一、免疫扩散法诊断家兔溶血性链球菌病的研究（论文文献综述）
矫正德,王英厚,王翠兰,王西川[1]（1994）在《免疫扩散法诊断家兔溶血性链球菌病的研究》文中研究指明用分离自家兔的溶血性链球菌制备琼扩抗原，以免疫扩散法对人工感染溶血性链球菌的免血清和现地兔血清进行检测，对前者检出率为１００％，对现地暴发本病的兔血清检出数为１７／３０．
任思宇[2]（2013）在《家兔无乳链球菌的分离鉴定及其感染的动态病理学与病原分布研究》文中进行了进一步梳理2011年7月四川绵阳某家兔养殖场爆发了以四肢麻痹、划游和呼吸障碍为特征的疾病,死亡率达42%；从患病家兔肝、肺、脑和心血中分离到一株链状革兰氏阳性球菌（P110323）,以浓度为1×106CFU/mL的P110323菌株培养液灌胃感染健康家兔,家兔出现站立不稳、四肢划动、惊厥和呼吸障碍等症状,并逐渐死亡；解剖可见肺淤血、出血；肝、脾和肾肿大,坏死；大脑肿胀,脑膜充血,脑回肿胀扁平,脑沟变浅。P110323在BHI平板上形成湿润、边缘整齐的灰白色菌落,在5%的脱纤维羊血平板上形成透明的p溶血环,V-P试验、水解精氨酸与马脲酸等为阳性；水解七叶苷和利用甘露醇、山梨醇产酸为阴性。药物敏感性实验结果显示氨苄西林、庆大霉素、氟哌酸、奥复星、复达欣和氟苯尼考对P110323有效,四环素、强力霉素的抑制作用为中介；青霉素,链霉素,阿莫西林、丁胺卡娜及妥布霉素对其无效。16S rDNA系统发育分析显示分离菌与Streptococcus difficilis和Streptococcus agalactiae聚在一簇；gyrB基因系统发育分析表明分离菌属于无乳链球菌（S. agalactiae）.结合细菌形态特点和生理生化特性,鉴定该P110323为无乳链球菌（S. agalactiae）,多重PCR方法确定该菌荚膜多糖类型为la型。采用灌胃接种的感染方式建立S. agalactiae人工感染家兔的病理模型,观察和记录家兔感染后的临床症状,并在接种后的0h,6h,12h，18h,24h,48h,72h,96h......10d时间点,随机抽取试验组和对照组家兔各2只,腹腔注射过量的戊巴比妥让其死亡,解剖后取脑、心、肝、脾、肾、肺等重要的组织器官进行组织病理学、超微病理学研究,同时建立基于无乳链球菌cfb基因的间接原位PCR检测方法研究无乳链球菌感染家兔后的侵染规律。结果表明S. agalactiae主要引起胃、肺、肝、脾、肾、小脑等组织的损伤,并导致家兔体内发生弥散性血管内凝血（Disseminated intravascular coagulation, DIC）,引起死亡。接种6h后,在胃组织中检测出S. agalactiae,引起胃组织充血,黏膜上皮坏死、脱落；12h在脾和肺中检测到S. agalactiae,脾可见巨噬细胞增多和淋巴细胞减少,随着病情发展,脾出现弥漫性坏死,细胞结构模糊不清；肺在感染初期表现为充血、出血,大量巨噬细胞出现在肺泡腔内,后期在肺泡隔的小血管中形成微血栓；24h在肝和肾中出现阳性信号,S. agalactiae主要引起肝淤血、肝细胞颗粒变性及溶解坏死,并逐渐在门管区血管中形成血栓；肾主要表现为肾小管上皮细胞坏死脱落,肾小球毛细血管中形成透明血栓；2d后在心肌和小脑中检测到阳性信号,心肌肌纤维胞浆浓缩,逐步演变为肌纤维的断裂坏死；小脑中S. agalactiae主要集中在分子层,引起神经细胞的溶解坏死,神经元髓鞘结构增厚。
黄锦炉[3]（2012）在《罗非鱼无乳链球菌病病原学、病理学及cpsE基因的原核表达研究》文中研究说明罗非鱼具有良好的生物学习性,能存活于恶劣的水质环境中,是一种重要的淡水养殖鱼类,也是我国南方地区重点推广的优良养殖品种之一。随着养殖规模的扩大,包括链球菌、柱状黄杆菌、嗜水气单胞菌、爱德华氏菌等病原感染罗非鱼所引起的疾病已经严重制约罗非鱼养殖业的健康稳定发展。其中,由链球菌属成员中的海豚链球菌和无乳链球菌感染罗非鱼引起的链球菌病,每年都给全球罗非鱼养殖业造成惨重的经济损失。2009年夏季,海南省养殖罗非鱼大规模暴发了链球菌病,该病发病快,传染性强,发病率和死亡率高,造成的经济损失极其惨重。本研究以收集自海南多个养殖场的发病罗非鱼为研究对象,首先应用微生物学技术、组织病理学技术和间接原位PCR技术对发病罗非鱼的病原学和病理学进行研究,接着应用分子生物学手段研究了致病菌功能基因的分子特性、原核表达,旨在通过以上研究为该病的病原种属鉴定、生物学特性分析、快速诊断方法建立、发病机制提供科学参考,并为以该功能基因重组蛋白为主要抗原成分的新型渔用疫苗的研发奠定理论基础。1.罗非鱼无乳链球菌的分离和鉴定通过对7批次收集自海南省池塘养殖发病罗非鱼样品进行病原的分离、纯化和鉴定检测,从7批次的发病罗非鱼样品中分离到7株代表菌株,这些菌株在营养琼脂平板上的菌落形态极为相似,呈Y-溶血性,镜检形态为革兰氏阳性球菌。动物回归试验结果表明,分离菌株人工感染健康罗非鱼可复制出与自然发病罗非鱼极为相似的症状。7株代表菌株的16SrDNA基因序列与链球菌属成员菌进化关系最近,相似度均超过95.0%；菌株表面群抗原均与B组链球菌特征性群抗原吻合；菌株的API20Strep特征性生化鉴定结果读写值均为3663414,与无乳链球菌匹配度最高。综合上述结果,7株代表菌株均被鉴定为无乳链球菌。采用纸片琼脂扩散法分别对7株代表菌株进行药物敏感性试验,结果显示所有菌株对第二代头孢类药物美福仙均具有良好敏感性,而对其它药物则呈现不同程度的敏感性,例如有的菌株对临床上常用于防治链球菌病的青霉素、庆大霉素等药物完全耐药,有的菌株则表现敏感。7株代表菌株的基因组经二步扩增获得两条特异性条带,条带大小分别为688bp和272bp,均与参考标准中无乳链球菌Ia血清型菌株扩增条带特征一致,因此鉴定7株代表菌株属于Ia血清型。通过比较腹腔注射不含有／含有胞外产物的无乳链球菌菌液对罗非鱼的半数致死剂量差异,发现不含有胞外产物的菌液对罗非鱼的半数致死剂量（LD50）为2.4×107cfu/mL,含有胞外产物的菌液对罗非鱼的半数致死剂量（LD50）为6.9×106cfu/mL无乳链球菌胞外产物总蛋白含量和酶活性检测结果显示,胞外产物总蛋白浓度为1.6g/L具有降解脂酶和脲酶的活性,不具有降解蛋白酶、淀粉酶和卵磷脂酶的活性。3.无乳链球菌三重PCR快诊方法的建立与应用以无乳链球菌分离株cpsE、sip和cpsL基因为靶检测基因模板,分别设计三组特异性引物,应用于无乳链球菌三重PCR检测方法的构建。结果表明,建立的三重PCR检测方法具有良好的特异性,可以对无乳链球菌与包括海豚链球菌在内的七种病原菌进行区别鉴定；对无乳链球菌DNA样本的最低检测浓度为0.32ng/μl,最适Mg2+浓度为37.5mM,整个检测过程耗时100mmin左右。应用本三重PCR检测方法对人工感染罗非鱼样本和临床上收集的疑似无乳链球菌感染鱼样本进行诊断,结果显示,40尾人工感染罗非鱼的肝脏、肾脏组织DNA样本阳性检出率均为100%,22尾疑似无乳链球菌感染鱼的肝脏、肾脏组织DNA样本阳性检出率均为72.7%,对这两批样本的检测结果与常规细菌鉴定方法获得的结果完全一致。4.无乳链球菌对罗非鱼的病理损伤对自然发病和人工感染无乳链球菌的罗非鱼进行临床症状、组织病理学和超微病理学研究。结果显示,人工感染罗非鱼的临床症状与自然发病罗非鱼基本相同,均表现为下颌、鳃盖内侧及鳃盖边缘出现点状出血,鳍条基部有不同程度的充血；肝脏肿大充血颜色不均,质地脆弱,胆囊肿大；肠腔内有黄色透明黏液；肛门红肿；脑膜充血；所不同的是,自然发病罗非鱼眼球外突,而人工感染罗非鱼则无此症状。组织病理学上,发病罗非鱼均表现为全身性多组织器官的急性炎症反应和坏死；肝脏、脾脏和肾脏变性、坏死；脑水肿、心肌+心外膜炎和卡他性胃肠炎。超微病理学上,发病罗非鱼肝脏、脾脏和肾脏细胞超微结构破坏,细胞内可观察到细菌繁殖,脑组织基质血管内有大量病原菌分布。5.无乳链球菌在人工感染罗非鱼组织的分布与定位通过腹腔注射无乳链球菌分离株活菌液、无乳链球菌标准菌株活菌液和生理盐水的方式,制备罗非鱼人工感染阳性对照样品、待检样品和阴性对照样品。以无乳链球菌cpsE基因为模板设计特异性引物和寡核苷酸探针,应用于在已制备的阳性对照样品和阴性对照样品上进行的间接原位PCR方法的构建,并以建立的间接原位PCR方法检测待检样品,研究无乳链球菌分离株在罗非鱼体内组织的分布规律。结果表明,攻毒后2h,在罗非鱼脾脏红髓区首先检测到无乳链球菌阳性信号；攻毒后4h,在罗非鱼肝脏血窦和肝细胞内检测到无乳链球菌阳性信号；攻毒后12h,在罗非鱼肾脏、心肌和眼球也检测到阳性信号；攻毒后24h,在罗非鱼脑组织检测到无乳链球菌阳性信号；攻毒后36h,在罗非鱼的脾脏、肝脏、肾脏、心肌、眼球和脑组织可检测到大量的阳性信号。6.无乳链球菌cpsE基因的克隆、鉴定及分子特性分析对无乳链球菌分离株cpsE基因进行克隆和鉴定,并利用生物信息学软件对cpsE扩增序列进行分子特性分析。结果显示,无乳链球菌分离株cpsE基因推导氨基酸序列具有高度保守性,与人源、动物源无乳链球菌亲缘性达100%；序列中Lys和Val含量最高,分别为10.7%和10.1%；具有1个参与催化糖基元的糖基转移酶超级家族结构域,具有与蛋白翻译后修饰功能相关的磷酸化位点3个,编码多肽链中亲水区大于疏水区,含有跨膜区,不存在信号肽；二级结构中,α-螺旋占的比例达40.94%,p-折叠占25.50%,p-转角占5.37%,无规则卷曲占28.19%。7.无乳链球菌cpsE基因的原核表达构建重组表达质粒pET-32a（+）-cpsE,并转入大大肠杆菌BL21（DE3）进行原核表达,再利用SDS-PAGE、Western-blot和琼脂扩散试验对重组蛋白免疫原性进行研究。结果显示,当诱导剂IPTG的浓度为0.4mM时,转化菌株在30℃、34℃、37℃温度下诱导表达3h,在菌体经超声波破碎处理的沉淀成分中可检测到一种大小约36kDa的蛋白,与cpsE基因表达产物的预期大小相吻合。经Western-blot和琼脂扩散试验检测结果表示,CpsE重组蛋白具有良好的免疫原性,制备的兔抗CpsE重组蛋白多克隆抗体的免疫效价达1：32。
任思宇,耿毅,汪开毓,周赵英,刘星星,吴春艳[4]（2013）在《1株致病性兔无乳链球菌的分离、鉴定与系统发育分析》文中研究指明从患病家兔肝、肺、脑和心血中分离到1株链状革兰阳性球菌P110323,以1×106 CFU/mL菌液灌胃感染健康家兔后,表现出站立不稳、四肢划动、惊厥和呼吸障碍等症状,感染96h后,死亡率为60%。解剖见肺淤血、出血;肝、脾和肾肿大,坏死;大脑肿胀,脑膜充血,脑回肿胀扁平,脑沟变浅。分离菌在BHI平板上形成湿润、边缘整齐的灰白色菌落;在5%的脱纤维羊血平板上形成透明的β溶血环;V-P试验、水解精氨酸与马脲酸等为阳性;水解七叶苷和利用甘露醇、山梨醇和乳糖产酸为阴性。16SrDNA系统发育分析显示分离菌与Streptococcus difficilis和Streptococcus agalactiae聚在一簇。gyrB基因系统发育分析表明分离菌属于无乳链球菌（S.agalactiae）,结合细菌形态特点和生理生化特性鉴定该病原菌为无乳链球菌（S.agalactiae）,多重PCR方法确定该菌荚膜多糖类型为Ia型。
张连芝[5]（2017）在《兔出血症病毒RPA检测方法的建立及间接ELISA检测抗体的研究》文中研究指明兔病毒性出血症（viral haemorrhagic disease of rabbits）是由兔出血症病毒（rabbit haemorrhagic disease virus,RHDV）感染所引起的兔的一种急性、败血性、高度接触传染性、高致死性的传染性疾病,以全身实质器官出现水肿、淤血和出血为主要特征。RHDV被分为G1G5以及G6（RHDVa,又名RHDV抗原变异株）6种基因型。2010年首次报道了变异型RHDV,它在遗传特性上与RHDV的6个基因型有很大的差异,命名为RHDV2也称为RHDVb。在欧洲野兔体内,发现一个能引起野兔发病的新型毒株与RHDV的基因组结构类似,被称为欧洲褐色兔综合症病毒（EBHSV）。本试验利用RHDV病原建立了RHDV重组酶聚合酶等温扩增（Recombinase Polymerase Amplification,RPA）检测方法,通过生物信息学分析,将RHDV的VP60基因进行分段表达确定其抗原性,以此建立了间接ELISA方法。本研究主要包括以下四部分内容:1 RHDV毒株的分离与分子遗传变异特性分析在山东不同地区分离了3株RHDV毒株,分别命名为BZ/2015株、LW/2015株和MY/2015株,克隆RHDV病毒的VP60蛋白基因,通过VP60核酸序列进化树分析显示,3个毒株均属G6（RHDVa）变异群,序列同源性比对分析显示,BZ/2015株、LW/2015株和MY/2015株与Genbank中其它经典型RHDV毒株核苷酸序列同源性分别在90.2%98.6%、90.5%99.9%、89.4%99.5%,BZ/2015株、LW/2015株和MY/2015株与Genbank中RHDV2毒株核苷酸序列同源性分别在82.6%82.9%、82.5%82.8%、81.5%81.9%。2014年河北分离到HB毒株与1984年江苏首次分离的WX84毒株遗传距离很近,推测其很可能来自毒株WX84株,近几年,中国从西北、华东、东北和西南四大地区分离到的具有代表性的RHDV毒株与WX84株差异较大,说明RHDV发生了变异,但是四大地区之间的RHDV毒株差异不大,且同世界其他国家和地区RHDV分离株基因序列几乎没有差异,同源性达到90%以上,因此,病毒基因型和流行的地域性没有必然联系。2 RPA检测方法的建立根据BZ/2015株的VP60基因的核酸序列,设计1对特异性引物,优化反应条件,建立了RHDV重组酶聚合酶等温扩增检测方法。通过敏感性、特异性、人工感染和临床应用等表明,该方法能特异扩增出特异片段,检测灵敏度达到0.1 LD50,与常规一步法RT-PCR敏感性相同。该方法具有较好的稳定性、敏感性和特异性。重组酶聚合酶等温扩增反应过程总耗时30 min左右,RPA检测方法和一步法RT-PCR的检出符合率为100%。3 VP60基因分段表达及抗原性分析VP60基因分为3个区域VP60-1（2aa-208aa）、VP60-2（174aa-425aa）和VP60-3（342aa-579aa）。VP60-1、VP60-2、VP60-3和VP60分别克隆到原核表达载体pET32a（+）和pColdⅢ中,4个重组质粒分别命名为pET-VP60-1、pET-VP60-2、pET-VP60-3和pCold-VP60。对VP60-1、VP60-2、VP60-3和VP60基因进行IPTG诱导表达,重组蛋白进行SDS-PAGE和Western blot分析。SDS-PAGE结果显示表达的重组蛋白VP60-1、VP60-2、VP60-3和VP60条带大小,与预期大小一致。将表达的重组蛋白纯化后的蛋白进行Western blot检测结果表明,表达的重组蛋白VP60-1、VP60-2、VP60-3和VP60均能和RHDV阳性血清发生特异性反应。4 ELISA方法建立利用纯化的VP60分段蛋白作为包被抗原,以兔出血症病毒阳性血清为一抗,HRP标记的羊抗兔IgG为二抗建立间接ELISA检测方法。分别用ELISA方法和HI试验对7只6周龄SPF兔免疫RHD灭活疫苗后7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d的抗体水平进行检测,间接ELISA结果显示,重组蛋白VP60-1和VP60作为包被抗原检测兔免疫后血清中的抗体消长规律一致。HI试验和以VP60-1作为包被抗原的间接ELISA试验检测结果一致,本试验根据两种方法所测得的各组兔群的抗体效价建立了相应的回归方程r2=0.9547,表明ELISA方法与HI试验检测的抗体效价结果呈显着相关性。
王树坤[6]（2012）在《兔出血症病毒衣壳蛋白基因在家蚕中的表达》文中研究说明兔出血症（rabbit hemorrhagic disease，RHD）是由兔出血症病毒（rabbit hemorrhagic diseasevirus，RHDV）引起的一种高度接触传染性的急性致死病，给养兔业造成严重影响和经济损失。现行RHDV疫苗多为病兔肝脾组织制备的组织灭活疫苗或油乳剂灭活疫苗，存在诸多弊端。近年来，研究人员致力于RHD亚单位疫苗的研制。兔出血症病毒粒子的主要结构蛋白是衣壳蛋白VP60，是病毒免疫保护性抗原，在基因工程疫苗的研究中意义重大。本文以NCBI中RHDV衣壳蛋白vp60基因序列（登录号：AF453761）为基础，对原序列进行密码子优化并人工合成。为制备检测RHDV-vp60真核表达产物所需的多克隆抗体，选取了vp60基因部分片段，PCR扩增后连接到克隆载体上pMD18-T。成功构建了原核表达使用重组质粒pET-28a-RHDV-vp60并转化表达菌BL21（DE3），将重组菌置于37°C0.5mmol/L IPTG诱导表达4h后经SDS-PAGE分析，在分子量约为26kDa处出现目的蛋白带,与预期蛋白分子质量相符。质谱结果表明，该蛋白序列与理论相符。纯化的重组蛋白免疫兔制备多克隆抗体，ELISA结果显示在抗原浓度为2μg/mL时多抗的效价可达1：6400，可用于检测RHDV-vp60在家蚕中的表达。将优化后的vp60序列定向连接到真核表达所用转移载体pVL1393上，鉴定后得到重组质粒pVL-RHDV-vp60，将病毒Bm-BacPAK6DNA进行线性化处理后，与pVL-RHDV-vp60共转染家蚕Bm-N细胞。成功发生同源重组后获得重组病毒reBm-RHDV，用其感染家蚕5龄幼虫，酶联免疫吸附法对家蚕中VP60蛋白进行检测并筛选表达量高的重组病毒株，用该病毒株同时感染家蚕5龄幼虫和蚕蛹，收集幼虫血淋巴，超速离心纯化后进行电镜观察，结果表明RHDV衣壳蛋白基因在家蚕中得到了较高水平的表达，真核表达蛋白形成类病毒空衣壳粒子。将蚕蛹制成疫苗后免疫家兔，ELISA法检测免疫兔体内抗血清的变化，结果显示类病毒空衣壳粒子有效地刺激机体产生特异性抗体，病理检测结果表明免疫后家兔未出现不良副反应，疫苗安全性好。本研究为制备安全有效的RHD基因工程疫苗、研制诊断试剂盒、研究病毒粒子的形成和病毒与细胞受体的相互关系等奠定基础。
杨丰利[7]（2011）在《南宁市郊奶牛乳腺炎相关研究及其对繁殖性能的影响》文中研究表明奶牛乳腺炎是导致奶牛业经济损失最严重的疾病之一。本文对南宁市郊奶牛乳腺炎的发病情况、致病菌的流行状况、金黄色葡萄球菌毒性基因的分布、隐性乳腺炎乳汁酶类诊断、治疗乳腺炎中草药制剂组方的确定、乳腺炎疫苗的研制和效果评价以及临床乳腺炎对繁殖性能的影响等方面进行了探索和研究,取得结果如下：（1）2005-2009年对南宁市郊某规模化奶牛场全场奶牛进行乳腺炎调查,平均瞎乳头的奶牛占11.5%,平均瞎乳头率3.7%,临床乳腺炎奶牛平均发病率8.7%,乳区平均发病率3.7%,隐性乳腺炎奶牛平均发病率48.8%,乳区平均发病率19%,此外,临床乳腺炎和隐性乳腺炎的发病率随着胎次的增加而升高。临床乳腺炎和隐性乳腺炎乳汁致病菌检出率分别为96%和34%,临床乳腺炎的主要致病菌是金黄色葡萄球菌（29.5%）、大肠杆菌（25.7%）和新型隐球菌（16.2%）,隐性乳腺炎的主要致病菌是金黄色葡萄球菌（32.1%）、凝固酶阴性葡萄球菌（19.7%）和无乳链球菌（17.9%）,本实验所用的大多数抗生素和乳炎消对致病性细菌都比较敏感,分离的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的毒性最强,致病率分别为61%和54%。（2）对39株细菌的23S rRNA序列进行检测,全部确定为金黄色葡萄球菌,与之前生化鉴定结果完全一致,PCR结果检出了clfA、tsst-1、nuc、fnb、hla、hlb、cap5、cap8和mecA共九种基因,未检测出sea、fnbB基因,金黄色葡萄球菌携带一种以上毒力基因的现象较为普遍,提示菌株间毒力基因连锁流行的情况较普遍,并且毒性基因的流行病学具有一定的地域性。（3）从奶牛产后两周到产后十周采集的124个乳样,同时进行细菌学检测和上海隐性乳腺炎检测（SMT）,均为阳性结果的乳汁确定为隐性乳腺炎（SCM）。结果显示,SCM发病率为26.6%,主要致病菌是金黄色葡萄球菌（47%）和凝固酶阴性葡萄球菌（27%）,SCM乳汁中的MDA浓度和乳酸脱氢酶（LDH）、碱性磷酸酶（ALP）的活性显着高于正常乳汁,而SCM乳汁中的谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）活性显着低于正常乳汁,SCM乳汁中的超氧化物歧化酶（SOD）和天门冬氨酸氨基转移酶（AST）的活性与正常乳汁没有显着差异。因此,测定乳汁中的MDA浓度和LDH、ALP与GPx的活性可以作为奶牛隐性乳腺炎诊断的一种方法,并且在一定程度上为探明奶牛乳腺炎的发病机理提供依据。（4）金黄色葡萄球菌对连翘和黄连极度敏感,大肠杆菌对乌梅高度敏感。诃子、黄连对金黄色葡萄球菌的抑制作用最强,最低抑菌浓度（MIC）达到8 mg/mL,乌梅和黄连对大肠杆菌的抑制作用最强,MIC达到16mg/mL。通过正交设计,连翘、诃子、乌梅和黄连均能明显提高对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制作用,可以作为奶牛乳腺炎中草药组方的主要成分。该组方对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的MIC分别为8 mg/mL和16mg/mL。（5）所研制的两种金黄色葡萄球菌疫苗对小白鼠的攻毒保护率达到60%以上。根据常规间接ELISA方法,通过反应体系的优化,确定了最佳反应条件,初步建立了间接ELISA检测奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌抗体的方法。同时确定了建立的间接ELISA阴阳临界值（OD=0.28）和建立了标准曲线和回归方程,回归方程计算的预测效价和实际效价基本一致。接种疫苗后7-14天,奶牛血清的特异性抗体效价逐渐升高,疫苗1组奶牛于接种后14天达到最高峰（1：2995）,随后逐渐缓慢下降；疫苗2组奶牛于接种后21天达到最高峰（1：2062）,随后逐渐缓慢下降。直至实验结束（接种疫苗后第150天）,两个实验组奶牛血清的特异性抗体效价仍然高于阴阳临界值。（6）对南宁市郊某规模化奶牛场152头2-4胎次的经产奶牛产后进行临床乳腺炎的发病时间和繁殖指标的调查,包括首次配种天数、配种次数、首次配种怀孕率、空怀期、产后70天内怀孕率、流产率。产后至怀孕之间发生临床乳腺炎奶牛的首次配种天数和空怀期均极显着多于对照组奶牛（P<0.01）,配种次数显着多于对照组奶牛（P<0.05）；首次配种怀孕率显着低于对照组奶牛（P<0.05）,产后70天内怀孕率低于对照组奶牛（P>0.05）,流产率高于对照组奶牛（P>0.05）。产后至首次人工授精之间发生临床乳腺炎奶牛的首次配种天数和空怀期极显着多于对照组奶牛（P<0.01）,首次配种怀孕率显着低于对照组奶牛（P<0.05）。首次人工授精至怀孕之间发生临床乳腺炎奶牛的首次配种天数和空怀期极显着多于对照组奶牛（P<0.01）,配种次数显着多于对照组奶牛（P<0.05）,首次配种怀孕率显着低于对照组奶牛（P<0.05）。结论：奶牛产后至怀孕之间发生临床乳腺炎对繁殖性能具有严重的负面影响。
张秀芝[8]（2008）在《锦灯笼有效成分抗炎作用实验研究》文中指出咽炎是影响人类健康和生活质量的疾病之一。急、慢性咽炎所导致的病理改变,不仅造成咽局部的机能障碍,也可波及邻近器官组织,甚至影响全身其它系统,损害人体的健康。现代社会生活、工作压力的增加,空气环境的污染,尤其在我国东北地区,气候干燥,咽炎的发病率有升高的趋势。目前临床上治疗各种急、慢性咽炎的药物大多为抗生素类药物,近年来由于微生物对抗生素耐药越来越严重,这使抗生素类药物的临床应用收到限制。中药治疗咽炎具有毒副作用低、作用持久的特点,近年来迅速成为医学和药学研究者的关注热点。本课题研究选用盛产于长白山区的锦灯笼,经水提醇沉有机溶剂萃取得到粗提物（Extracts of Physalis alkekengi L var. franchetii （Mast.） Makino, EPAFM）。采用体内外实验方法,分别从毒理学、药效学和免疫学等方面研究了EPAFM对小鼠的体内毒性、体内外抗菌活性、抗炎活性、祛痰活性和免疫调节活性。实验结果表明:EPAFM对小鼠的MTD>20g/kg。EPAFM体外抗金黄色葡萄球菌和乙型溶血性链球菌的活性较高,其中对乙型溶血性链球菌的抗菌活性要高于金黄色葡萄球菌。EPAFM体内能有效抑制大鼠咽炎模型的诱发菌的生长。EPAFM能减轻二甲苯所致的炎性水肿,降低咽炎动物外周血中炎细胞数量,减少炎症部位炎细胞的浸润,抑制纤维组织增生。小鼠酚红实验结果表明,EPAFM有一定的祛痰效果。EPAFM对免疫器官重量和T淋巴细胞转化能力影响不大,但对血清抗体IgG有很强的促进作用。提示:EPAFM可通过抗菌、降低毛细血管通透性、提高血清免疫球蛋白含量发挥其治疗咽炎的作用。
杨国兴[9]（2008）在《多重PCR检测肉及肉制品中四种食源性致病菌的研究》文中研究表明食品安全突发事件频率高是近年来食品安全问题的一个显着特点,在各种食品安全事件中,细菌性食物中毒则是食物中毒的重要因素。常见的食源性致病菌主要有金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌、单核增生李斯特氏菌、致泻性大肠杆菌等。目前,国内检测食品中致病菌主要采用传统的培养方法,其操作繁琐,检测时间较长,通常需要3～5d才能完成,且灵敏度较低。近年来,PCR针对某一种或一类致病菌的检验方法被建立起来,但是一旦检测的方向有误就会造成时间和药品的浪费。因此,急需建立一种快速有效且通量较高的检测方法。本文根据金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因nuc、沙门氏菌的侵染性质粒抗原B基因ipaB、志贺氏菌的侵染性质粒抗原H基因ipaH、单核增生李斯特氏菌的内化素A基因inlA设计了四对特异性引物,进行多重PCR反应,可同时实现对四种食源性致病菌的检测。试验过程中对多重PCR反应体系中引物添加量、镁离子浓度、dNTPmixture添加量及退火温度和循环数等影响要素进行优化,确定了适宜的多重PCR反应体系和扩增程序,其反应体系为:5μL 10×PCR buffer,3.5μL 25 mmol/L Mg2+,5.5μLdNTP mixture,正向引物各2μL,反向引物各2μL,0.8μL(5UμL-1)Taq酶,模板为FTA膜,双蒸水补足至50μL;多重PCR扩增程序为:多重PCR反应采用冷启动,94℃预变性5min,94℃变性1min,55.5℃退火45s,72℃延伸1min,35个循环,72℃终延伸5min,反应产物在1%的琼脂糖凝胶中进行电泳,凝胶成像系统观察结果。对多重PCR扩增产物进行了DNA测序,登录Genebank将测序结果进行网上blast,从而证实PCR扩增产物确为目的扩增产物。本研究共检测了20株菌,2株金黄色葡萄球菌、4株沙门氏菌、4株志贺氏菌、1株单核增生李斯特氏菌均为阳性结果;9株其它肠杆菌均为阴性结果。将四种致病菌随机组合,均能够准确检测出结果,因此该多重PCR反应特异性较强。本方法对四种食源性致病菌的纯菌培养物单菌检测灵敏度均为101cfu/mL;同时检测四种食源性致病菌的灵敏度金黄色葡萄球菌为102 cfu/mL、沙门氏菌102cfu/mL、志贺氏菌101cfu/mL、单核增生李斯特氏菌101cfu/mL。对实际样品进行检测,将多重PCR方法与国标进行比较,确定多重PCR方法对四种致病菌的敏感性均为100%;特异性分别为:金黄色葡萄球菌为95.5%、沙门氏菌为95.7%、志贺氏菌为91.3%、单核增生李斯特氏菌为94.1%;符合率分别为98%、98%、96%、94%。本方法使用FTA滤膜处理样品,再通过多重PCR方法同时检测人工污染肉及肉制品中四种致病菌,金黄色葡萄球菌检出限为102 cfu/g、沙门氏菌检出限为102 cfu/g、志贺氏菌检出限为101 cfu/g、单核增生李斯特氏菌检出限为101cfu/g。并且检测可以在6h内完成,大大缩短了检测时间。为多重PCR快速检测食品中四种食源性致病菌构建了一个技术平台。
丘建龙[10]（2015）在《不同猪群副猪嗜血杆菌的分布与分型及耐药性研究》文中指出目的:本研究对福建省部分地区的副猪嗜血杆菌疑似病例及两具体猪场内部不同猪群的副猪嗜血杆菌进行分离鉴定、血清学分型、分子分型及药敏试验等开展研究,为我国和福建地区及猪场内部的副猪嗜血杆菌的流行、分布和临床用药提供切实的基础数据。方法:临床无菌采集病料及各阶段猪群鼻腔拭子样本,采用胰蛋白胨琼脂培养基（TSA）、胰蛋白胨肉汤培养基（TSB）与16SrRNAPCR进行分离鉴定。将分离到的副猪嗜血杆菌送往华中农业大学动物传染病诊断中心,通过传统的KRG琼脂扩散法,进行血清型分型鉴定。并通过ERIC-PCR分型技术对其进行基因分型。同时还利用肉汤稀释法对临床分离株进行耐药性研究。结果:从336份样品中分离出副猪嗜血杆菌57株,分离率为16.96%,其中分离率最高的部位为气管39.13%,肺脏、鼻腔、心脏、淋巴结、肾脏、脾脏和心包积液的分离率分别为 18.37%、18.25%、9.68%、3.45%、7.14%、3.45%和 11.11%;其中126份健康猪鼻拭子中分离出副猪嗜血杆菌23株,分离率为18.25%,其中分离率最高的是育肥猪群41%,哺乳仔猪、保育仔猪和后备母猪的分离率分别为25%、30%和14%;经产母猪鼻拭子中没有分离出HPS。57株临床分离菌的血清型中包括血清型1（4株）、血清型2（5株）、血清型5（1株）、血清型10（8株）、血清型11（2株）、血清型12（2株）、血清型13（1株）、血清型14（2株）和血清型15（2株）;另外还有7株有交叉反应和23株不可分型的菌株。ERIC-PCR结果显示HPS基因分型具有很强的多样性,共表现出51种不同的ERIC-PCR基因型,识别率为100%。通过对ERIC-PCR谱图的聚类分析,大致可将其分为两个大的集群（A集群和B集群）共6个小集群,其中所有健康猪群鼻腔拭子分离株的ERIC-PCR图谱相似,均被归为B集群中（图3-2）,而A群中除两株外均分离自疑似发病猪,可见疑似发病猪体内的HPS的基因型不同于健康猪群。同时对同一猪场健康猪群的气管和鼻腔分离株进行ERIC-PCR研究,结果显示,同一猪场不同分离部位的HPS的基因型也存在差异。药敏试验结果显示,所有临床分离的56株副猪嗜血杆菌敏感率较高的药物有阿奇霉素（56,98.3%）、氨苄西林（54,94.7%）、头孢噻肟（53,93.0%）和氯霉素（40,70.2%）;另外,试验菌株对四环素的耐药率高达49.12%（28株）。副猪嗜血杆菌对环丙沙星的耐药率为12.28%,但其42.11%（24株）的菌株都处于中介值。结论:1.福建部分地区猪场的HPS主要以血清型10、1、2和不能分型的为主,血清型5、11、12、13、14和15仅有少数分离,且血清型3、4、6、7、8和9没有分离到。2.在ERIC-PCR基因分型中,发现HPS具有很强的基因多样性,而且HPS的基因型差异不仅存在于健康猪群和病猪群之间,也存在于健康猪群内的气管和鼻腔之间。3.同一猪场流行的副猪嗜血杆菌同源性具有一定相似性,不同猪场间的HPS在同源性上具有一定的差异。4.在耐药性的研究中,发现福建东南部地区的HPS对头孢噻肟、阿米卡星和氨苄西林敏感性高,而对四环素具有较强的耐药性,同时对环丙沙星也不敏感,这为该地区的临床用药的选择提供了确实的参考。
二、免疫扩散法诊断家兔溶血性链球菌病的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、免疫扩散法诊断家兔溶血性链球菌病的研究（论文提纲范文）
（2）家兔无乳链球菌的分离鉴定及其感染的动态病理学与病原分布研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 家兔养殖与病害 |
| 1 家兔生物学特性 |
| 2 家兔养殖概况 |
| 3 家兔主要病害 |
| 3.1 病毒性疾病 |
| 3.2 细菌性疾病 |
| 3.3 寄生虫性疾病 |
| 3.4 真菌性疾病 |
| 第二章 无乳链球菌的研究进展 |
| 1 无乳链球菌的分类及生物学特性 |
| 2 无乳链球菌的感染及病症 |
| 2.1 鱼类无乳链球菌感染 |
| 2.2 奶牛无乳链球菌感染 |
| 2.3 人类无乳链球菌感染 |
| 3 无乳链球菌致病机理及毒力因子 |
| 3.1 荚膜多糖 |
| 3.2 表面蛋白 |
| 3.3 β-溶血素 |
| 3.4 肽聚糖 |
| 3.5 脂磷壁酸 |
| 4 无乳链球菌的防治 |
| 4.1 改善养殖环境 |
| 4.2 化学药物治疗 |
| 4.3 免疫防治 |
| 5 无乳链球菌的监测和定位研究现状 |
| 第三章 家兔无乳链球菌的分离鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 病原菌分离与回归感染试验 |
| 2.2 生化特性 |
| 2.3 药物敏感性实验 |
| 2.4 荚膜多糖分子血清型 |
| 3 讨论 |
| 3.1 无乳链球菌鉴定及感染现状 |
| 3.2 无乳链球菌的药物敏感特性 |
| 3.3 无乳链球菌血清型分型 |
| 第四章 无乳链球菌感染家兔的动态病理学及病原分布研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 主要试剂及配置方法 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 人工感染 |
| 2.2 临床症状及病理解剖变化 |
| 2.3 组织病理学观察 |
| 2.4 细胞病理学观察 |
| 2.5 间接原位PCR检测病原分布 |
| 3 结果 |
| 3.1 主要临床与解剖症状 |
| 3.2 动态病理学观察 |
| 3.3 超微病理学变化 |
| 3.4 间接原位PCR检测家兔无乳链球菌的分布 |
| 4 讨论 |
| 4.1 间接原位PCR技术 |
| 4.2 无乳链球菌感染家兔的致病机理 |
| 4.3 无乳链球菌感染家兔的侵染过程 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 发表文章情况 |
（3）罗非鱼无乳链球菌病病原学、病理学及cpsE基因的原核表达研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一章 研究综述 |
| 第一节 罗非鱼链球菌病的研究综述 |
| 1 病原学 |
| 1.1 分类与分布 |
| 1.2 生物学特征 |
| 1.3 分离鉴定 |
| 2 传播途径 |
| 3 致病性与致病机制 |
| 3.1 临床症状 |
| 3.2 致病机理 |
| 4 环境诱因 |
| 4.1 水温 |
| 4.2 氧气 |
| 4.3 氨浓度 |
| 4.4 硝酸盐和亚硝酸盐 |
| 4.5 pH值 |
| 5 诊断 |
| 5.1 常规诊断 |
| 5.2 金标准诊断 |
| 5.3 分子生物学技术诊断 |
| 6 防控措施 |
| 6.1 加强饲养管理 |
| 6.2 化药治疗 |
| 6.3 免疫接种 |
| 7 小结 |
| 第二节 无乳链球菌荚膜多糖合成基因研究进展 |
| 1 CPS基因的命名和序列特点 |
| 1.1 cps基因的命名 |
| 1.2 cps基因序列的特点 |
| 2 CPS基因的转录调节机制 |
| 2.1 RogB的调节机制 |
| 2.2 CovR/S的调节机制 |
| 2.3 通适型调节机制 |
| 3 CPS基因编码蛋白及其生物功能 |
| 3.1 糖基转移酶类 |
| 3.2 糖基聚合酶类 |
| 3.3 其他 |
| 4 CPS基因与荚膜多糖合成 |
| 4.1 荚膜多糖的合成启动 |
| 4.2 荚膜多糖的聚合和修饰 |
| 4.3 荚膜多糖的运输和形成 |
| 5 CPS基因与血清分型 |
| 5.1 基于cps基因的血清分型与传统血清分型方法的比较 |
| 5.2 基于cps基因的血清分型的应用前景 |
| 6 与CPS基因相关的突变株的构建及生物特性 |
| 6.1 基于转座子突变技术的突变株的构建 |
| 6.2 基于同源重组技术的突变株的构建 |
| 7 小结 |
| 第二章 研究目的与意义 |
| 第三章 罗非鱼源无乳链球菌的分离、鉴定和生物学特性研究 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 培养基 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 病样采集 |
| 2.2 病原检测 |
| 2.3 菌株鉴定 |
| 2.4 回归试验 |
| 2.5 药物敏感性试验 |
| 2.6 血清分型 |
| 2.7 LD_(50)的测定 |
| 2.8 胞外产物蛋白含量和胞外酶活性检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 寄生虫性病原检测结果 |
| 3.2 细菌性病原检测结果 |
| 3.3 病毒性病原检测结果 |
| 3.4 菌株鉴定 |
| 3.5 回归试验结果 |
| 3.6 药物敏感性试验结果 |
| 3.7 血清分型结果 |
| 3.8 LD_(50)的测定结果 |
| 3.9 胞外产物蛋白含量和胞外酶活性检测理化特性检测结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 样品收集方法对研究准确性的影响 |
| 4.2 无乳链球菌的鉴定方法 |
| 4.3 无乳链球菌鉴定方法的准确性和可靠性 |
| 4.4 无乳链球菌的耐药性分析 |
| 4.5 血清型鉴定方法的比较 |
| 4.6 菌株LD_(50)测定与菌株毒力评估 |
| 4.7 胞外产物理化特性检测的意义 |
| 4.8 无乳链球菌病的综合防控 |
| 5 小结 |
| 第四章 无乳链球菌三重PCR快诊方法的建立与应用 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 试验菌株 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 PCR引物设计与合成 |
| 2.2 无乳链球菌DNA的提取 |
| 2.3 序列的PCR扩增和鉴定 |
| 2.4 引物组合和温度条件优化 |
| 2.5 特异性试验 |
| 2.6 敏感性试验 |
| 2.7 Mg~(2+)浓度优化 |
| 2.8 重复性试验 |
| 2.9 应用 |
| 3 结果 |
| 3.1 三对特异性引物的扩增结果 |
| 3.2 序列的测定和比对 |
| 3.3 引物组合和温度条件优化 |
| 3.4 Mg~(2+)浓度优化 |
| 3.5 特异性检测 |
| 3.6 敏感性检测 |
| 3.7 重复性 |
| 3.8 应用 |
| 4 讨论 |
| 4.1 三重PCR检测方法的现实意义 |
| 4.2 特异性和敏感性问题 |
| 4.3 三重PCR反应体系参数优化 |
| 4.4 三重PCR反应条件优化 |
| 4.5 三重PCR的应用 |
| 5 小结 |
| 第五章 无乳链球菌对罗非鱼的病理损伤研究 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 试验菌株 |
| 1.2 试验动物 |
| 1.3 试验仪器 |
| 1.4 主要试剂 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 自然发病罗非鱼病理损伤 |
| 2.2 人工感染发病罗非鱼病理损伤 |
| 3 结果 |
| 3.1 临床症状 |
| 3.2 组织病理损伤 |
| 3.3 超微病理学损伤 |
| 4 讨论 |
| 4.1 临床症状辨析 |
| 4.2 组织病理损伤辨析 |
| 4.3 致病机制探讨 |
| 5 小结 |
| 图版Ⅰ 发病罗非鱼的临床症状 |
| 图版Ⅱ 发病罗非鱼的组织病理形态 |
| 图版Ⅲ 发病罗非鱼的超微病理形态 |
| 第六章 无乳链球菌在人工感染罗非鱼组织的分布与定位 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 试验菌株 |
| 1.2 试验动物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 溶液配制 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 菌株的复壮和稀释 |
| 2.2 人工感染和样品收集 |
| 2.3 引物及特异性探针的设计和合成 |
| 2.4 探针的稀释 |
| 2.5 间接原位PCR方法的建立 |
| 2.6 结果判断标准 |
| 3 结果 |
| 3.1 引物的特异性 |
| 3.2 间接原位PCR条件优化 |
| 3.3 间接原位PCR方法的特异性 |
| 3.4 无乳链球菌在罗非鱼部分组织中的分布规律 |
| 4 讨论 |
| 4.1 原位PCR在微生物检测方面的应用 |
| 4.2 间接原位PCR敏感性的影响因素 |
| 4.3 间接原位PCR特异性的影响因素 |
| 4.4 无乳链球菌在罗非鱼体内的分布规律 |
| 5 小结 |
| 图版Ⅳ 间接原位PCR阴性对照 |
| 图版Ⅴ 间接原位PCR阳性对照 |
| 图版Ⅵ 人工感染罗非鱼间接原位PCR检测结果 |
| 第七章 无乳链球菌cpsE基因的克隆、鉴定及分子特性分析 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 试验菌株 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 琼脂糖凝胶电泳相关溶液的配制 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 引物设计与合成 |
| 2.2 cpsE基因的PCR扩增 |
| 2.3 cpsE基因的T克隆、测序及序列分析 |
| 2.4 核酸序列分子特性分析 |
| 2.5 氨基酸序列分子特性分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 无乳链球菌cpsE基因的扩增和T克隆鉴定 |
| 3.2 核苷酸序列特征分析 |
| 3.3 蛋白序列特征分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 cpsE基因的研究价值 |
| 4.2 引物设计与克隆连接 |
| 4.3 cpsE基因的分子特性 |
| 5 小结 |
| 第八章 无乳链球菌cpsE基因重组表达质粒的构建及原核表达 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 试验菌株和连接载体 |
| 1.2 试验动物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 主要溶液的配制 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 引物的设计与合成 |
| 2.2 cpsE基因的PCR扩增 |
| 2.3 cpsE基因的T-载体克隆与鉴定 |
| 2.4 pET-32a(+)-CpsE重组质粒的构建及鉴定 |
| 2.5 重组蛋白的诱导表达 |
| 2.6 重组蛋白的纯化 |
| 2.7 兔抗GBS CpsE重组蛋白多克隆抗体的制备及免疫原性检测 |
| 2.8 兔抗CpsE重组蛋白抗体效价的检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 cpsE基因扩增结果 |
| 3.2 重组表达质粒pET-32a(+)-cpsE的鉴定 |
| 3.3 CpsE重组蛋白的表达 |
| 3.4 重组蛋白的纯化 |
| 3.5 Western-blot检测 |
| 3.6 琼脂扩散试验检测血清抗体滴度 |
| 4 讨论 |
| 4.1 cpsE基因重组质粒连接载体的选择 |
| 4.2 CpsE重组蛋白原核表达主要影响因素 |
| 4.3 兔抗CpsE重组蛋白血清的制备 |
| 5 小结 |
| 第九章 结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（4）1株致病性兔无乳链球菌的分离、鉴定与系统发育分析（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 病原菌的分离 |
| 1.3 人工感染试验 |
| 1.4 细菌表型特征测定 |
| 1.5 16SrDNA和gyrB基因扩增 |
| 1.6 血清型分型 |
| 2 结果 |
| 2.1 病原菌分离与人工感染 |
| 2.2 生化特性 |
| 2.3 16SrDNA和gyrB的PCR扩增与系统发育学分析 |
| 2.4 荚膜多糖分型 |
| 3 讨论 |
（5）兔出血症病毒RPA检测方法的建立及间接ELISA检测抗体的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 兔病毒性出血症的概述 |
| 1.2 RHDV基因组结构及功能 |
| 1.3 RHDV病原学特点 |
| 1.3.1 RHDV形态学 |
| 1.3.2 RHDV对理化因素的抵抗力 |
| 1.3.3 RHDV的血凝特性 |
| 1.4 RHD的流行病学研究 |
| 1.4.1 流行特点 |
| 1.4.2 传染源与传播途径 |
| 1.4.3 易感动物 |
| 1.5 RHD诊断方法的研究进展 |
| 1.5.1 根据临床症状进行初步诊断 |
| 1.5.2 病理剖检及病理组织学诊断 |
| 1.5.3 实验室检测 |
| 1.6 本研究的目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要试剂和材料 |
| 2.1.2 主要试剂的配制 |
| 2.1.2.1 琼脂糖凝胶电泳试剂 |
| 2.1.2.2 诱导表达试剂 |
| 2.1.2.3 SDS-PAGE试剂的配制 |
| 2.1.2.4 Western blot试剂的配制 |
| 2.1.2.5 ELISA试剂的配制 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 RHDV的分离与分子遗传变异特性分析 |
| 2.2.1.1 兔出血症病毒VP60基因的克隆 |
| 2.2.1.2 VP60基因的核酸序列分析 |
| 2.2.2 兔出血症病毒RPA检测方法的建立 |
| 2.2.2.1 兔出血症病毒VP60基因引物的设计 |
| 2.2.2.2 兔出血症病毒RNA的提取 |
| 2.2.2.3 兔出血症病毒RPA检测方法的建立 |
| 2.2.2.4 特异性试验 |
| 2.2.2.5 敏感性试验 |
| 2.2.2.6 人工感染的样本检测 |
| 2.2.2.7 临床应用 |
| 2.2.3 间接ELISA检测抗体的研究 |
| 2.2.3.1 VP60基因序列比对 |
| 2.2.3.2 VP60基因的分段扩增及原核表达载体构建 |
| 2.2.3.3 VP60-1、VP60-2、VP60-3 基因的原核表达及纯化 |
| 2.2.3.4 Western blot分析 |
| 2.2.3.5 间接ELISA方法的建立 |
| 2.2.3.6 RHD免疫抗体检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 RHDV毒株的分离与分子遗传变异特性分析 |
| 3.1.1 VP60基因的克隆 |
| 3.1.2 VP60基因的核酸序列系统进化树分析 |
| 3.2 兔出血症病毒RPA检测方法的建立 |
| 3.2.1 重组酶聚合酶等温扩增反应 |
| 3.2.2 RPA反应条件的优化 |
| 3.2.3 特异性试验 |
| 3.2.4 敏感性试验 |
| 3.2.5 人工感染的样本检测 |
| 3.2.6 临床应用 |
| 3.3 间接ELISA检测抗体的研究 |
| 3.3.1 VP60基因序列比对 |
| 3.3.2 VP60基因的分段扩增及原核表达载体构建 |
| 3.3.3 VP60-1、VP60-2、VP60-3 基因的原核表达及纯化 |
| 3.3.4 Western blot分析 |
| 3.3.5 间接ELISA方法的建立 |
| 3.3.5.1 抗原最适包被浓度与血清最佳稀释度的确定 |
| 3.3.5.2 抗原最佳包被时间的确定 |
| 3.3.5.3 最佳封闭液的确定 |
| 3.3.5.4 最佳封闭时间的确定 |
| 3.3.5.5 二抗工作浓度的确定 |
| 3.3.5.6 ELISA阴阳性临界值的确定 |
| 3.3.6 RHD免疫抗体检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 RHDV毒株的分离与分子遗传变异特性分析 |
| 4.2 兔病毒性出血症RPA检测方法的建立 |
| 4.3 间接ELISA检测抗体的研究 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
| 个人简介 |
（6）兔出血症病毒衣壳蛋白基因在家蚕中的表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 RHDV 研究现状 |
| 1.2.1 RHDV 病原学 |
| 1.2.2 RHDV 分子生物学 |
| 1.2.3 RHD 的流行病学与组织病理学 |
| 1.2.4 RHDV 的检测 |
| 1.2.5 RHD 的防控 |
| 1.3 昆虫-杆状病毒表达系统 |
| 1.4 家蚕-杆状病毒表达系统 |
| 1.4.1 家蚕-杆状病毒表达系统的优点 |
| 1.4.2 家蚕生物反应器表达策略的优化 |
| 1.4.3 家蚕-杆状病毒表达系统在疫苗生产方面的研究及应用 |
| 1.5 研究目的和意义 |
| 1.6 实验研究方案 |
| 第二章 检测抗体的制备 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 仪器与试剂 |
| 2.1.2 菌株与质粒 |
| 2.1.3 引物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 实验流程 |
| 2.2.2 RHDV-vp60 基因序列优化和合成 |
| 2.2.3 目的片段的扩增 |
| 2.2.4 PCR 产物的纯化、回收 |
| 2.2.5 PCR 产物与 pMD18-T 载体的连接 |
| 2.2.6 E.coli 热击感受态细胞的制备 |
| 2.2.7 连接产物的转化 |
| 2.2.8 鉴定阳性克隆质粒 |
| 2.2.9 原核表达载体的构建 |
| 2.2.10 重组蛋白的诱导表达 |
| 2.2.11 表达产物存在形式的检测 |
| 2.2.12 SDS-PAGE 电泳分析 |
| 2.2.13 重组蛋白的质谱鉴定 |
| 2.2.14 重组蛋白的表达与纯化 |
| 2.2.15 兔源多克隆抗体制备 |
| 2.2.16 多克隆抗体效价检测 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 vp60 基因序列的优化 |
| 2.3.2 目的片段的扩增 |
| 2.3.3 pMD18-T-RHDV-vp60 的酶切验证 |
| 2.3.4 重组质粒 pET-28a-RHDV-vp60 的验证 |
| 2.3.5 重组蛋白表达条件 |
| 2.3.6 重组蛋白存在形式 |
| 2.3.7 重组蛋白的纯化 |
| 2.3.8 重组蛋白的质谱分析 |
| 2.3.9 蛋白质浓度测定 |
| 2.3.10 多克隆抗体效价测定 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 兔出血症病毒衣壳蛋白基因在家蚕中的表达 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 仪器与试剂 |
| 3.1.2 菌株与质粒、病毒 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 实验流程 |
| 3.2.2 重组杆状病毒转移载体的构建 |
| 3.2.3 家蚕细胞的准备 |
| 3.2.4 病毒 Bm-BacPAK6 基因组 DNA 的制备 |
| 3.2.5 基因组 DNA 的线性化 |
| 3.2.6 共转染 |
| 3.2.7 重组病毒 reBm-RHDV 在蚕体中表达 |
| 3.2.8 RHDV-vp60 基因表达产物的抗原性分析 |
| 3.2.9 筛选高表达的克隆毒株 |
| 3.2.10 RHDV-vp60 基因在家蚕中的表达 |
| 3.2.11 RHDV 空衣壳的纯化 |
| 3.2.12 RHDV 空衣壳电镜观察 |
| 3.2.13 RHD 疫苗的制备及免疫 |
| 3.2.14 免疫兔血清中抗体的检测 |
| 3.2.15 免疫兔病理检测 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 重组转移载体的鉴定 |
| 3.3.2 蚕体中 RHDV 衣壳蛋白基因的表达 |
| 3.3.3 真核表达蛋白的免疫印迹检测 |
| 3.3.4 高表达毒株的筛选 |
| 3.3.5 RHDV 电镜观察 |
| 3.3.6 兔血清中抗体的检测 |
| 3.3.7 免疫兔病理检测 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（7）南宁市郊奶牛乳腺炎相关研究及其对繁殖性能的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 目录 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 奶牛乳腺炎的定义 |
| 1.2 奶牛乳腺炎的分类 |
| 1.3 奶牛乳腺炎的病因 |
| 1.4 国内外奶牛乳腺炎发病情况 |
| 1.5 奶牛隐性乳腺炎常用检测方法 |
| 1.6 中草药制剂治疗奶牛乳腺炎研究进展 |
| 1.7 乳腺炎致病性金黄色葡萄球菌毒力基因研究进展 |
| 1.8 奶牛乳腺炎疫苗研究进展 |
| 1.9 奶牛乳腺炎与繁殖性能的关系 |
| 1.10 本课题研究目的和意义 |
| 第二章 南宁市郊奶牛乳腺炎的发病率和主要致病菌调查 |
| 摘要 |
| 前言 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.3 分析与讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 奶牛乳腺炎致病性金黄色葡萄球菌分子特征性分析 |
| 摘要 |
| 前言 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.3 分析与讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 奶牛隐性乳腺炎乳汁中丙二醛浓度和酶类活性的研究 |
| 摘要 |
| 前言 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 中草药制剂对奶牛乳腺炎致病菌抗菌效果研究 |
| 摘要 |
| 前言 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌疫苗的初步研制 |
| 摘要 |
| 前言 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.2 结果 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 奶牛临床乳腺炎对繁殖性能的影响 |
| 摘要 |
| 前言 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.2 结果 |
| 7.3 讨论 |
| 7.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录: 英文缩写—中文对照表 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（8）锦灯笼有效成分抗炎作用实验研究（论文提纲范文）
| 提要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 1 研究背景 |
| 2 锦灯笼的研究进展 |
| 3. 研究目的 |
| 材料与方法 |
| 1 主要试剂与仪器 |
| 2 实验动物 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 锦灯笼有效成分的提取及鉴定 |
| 3.2 EPAFM 最大耐受剂量实验 |
| 3.3 小鼠耳肿胀实验 |
| 3.4 小鼠酚红实验 |
| 3.5 EPAFM 体外抗菌实验 |
| 3.6 EPAFM 对大鼠急性咽炎的治疗作用 |
| 3.7 统计学方法 |
| 实验结果 |
| 1 EPAFM 对小鼠的最大耐受剂量 |
| 2 EPAFM 对二甲苯所致的小鼠耳肿胀的影响 |
| 3 EPAFM 对小鼠酚红实验的影响 |
| 4 EPAFM 的体外抑菌结果 |
| 5 EPAFM 对咽炎大鼠的作用结果 |
| 5.1 模型评价 |
| 5.2 EPAFM 的抗炎、抗菌作用 |
| 5.3 EPAFM 对咽炎大鼠免疫指标的影响 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 1 EPAFM 对细菌的抑制作用 |
| 2 EPAFM 抗炎作用 |
| 3 EPAFM 的祛痰作用 |
| 4 EPAFM 的免疫调节活性 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 致谢 |
| 导师及作者简介 |
（9）多重PCR检测肉及肉制品中四种食源性致病菌的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 立题背景及意义 |
| 1.2 本文所涉及的食源性致病菌简介 |
| 1.2.1 金黄色葡萄球菌 |
| 1.2.2 沙门氏菌 |
| 1.2.3 志贺氏菌 |
| 1.2.4 单核增生李斯特氏菌 |
| 1.3 食源性致病菌检测方法 |
| 1.3.1 常规的检测方法 |
| 1.3.2 快速的检测方法 |
| 1.4 肉及肉制品中食源性致病菌PCR检测研究现状 |
| 1.5 本文研究目的及研究内容 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 菌株 |
| 2.1.2 主要培养基 |
| 2.1.3 仪器与设备 |
| 2.1.4 样品与生化试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细菌的培养 |
| 2.2.2 菌体的DNA的提取 |
| 2.2.3 多重PCR引物的设计 |
| 2.2.4 多重PCR反应条件的优化 |
| 2.2.5 特异性 |
| 2.2.6 灵敏度的检测 |
| 2.2.7 多重PCR反应产物检测 |
| 2.2.8 多重PCR反应产物胶回收 |
| 2.2.9 多重PCR产物的测序鉴定 |
| 2.2.10 多重PCR检测人工污染的肉及肉制品 |
| 2.2.11 肉及肉制品中四种致病菌DNA提取方法比较 |
| 2.2.12 多重 PCR方法与国标方法进行实际样品检测对比试验 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 PCR反应条件优化结果 |
| 3.1.1 最适引物添加量的选择 |
| 3.1.2 最适Mg~(2+)(25mmol)添加量的选择 |
| 3.1.3 最适退火温度选择 |
| 3.1.4 最适dNTPmixture(各2.5mM)添加量的选择 |
| 3.1.5 最适Taq酶(5U/μL)添加量 |
| 3.1.6 多重PCR反应循环数的选择 |
| 3.1.7 多重PCR反应的热启动与冷启动比较 |
| 3.2 特异性 |
| 3.2.1 多重PCR引物特异性 |
| 3.2.2 多重PCR反应特异性 |
| 3.3 多重反应的灵敏度 |
| 3.3.1 多重PCR检测单一致病菌的灵敏度 |
| 3.3.2 多重PCR同时检测四种致病菌的灵敏度 |
| 3.4 多重PCR反应产物测序结果 |
| 3.5 人工污染样品，确定检出限 |
| 3.6 肉及肉制品中四种致病菌DNA提取方法比较结果 |
| 3.7 实际样品检测结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 多重 PCR反应程序优化 |
| 4.1.1 靶基因及引物的确定 |
| 4.1.2 dNTP和Taq酶及引物添加量的确定 |
| 4.1.3 镁离子浓度和退火温度及循环数的确定 |
| 4.2 DNA模板的制备方法比较 |
| 4.3 与国标检测方法的比较 |
| 4.4 多重PCR反应污染的防控 |
| 4.5 展望 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 硕士期间发表学术论文 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
（10）不同猪群副猪嗜血杆菌的分布与分型及耐药性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1、研究背景 |
| 2、病原的流行病学研究 |
| 2.1 病原学研究 |
| 2.2 副猪嗜血杆菌的危害 |
| 2.3 临床症状与病理变化 |
| 2.4 致病机理研究 |
| 3、副猪嗜血杆菌病的诊断 |
| 3.1 临床病理诊断 |
| 3.2 实验室诊断 |
| 4、血清型分型研究现状 |
| 5、分子分型研究现状 |
| 6、耐药性研究进展 |
| 7、副猪嗜血杆菌病的防治 |
| 7.1 加强饲养管理 |
| 7.2 免疫接种 |
| 7.3 药物预防治疗 |
| 第二章 福建部分地区副猪嗜血杆菌分离鉴定及血清学分型研究 |
| 1、材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2、结果与分析 |
| 2.1 细菌的分离培养 |
| 2.2 HPS的PCR鉴定 |
| 2.3 副猪嗜血杆菌的分离率 |
| 2.4 血清型分型结果 |
| 3、讨论 |
| 3.1 H.parasuis的分离率 |
| 3.2 不同猪群H.parasuis的分离率 |
| 3.3 H.parasuis血清型分布 |
| 3.4 健康猪群中H.parasuis分离株的血清型 |
| 第三章 福建地区副猪嗜血杆菌分离株的ERIC-PCR图谱分析 |
| 1、材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2、结果 |
| 2.1 ERIC-PCR图谱及聚类分析 |
| 2.2 某一具体猪场内部HPS分离菌株的遗传进化树分析 |
| 3、讨论 |
| 3.1 副猪嗜血杆菌的基因型 |
| 3.2 具体猪场健康猪群HPS的基因型 |
| 第四章 副猪嗜血杆菌耐药性研究 |
| 1、材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1 副猪嗜血杆菌临床分离株的耐药性 |
| 2.2 福建两猪场副猪嗜血杆菌临床分离株的药物敏感性(%)比较 |
| 2.3 福建两猪场副猪嗜血杆菌临床分离株的MIC_(50)和MIC_(90)的比较 |
| 2.4 不同猪群与不同分离部位HPS耐药性的比较 |
| 3、讨论 |
| 3.1 福建部分地区副猪嗜血杆菌的耐药性 |
| 3.2 不同用药背景下副猪嗜血杆菌分离株的耐药性 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 英文缩写 |
四、免疫扩散法诊断家兔溶血性链球菌病的研究（论文参考文献）
- [1]免疫扩散法诊断家兔溶血性链球菌病的研究[J]. 矫正德,王英厚,王翠兰,王西川. 中国畜禽传染病, 1994(01)
- [2]家兔无乳链球菌的分离鉴定及其感染的动态病理学与病原分布研究[D]. 任思宇. 四川农业大学, 2013(03)
- [3]罗非鱼无乳链球菌病病原学、病理学及cpsE基因的原核表达研究[D]. 黄锦炉. 四川农业大学, 2012(07)
- [4]1株致病性兔无乳链球菌的分离、鉴定与系统发育分析[J]. 任思宇,耿毅,汪开毓,周赵英,刘星星,吴春艳. 中国兽医学报, 2013(08)
- [5]兔出血症病毒RPA检测方法的建立及间接ELISA检测抗体的研究[D]. 张连芝. 山东农业大学, 2017(02)
- [6]兔出血症病毒衣壳蛋白基因在家蚕中的表达[D]. 王树坤. 中国农业科学院, 2012(10)
- [7]南宁市郊奶牛乳腺炎相关研究及其对繁殖性能的影响[D]. 杨丰利. 广西大学, 2011(07)
- [8]锦灯笼有效成分抗炎作用实验研究[D]. 张秀芝. 吉林大学, 2008(10)
- [9]多重PCR检测肉及肉制品中四种食源性致病菌的研究[D]. 杨国兴. 河北农业大学, 2008(08)
- [10]不同猪群副猪嗜血杆菌的分布与分型及耐药性研究[D]. 丘建龙. 福建农林大学, 2015(05)