活菌分别人工感染56日龄ICR小鼠、3日龄伊莎鸡和140日龄SPF鸡．用单抗竞争ELISA亦检测出鞭毛蛋白共同抗原表位的抗体。这些结果表明：沙门氏菌鞭毛蛋白共同抗原表位可作为新的检测对象，在该菌感染诊断方面具有重要意义。研究中证实．单抗竞争ELISA为检测该类表位抗体提供了新方法。
黄秀芬,章振华,孙惠铃,孙盈,陈小铃,李永清[6]（2013）在《沙门氏菌鞭毛佐剂禽流感灭活疫苗可诱导良好免疫保护》文中研究说明禽流感病毒是一种广泛存在于禽类中的呼吸道病毒,尤其是H9N2亚型禽流感病毒,几乎所有的家禽、水禽及飞鸟均能感染。当前,为了防控该病的暴发,各地均使用了疫苗对受威胁的家禽进行免疫接种。然而,由于该病毒表面抗原（血凝素抗原HA及神经氨酸酶NA）极易发生变异,以致于人们无法研制可用于点眼、滴鼻及喷雾免疫的弱毒疫苗,更没有可以用于野禽或飞鸟免疫的口服疫苗。
李冰清[7]（2013）在《YdiV负调控细菌鞭毛合成的分子机制研究》文中研究表明鞭毛是很多细菌具有的运动器官。自然界中的细菌,利用鞭毛的推动,运动到营养物质更丰富、更有力于其生存的环境中。有些致病菌的鞭毛还与其致病性密切相关。例如,在致病菌侵染人体初期,鞭毛功能正常的细菌能较快吸附到人体细胞上,依靠鞭毛的推动突破人体表皮粘膜的防护。而失去鞭毛的菌株将失去吸附能力,从而丧失其致病性。因此,细菌鞭毛的合成途径是设计新型抗菌药物的重要的靶点之一。细菌的鞭毛实际上是一个大的蛋白质复合休,鞭毛蛋白的合成和组装由一系列的蛋白共同参与来先成。鞭毛毛基因的转录和翻译都有着严格的时序性。大肠杆菌基因组中有超过25个操纵子、近60个基因直接参与鞭毛的合成过程。根据基因的转录顺序的不同,这些基因被分为三类：第一级鞭毛基因,第二级鞭毛基因和第三级鞭毛基因处于整个流程最上游的、最先被转录和表达的是flhDC操纵子。此操纵子中包含flhD和flhC两个基因。这两个基因的表达产物组装成异源蛋白质六聚体FlhD4C2。FlhD4C2复合物能够结合在第二级鞭毛基因上游的启动子位置,是启动这些基因的转录所必需的。第二级鞭毛基因包含编码组成基体和钩型鞘的蛋白质、鞭毛特异的三型分泌系统的组分蛋白及鞭毛特异的转录因子δ的基因。第三级鞭毛基因的表达产物包括鞭毛组装蛋白、调控鞭毛功能的蛋白以及一些未知功能的蛋白。鞭毛基因这种分层调控的特征在革兰氏阴性细菌中是高度保守的。鞭毛蛋白的表达和鞭毛的合成过程是高度有序的过程,鞭毛的调控也会受到很多因子的在不同层次的调控。对于flhDC操纵子的调控是最关键的调控点,多种调控因子分别在DNA, mRNA以及蛋白水平上对于此操纵子进行调控。本文的研究对象YdiV是最近被识别的、在蛋白水平上调控FlhDC功能的蛋白。YdiV属于负责降解C-di-GMP的EAL蛋白家族中的一员。但YdiV序列中负责催化C-di-GMP降解所必需的10个保守的氨基酸中8个发生了突变。也就是说YdiV可能不具有降解C-di-GMP的功能。早期的研究发现这个蛋自功能与EAL的同源蛋白有很大不同：正常EAL结构域的蛋白正调控细菌的移动性,而YdiV蛋白显着抑制细菌的鞭毛合成和移动性;YdiV蛋白对下拨内C-di-GMP浓度的影响也存在着争议。2011年,Wada等将沙门式菌中YdiV蛋白的作用对象锁定在F1hDC复合物上,但这一过程种的具体机制仍然不明确。另外,2012年Takaya等人研究发现YdiV协助C1pXP蛋白酶降解F1hDC复合物,而本身不被降解。这一过程的机制也未知。本论文研究试图通过结构生物学、生物化学、分子生物学及微生物学的多种实验方法结合来揭示YdiV抑制细菌移动性这一过程的分子机制。本论文的主要研究内容和结论如下（Ⅰ）使用蛋白质晶体X射线衍射法解析得到了1.9A分辨率的大肠杆菌YdiV蛋白结构。将YdiV结构与其他EAL结构进行对比发现两者在折叠类型上较相似,但是结构细节有较大的差别。与其他EAL蛋白不同,YdiV在溶液中以单体形式存在。虽然YdiV不能结合C-di-GMP,但保守的C-di-GMP结合凹槽仍然存在YdiV的机构中,此凹槽中结合了一个甘油分子和一个磷酸分子。这说明YdiV虽不能结合C-di-GMP,但其可能结合某些比C-di-GMP小的、构象类似的小分子由此来调控其下游的功能。（2）首次验证了大肠杆菌fYdiV蛋自的F1hDC的相互作用。并将YdiV相互作用的对象锁定在F1hD上。为了找到与YdiV相互作用的最小F1hD片段,克隆了四个F1hD片段：F1hD1-71aa, F1hD1-82aa, F1hD1-98aa, F1hD1-106aa。将于YdiV相互作用的区域确定为F1hD的N端71个氨基酸。EMSA实验发现YdiV抑制F1hDC结合DNA呈现浓度效应：当YdiV的浓度比较低时,YdiV与F1hDC形成的复合物还能结合DNA,但当YdiV与F1hDC的比例超过3以后,形成的复合物就不能结合DNA。（3）使用蛋白质晶体X射线衍射法解析得到了2.9A分辨率的YdiV-F1hD复合物的结构。结构分析结合生化实验证明,在溶液状态下复合物以YdiV2-F1hD2四聚体的形式存在。YdiV的第6、7、8个α螺旋与F1hD的第1、4个α螺旋组成两蛋白的相互作用面。复合物结构中YdiV, F1hD与各自的单体结构的构象变化都不大,但参与相互作用的具体氨基酸有比较大的构象变化。通过序列比对发现,参与YdiV与F1hD相互作用的氨基酸在所有肠道细菌中都非常保守,暗示其他肠道细菌中YdiV同源蛋白通过相同的机制发挥功能。（4）通过对F1hD4C复合物的结构分析,找到了位于蛋白质表面可能与DNA结合有关的正电荷密集的区域。并通过定点突变的方法,克隆并纯化得了多种FlhD4C2的突变体。EMSA实验证明突变体蛋白都完全丧失了DNA结合的活性。这一数据有力的证明,FlhC上正电荷富集的区域和环状结构都是FlhD4C2结合DNA所必须的。DNA主要结合在FlhC亚基上,而FlhD亚基对于形成和稳定FlhD4C2环状结构和DNA结合都是必不可少的。最后,提出了FlhD4C2复合物与DNA相互作用的模型：DNA与FlhC上正电荷富集的区域互作,并被FlhCL的锌指结构固定。整体构象上,DNA呈现一定的弯曲度,并且DNA是环绕FlhC亚基的。（5）通过YdiV-FlhD结构与F1hD4C2结构的叠合,模拟出了YdiV,-FlhD4C2YdiV2-FlhD4C2. YdiV3-FlhD4C2和YdiV4-FlhD4C2四种三元复合物的结构模型。使用负染电镜的方法观察到了不同构象的YdiV-FlhDC三元复合物,验证了我们提出的三元复合物结构模型。（6）构建了多种YdiV突变体来进一步验证突变体功能。发现不能与FlhD互作的YdiV突变体也都不能抑制F1hD4C2的DNA结合活性,并且不影响细菌的移动性。说明YdiV蛋白影响细菌移动性的原因确实是由其与F1hD相互作用而引发的。另外,我们分析YdiV-F1hD结构,设计了沙门式菌同源蛋白CdgR的一些突变体。使用Pull down方法检测了这些突变体与stF1hD和stF1hDC的相互作用。实验数据暗示沙门氏菌CdgR蛋白与YdiV蛋白的作用机制是类似的。（7）对YdiV蛋白与C1pX蛋白相互作用情况进行了初步的研究。YdiV与C1pX的ZBD结构域在体内共转共纯化时存在相互作用,而当分别提纯得到两种蛋自在体外却检测不到蛋白间的相互作用。提出细胞内某小分子（与C-di-GMP有类似的结构）可能结合到YdiV的疏水口袋调控YdiV与C1pX的相互作用的假说。根据以上实验结果,提出了YdiV负调控细菌鞭毛合成和移动性的分子机制模型：溶液中的YdiV蛋白以单体形式存在。YdiV蛋白主要通过第8个α螺旋与FlhD分子上第1和第4个α螺旋相互作用。在F1hD4C2复合物中,四个F1hD分子（D1,D2,D3,D4）所处的状态不同。D1-D2和D3-D4各自组成二聚体。而D2和D3分子的相互作用面也是由其第1和第4个α螺旋介导的。由于D1和D4分子的第1和第4个α螺旋是暴露的,所以当YdiV分子处于较低的浓度时,YdiV分子优先结合在这两个F1hD分子上。DNA结合在F1hD4C2复合物的F1hC亚基外侧上,几乎不与F1hD接触。所以YdiV结合在D1和D4上时候,形成的YdiV1F1hD4C2和YdiV2F1hD4C2三元复合物还能和DNA结合,这时F1hDC的转录因子活性并没有受到抑制。当YdiV浓度升高到一定程度,当所有的D1和D4亚基都被饱和的时候,YdiV就开始吸附D2或D3分子。这时由于YdiV的侵入,F1hD4C2六元环状结构被迫打开。目的DNA与F1hD4C2结合是一个精确的定位过程,DNA结合到F1hD4C2分子上时呈现一定的弧度,F1hD4C2的圆环构象对于其结合DNA的能力也是必不可少的。多个YdiV结合导致F1hD4C2六元环状结构被破坏,DNA将不能结合到此复合物上。这时F1hD4C2转录辅助因子的功能丧失,第二级及之后的鞭毛蛋白停止表达。最终导致鞭毛合成受阻,细菌的移动性减弱甚至消失。F1hD4C2复合物结合过量YdiV后环状结构打开,结构变的疏松YdiV蛋白通过与细胞内C1pXP蛋白酶的C1pX亚基的ZBD结构域互作,促进其结合的F1hD4C2复合物被C1pXP蛋白酶降解掉。YdiV调控鞭毛表达和细菌移动性的过程是浓度依赖的并且是不可逆的。细胞内YdiV的浓度受到很多因素的影响。已有文献报道,外界葡萄糖的浓度显着影响细胞内YdiV蛋白的浓度。另外,ydiV基因转录活性受转录调控因子SdiA蛋白的调节,而SdiA蛋白与DNA的结合活力又受细菌产生的自诱导物的直接影响。即细菌所处环境的菌浓的不同,细胞内的YdiV的浓度也会不同。我们的研究发现只有在YdiV浓度足够高时,细菌的鞭毛合成才会完全停止。细菌的鞭毛表达是个十分耗时和耗能的过程,细菌鞭毛合成与否是细菌生命状态的一个重大决定。只有当外界信号分子的浓度足够大并且持续时间足够长时,细胞内的YdiV的表达量才会积累到足够的浓度,这时细菌的鞭毛合成才被迫从源头终止YdiV蛋白作为EAL蛋白家族的一员,其发挥的功能与正常EAL蛋白南辕北辙。这一现象给我们启示,细菌基因组中大造突变失活的酶可能是通过其他途径发挥重要功能的。
胡波[8]（2010）在《重要致病菌表面抗原的分子生物学研究》文中研究指明细菌表面抗原,如O-抗原、H抗原和K抗原等,细菌的重要组成部分。O-抗原位于细菌表面,是位于革兰氏阴性菌表面的脂多糖的重要组成部分,由多个寡糖单位组成,由于长期受到来自宿主的选择压力,具有非常丰富的多样性。大肠杆菌有180多种O-抗原,志贺氏菌有33种O-抗原,沙门氏菌有46种不同的O-抗原。O抗原的多样性主要是由于O抗原基因簇的遗传学多样性造成的。O抗原基因簇中的基因可以被分为3类：单糖合成酶基因、糖基转移酶基因和寡糖单位处理酶基因。本文重点研究了O-抗原合成相关的糖基转移酶的功能。糖基转移酶负责催化将糖加到其它糖、脂、蛋白、核酸等分子上,在所有生物体中行使着重要的生物功能。绝大多数的糖基转移酶家族的成员仅仅分为两个糖基转移酶超家族,命名为GT-A和GT-B超家族。按立体化学反应结合序列特征和糖基供体受体结构分类,糖基转移酶共分为90多个家族和一个未分类族。本研究破译了9种沙门氏菌和4种大肠杆菌的O抗原基因簇,沙门氏菌和大肠杆菌被认为是在1.4亿年前从同一祖先分化而来。之前进行的许多研究一直认为,在沙门氏菌和大肠杆菌之间只具有三对相同的O抗原,本研究新发现在沙门氏菌和大肠杆菌之间存在4对相同或者相似结构的O抗原基因簇,高于以前人们的预期,表明沙门氏菌和大肠杆菌的O抗原具有更为紧密的关系。进化分析表明沙门氏菌和大肠杆菌之间共有的O抗原基因簇起源于同一个祖先,但基因簇内基因的分化速度要高于持家基因的分化速度,表明O抗原基因簇内的基因为了适应新的环境而受到的选择压力要高于持家基因。此外发现在这些基因簇分化的过程之中,糖基转移酶基因和寡糖单位处理酶基因所受到的选择压力要明显大于单糖合成酶基因。本研究对大肠杆菌O56和O152的葡萄糖糖基转移酶以及鲍氏志贺氏菌14型的O-抗原合成相关的半乳糖糖基转移酶进行了深入研究。包括酶反应动力学,酶的性质（离子,离子去污剂,pH值）对酶活性的影响,以及酶的底物特异性的研究。研究发现这三个酶的性质都比较接近,2价锰离子和镁离子都能较好的促进酶活,酶在较为宽泛的pH值范围都有活性,发现都对受体底物结构中的焦磷酸基团有要求,与酶的特异性识别底物有关,并通过点突变的方法鉴定了B14中与底物作用的重要氨基酸。鞭毛是负责细菌运动的器官,鞭毛抗原,又名H抗原,是大肠杆菌等革兰氏阴性菌表面的主要抗原之一。细菌可选择性表达2个不同的鞭毛蛋白基因,称之为H-抗原的相位变异。相位变异细菌的一种重要机制,可以使细菌适应不至一种生存环境,尤其是可以逃避宿主免疫系统。传统观点认为大肠杆菌是单相的,但在一些菌株中也发现存在相位变异现象。研究已经表明,在所有的53种E. coli H抗原类型中,有44种的H抗原是由fliC基因编码的,剩余9种类型的H抗原基因均不位于fliC位点。本实验室之前的研究发现,在大肠杆菌H3和H47中,鞭毛蛋白基因操纵子所在的flk区域是一个典型的基因组岛flk GI,H抗原的相位变异是由flk GI的删除造成的。这是首次对大肠杆菌H-抗原相位变异的机制做出阐明。目前,只有编码大肠杆菌H17型鞭毛蛋白的基因以及其相位变异机制尚未破译。本研究在对大肠杆菌H17标准菌株全基因组的破译的基础之上,对大肠杆菌H17的鞭毛抗原基因进行了定位及功能鉴定。对大肠杆菌H17相位变异的分子机制做了深入研究,确定其相位变异的发生机制为一个基因组岛元件（编码H17抗原的基因在该基因组岛中）的丢失导致的相位变异。并且发现该基因组岛两端发生非同源重组,以环化的形式脱离细菌染色体。同时鉴定了介导该基因组岛非同源重组的整合酶的功能。
徐耀辉,乔宏兴,臧金灿,李翠平,卢建洲[9]（2007）在《鸭沙门氏菌鞭毛抗原的提取与抗原性鉴定初报》文中研究说明【研究目的】提取沙门氏菌鞭毛蛋白并鉴定其抗原性;【方法】选用鸭沙门氏菌经半固体培养基诱导鞭毛,经肉汤培养后,用酸裂解、经差速离心、硫酸铵沉淀,分离出粗制鞭毛蛋白。将粗制的鞭毛蛋白用SDS-PAGE和磷钨酸负染投射电镜观察,并包板做ELISA检测其抗原性;【结果】SDS-PAGE显示提取的鞭毛蛋白相对分子质量约为58.0KD,且纯度较高,抗原性较好,每1000ml培养液可获得32.8mg鞭毛蛋白;【结论】酸裂解法可获得高质量的鞭毛蛋白,抗原性较好,为禽副伤寒沙门氏菌病诊断方法的建立奠定了基础。
曹军平,焦新安,刘秀梵,张如宽[10]（1996）在《4株沙门氏菌鞭毛蛋白属共同抗原组分免疫原性及免疫保护性的研究》文中认为采用酸解法、单抗亲和层析提纯了鼠伤寒沙门氏菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）鞭毛蛋白Ｈｉ。经电镜和ＳＤＳＰＡＧＥ鉴定，发现４２ｋＤ的蛋白带，即鞭毛蛋白（Ｆｌａｇｅｌｌｉｎ）。它能够刺激小鼠产生特异性抗体，酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）、凝集试验（ＤＡ）测定其Ｈｉ抗体效价分别为１：１０４、１：１０３。用其他非Ｈｉ抗原的沙门氏菌包板，ＥＬＩＳＡ效价可达１：１００～１：１０００，ＤＡ阴性。这表明沙门氏菌鞭毛蛋白上存在着属特异共同抗原表位，且免疫原性较好，该类表位免疫性比分型Ｈ抗原弱，提示沙门氏菌分型Ｈ抗原表位是鞭毛蛋白分子上的优势表位。用沙门氏菌鞭毛蛋白属特异共同抗原表位单抗ｄｅ７研究被动保护作用，结果显示该表位被动保护作用很小。本研究为沙门氏菌鞭毛蛋白抗原多样性及特性研究提供了新的认识，并为临床上诊断沙门氏菌感染提供了新的检测对象。
二、沙门氏菌鞭毛蛋白的提纯与鉴定（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、沙门氏菌鞭毛蛋白的提纯与鉴定（论文提纲范文）
（2）百里香精油与海藻酸盐复合涂膜防控鲜切水果食源性病原微生物作用机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要缩略词/符号表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 鲜切果蔬 |
| 1.1.1 鲜切果蔬的定义 |
| 1.1.2 鲜切果蔬生理生化变化 |
| 1.1.3 鲜切果蔬污染的微生物种类 |
| 1.2 食源性病原微生物及其危害 |
| 1.2.1 食源性病原微生物 |
| 1.2.2 食源性病原微生物污染果蔬引起食源性疾病的发生 |
| 1.3 鲜切果蔬食源性病原微生物防控技术 |
| 1.3.1 物理防控技术 |
| 1.3.2 化学防控技术 |
| 1.3.3 生物防控技术 |
| 1.3.4 综合防控技术 |
| 1.4 天然抑菌剂—植物精油 |
| 1.4.1 植物精油的主要成分及其抑菌活性 |
| 1.4.2 植物精油抑制食源性病原微生物的作用机制 |
| 1.5 可食性涂膜在鲜切果蔬保鲜中的应用 |
| 1.5.1 鲜切果蔬可食性涂膜种类 |
| 1.5.2 鲜切果蔬可食性复合涂膜的活性成分 |
| 1.6 植物精油可食性复合涂膜在鲜切果蔬保鲜中的应用 |
| 1.7 论文的研究意义及内容 |
| 1.7.1 论文的研究意义 |
| 1.7.2 论文的研究内容 |
| 2 15种植物精油对食源性病原微生物的抑制效果 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 实验仪器与试剂 |
| 2.2.2 植物精油 |
| 2.2.3 实验菌株 |
| 2.2.4 植物精油对食源性病原微生物抑菌圈的测定 |
| 2.2.5 植物精油对食源性病原微生物MIC的测定 |
| 2.2.6 植物精油处理食源性病原微生物生长曲线的绘制 |
| 2.2.7 统计学分析 |
| 2.3 实验结果与讨论 |
| 2.3.1 植物精油对食源性病原微生物的抑菌圈直径 |
| 2.3.2 植物精油对食源性病原微生物的MIC |
| 2.3.3 植物精油处理食源性病原微生物的生长曲线 |
| 2.4 本章小结 |
| 3 百里香精油抑制单增李斯特菌的作用机制 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.2.1 实验仪器与试剂 |
| 3.2.2 实验菌株 |
| 3.2.3 百里香精油挥发性物质分析 |
| 3.2.4 百里香精油处理单增李斯特菌的扫描电子显微镜观察 |
| 3.2.5 百里香精油处理单增李斯特菌的透射电子显微镜观察 |
| 3.2.6 百里香精油处理单增李斯特菌的TMT标记定量蛋白质组学分析 |
| 3.3 实验结果与讨论 |
| 3.3.1 百里香精油的挥发性物质 |
| 3.3.2 百里香精油处理单增李斯特菌的扫描电子显微镜观察结果 |
| 3.3.3 百里香精油处理单增李斯特菌的透射电子显微镜观察结果 |
| 3.3.4 百里香精油处理单增李斯特菌蛋白质的定量 |
| 3.3.5 百里香精油处理单增李斯特菌蛋白质的SDS-PAGE |
| 3.3.6 百里香精油处理单增李斯特菌蛋白质的鉴定及定量结果 |
| 3.3.7 百里香精油处理单增李斯特菌蛋白质的聚类分析 |
| 3.3.8 百里香精油处理单增李斯特菌差异表达蛋白质的GO富集分析 |
| 3.3.9 百里香精油处理单增李斯特菌差异表达蛋白质的KEGG通路富集分析 |
| 3.3.10 百里香精油处理单增李斯特菌差异表达蛋白质的PPI网络分析 |
| 3.3.11 百里香精油对单增李斯特菌重要KEGG通路的影响 |
| 3.3.12 百里香精油抑制单增李斯特菌的作用机制 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 TOAC对鲜切苹果品质与安全性的影响 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与方法 |
| 4.2.1 实验仪器与试剂 |
| 4.2.2 实验样品 |
| 4.2.3 实验菌株 |
| 4.2.4 海藻酸钠可食性涂膜制备 |
| 4.2.5 食源性病原微生物菌液制备 |
| 4.2.6 鲜切苹果涂膜处理 |
| 4.2.7 鲜切苹果呼吸速率的测定 |
| 4.2.8 鲜切苹果失重率、硬度和色泽指标的测定 |
| 4.2.9 鲜切苹果品质的感官评价 |
| 4.2.10 鲜切苹果背景微生物和食源性病原微生物分析 |
| 4.2.11 统计学分析 |
| 4.3 实验结果与讨论 |
| 4.3.1 鲜切苹果呼吸速率、失重率和硬度 |
| 4.3.2 鲜切苹果色泽和外观 |
| 4.3.3 鲜切苹果品质的感官评价 |
| 4.3.4 鲜切苹果背景微生物和食源性病原微生物分析 |
| 4.4 本章小结 |
| 5 TOAC对鲜切哈密瓜品质与安全性的影响 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与方法 |
| 5.2.1 实验仪器与试剂 |
| 5.2.2 实验样品 |
| 5.2.3 实验菌株 |
| 5.2.4 海藻酸钠可食性涂膜制备 |
| 5.2.5 食源性病原微生物菌液制备 |
| 5.2.6 鲜切哈密瓜涂膜处理 |
| 5.2.7 鲜切哈密瓜呼吸速率的测定 |
| 5.2.8 鲜切哈密瓜失重率、硬度和色泽指标的测定 |
| 5.2.9 鲜切哈密瓜品质的感官评价 |
| 5.2.10 鲜切哈密瓜背景微生物和食源性病原微生物分析 |
| 5.2.11 统计学分析 |
| 5.3 实验结果与讨论 |
| 5.3.1 鲜切哈密瓜呼吸速率、失重率和硬度 |
| 5.3.2 鲜切哈密瓜色泽和外观 |
| 5.3.3 鲜切哈密瓜品质的感官评价 |
| 5.3.4 鲜切哈密瓜背景微生物和食源性病原微生物分析 |
| 5.4 本章小结 |
| 6 结论、创新点与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录A 显着性差异表达蛋白质结果统计 |
| 作者简介 |
| 攻读博士学位期间参与的科研项目及科研成果 |
| 致谢 |
（3）植物乳杆菌HD-23细菌素基因plnE和plnF的原核表达及抑菌机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要英汉及缩略词对照 |
| 1 前言 |
| 1.1 细菌素及其分类 |
| 1.2 II类乳酸菌细菌素 |
| 1.2.1 植物乳杆菌素 |
| 1.2.2 细菌素PlnEF的研究现状 |
| 1.3 玉米粉培养基研究现状 |
| 1.4 基因原核表达方法研究现状 |
| 1.5 细菌素抑菌机理及结合位点研究现状 |
| 1.6 研究目的和意义 |
| 1.7 研究内容和技术路线 |
| 1.7.1 研究内容 |
| 1.7.2 技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 原料 |
| 2.1.2 菌株 |
| 2.1.3 质粒 |
| 2.1.4 培养基与主要试剂 |
| 2.1.5 主要仪器与设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 产细菌素乳酸菌的分离鉴定 |
| 2.2.2 玉米粉培养基的响应面优化 |
| 2.2.3 plnE和plnF原核表达菌的构建 |
| 2.2.4 PlnE和PlnF的纯化 |
| 2.2.5 PlnEF对鼠伤寒沙门氏菌SL1344抑菌机理研究 |
| 2.2.6 PlnEF对鼠伤寒沙门氏菌SL1344细菌素受体定位 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 产细菌素乳酸菌的分离鉴定 |
| 3.1.1 初筛 |
| 3.1.2 复筛 |
| 3.1.3 排酸、排过氧化氢干扰 |
| 3.1.4 蛋白酶敏感试验 |
| 3.1.5 16 SrDNA鉴定 |
| 3.2 玉米粉培养基的响应面优化 |
| 3.2.1 Plackett-Burman试验 |
| 3.2.2 最陡爬坡试验 |
| 3.2.3 响应面试验 |
| 3.3 plnE和plnF原核表达菌的构建 |
| 3.3.1 plnE和plnF的PCR扩增 |
| 3.3.2 目的产物及表达载体pET-32a的双酶切回收 |
| 3.3.3 阳性转化子的筛选 |
| 3.3.4 诱导表达 |
| 3.4 PlnE和PlnF的纯化 |
| 3.4.1 Ni-NTA亲和层析纯化重组蛋白 |
| 3.4.2 酶切重组蛋白 |
| 3.4.3 蛋白含量及抑菌谱测定 |
| 3.5 PlnEF的生物信息学分析 |
| 3.6 PlnEF对鼠伤寒沙门氏菌SL1344抑菌机理 |
| 3.6.1 细胞裂解率测定 |
| 3.6.2 紫外吸收物质的测定 |
| 3.6.4 ATP测定 |
| 3.6.5 乳酸脱氢酶测定 |
| 3.7 PlnEF对鼠伤寒沙门氏菌SL1344细菌素受体的定位 |
| 3.7.1 双向电泳 |
| 3.7.2 MALDI-TOF-MS检测 |
| 3.8 磷酸甘油酸激酶蛋白的验证 |
| 3.8.1 磷酸甘油酸激酶蛋白开放阅读框的确定 |
| 3.8.2 PGK基因的敲除 |
| 4 讨论 |
| 4.1 响应面优化玉米粉培养基 |
| 4.2 同源重组技术构建基因工程菌 |
| 4.3 细菌素PlnEF抑菌机理 |
| 4.4 PlnEF对鼠伤寒沙门氏菌SL1344细菌素受体 |
| 4.5 基因敲除结果讨论 |
| 5 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（4）鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白FliC的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 文献综述 |
| 1 沙门氏菌免疫学检测方法的研究进展 |
| 1.1 免疫荧光标记技术 |
| 1.2 免疫扩散技术 |
| 1.3 酶联免疫吸附试验(ELISA)技术 |
| 1.4 免疫印迹技术 |
| 1.5 免疫沉淀 |
| 1.6 免疫磁性分离(IMS)技术 |
| 1.7 协同凝集试验 |
| 1.8 免疫传感器 |
| 2 沙门氏菌鞭毛蛋白的研究进展 |
| 课题技术路线 |
| 第一章 鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白基因fliC的克隆及其在E.coli中的表达 |
| 1 材料 |
| 1.1 质粒与菌种 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 细菌的培养 |
| 2.2 细菌基因组DNA的提取 |
| 2.3 引物设计 |
| 2.4 聚合酶链式反应(PCR) |
| 2.5 质粒pET-28a(+)的提取 |
| 2.6 pET-28a(+)-F表达载体构建 |
| 2.7 细菌的转化 |
| 2.8 表达菌的鉴定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 沙门氏菌fliC基因片段的扩增和鉴定 |
| 3.2 重组质粒pET28a-flic酶切鉴定和测序验证 |
| 3.3 重组质粒的表达 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二章 鼠伤寒沙门氏菌Ⅰ相鞭毛蛋白的纯化及鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 pET-28a(+)-F-BL21(DE3)pLysS表达菌的大量诱导与纯化 |
| 2.2 重组蛋白pET-28a(+)-F的鉴定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 蛋白可溶性分析 |
| 3.2 重组蛋白纯化产物的SDS-PAGE鉴定结果 |
| 3.3 FliC蛋白量测定 |
| 3.4 Western-blot鉴定结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三章 FliC多克隆抗体的制备 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 抗原乳化 |
| 2.2 动物免疫 |
| 2.3 抗体效价测定 |
| 2.4 抗血清特异性的测定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 血清效价的测定 |
| 3.2 抗体特异性检测结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表论文目录 |
（7）YdiV负调控细菌鞭毛合成的分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 细菌鞭毛简介 |
| 1.1.1 大肠杆菌中鞭毛合成与组装 |
| 1.1.2 大肠杆菌鞭毛的分级调控 |
| 1.1.3 鞭毛第一级表达产物FlhD_4C_2复合体的结构与功能研究进展 |
| 1.2 C-di-GMP与细菌的移动性 |
| 1.2.1 C-di-GMP简介 |
| 1.2.2 大肠杆菌中C-di-GMP调控系统 |
| 1.2.3 C-di-GMP与细菌移动性的关系 |
| 1.3 YdiV蛋白的相关介绍 |
| 1.3.1 YdiV介导大肠杆菌中两个群体感应系统的互作 |
| 1.3.2 YdiV与C-di-GMP |
| 1.3.3 YdiV与细菌移动性 |
| 1.3.4 YdiV可能作为ClpXP降解FlhD_4C_2的辅助因子 |
| 1.4 本课题的研究内容 |
| 第二章 YdiV单体的结构研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料及仪器 |
| 2.2.1 菌株及载体 |
| 2.2.2 试剂及工具酶 |
| 2.2.3 仪器及服务 |
| 2.3 实验流程与具体实验方法 |
| 2.3.1 实验流程示意图 |
| 2.3.2 具体实验方法 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 Native YdiV蛋白的纯化、结晶及数据收集 |
| 2.4.2 Se-YdiV的纯化、结晶及硒代数据的收集及结构解析 |
| 2.4.3 沙门氏菌中CdgR蛋白的纯化与结晶 |
| 2.5 实验分析与讨论 |
| 2.5.1 YdiV结构与其他EAL结构的对比 |
| 2.5.2 YdiV蛋白在溶液中的聚集状态 |
| 2.5.3 YdiV结构中的小分子及可能的生理学意义 |
| 2.6 本章小结 |
| 第三章 大肠杆菌中YdiV与FlhDC互作的初步研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料及仪器 |
| 3.2.1 菌株及载体 |
| 3.2.2 仪器与试剂 |
| 3.3 实验设计思路与具体实验方法 |
| 3.3.1 鉴定YdiV与FlhDC的相互作用 |
| 3.3.2 YdiV对于FlhDC结合目的基因的影响 |
| 3.4 实验结果与分析 |
| 3.4.1 YdiV与FlhDC的共转化实验 |
| 3.4.2 确定FlhD与YdiV互作的最小作用片段 |
| 3.4.3 FlhDC复合物的纯化 |
| 3.4.4 EMSA检测FlhDC与DNA的相互作用 |
| 3.4.5 不同浓度的YdiV对于FlhDC结合DNA活性的影响 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 YdiV-FlhD复合物的结构研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料及仪器 |
| 42.1 菌株及载体 |
| 4.2.2 试剂及工具酶 |
| 4.2.3 仪器及服务 |
| 4.3 实验流程与具体实验方法 |
| 4.3.1 试验流程示意图 |
| 4.3.2 具体实验方法 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 YdiV-FlhD复合物的纯化、结晶 |
| 4.4.2 CdgR-stFlhD复合物的纯化、结晶 |
| 4.4.3 YdiV-FlhD1-71aa复合物的纯化、结晶 |
| 4.4.4 YdiV-FlhDC三元复合物的纯化、结晶 |
| 4.4.5 胰蛋白酶酶解YdiV-FlhD复合物及酶解产物纯化、结晶 |
| 4.4.6 YdiV-FlhD复合物酶解产物结构解析 |
| 4.5 实验分析与讨论 |
| 4.5.1 YdiV-FlhD结构分析 |
| 4.5.2 YdiV-FlhD结构与单体结构的对比 |
| 4.5.3 YdiV上参与相互作用的氩基酸的保守性 |
| 4.5.4 YdiV破坏FlhD_4C_2环状结构 |
| 4.5.5 YdiV4_-FlhD_4C_2复合物是否真实存在 |
| 4.5.6 电镜观察YdiV-FlhD_4C_2复合物 |
| 4.6 本章小结 |
| 第五章 FlhDC复合物与DNA互作机制的研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料及仪器 |
| 5.2.1 菌株及载体 |
| 5.2.2 仪器与试剂 |
| 5.3 实验设计思路与具体实验方法 |
| 5.3.1 实验设计思路 |
| 5.3.2 具体实验方法 |
| 5.4 实验结果与分析 |
| 5.4.1 FlhD_4C_2突变体的克隆和表达纯化 |
| 5.4.2 FlhD_4C_2突变体的圆二色光谱结果 |
| 5.4.3 Native FlhD_4C_2及突变体的分子筛出峰位置对比 |
| 5.4.4 Native FlhD_4C_2及突变体与YdiV相互作用情况 |
| 5.4.5 Native FlhD_4C_2及突变体与DNA相互作用对比 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 YdiV抑制FlhDC结合DNA的分子机制 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验材料及仪器 |
| 6.2.1 菌株及载体 |
| 6.2.2 仪器与试剂 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 YdiV_2-FlhD_2的结构分析及突变点选择 |
| 6.3.2 突变体的克隆、纯化 |
| 6.3.3 Pull down与EMSA实验 |
| 6.3.4 细菌移动性实验 |
| 6.3.5 大肠杆菌MG1655菌株的ydiV基因敲除 |
| 6.3.6 特殊移动性培养基的配制 |
| 6.3.7 细菌生长曲线测定 |
| 6.4 实验结果与分析 |
| 6.4.1 YdiV抑制FlhDC结合DNA的分子机制 |
| 6.4.2 YdiV突变体的构建 |
| 6.4.3 YdiV突变体与FlhDC相互作用检测 |
| 6.4.4 YdiV突变体对FlhDC结合DNA的抑制作用 |
| 6.4.5 native YdiV对大肠杆菌移动性的影响 |
| 6.4.6 几种YdiV突变体对大肠杆菌移动性的影响 |
| 6.4.7 CdgR突变体与stFlhD及stFlhDC相互作用检测 |
| 6.4.8 MG1655菌株与ydiV敲除体在不同营养条件下的表型对比 |
| 6.5 本章小结 |
| 第七章 YdiV与ClpxP蛋白酶互作研究 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 实验材料及仪器 |
| 7.2.1 菌株及载体 |
| 7.2.2 仪器与试剂 |
| 7.3 实验设计思路与具体实验方法 |
| 7.3.1 鉴定YdiV与ClpX的体内相互作用 |
| 7.3.2 鉴定YdiV与ClpX1-60aa的体外相互作用 |
| 7.3.3 ITC(等温滴定量热法) |
| 7.4 实验结果与分析 |
| 7.4.1 YdiV与ClpX相互作用 |
| 7.4.2 YdiV与ClpX的ZBD结构域的体内相互作用 |
| 7.4.3 YdiV-ZBD结构域复合物的纯化 |
| 7.4.4 YdiV-ZBD结构域复合物晶体筛选结构解析中出现的问题 |
| 7.4.5 YdiV与ClpX的ZBD结构域的体外相互作用 |
| 7.4.6 YdiV-ZBD-FlhD三元复合物的纯化 |
| 7.4.7 可能参与相互作用的小分子探究 |
| 7.5 本章小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 博士期间发表的学术论文 |
| 附 外文论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（8）重要致病菌表面抗原的分子生物学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 沙门氏菌和大肠杆菌O-抗原的分子生物学研究 |
| 第一章 前言 |
| 第一节 研究背景简介 |
| 1 重要肠道致病菌 |
| 2 革兰氏阴性细菌的O-抗原 |
| 3 糖基转移酶 |
| 第二节 本文工作的研究目标、内容和创新性 |
| 1 研究目标 |
| 2 研究内容 |
| 3 本项工作的创新性 |
| 第二章 材料与方法 |
| 第一节 实验材料 |
| 第二节 实验方法 |
| 第三章 结果与分析 |
| 第一节 O-抗原基因簇的分子鉴定 |
| 1 大肠杆菌0170-抗原基因簇的鉴定 |
| 2 沙门氏菌0820-抗原基因簇鉴定 |
| 3 沙门氏菌0930-抗原基因簇鉴定 |
| 4 沙门氏菌014的O-抗原基因簇的分子鉴定 |
| S 沙门氏菌015的O-抗原基因簇的分析 |
| 6 沙门氏菌006的O-抗原基因簇的鉴定 |
| 7 沙门氏菌016的O-抗原基因簇的鉴定 |
| 8 沙门氏菌065的O-抗原基因簇的鉴定 |
| 9 沙门氏菌O“的O-抗原基因簇的鉴定 |
| 10 大肠杆菌01“的O-抗原基因簇的鉴定 |
| 11 沙门氏菌DZ的O-抗原基因簇的鉴定 |
| 12 沙门氏菌E4O-抗原基因簇的鉴定 |
| 第二节 糖基转移酶功能的鉴定 |
| 1 大肠杆菌065WfaP功能的鉴定 |
| 2 大肠杆菌0125WgfD功能的鉴定 |
| 3 志贺氏菌鲍氏14型O一抗原合成相关糖基转移酶WfeD的功能鉴定 |
| 第四章 讨论 |
| 第一节 本文破译的沙门氏菌和大肠杆菌O-抗原基因簇的特征 |
| 第二节 大肠杆菌与沙门氏菌的0-抗原的进化关系 |
| 第三节 O-抗原合成相关糖基转移酶 |
| 大肠杆菌H71鞭毛相位变异的研究 |
| 第一章 前言 |
| 第一节 研究背景简介 |
| 1 细菌的H抗原 |
| 2 细菌的相位变异 |
| 3 细菌基因组岛 |
| 4 大肠杆菌的H抗原及其研究进展 |
| 第二节 项目的研究内容、研究目标、以及创新性 |
| 1 研究内容 |
| 2 研究目标 |
| 3 本项目的特色与创新之处 |
| 第二章 材料与方法 |
| 第三章 结果与讨论 |
| 1 flnA基因序列分析 |
| 2 对编码H71鞭毛蛋白基因功能的研究 |
| 3 flnA区域的基因结构分析 |
| 4 大肠杆菌H17相位变异是由基因组岛介导的flnA“区域环化导致 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果 |
四、沙门氏菌鞭毛蛋白的提纯与鉴定（论文参考文献）
- [1]沙门氏菌鞭毛蛋白的提纯与鉴定[J]. 曹军平,焦新安,杜元钊,刘秀梵,张如宽. 中国畜禽传染病, 1996(01)
- [2]百里香精油与海藻酸盐复合涂膜防控鲜切水果食源性病原微生物作用机制的研究[D]. 萨仁高娃. 大连理工大学, 2020(01)
- [3]植物乳杆菌HD-23细菌素基因plnE和plnF的原核表达及抑菌机理研究[D]. 杨梦露. 四川农业大学, 2018(02)
- [4]鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白FliC的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备[D]. 陈明. 南京农业大学, 2012(04)
- [5]沙门氏菌鞭毛蛋白共同抗原的诊断价值探讨[J]. 焦新安,徐卫平,曹军平,潘志明,张国强,高崧,吴长新,文其乙,张如宽,刘秀梵. 扬州大学学报(自然科学版), 1998(01)
- [6]沙门氏菌鞭毛佐剂禽流感灭活疫苗可诱导良好免疫保护[A]. 黄秀芬,章振华,孙惠铃,孙盈,陈小铃,李永清. 中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第八届全国会员代表大会暨第十五次学术研讨会论文集, 2013
- [7]YdiV负调控细菌鞭毛合成的分子机制研究[D]. 李冰清. 山东大学, 2013(09)
- [8]重要致病菌表面抗原的分子生物学研究[D]. 胡波. 南开大学, 2010(07)
- [9]鸭沙门氏菌鞭毛抗原的提取与抗原性鉴定初报[J]. 徐耀辉,乔宏兴,臧金灿,李翠平,卢建洲. 中国农学通报, 2007(09)
- [10]4株沙门氏菌鞭毛蛋白属共同抗原组分免疫原性及免疫保护性的研究[J]. 曹军平,焦新安,刘秀梵,张如宽. 上海免疫学杂志, 1996(04)