一、绿脓杆菌外毒素A的细胞毒性和细胞表面受体密度（论文文献综述）
张伯顺[1]（2020）在《H9N2流感病毒与绿脓杆菌共感染致水貂出血性肺炎的病程演化研究》文中研究表明水貂出血性肺炎是严重危害水貂养殖业的重要疾病之一,传统上认为是由绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa,P.aeruginosa）感染引起,但近年来研究表明P.aeruginosa单一感染不易引起水貂出血性肺炎,应该还有其他的原因。甲型流感病毒（Influenza A virus,IAV）和细菌共感染会影响宿主感染的过程和严重程度。近年来,IAV和细菌的共感染已成为研究前沿。本实验室前期研究表明H9N2 IAV在水貂中流行,可引起轻度呼吸道疾病。为了探究H9N2 IAV和绿脓杆菌共感染是否能够导致水貂出血性肺炎,开展了该项研究。用本实验室分离保存的H9N2 IAV（Mk/SD/F10/13株）与绿脓杆菌（P.aeruginosa-CS-2株）,进行H9N2 IAV和绿脓杆菌不同顺序共感染水貂的致病性研究,分别设H9N2 IAV和绿脓杆菌同时共感染、H9N2 IAV继发绿脓杆菌感染、绿脓杆菌继发H9N2 IAV感染组,同时设H9N2 IAV和绿脓杆菌单一感染对照,接种PBS水貂作为阴性对照。在实验期间,观察检测水貂的临床症状与病理变化,定期采集水貂的鼻洗液、血清、组织（心、肝、脾、肺、肾等）,进行血清学或病原学检测。结果,相比于单独感染H9N2 IAV或绿脓杆菌,H9N2 IAV和绿脓杆菌共感染的水貂表现出更严重的临床症状。并且H9N2 IAV和绿脓杆菌共感染组水貂的临床症状评分（CSS）峰值比单独感染H9N2 IAV或绿脓杆菌组水貂出现的更早,且峰值较高,差异显着（P<0.05）;不同顺序共感染组水貂之间的CSS峰值无显着差异。同时研究表明,共感染加剧了水貂肺组织病理学损伤,并导致肺组织更为明显的细胞凋亡,其中H9N2 IAV和绿脓杆菌同时共感染组的凋亡指数（AI）最高。建立了HA基因的实时荧光定量PCR（qRT-PCR）方法,进行H9N2 IAV的排毒及其在组织中的分布与载量检测。结果,H9N2 IAV和绿脓杆菌共感染水貂的排毒水平在1 dpi和3 dpi时显着高于H9N2 IAV单独感染的水貂。在3 dpi时,共感染水貂肺中的病毒载量均高于单独感染H9N2 IAV的水貂,在气管和其他器官中,存在相似的情况。采用细菌分离培养法检查肺组织的细菌载量,在3 dpi和11 dpi时,共感染水貂的肺部细菌载量明显高于绿脓杆菌单独感染组,表明H9N2 IAV和绿脓杆菌共感染水貂的肺部绿脓杆菌清除延迟。此外,利用HI试验对水貂的抗H9N2抗体效价进行了检测。结果表明,在3 dpi和7 dpi时,H9N2 IAV继发绿脓杆菌感染和绿脓杆菌继发H9N2 IAV感染组水貂的HI效价明显高于单独感染H9N2 IAV组,而H9N2 IAV与绿脓杆菌同时共感染组与单独感染H9N2 IAV组的HI滴度无显着差异。采用qRT-PCR检测水貂肺和脾脏中细胞因子的mRNA水平。共感染水貂肺中IFN-α和IFN-γ的mRNA水平在3 dpi时高于H9N2 IAV或绿脓杆菌单独感染的水貂,而TNF-α的mRNA水平同样能快速而强烈地上调表达。综上所述,H9N2 IAV和绿脓杆菌不同顺序共感染均能导致水貂出血性肺炎,病情恶化快,而绿脓杆菌应在该疾病中起主要作用。本研究丰富了流感病毒-细菌共感染的研究数据,为水貂出血性肺炎甚至人类呼吸系统疾病的防控提供了理论依据。
王静[2]（2019）在《新型免疫毒素降低非特异性毒性的设计与研究》文中研究说明免疫毒素是一种由靶向部分连接毒素部分组成的融合蛋白。其中,靶向部分通常是抗体、抗体片段或生长因子等具有导向功能的生物活性分子,能够通过特异性识别细胞表面的受体将毒素部分靶向传递至病变细胞。毒素部分普遍具有较强的细胞毒性,通过受体介导进入细胞后,可以发挥杀灭病变细胞的功能。根据来源不同划分,毒素部分可以来自微生物、植物、昆虫和动物等。绿脓杆菌外毒素和白喉毒素是两种获得广泛研究的细菌毒素,目前已有相应的药品Lumoxiti和Ontak被批准上市,对许多不同类型的血液瘤具有明显的治疗效果。然而,临床上广泛应用免疫毒素还存在许多待解决的问题,例如,免疫毒素存在免疫原性、非特异性毒性和低渗透性等。免疫毒素的非特异性毒性主要来源于两部分,一部分是由于毒素分子与内皮细胞的非特异性结合,对内皮细胞的损伤导致血管渗漏综合征的发生;另一部分则是靶向部分与表达肿瘤相关抗原的正常细胞非特异性结合,对正常组织的损伤引发对机体的毒副作用。由于毒素本身的异源性以及肿瘤特异性抗原极少存在,所以免疫毒素的非特异性毒性问题较难解决,于是我们设计新型的免疫毒素,分别对传统免疫毒素的毒素部分和靶向部分进行修饰与改造,从而降低免疫毒素的非特异性毒性。本课题针对靶向表皮生长因子受体2的免疫毒素scFvPE38进行改造,首次设计并制备无毒性两段式免疫毒素。断裂型内含肽是一种能够自我剪切并将两侧蛋白（外显肽）以天然共价键进行连接的自处理功能序列。我们借助断裂型内含肽将免疫毒素分成两段,两段分别与断裂型内含肽融合,在到达靶细胞后,通过控制反应条件,发生内含肽介导的蛋白反式剪接反应,使两段式免疫毒素重新连接形成完整免疫毒素。实验表明,两段式免疫毒素均不具有毒素活性,即使在高浓度条件下,也不会产生细胞毒性。两段式免疫毒素可以在还原性条件下发生内含肽介导的反式蛋白剪接反应,生成完整免疫毒素,并且恢复免疫毒素的细胞毒性,通过受体介导的内吞入胞后,引起靶细胞的凋亡。本课题同时设计新型的抗原屏蔽型免疫毒素M-Fab-PE24,通过连接抗原屏蔽肽至免疫毒素的靶向部分,降低免疫毒素对表达肿瘤相关抗原的正常组织产生的非特异性毒性。在免疫毒素Fab部分的轻链N端通过酶解型连接肽连接抗原屏蔽肽,屏蔽抗体的抗原结合位点,在循环过程中降低免疫毒素对正常组织的结合。在达到肿瘤部位后,接受肿瘤微环境特异性蛋白酶处理,切除屏蔽肽,释放Fab的抗原结合部位,恢复其抗原结合亲和力,选择性对肿瘤细胞发挥杀伤作用。本课题分别从体外和体内验证了抗原屏蔽型免疫毒素的抗原亲和力和生物活性。体外研究结果显示,抗原屏蔽型免疫毒素的抗原结合能力和细胞毒性明显下降,但在接受特定蛋白酶活化后,能够恢复原有的结合亲和力和细胞毒性;使用小鼠异种移植瘤模型进行药效研究显示,抗原屏蔽型免疫毒素M-Fab-PE24具有明显的抑瘤效果,并且与未屏蔽型免疫毒素Fab-PE24相比,对肝脏的损伤较轻,显示出更好的安全性。本课题设计的两种新型免疫毒素分别从1)降低细胞毒性与肿瘤靶位定点恢复以及2)抑制抗原结合能力与肿瘤靶位定点恢复两个方面来研究降低免疫毒素非特异性毒性的通用方法,使其可以用于不同抗体和毒素的任意组合,而不用局限于毒素的来源以及抗原的特异性表达。对以上两种新型免疫毒素的研究,为降低免疫毒素非特异毒性建立了一定的基础,有助于推动免疫毒素广泛应用于临床。本论文首创的新型低非特异性毒性免疫毒素的设计具有较高的开发应用价值。
吕娇[3]（2019）在《貂源铜绿假单胞菌的分离鉴定及△Hsp33缺失株的构建》文中研究说明水貂出血性肺炎是由铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa,PA）引起的以出血性肺炎为特征的水貂急性传染病。本团队前期研究首次证实了貂源PA的主要流行血清型为G型和B型,2017-2018年从患水貂出血性肺炎水貂分离了18株PA,发现了新的致病血清型C型、D型,本文对PA菌株C、D血清型的生物学特性和免疫原性进行研究,并对此次分离的强毒株HY-1以及实验室保存弱毒株PA1060的基因差异以及毒力因子Hsp33的致病性进行了研究,获得如下结果:阐明了水貂出血性肺炎病原PA的生物学特性和致病特点,对分离的18株P A菌株进行血清型、运动能力、生物被膜、绿脓菌素、生长曲线、耐药性及致病性研究,结果表明:貂源PA血清型为G型12株、B型1株、C型1株、D型3株和E型1株。菌株泳动能力在1.89.2 cm之间,群集运动能力在1.003.15 c m之间,抽动面积在0.00812.567 cm2之间;生物被膜形成能力结果表明,5株PA形成能力较强,10株为中,3株弱;18株PA均可产生绿脓菌素;PA生长曲线均相同,于培养的第4个小时进入对数生长期,第18小时进入平稳期;PA对亚胺培南、阿米卡星、庆大霉素、环丙沙星、头孢哌酮、头孢吡肟、左氧氟沙星、哌拉西林、头孢他啶和氨曲南100%敏感;致病性结果表明HY-1为毒力最强,对小鼠LD50为1.5×106 CFU,C型菌株PK13对小鼠和水貂的LD50分别为7.5×106 CFU和7×105 CFU,D型箘株H2F对小鼠和水貂的LD50分别为2.05×107 CFU和2.2×106 CFU,二者对本血清型菌株的免疫保护率均为100%;对交叉血清型菌株的保护率为80%90%。阐明了弱毒株PA1060与强毒株HY-1的基因组差异。通过弱毒株PA1060和强毒株HY-1的全基因组测序及基因组成分比较分析发现,弱毒株散在重复序列、非编码RNA及基因岛的编码基因数量均多于强毒株HY-1,但PA1060与H Y-1相比缺少一个编码T3SS分泌系统的基因,因此推测T3SS分泌系统的缺失、插入序列及基因序列重排基因可能是PA1060毒力致弱的主要原因。构建了HY-1的基因缺失株△Hsp33基因缺失株并对其进行了功能验证,测定△Hsp33的LD50为（6.83±0.38）×105CFU,与野毒株HY-1相比致病性下降;缺失株、互补株及野毒株的生长曲线表明△Hsp33的生长能力最弱;生物被膜形成能力、泳动及抽动能力无变化,群集运动能力△Hsp33为（13.76±0.32）cm,较HY-1相比有所升高;△Hsp33分泌绿脓菌素颜色为黄绿色,HY-1为浅绿色;△Hsp33对貂肺上皮细胞的黏附率为12.6%±2.4%,较HY-1相比减少了6.53%;药敏结果显示△Hsp33可以引起四环素、庆大霉素抗药由中度耐药到敏感。综上所述,本研究分离出的C型、D型铜绿假单胞菌具有良好的免疫原性,为研制水貂出血性肺炎四价灭活疫苗（G型+B型+C型+D型）提供依据;通过对PA1060及HY-1的全基因组测序,指出了强弱毒株之间的基因差异;确定分析了Hsp33基因的功能。本研究为进一步防控水貂出血性肺炎提供依据。
张海威[4]（2019）在《水貂绿脓杆菌和大肠杆菌二联四价灭活疫苗的研制及初步应用》文中指出随着我国经济的发展,水貂养殖业发展非常迅猛,水貂养殖户数量逐年增加,随之而来的是一些传染病发病率升高,尤其是细菌性呼吸道疾病,给水貂养殖业带来了巨大经济损失,严重影响毛皮动物产业健康发展。水貂出血性肺炎是近年来引起水貂死亡的一种急性、热性、高致死性的细菌性呼吸道传染病。该病最早鉴定为是由绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）单独感染而引起。然而,近年来我们对临床发病病例的研究发现,引起水貂出血性肺炎的病原并不单一是绿脓杆菌,还有大肠杆菌（Escherichia coli）,也有大肠杆菌和绿脓杆菌混合感染的情况。为此,多种病原体导致水貂出血性肺炎的发生,并引起水貂急性死亡,给药物防治增加了困难,养殖户的经济损失也日益增加,严重妨碍了我国水貂养殖业的发展。水貂出血性肺炎病例在全国各地区均有发生,主要集中在河北、山东、辽宁、黑龙江等省份。感染的水貂初期看不见任何临床症状,中后期食欲不振、精神萎靡、尖叫后立即死亡、口鼻流血,剖检可见肺脏大面积出血、脾脏、肾脏等器官大出血,使用抗生素治疗效果不理想,尤其是大肠杆菌单独感染的病例对抗生素极容易产生耐药性,可使用的抗生素种类不多。该病目前严重困扰着我国水貂养殖户,为此对我国河北、山东、辽宁和黑龙江等地的水貂出血性肺炎病例进行收集,并开展了病原菌分离鉴定、血清型、基因型鉴定、药敏试验、小鼠和水貂攻毒试验等研究,对水貂出血性肺炎的病原体进行分离鉴定,并对其在实验动物和本源动物的致病性方面进行检测。同时利用分离鉴定的主要致病菌研制了水貂出血性肺炎绿脓杆菌和大肠杆菌二联四价灭活疫苗,并对该疫苗的免疫原性和免疫保护力进行了检测,并在临床上进行了初步应用。通过以上研究,我们得到了如下研究结果:（一）病原菌分离鉴定试验结果显示,引起水貂出血性肺炎的病原体主要有绿脓杆菌和大肠杆菌两种重要的病原体,有的是单独感染,有的是混合感染。引起水貂出血性肺炎的绿脓杆菌的血清型除了已有的G型外,还有D型和E型,其中以G型、D型和E型为多发,并且致病力较强。引起水貂出血性肺炎的大肠杆菌的基因型为H11,且具有较强的致病力。（二）对小鼠和水貂攻毒试验显示分离到的菌株均可以引起小鼠和水貂死亡,并引起水貂出现典型的出血性肺炎临床症状,病理切片结果显示出现明显的炎症反应。（三）药敏试验结果显示分离到的绿脓杆菌和大肠杆菌具有高度的耐药性,其中绿脓杆菌对头孢噻肟、头孢他啶产生高度耐药,对环丙沙星、妥布霉素、阿米卡星等7种抗生素敏感,大肠杆菌对环丙沙星、妥布霉素、阿米卡星、头孢噻肟、头孢他啶等10种抗生素均产生高度耐药。（四）利用大肠杆菌H基因型菌株和绿脓杆菌G型、D型和E型血清型菌株研制水貂出血性肺炎二联四价灭活疫苗,并进行临床初步应用,结果显示该疫苗在预防水貂因大肠杆菌和绿脓杆菌而引起的出血性肺炎具有良好的保护力。免疫水貂21日后,进行攻毒,5只水貂全部被保护,同时对临床上7000只水貂进行免疫,结果该疫苗无不良反应,并起到了很好的保护作用,免疫后水貂无出血性肺炎疾病发生。通过以上研究,我们明确了当前引起我国水貂出血性肺炎的主要病原体及其感染和流行情况,并对这些病原体的血清型和基因型以及致病性和耐药性均进行了鉴定,并研制了适合我国水貂出血性肺炎防控的多价灭活疫苗,为我国水貂出血性肺炎的防控提供了技术保障。
王冬雪[5]（2019）在《维氏气单胞菌TH0426 rpoN与rpoE基因缺失株的构建及功能的初探》文中研究表明维氏气单胞菌（Aeromonas veroni,A.veronii）是一种重要的人—兽—水生动物共患致病菌,研究显示近来毒力呈逐年上升趋势,已被越来越多的学者重视,但对于A.veronii毒力方面研究较少,对于毒力基因的研究有助于对A.veronii的致病机制的研究提供理论依据。对于rpoN基因的研究最早见于1985年,近年来有关rpoN的研究报道逐年增多,它能够控制多个功能基因的转录表达,包括氮代谢、逆迫应答、碳源利用、运动及毒力等基因的表达,在很多细菌中发挥至关重要的作用。因此试验选取rpoN基因作为敲除对象,应用基于自杀性质粒的同源重组技术分别构建A.veronii TH0426株rpoN的缺失株△rpoN,以及其互补株C-rpoN,并对上述菌进行部分生物学特性分析。结果显示,在生长曲线、溶血活性方面,三者未见明显区别;菌落形态上,缺失株△rpoN呈明显波浪状边缘,互补株C-rpoN恢复至野生株表面光滑,边缘整齐的状态;斑马鱼半数致死量测定结果显示缺失株△rpoN的LD50比野生株升高了22.9倍,小鼠的LD50升高3.06倍,毒力显着下降;生物被膜形成能力检测结果显示缺失株△rpoN较野生株而言减弱,相差11倍,回补株有所增强,但同样没有恢复到野生株水平;对细胞的黏附与侵袭和对EPC的毒性也有所下降;游动能力检测结果显示野生株TH0426有鞭毛,具有游动能力,而缺失株△rpoN的游动能力基本丧失,通过进一步鞭毛染色试验结果可观察到,野生株TH0426具有极性鞭毛,每个菌体有一根,而缺失株△rpoN未见明显鞭毛,互补株C-rpoN视野中存在少量断裂鞭毛。rpoE是菌体抵御外界不利环境下引起逆迫应答的关键因子,通过调控基因表达量来调控菌体活性,协助细菌产生御热应答,以此抵抗恶劣环境,对于菌体的生存有着至关重要的影响。因此依靠相同方法对rpoE进行敲除,通过生物学特性分析,结果显示缺失株△rpoE与野生株相比溶血活性无变化,菌落形态无明显变化,但生长速度较野生株慢;生物被膜检测缺失株△rpoE较野生株下降3.7倍;黏附与侵袭能力也较野生株下降,缺失株△rpoE对斑马鱼的LD50比野生株升高了82.3倍,小鼠的LD50升高了5.22倍;同样细胞毒性试验结果显示,缺失株△rpoE在对EPC的毒性明显弱于野生株TH0426;运动能力检测结果显示在半固体培养基中,缺失株△rpoE基本丧失运动能力,在鞭毛染色结果中△rpoE无明显鞭毛。综上所述,本试验通过构建A.veronii TH0426株rpoN和rpoE的缺失株及互补株并对其与野生株的生物学差异进行比对分析,推测rpoN和rpoE的功能,研究结果对于A.veronii致病机制的研究奠定基础。
张瑾[6]（2019）在《新生儿感染病原菌脑膜炎大肠杆菌与铜绿假单胞菌的免疫干预研究》文中进行了进一步梳理研究背景:感染是引起新生儿死亡及严重后遗症的主要原因之一。其中,新生儿细菌性脑膜炎病死率高,即便恢复亦伴发神经系统损伤后遗症,为家庭和社会造成严重的负担。大肠杆菌K1（Escherichia coli K1,E.coli K1）是引发新生儿细菌性脑膜炎的主要病原体,超过80%患者是由该菌感染所致。外膜蛋白A（Outer membrane A,OmpA）是E.coli K1的关键致病因子,其胞外Loops在E.coli K1抵抗免疫系统的损伤并引发菌血症、入侵血脑屏障导致颅内感染过程中发挥决定性的作用。新生儿感染性肺炎是新生儿期最常见的感染性疾病和重要死亡病因,即使感染控制后亦可造成不可逆损伤,严重影响大脑和身体发育。铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa,PA）是引起新生儿感染性肺炎的三大主要病原菌之一。PA致病因子繁多,其中外毒素A（Exotoxin A,ETA）是PA发现最早、毒力最强、也是最经典的毒力因子。它主要通过细胞识别、跨膜转位和催化活性等过程发挥其细胞的致死效应,在PA引起的新生儿感染性肺炎中发挥重要作用。随着E.coli K1和PA耐药日趋严重,常规抗感染治疗手段已捉襟见肘。因此选择合适的抗体是治疗PA,尤其对耐药PA感染的是有效替代疗法。历史经验证明:疫苗是预防与控制病原菌流行、感染及致病的最佳科学手段;抗体是中和病原菌毒素、治疗感染性疾病的特效药物。若能成功研制针对E.coli K1 OmpA和PA ETA的特异性疫苗或抗体药物,必将有效控制上述细菌的传播和致病。因此本研究针对新生儿常见病原菌Ecoli.K1和铜绿假单胞菌的严峻防控形势,研究新型疫苗和抗体为核心的免疫干预策略和药物,以期为预防新生儿感染的发生、提高其救治水平打下基础。第一部分基于脑膜炎大肠杆菌K1外膜蛋白A胞外功能片段的纳米粒疫苗的研制研究目的:本研究针对新生儿细菌性脑膜炎常见病原菌Ecoli.K1的严峻防控形势,针对其关键毒力因子OmpA研制新型疫苗,以期为预防新生儿Ecoli.K1脑膜炎的发生、提高其救治水平打下基础。研究方法:1.本课题拟在前期发现Vo抗原具有良好的免疫保护效果的基础上,以聚乳酸-羟基乙酸共聚物（Poly（1actide-CO-glycolide）PLGA）和壳聚糖（Chitosan,CS）为辅料,构建包裹Vo的纳米粒疫苗。以复乳溶剂挥发法和直接吸附法制备空白纳米粒,通过检测纳米粒的形态、粒径、分散性指数等重要参数,评价PLGA、丙酮、二氯甲烷及不同修饰方法对纳米粒的影响,筛选出空白纳米粒的最优处方;通过测定不同条件下纳米粒包裹Vo蛋白的包封率,获得最大载药量Vo纳米粒（Vo nanoparticles,VoNP）的最优处方;通过检测VoNP冻干前后的外观、形态学、粒径、电位、物理及化学稳定性等参数的变化,评价冻干工艺对VoNP质量的影响,获得VoNP的最佳制备工艺;按照最佳工艺制备VoNP,通过透射电镜、扫描电子显微镜和原子显微镜,粒度和电位分析仪,质谱仪等考察纳米粒疫苗的基本理化特征及其稳定性。2.以L929国家标准细胞毒性细胞为模型,评价VoNP的体外细胞毒性;以BALB/c小鼠为模型,肌肉注射VoNP后观察心、肝、脾、肺、肾组织病理改变,评价其体内毒性;将VoNP于0,7和14天三次免疫小鼠,检测血清中抗Vo特异性抗体的水平及类型,评价VoNP的免疫原性;致死剂量攻毒VoNP免疫后小鼠,观察小鼠生存率、体重变化情况评价VoNP的保护效果,亚致死剂量攻毒VoNP免疫后小鼠,观察脾、血细菌定植量,初步评价VoNP的免疫保护机制;将制备的VoNP4℃保存180天后按上述方法评价其免疫原性和免疫保护效果,与同样处理的Al（OH）3佐剂吸附的Vo疫苗相比较,评价VoNP长期稳定性。研究结果:1.纳米粒的最适配方为:以丙酮为溶剂壳聚糖修饰的PLGA纳米粒;VoNP的最大载药量为1mg,其包封率为59%;冻干过程（冷冻3h,干燥22小时）对VoNP的形态,粒径和分散性无明显影响;最佳工艺制备的VoNP的平均粒径为250.8±2.13 nm,分散性指数为0.09±0.01,电位为0.6110±0.0267 mV,VoNP呈球状、表面光滑,无明显聚集现象,分散性好;通过MALDI-TOF MS研究证实Vo蛋白在纳米粒疫苗中稳定存在;4℃放置180天的VoNP的粒径、分散性及Zeta电位未发生明显变化,稳定性良好。2.VoNP对L929细胞无明显细胞毒性作用;肌肉注射VoNP的BALB/c小鼠7天内无死亡及不良反应的发生情况,心、肝、脾、肺和肾脏器无明显病理组织学改变,表明VoNP对BALB/c小鼠无明显毒性作用;VoNP免疫小鼠后可引起较强的体液免疫应答反应,且其免疫应答类型以Th2型免疫应答为主。在攻毒保护实验中,VoNP的免疫能通过降低外周血及脾脏中的细菌定植,减轻体重变化等方式抵抗E.coli K1的感染,提高小鼠的生存率。通过动物实验证实长期保存（180天）VoNP不仅具有稳定的理化性质,且其免疫原性和免疫保护效果未见显着变化。表明,VoNP安全性较好,质量稳定。研究结论:本研究成功建立并优化了VoNP的制备工艺,获得了质量稳定、安全性较好的VoNP疫苗,动物实验表明该疫苗具有长期稳定的免疫原性和免疫保护效果,这些发现为进一步成功研发E.coli K1疫苗奠定了基础,并对促进新生儿脑膜炎E.coli K1感染的免疫干预策略研究具有重要的推动作用。第二部分抗外毒素A人免疫球蛋白在铜绿假单胞菌肺炎中的预防和治疗作用研究研究目的:本研究针对新生儿铜绿假单胞菌肺炎治疗的难题,研究以免疫球蛋白为核心的干预策略和药物,以期为预防新生儿PA感染的发生、提高其救治水平打下基础。研究方法:1.建立以Luminex技术为基础的抗ETA抗体浓度检测方法,检测320份健康的志愿者血清中ETA特异性抗体浓度;通过Protein A亲和层析法纯化含高效价ETA抗体的免疫球蛋白（Intravenous immunoglobulin,IVIG）;用L929细胞模型评价抗ETA抗体对ETA毒素的中和活性;对BALB/c小鼠腹腔注射抗ETA抗体,后予致死剂量的ETA攻毒小鼠,观察生存率、体温体重变化,评价抗ETA抗体的预防性保护效果,同时,通过亚致死剂量ETA攻毒小鼠,观察肝脏细胞因子及病理组织改变,探索其保护机制。2.BALB/c小鼠腹腔注射不同浓度的抗ETA抗体,1小时后致死剂量PA103菌气管注射攻毒小鼠,观察生存率、体温体重变化,评价抗ETA抗体的预防性保护效果,同时,通过亚致死剂量PA103菌攻毒小鼠,观察肺部细菌定植量和炎性病理改变,检测肺泡灌洗液中TNF-α和IL-1β的水平等参数,探索其保护机制;致死剂量PA103菌气管注射攻毒BALB/c小鼠3小时后,腹腔注射不同浓度的抗ETA抗体,观察生存率、体温体重变化,评价抗ETA抗体的治疗效果,同时,通过亚致死剂量PA103菌攻毒小鼠,观察肺部细菌定植量和炎性病理改变,检测肺泡灌洗液中TNF-α和IL-1β的水平等参数,探索其保护机制;将结合GST-ETA的固相载体与纯化得到含高效价抗ETA抗体IVIG共孵育,去除其中ETA特异性IgG,用上述方法评价其毒素中和活性,预防和治疗保护效果的变化,验证其保护效果的特异性。研究结果:1.本研究成功构建了表达ETA及其无毒突变体（mETA）的工程菌株,并纯化得到重组ETA毒素,其活性与天然毒素相当;建立了以Luminex技术为基础的抗ETA抗体浓度检测方法。检测320名健康志愿者血清中抗ETA抗体水平,发现抗ETA抗体平均浓度为98.7 ng/ml,最高可达918.24 ng/ml。其中血清抗ETA抗体浓度在099 ng/ml约占54%。通过Protein A亲和层析法,成功纯化得到含有高浓度抗ETA抗体的人免疫球蛋白,其SDS-PAGE纯度大于90%。2.通过L929细胞模型发现该抗ETA抗体能有效抑制ETA的细胞毒性,且具有浓度依赖的趋势;通过ETA毒素攻毒小鼠模型发现该抗体可阻断ETA导致的肝脏损伤,从而发挥良好保护效果;在急性PA肺部感染模型上发现,高效价的抗ETA免疫球蛋白可显着降低细菌在肺部的定植和炎症反应,从而发挥预防性及治疗性效应。此外,本研究发现单独使用兔抗ETA抗体或非特异性人IgGs亦可产生有限的保护效果。研究结论:本研究成功从健康的献血者中纯化得到高效价的抗ETA抗体的免疫球蛋白,其具有良好的毒素中和活性。动物实验发现该免疫球蛋白针对ETA毒素和PA急性肺部感染具有良好预防及治疗效果。这些结果为非抗生素预防和治疗PA肺部感染奠定了基础,对PA的防控提供了新的策略和方案,也为其它耐药细菌的免疫干预提供了范例。
陈伟芝[7]（2017）在《基于类弹性蛋白的纳米药物传输体系的设计及生物性能研究》文中认为由于基因工程和免疫疗法的发展,功能性多肽和蛋白质越来越多的用于肿瘤治疗领域的药物纳米传输系统。类弹性蛋白结构基于哺乳动物的原弹性蛋白,由VPGXG五肽序列重复组成,具有生物相容性好、生物可降解性、低免疫原性、药代动力学优良等一系列优势。更重要的是类弹性蛋白主要由大肠杆菌表达制得,而且可以通过自身的温度敏感可逆相变行为进行非色谱纯化,十分方便。利用基因重组技术,可以将几种功能性多肽片段或者蛋白质在基因水平融合,进而表达出具有多功能的融合蛋白。此外,改变基因编码,可以插入合适的活性位点,用于后期与小分子偶联。肿瘤细胞活动旺盛、生长迅速,因而形成了与正常组织和细胞不同的病理变化。主要表现为新生血管结构不完整,肿瘤血管渗透滞留增强、无氧代谢、细胞转化、生长失控、弱酸环境以及营养物质大量需求形成的肿瘤细胞表面相关受体的表达上调。利用肿瘤组织的微环境的特异性,可以实现药物的选择性靶向输送。本论文采用基因重组技术和分子生物学手段,构建了以类弹性蛋白为基础的纳米药物传输体系,并系统研究了他们的药物传输性能。具体内容如下:（1）利用原位自由基聚合合成了类弹性蛋白苯硼酸纳米粒子,透射电镜和扫描电镜显示其粒径均一,具有良好的球形形貌,动态光散射测得其水合粒径在100 nm左右。接着对纳米粒子的细胞摄取、细胞相容性以及3D细胞中的渗透情况进行了研究。其次,将纳米粒子负载上化疗药物阿霉素,考察了其体外释放情况和细胞毒性。最后在小鼠皮下H22肿瘤模型中评价载药纳米粒子的体内分布情况和抗肿瘤效果。（2）利用基因重组技术将anti-EGFR的纳米抗体和细胞穿膜肽iRGD与类弹性蛋白进行融合表达。圆二色谱测试显示融合蛋白保持了各部分的二级结构。进一步在细胞层面上,相对于类弹性蛋白,融合蛋白显示出优越的进细胞能力和3D细胞的穿透能力。其次在小鼠皮下CT-26肿瘤模型中,考察融合蛋白的体内分布情况和肿瘤的靶向能力以及与阿霉素共给药的抗肿瘤效果。（3）利用酸敏感的腙键将阿霉素偶联到融合蛋白上,形成双靶向蛋白大分子药物。动态光散射显示偶联体以分子状态存在。体外药物释放实验证实药物释放的酸敏感特性。进一步在细胞层面验证双靶向蛋白大分子药物对细胞的选择性以及细胞毒性。在小鼠皮下H22肿瘤模型中,相对于裸药,双靶向蛋白大分子药物达到降低了药物在正常组织中的分布,进而将药物的最大耐受量提高了 4倍,最终在体内抗肿瘤方面显示了显着的效果。
赵安娜[8]（2017）在《绿脓杆菌双组分调节系统NioS/NioR在皮肤感染中的功能机制研究》文中提出绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）是临床常见的条件性致病菌,当人体皮肤屏障功能受损及正常免疫功能低下时,多种组织器官易受绿脓杆菌感染,且此菌具有耐药性强和致死率高的特点。双组分调节系统（Two-component regulatory system,TCS）是原核生物占主导的信号传导系统,在细菌适应环境、发挥毒力等过程中行使重要的调控作用。然而,在皮肤感染过程中绿脓杆菌的双组分调节系统行使怎样的功能,以及对于它们如何调节致病性相关基因的表达从而促进绿脓杆菌引起皮肤感染的具体机制仍然知之甚少。本研究首先基于绿脓杆菌PA14的转座子突变文库的高通量测序（Tn-seq）技术,筛选绿脓杆菌皮肤伤口感染过程中致病性相关的双组分调节系统。实验发现在绿脓杆菌皮肤伤口感染的第1、3、5天内,共有684个基因可能与绿脓杆菌致病性相关,其中包含17个双组分调节系统基因。进一步选择影响最为显着的双组分调节系统PA 1432570/PA 1432580来研究其在绿脓杆菌皮肤伤口感染过程中的重要作用,将其命名为NioS/NioR。为了研究NioS/NioR在皮肤伤口感染过程中具体的功能机制,实验首先构建完成NioS/NioR基因敲除和回补菌株。通过小鼠伤口感染实验发现,NioS/NioR基因敲除菌株的感染能力明显下降,验证了 Tn-seq的结果,也确证NioS/NioR在绿脓杆菌皮肤感染中起着重要作用。为了研究双组分调节系统NioS/NioR是如何增强绿脓杆菌感染能力的,实验检测了绿脓杆菌生物膜这一衡量绿脓杆菌感染能力的重要指标,结果证明NioS/NioR可以调节绿脓杆菌生物膜的形成。进一步研究表明,NioS/NioR调控绿脓杆菌鞭毛介导的快速黏附于固相表面的能力,这是其生物膜形成的第一步。同时,通过测定其鞭毛依赖的群集运动能力,也佐证了NioS/NioR系统对绿脓杆菌鞭毛的影响。另一方面,巨噬细胞作为主要的先天免疫细胞,在机体识别并清除病原菌的过程中发挥巨大作用。研究发现NioS/NioR可以增强绿脓杆菌抵抗宿主巨噬细胞吞噬作用的能力,从而有助于其皮肤感染。进一步的实验数据表明,绿脓杆菌的抗吞噬能力得益于其通过NioS/NioR调节包括fliC、algD在内的多种抗吞噬相关基因的表达,也与NioS/NioR调控的生物膜形成相关。为了更全面深入地研究NioS/NioR系统是通过调节下游哪些毒性因子基因的表达,从而达到促进绿脓杆菌皮肤感染的目的,我们对NioS/NioR各基因敲除菌株和野生型菌株进行RNA-seq分析。数据表明,NioS/NioR调节包括绿脓杆菌反硝化作用、绿脓杆菌鳌铁蛋白的生物合成以及包括蛋白酶的表达等在内的57个毒力因子的表达。进一步实验证明NioS/NioR通过调节绿脓杆菌一氧化氮还原酶相关基因norB、norC等的表达,促进细菌降解巨噬细胞产生的一氧化氮,从而抵抗巨噬细胞的杀伤。综上所述,本研究通过Tn-seq技术筛选出绿脓杆菌致病性相关的新型双组分调节系统NioS/NioR,并证明NioS/NioR在皮肤感染过程中具有重要作用。一方面,NioS/NioR影响绿脓杆菌生物膜的形成,从而影响细菌致病性;另一方面,NioS/NioR增强绿脓杆菌抵抗巨噬细胞的吞噬作用来逃逸宿主的清除;第三方面,NioS/NioR促进绿脓杆菌降解巨噬细胞产生的一氧化氮,从而抵抗巨噬细胞的杀伤。此外NioS/NioR还通过调节绿脓杆菌鳌铁蛋白等其他多种毒性因子的表达来进一步增强绿脓杆菌的致病性。本课题的开展为系统了解绿脓杆菌引起皮肤感染的机制奠定初步的理论基础。
李爽[9]（2015）在《融合蛋白GTH作为基因转运载体的试验研究》文中指出本课题利用的重组蛋白GTH是一种新型,方便,稳定,安全性高,具有靶向性的基因转运载体。它由三部分基因融合表达而成:超嗜热古菌组蛋白HphA具有组蛋白生物学功能,能够与DNA稳定结合,降低限制性内切酶对DNA的降解作用;PEAⅡ为绿脓杆菌外毒素A的跨膜转运区,能够完成转运作用;GnRH为促性腺激素释放激素,起到导向作用。即蛋白GTH同时具有DNA结合,跨膜转运,结合受体功能,本实验通过一系列实验证明其活性。EMSA凝胶电泳迁移实验表明,融合蛋白GTH减慢DNA在琼脂糖凝胶中的迁移速率,即融合蛋白GTH可以与绿色荧光质粒PEGFP-C1结合;细胞转染实验证明融合蛋白GTH可以运载绿色荧光蛋白质粒进入Hela细胞,并在细胞中出现荧光表达:提取被转染细胞的总DNA,PCR检测证明质粒PEGFP-C1被携带进入细胞;利用抗HphA单克隆抗体进行细胞免疫组化实验,在被转染细胞内检测到蛋白GTH的HphA组分;如上诸多实验表明融合蛋白GTH具备结合DNA及转运的能力,适用于细胞DNA转运,有望成为临床用基因转运载体,对今后基因治疗有着不可替代的作用。
惠琦[10]（2014）在《靶向黑色素瘤重组免疫毒素MSH-PE38KDEL的表达、纯化及其靶向抗肿瘤生物学效应》文中认为恶性黑色素瘤是恶性肿瘤中发病率增长最快的一种，目前仍没有找到治疗转移性黑色素瘤最为有效的方法。重组毒素由于具有特异性高、细胞毒性强的特点，有望成为黑色素瘤（辅助）治疗的有效方法之一，特别是对转移性黑色素瘤的治疗可能是最好的方式。本研究利用恶性黑色素瘤细胞表面MC1R的结合位点为正常细胞及其它肿瘤的几十倍的巨大差异，并利用促黑色素细胞激素（Melanophore-stimulating hormone, α-MSH）可特异性的与恶性黑色素瘤表面的MC1R结合的特性，将α-MSH作为恶性黑色素瘤特异的靶向载体；将绿脓杆菌外毒素PE作为免疫毒素的毒性部分用于杀伤靶细胞，构建了重组毒素MSH-PE38KDEL，以基因工程方式表达黑色素瘤靶向免疫毒素。重组毒素MSH-PE38KDEL的构建与表达。本研究通过生物信息学分析，优化MSH与PE40的链接Linker，确保各自的结构与功能不受影响；然后对PE40进行修饰，降低其免疫原性（PE38），并增加其活性（PE38KDEL）；构建了MSH-PE38KDEL基因，将其连接到pET28a、pHis1525表达载体上，构建了pET28a-MSH-PE38KDEL、 pHis1525-MSH-PE38KDEL重组质粒，分别在Rosegami、WH320表达宿主菌内进行了表达，经SDS-PAGE分析及活性测定，最终筛选了高表达且具有生物活性的重组质粒pET28a-MSH-PE38KDEL。将序列鉴定正确的重组质粒转化入Rosetta-gamiTM2（DE3），IPTG诱导目的蛋白表达。以SDS-PAGE对表达产物进行鉴定。同时用凝胶成像分析系统配套软件对MSH-PE38KDEL融合蛋白的表达量进行分析，证明其表达量可占全菌体的10%。重组毒素MSH-PE38KDEL的纯化。利用Western blot对超声破碎后菌体进行分析证明融合蛋白为可溶性表达。对表达后蛋白采用了菌体超声破碎、离心、疏水层析、离子交换及分子筛层析等纯化手段， SDS-PAGE分析MSH-PE38KDEL的纯度，其纯度可达90%以上。重组毒素MSH-PE38KDEL的体外抗黑色素瘤活性。采用α-MSH受体高表达的人黑色素瘤A875细胞及鼠黑色素瘤B16细胞进行了体外生物活性试验，同时以α-MSH受体低表达的鼻咽癌细胞CNE、乳腺癌细胞MCF及人正常细胞2BS做对照，证明其靶向杀伤作用。MTT检测MSH-PE38KDEL对黑色素瘤细胞A875及B16的杀伤作用在85%以上，而对人正常细胞2BS无杀伤作用。重组毒素MSH-PE38KDEL的体内抗黑色素瘤活性。以鼠黑色素瘤B16细胞在NIH/nu裸鼠体内建立黑色素瘤高转移动物模型。采用了瘤周围注射及静脉注射两种给药途径，对荷瘤小鼠进行治疗。结果显示以MSH-PE38KDEL1.1mg/只连续注射10天，可显着抑制肿瘤生长，其抑瘤率＞90%，且瘤周注射组肿瘤消失率为30%，静脉注射组肿瘤消失率为40%。病理切片HE染色结果显示MSH-PE38KDEL有效抑制了黑色素瘤B16细胞的肝内转移；电镜观察肝脏超微结构结果显示，MSH-PE38KDEL抑制了黑色素瘤B16细胞对机体细胞的破坏作用。重组毒素MSH-PE38KDEL在体内具有明显的抗黑色素瘤的效应，毒副作用低，病理及电镜结果显示对实质脏器均未见损伤。MSH-PE38KDEL有望成为靶向治疗黑色素瘤的候选药物。
二、绿脓杆菌外毒素A的细胞毒性和细胞表面受体密度（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、绿脓杆菌外毒素A的细胞毒性和细胞表面受体密度（论文提纲范文）
（1）H9N2流感病毒与绿脓杆菌共感染致水貂出血性肺炎的病程演化研究（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 病毒-细菌共感染 |
| 1.1.1 病毒-细菌共感染的研究进展 |
| 1.1.2 共感染的致病机制 |
| 1.2 H9N2 流感病毒的研究进展 |
| 1.2.1 病原学 |
| 1.2.2 流行病学 |
| 1.2.3 致病机制 |
| 1.3 绿脓杆菌的研究进展 |
| 1.3.1 病原学 |
| 1.3.2 流行病学 |
| 1.3.3 致病机制 |
| 1.4 水貂共感染的研究进展 |
| 1.4.1 水貂简介 |
| 1.4.2 水貂感染绿脓杆菌的情况 |
| 1.4.3 水貂感染流感的情况 |
| 1.4.4 水貂共感染的概况 |
| 1.5 目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病毒和细菌 |
| 2.1.2 血清 |
| 2.1.3 鸡胚 |
| 2.1.4 实验动物 |
| 2.1.5 仪器和试剂 |
| 2.1.6 引物设计 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病毒的EID50 测定 |
| 2.2.1.1 H9N2 IAV的增殖 |
| 2.2.1.2 红细胞凝集试验 |
| 2.2.1.3 H9N2 IAV的 EID50 测定 |
| 2.2.2 细菌悬液的制备 |
| 2.2.2.1 细菌复苏与纯化 |
| 2.2.2.2 细菌的CFU测定 |
| 2.2.3 H9N2 IAV的 HA基因荧光定量PCR(qRT-PCR)检测方法的建立 |
| 2.2.3.1 HA基因引物设计 |
| 2.2.3.2 病毒RNA的提取 |
| 2.2.3.3 c DNA合成 |
| 2.2.3.4 PCR扩增 |
| 2.2.3.5 PCR产物的克隆 |
| 2.2.3.6 阳性质粒DNA的提取 |
| 2.2.3.7 荧光定量PCR反应条件的优化 |
| 2.2.3.8 荧光定量PCR标准曲线的建立 |
| 2.2.3.9 荧光定量PCR的特异性试验 |
| 2.2.3.10 荧光定量PCR的敏感性试验 |
| 2.2.3.11 荧光定量PCR的重复性试验 |
| 2.2.4 绿脓杆菌攻毒剂量的选择 |
| 2.2.5 共感染水貂的致病性试验 |
| 2.2.5.1 临床检查 |
| 2.2.5.2 肺组织病理学病变 |
| 2.2.5.3 肺组织细胞凋亡 |
| 2.2.5.4 排毒检测 |
| 2.2.5.5 病毒的分布与载量 |
| 2.2.5.6 细菌的分布与载量 |
| 2.2.5.7 抗H9N2 抗体检测 |
| 2.2.5.8 细胞因子测定 |
| 2.2.6 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 病毒的EID_(50)测定 |
| 3.2 细菌悬液的制备 |
| 3.3 H9N2 IAV的 HA基因qRT-PCR检测方法的建立 |
| 3.3.1 荧光定量PCR引物特异性 |
| 3.3.2 荧光定量PCR反应条件的优化 |
| 3.3.3 荧光定量PCR检测HA基因标准曲线的建立 |
| 3.3.4 荧光定量PCR特异性试验结果 |
| 3.3.5 荧光定量PCR敏感性试验结果 |
| 3.3.6 荧光定量PCR重复性试验结果 |
| 3.4 绿脓杆菌攻毒剂量的选择 |
| 3.5 水貂共感染试验结果 |
| 3.5.1 临床体征 |
| 3.5.2 共感染加剧了肺组织病理学病变 |
| 3.5.3 共感染导致肺组织更明显的细胞凋亡 |
| 3.5.4 排毒结果 |
| 3.5.5 H9N2 病毒在水貂中的分布与载量 |
| 3.5.6 肺中绿脓杆菌的清除延迟 |
| 3.5.7 抗H9N2 抗体效价 |
| 3.5.8 细胞因子测定 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（2）新型免疫毒素降低非特异性毒性的设计与研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语 |
| 第一章 绪论 |
| 1.免疫毒素及其研究进展 |
| 2.免疫毒素的作用机制 |
| 2.1 植物毒素的作用机制 |
| 2.2 细菌毒素的作用机制 |
| 2.3 人源毒素的作用机制 |
| 3.免疫毒素的制备方法 |
| 3.1 化学偶联法 |
| 3.2 基因融合法 |
| 4.免疫毒素的缺陷及解决方法 |
| 4.1 借助蛋白内含肽设计两段式免疫毒素降低非特异毒性 |
| 4.2 设计抗原屏蔽型免疫毒素降低非特异性毒性 |
| 第二章 新型两段式免疫毒素的制备与鉴定 |
| 1.前言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 菌株、细胞和质粒 |
| 2.2 实验物品和试剂 |
| 2.3 实验仪器与设备 |
| 2.4 实验相关溶液 |
| 2.5 表达载体的构建 |
| 2.6 重组蛋白的表达 |
| 2.7 目的蛋白的纯化 |
| 2.8 细胞毒性的检测 |
| 2.9 体外反式剪接反应 |
| 3.结果 |
| 3.1 两段式免疫毒素的制备策略 |
| 3.2 构建免疫毒素表达载体 |
| 3.3 免疫毒素的表达与纯化 |
| 3.4 免疫毒素的细胞毒性 |
| 3.5 两段式免疫毒素的载体构建 |
| 3.6 两段式免疫毒素的表达 |
| 3.7 两段式免疫毒素的纯化 |
| 3.8 体外蛋白反式剪接反应 |
| 4.讨论 |
| 第三章 新型两段式免疫毒素的活性检测 |
| 1.前言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 细胞及其培养条件 |
| 2.2 实验试剂和仪器 |
| 2.3 抗原亲和力分析 |
| 2.4 细胞摄取分析 |
| 2.5 细胞毒性检测 |
| 2.6 细胞凋亡检测 |
| 3.结果 |
| 3.1 两段式免疫毒素的抗原结合活性 |
| 3.2 两段式免疫毒素的细胞摄取 |
| 3.3 两段式免疫毒素的细胞毒性 |
| 3.4 两段式免疫毒素诱导细胞凋亡 |
| 4.讨论 |
| 第四章 抗原屏蔽型免疫毒素的制备与验证 |
| 1.前言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 菌株、质粒和细胞 |
| 2.2 实验材料和试剂 |
| 2.3 实验仪器和设备 |
| 2.4 实验相关溶液配制 |
| 2.5 表达载体的构建 |
| 2.6 重组蛋白的表达 |
| 2.7 目的蛋白的纯化 |
| 2.8 体外反式剪接反应 |
| 2.9 体外酶切反应 |
| 2.10 抗原结合亲和力检测 |
| 2.11 细胞毒性检测 |
| 3.结果 |
| 3.1 表达载体的构建 |
| 3.2 抗体片段的表达与分析 |
| 3.3 毒素片段的表达和鉴定 |
| 3.4 抗体片段的纯化 |
| 3.5 毒素片段的纯化 |
| 3.6 免疫毒素的生成 |
| 3.7 免疫毒素的纯化 |
| 3.8 免疫毒素的体外活化 |
| 3.9 免疫毒素抗原亲和力检测 |
| 3.10 免疫毒素细胞毒性检测 |
| 4.讨论 |
| 第五章 抗原屏蔽型免疫毒素体内药效学评价 |
| 1.前言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 细胞和动物 |
| 2.2 实验物品和试剂 |
| 2.3 实验仪器和设备 |
| 2.4 实验相关溶液配制 |
| 2.5 肿瘤细胞培养 |
| 2.6 小鼠皮下接种 |
| 2.7 体内药效研究 |
| 2.8 肿瘤分布研究 |
| 2.9 非特异性毒性评价 |
| 3.结果 |
| 3.1 免疫毒素的抑瘤作用 |
| 3.2 免疫毒素的肿瘤分布 |
| 3.3 免疫毒素的非特异性毒性 |
| 4.讨论 |
| 第六章 结论与展望 |
| 1.研究总结 |
| 2.特色与创新 |
| 3.课题展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 攻读博士学位期间申请的专利 |
| 致谢 |
（3）貂源铜绿假单胞菌的分离鉴定及△Hsp33缺失株的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 铜绿假单胞菌毒力因子研究进展 |
| 1.1 群体感应系统 |
| 1.2 外毒素A |
| 1.3 鞭毛 |
| 1.4 内毒素 |
| 1.5 生物被膜 |
| 1.6 铁离子 |
| 1.7 分泌系统 |
| 1.8 胞外毒性产物 |
| 1.9 其他毒素 |
| 第二章 细菌基因组学 |
| 第三章 细菌基因敲除技术 |
| 3.1 Red同源重组技术 |
| 3.2 ZFN技术 |
| 3.3 TALEN技术 |
| 3.4 CRISPR/Cas技术 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 铜绿假单胞菌的分离鉴定及免疫效果评价 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 貂源铜绿假单胞菌强弱毒株基因组学分析 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 铜绿假单胞菌HY-1 Hsp33 基因功能的分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（4）水貂绿脓杆菌和大肠杆菌二联四价灭活疫苗的研制及初步应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 水貂养殖业的发展现状及面临问题 |
| 1.1 水貂养殖业发展现状 |
| 1.2 水貂疫病情况 |
| 1.3 总结 |
| 第二章 水貂出血性肺炎的研究进展 |
| 2.1 流行病学 |
| 2.2 发病机制和病理变化 |
| 2.3 病原微生物分离鉴定 |
| 2.4 总结 |
| 第三章 绿脓杆菌和大肠杆菌的研究进展及耐药性 |
| 3.1 一般特性 |
| 3.2 绿脓杆菌和大肠杆菌的分型 |
| 3.3 毒力因子 |
| 3.4 耐药性 |
| 3.5 总结 |
| 第四章 水貂出血性肺炎疫苗的研究进展 |
| 4.1 灭活疫苗 |
| 4.2 亚单位疫苗 |
| 4.3 总结 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 水貂出血性肺炎病原菌的分离鉴定及致病性与耐药性分析 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果与分析 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 绿脓杆菌和大肠杆菌分离株血清型和基因型鉴定 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 水貂出血性肺炎二联四价灭活疫苗的研制 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（5）维氏气单胞菌TH0426 rpoN与rpoE基因缺失株的构建及功能的初探（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 维氏气单胞菌研究进展 |
| 1.1 维氏气单胞菌概述 |
| 1.2 维氏气单胞菌国内外流行现状 |
| 1.3 维氏气单胞菌的毒力因子 |
| 1.4 A.veronii的临床表现 |
| 第二章 RpoN的发现及功能初探 |
| 2.1 RpoN在氮源调控的研究 |
| 2.2 RpoN在碳源调控的研究 |
| 2.3 调节细菌运动能力 |
| 2.4 调控生物被膜合成及毒力相关 |
| 2.5 RpoN蛋白表达调控的研究 |
| 第三章 RpoE研究进展 |
| 3.1 rpoE基因调控机体逆迫应答机制 |
| 3.2 rpoE基因调控毒力 |
| 第四章 基因敲除研究进展 |
| 4.1 同源重组技术构建缺失株 |
| 4.2 CRISPR/Cas9技术构建缺失株 |
| 4.3 随机插入法构建缺失株 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 维氏气单胞菌rpoN缺失株构建及生物学特性的分析 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 维氏气单胞菌rpoE缺失株构建及生物学特性分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（6）新生儿感染病原菌脑膜炎大肠杆菌与铜绿假单胞菌的免疫干预研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 基于脑膜炎大肠杆菌K1外膜蛋白A胞外功能片段的纳米粒疫苗的研制 |
| 前言 |
| 第一节 纳米粒疫苗制备及质量评价 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 实验小结 |
| 第二节 纳米粒疫苗保护效果评价及机制研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 实验小结 |
| 5 讨论 |
| 第二部分 抗外毒素A人免疫球蛋白在铜绿假单胞菌肺炎中的预防和治疗作用研究 |
| 前言 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 实验小结 |
| 5 讨论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间的研究成果及发表的学术论文目录 |
（7）基于类弹性蛋白的纳米药物传输体系的设计及生物性能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.前言 |
| 2.类弹性蛋白 |
| 2.1 ELPs单聚体 |
| 2.2 ELPs胶束 |
| 2.3 ELPs的热靶向 |
| 2.4 ELPs凝胶 |
| 3.纳米抗体 |
| 3.1 纳米抗体与癌症治疗 |
| 3.1.1 纳米抗体直接用作拮抗剂 |
| 3.1.2 纳米抗体与活性分子连接 |
| 3.1.3 纳米抗体修饰的药物传输体系 |
| 3.2 纳米抗体与体内医学成像 |
| 4.其他靶向配体 |
| 5.现存的蛋白纳米药物传输体系存在的问题 |
| 6.本论文的主要内容及创新点 |
| 6.1 本论文的主要内容 |
| 6.2 本论文的创新之处 |
| 参考文献 |
| 第二章 含苯硼酸的类弹性蛋白纳米粒子药物传输系统 |
| 1.前言 |
| 2.实验部分 |
| 2.1 实验材料、细胞系以及动物 |
| 2.2 实验仪器 |
| 2.3 基因编码合成ELP |
| 2.3.1 含ELP基因的重组质粒构建 |
| 2.3.2 ELP的表达纯化 |
| 2.4 ELP-PAPBA纳米粒子的合成 |
| 2.4.1 N-3-丙烯酰胺氨基苯硼酸(APBA)的合成 |
| 2.4.2 ELP-PAPBA纳米粒子的合成 |
| 2.5 载药量和包封效率 |
| 2.6 药物的体外释放 |
| 2.7 FITC和NIR-797标记的纳米粒子的制备 |
| 2.8 体外细胞毒性 |
| 2.9 体外细胞摄取 |
| 2.10 3D细胞中的渗透 |
| 2.11 活体近红外成像 |
| 2.12 肿瘤组织中的渗透 |
| 2.13 体内分布 |
| 2.14 体内抗肿瘤效果 |
| 3.结果与讨论 |
| 3.1 ELP和ELP-PAPBA纳米粒子的合成 |
| 3.2 体外药物释放 |
| 3.3 细胞毒性和细胞摄取 |
| 3.4 在SH-SY5Y 3D细胞中的渗透 |
| 3.5 实时近红外成像 |
| 3.6 肿瘤组织的渗透 |
| 3.7 体内分布 |
| 3.8 体内抗肿瘤效果 |
| 4.结论 |
| 参考文献 |
| 第三章 联合使用双靶向融合蛋白增强阿霉素的抗肿瘤效果 |
| 1.前言 |
| 2.实验部分 |
| 2.1 实验材料以细胞、动物 |
| 2.2 主要实验仪器 |
| 2.3 重组质粒的构建 |
| 2.4 蛋白表达与纯化 |
| 2.5 蛋白性质表征 |
| 2.6 癌细胞的EGFR表达量分析 |
| 2.7 FITC和NIR-797标记的蛋白质的制备 |
| 2.8 细胞毒性实验 |
| 2.9 细胞摄取 |
| 2.10 3D细胞中的渗透 |
| 2.11 实时近红外成像 |
| 2.12 肿瘤组织中的渗透 |
| 2.13 体内分布 |
| 2.14 体内抗肿瘤 |
| 3.结果与讨论 |
| 3.1 三种蛋白质的表征 |
| 3.2 细胞毒性实验 |
| 3.3 细胞摄取实验 |
| 3.4 3D细胞中的渗透 |
| 3.5 实时近红外成像 |
| 3.6 肿瘤组织的渗透 |
| 3.7 体内分布 |
| 3.8 体内抗肿瘤效果 |
| 4.本章小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 双靶向融合蛋白大分子药物的合成及其抗肿瘤效果 |
| 1.前言 |
| 2.实验部分 |
| 2.1 实验材料以细胞、动物 |
| 2.2 实验仪器 |
| 2.3 重组质粒构建与蛋白表达 |
| 2.4 腙键DOX的合成 |
| 2.4.1 2-羧乙基2'-吡啶基二硫化物的合成 |
| 2.4.2 3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酰肼基甲酸叔丁酯的合成 |
| 2.4.3 3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酰肼的合成 |
| 2.4.4 3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酰肼阿霉素的合成 |
| 2.5 双靶向融合蛋白大分子药物的合成 |
| 2.6 双靶向融合蛋白大分子药物的表征 |
| 2.7 药物的体外释放 |
| 2.8 细胞毒性实验 |
| 2.9 细胞摄取 |
| 2.10 实时近红外成像 |
| 2.11 肿瘤组织中的渗透 |
| 2.12 体内分布 |
| 2.13 最大耐受剂量 |
| 2.14 体内抗肿瘤 |
| 3.结果与讨论 |
| 3.1 双靶向融合蛋白大分子药物的合成与表征 |
| 3.2 药物的体外释放 |
| 3.3 细胞毒性实验 |
| 3.4 细胞摄取 |
| 3.5 实时近红外成像 |
| 3.6 肿瘤组织的渗透 |
| 3.7 体内分布 |
| 3.8 最大耐受剂量 |
| 3.9 体内抗肿瘤效果 |
| 4.本章小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 今后的工作及展望 |
| 已发表论文 |
| 致谢 |
（8）绿脓杆菌双组分调节系统NioS/NioR在皮肤感染中的功能机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 综述 |
| 1.绿脓杆菌与皮肤感染 |
| 2.绿脓杆菌的致病机制 |
| 2.1 绿脓杆菌的毒力因子 |
| 2.2 绿脓杆菌的双组分调控系统 |
| 2.3 绿脓杆菌的抗吞噬能力 |
| 2.4 Tn-seq技术在寻找致病菌毒力因子中的作用 |
| 第二章 绿脓杆菌双组分调控系统NioS/NioR在皮肤感染中的功能机制 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 Tn-seq分析皮肤感染中绿脓杆菌PA14致病性相关的毒力因子 |
| 3.2 绿脓杆菌皮肤感染中致病性相关双组分调节系统的筛选 |
| 3.3 绿脓杆菌双组分调节系统NioS/NioR调节绿脓对小鼠皮肤的感染 |
| 3.4 NioS/NioR调节绿脓杆菌致病性相关表型特征 |
| 3.5 NioS/NioR增强绿脓杆菌抵抗巨噬细胞的吞噬作用 |
| 3.6 双组分调节系统NioS/NioR影响多种毒力基因的表达 |
| 3.7 双组分调节系统NioS/NioR调节绿胺杆菌抵抗一氧化氮的杀伤 |
| 4.讨论 |
| 5.总结 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
（9）融合蛋白GTH作为基因转运载体的试验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 促性腺激素释放激素，绿脓杆菌外毒素A，超嗜热古菌HphA及融合蛋白GTH（GnRH-PEAⅡ-HphA）的构建 |
| 1.1 促性腺激素释放激素及其受体 |
| 1.2 绿脓杆菌外毒素A（PEA） |
| 1.3 超嗜热古菌组蛋白HphA |
| 1.4 融合蛋白GTH（GnRH-PEAⅡ-HphA）基因的构建 |
| 第二章 基因载体与基因治疗研究现状 |
| 2.1 基因治疗 |
| 2.2 基因治疗载体 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 绿色荧光质粒PEGFP-C1的提取和纯化 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 融合蛋白GTH纯化样品的制备 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 凝胶电泳迁移实验（EMSA） |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 高滴度抗HphA单抗制备与纯化 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 融合蛋白GTH介导绿色荧光质粒转染细胞实验 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（10）靶向黑色素瘤重组免疫毒素MSH-PE38KDEL的表达、纯化及其靶向抗肿瘤生物学效应（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 黑色素瘤研究进展 |
| 1.1 我国黑色素瘤发生情况 |
| 1.2 恶性黑色素瘤的转移途径及发生机制 |
| 1.3 黑色素瘤的治疗 |
| 1.4 免疫毒素用于黑色素瘤治疗的展望 |
| 第2章 免疫毒素的研究进展 |
| 2.1 免疫毒素的概念及策略 |
| 2.2 免疫毒素的研究历程 |
| 2.3 重组免疫毒素靶向分子的选择 |
| 2.4 重组免疫毒素毒素配体的设计及作用机制 |
| 2.5 重组免疫毒素在肿瘤治疗中的研究 |
| 2.6 重组免疫毒素治疗实体瘤的研究进展 |
| 2.7 重组免疫毒素研发及应用的瓶颈 |
| 第3章 PE 类重组免疫毒素的研究进展 |
| 3.1 PE 的结构与功能 |
| 3.2 PE 的细胞毒性机制 |
| 3.3 PE 衍生物 |
| 3.4 PE 衍生物基因重组免疫毒素的研究进展 |
| 3.5 PE 类毒素在肿瘤导向中的应用 |
| 第4章 促黑色素细胞激素及其受体研究进展 |
| 4.1 促黑色素细胞激素及其受体 |
| 4.2 以促黑色素细胞激素为靶向载体的重组毒素的研究进展 |
| 4.3 促黑色素细胞激素及其受体在人类疾病中的作用 |
| 4.4 促黑色素细胞激素为导向的研究策略 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 MSH-PE38KDEL 在巨大芽孢杆菌中的表达及活性测定 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 MSH-PE38KDEL 在大肠杆菌中的表达及活性测定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 MSH-PE38KDEL 的表达、纯化及鉴定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 MSH-PE38KDEL 对黑色素瘤细胞生长的抑制作用 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 MSH-PE38KDEL 对鼠黑色素瘤模型的治疗试验 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 攻读学位期间发表的学术论文及取得的成果 |
| 致谢 |
四、绿脓杆菌外毒素A的细胞毒性和细胞表面受体密度（论文参考文献）
- [1]H9N2流感病毒与绿脓杆菌共感染致水貂出血性肺炎的病程演化研究[D]. 张伯顺. 山东农业大学, 2020(12)
- [2]新型免疫毒素降低非特异性毒性的设计与研究[D]. 王静. 上海交通大学, 2019(06)
- [3]貂源铜绿假单胞菌的分离鉴定及△Hsp33缺失株的构建[D]. 吕娇. 吉林农业大学, 2019(03)
- [4]水貂绿脓杆菌和大肠杆菌二联四价灭活疫苗的研制及初步应用[D]. 张海威. 吉林农业大学, 2019(03)
- [5]维氏气单胞菌TH0426 rpoN与rpoE基因缺失株的构建及功能的初探[D]. 王冬雪. 吉林农业大学, 2019
- [6]新生儿感染病原菌脑膜炎大肠杆菌与铜绿假单胞菌的免疫干预研究[D]. 张瑾. 重庆医科大学, 2019(01)
- [7]基于类弹性蛋白的纳米药物传输体系的设计及生物性能研究[D]. 陈伟芝. 南京大学, 2017(01)
- [8]绿脓杆菌双组分调节系统NioS/NioR在皮肤感染中的功能机制研究[D]. 赵安娜. 华东师范大学, 2017(05)
- [9]融合蛋白GTH作为基因转运载体的试验研究[D]. 李爽. 吉林农业大学, 2015(04)
- [10]靶向黑色素瘤重组免疫毒素MSH-PE38KDEL的表达、纯化及其靶向抗肿瘤生物学效应[D]. 惠琦. 吉林大学, 2014(09)