一、应用改进消化法检测冷冻猪肉中旋毛虫（论文文献综述）
李健[1]（2021）在《应用表面增强拉曼光谱和上转换发光免疫层析技术检测旋毛虫的研究》文中进行了进一步梳理旋毛虫（Trichinella spiralis,T.spiralis）是一种人兽共患食源性寄生虫,生食或半生食含有旋毛虫的猪肉及其产品是人类感染旋毛虫的主要方式,因感染旋毛虫而引起的疾病被称为旋毛虫病（Trichinellosis）,该病呈世界性分布且严重威胁人类健康和公共安全,因此,猪旋毛虫检测被列为屠宰必检项目。目前使用的旋毛虫检测方法存在技术短板,无法满足对日常养殖和现代化屠宰加工过程中,猪体内旋毛虫的监测。因此,针对现代化大型养殖和屠宰场研发一种快速、灵敏的旋毛虫现场检测方法,对于旋毛虫病防控具有重要意义。本研究基于表面增强拉曼光谱（Surface-enhanced Raman spectroscopy,SERS）和上转换发光免疫层析法（Upconversion phosphor immunochromatography assay,UCP-ICA）建立旋毛虫快速检测体系,为研发适用于现代化大型养殖和屠宰场的旋毛虫检测方法奠定基础,具体研究内容和结果如下:1.基于SERS建立旋毛虫检测方法。利用盐酸羟胺还原硝酸银,制备银纳米溶胶,测试其拉曼光谱增强性能及其对实验样品的影响。20只Wistar大鼠口服感染旋毛虫肌幼虫（Muscle larvae,ML）（3500条/只）,并设平行空白对照组（20只Wistar大鼠）。收集血清,采用激光共聚焦显微拉曼光谱仪采集未感染的血清及感染后28天血清的SERS,对SERS进行去荧光背景及面积归一化处理。比较SERS变化以及通过多元统计分析,如主成分分析（Principal component analysis,PCA）和线性判别分析（Linear discriminant analysis,LDA）,分析SERS并建模。结果表明,所制备的银纳米溶胶颗粒直径约为25 nm,大小均匀,纯度高,且具有良好的拉曼光谱增强效果。感染组和对照组在未感染旋毛虫时的血清拉曼光谱无显着差异;第28天,两组的血清拉曼光谱出现显着差异。通过PCA结合LDA构建诊断算法,发现该方法灵敏度为87.5%,特异度为94.7%,正确度为91.4%。基于以上结果,将银纳米胶体的SERS与PCA和LDA相结合,有望实现大规模、现场、快速、无标记、高准确检测,在旋毛虫病防控方面具有巨大的应用潜力。2.基于UCP-ICA建立旋毛虫免疫层析检测法。将旋毛虫排泄分泌抗原（Excretorysecretory antigens,ES）、山羊抗兔Ig G与上转换发光纳米颗粒（Upconversion nanoparticles,UCNPs）共价偶联,以山羊抗猪Ig G（800 ng/条）与兔抗山羊Ig G（200 ng/条）喷于硝酸纤维素薄膜（Nitrate cellulose sheet,NC sheet）上,分别作为检查带（T线）与质控带（C线）,并且命名该方法为旋毛虫上转换发光免疫层析法（T.spiralis upconversion phosphor immunochromatography assay,Ts-UCP-ICA）。Ts-UCP-ICA优化后的最佳血清稀释倍数为1:150、最佳样品处理液为100 m M HEPES p H 7.5,270 m M Na Cl,0.5%v/v Tween-20,1%v/v BSA。通过检测169份阴性猪血清,确定Ts-UCP-ICA的低特异度cut-off值为0.1906（T/C ratio）,高特异度cut-off值为0.3233。检测猪囊尾蚴、亚洲带绦虫幼虫以及弓形虫感染后的猪血清样本,结果显示,Ts-UCP-ICA特异性良好,均未发生交叉反应。检测感染100、1000、10000 ML猪血清,发现三个剂量分别在第35、30、25天可检出阳性。Ts-UCP-ICA单盲测试（Single-blinded assay）55份猪血清,使用低特异度cut-off值时,检测特异度和灵敏度均100%,使用高特异度cut-off值时,检测特异度为100%和灵敏度为80%。该方法与人工消化法的检测总符合率为87.27%,一致性系数（Kappa值）为0.7454,稳定性为4℃保存6个月有效。本论文建立的两种旋毛虫检测方法,构成“旋毛虫快速检测体系”。基于SERS建立的旋毛虫检测法具有检测速度快,高通量的特点,适合大规模样本筛查;而基于UCP-ICA建立的旋毛虫检测方法可用于可疑血清进一步确定。该检测体系可提高检测效率和检测效果,进一步提升旋毛虫流行病学调查、畜牧养殖及屠宰即时检测水平,为旋毛虫病防控提供技术保障。
杨小迪,徐常艳,王舒颖,高宏宇,梁金宝[2]（2020）在《我国旋毛虫病流行病学诊断治疗及防治措施研究进展》文中提出旋毛虫病是一种呈世界性分布的人兽共患寄生虫病,人和多种动物（包括肉食动物、草食动物甚至某些禽鸟类）均可被感染,人因生食或半生食含有活幼虫囊包的肉类或肉制品而感染。在中国,该病主要流行于西南、东北和中原地区,危害人数多、社会影响大。该病暴发所导致的突发性公共卫生事件,严重威胁着人民健康和社会稳定。本文就我国旋毛虫病流行状况、诊断、治疗和防控措施等作一概述,旨在为进一步做好我国旋毛虫病防治工作提供参考。
刘佳璇[3]（2020）在《旋毛虫ELISA检测方法的建立及其血清流行病学的应用研究》文中研究指明目的采用旋毛虫肌幼虫排泄分泌物（ES）作为包被抗原,建立酶联免疫吸附试验（ELISA）检测方法,检测小鼠血清中的IgG和IgM抗体,为旋毛虫病的诊断提供依据。建立人血清中旋毛虫抗体ELISA检测方法,并将此法应用于郑州献血人群旋毛虫抗体筛查,分析郑州市献血人群中旋毛虫病的流行现状,为做好旋毛虫病的防控工作提供策略支持和理论参考依据。方法收集旋毛虫肌幼虫抗原,并绘制蛋白定量标准曲线,测得所提取的抗原浓度,应用棋盘滴定法选择最佳抗原包被浓度,血清稀释度,酶结合物稀释度,以及其他最适宜的反应条件,分别建立起IgM和IgG抗体的ELISA检测方法。最后评价该方法的准确性、敏感性、特异性及重复性。建立人血清中旋毛虫抗体的ELISA检测方法并检测5836人份献血人群中的旋毛虫感染率,对阳性者进行电话回访,按区域、年龄、性别、学历、职业、饮食及卫生习惯等进行分类统计,对献血人群中流行情况进行分析研究。结果旋毛虫ELISA方法的建立结果。1)通用参数优化:封闭剂为5%脱脂奶粉,封闭时间为120min;显色剂四甲基联苯胺浓度为0.4g/L;血清一抗、酶标二抗以及底物显色反应时间依次为:60min、30min、30min。2)检测鼠旋毛虫IgG参数为:ES抗原包被浓度为1μg/ml,被检血清最佳稀释度为1:100,羊抗鼠IgG酶标抗体稀释度为1:6000。临界值Cut off=0.21。在特异性实验中未出现假阳性,重复性小于15%,准确度达100%,敏感性达到1:3200。3)检测鼠旋毛虫IgM参数为:ES抗原包被浓度为1μg/ml、被检血清稀释度为1:100,羊抗鼠IgM酶标抗体稀释度为1:2500。临界值Cut off=0.25。4)检测人旋毛虫IgG参数优选为:ES抗原包被浓度0.77μg/ml,羊抗人IgG酶标抗体浓度为1:2000,血清稀释度1:20,临界值Cut off=0.16。献血人群旋毛虫流行病学调查结果。检测郑州市献血者5836人,旋毛虫抗体阳性59人,阳性率为1.01%。不同区域之间旋毛虫抗体阳性率差异有统计学意义（χ2=20.718,P=0.036）,以管城区旋毛虫抗体阳性率（2.69%）最高,新密市最低（0.38%）。不同的年龄组之间旋毛虫抗体阳性率差异有统计学意义（χ2=21.584,P=0.001）,36-45 岁旋毛虫抗体阳性率最高为 1.69%（26/1538）,18-25岁最低为0.32%（3/938）;36岁以上年龄组旋毛虫抗体阳性率是1.55%（50/3226）,36岁以下年龄组阳性率是0.35%（9/2610）。男性旋毛虫抗体阳性率1.18%（50/4254）高于女性旋毛虫抗体阳性率0.57%（9/1582）,两者差异具有统计学意义χ2=4.238,P=0.038)。不同的学历之间旋毛虫抗体阳性率差异有统计学意义（χ2=12.163,P=0.033）,小学文化程度旋毛虫抗体阳性率最高（2.41%）,本科生最低（0.33%）。不同职业旋毛虫抗体阳性率差异有统计学意义（χ2=40.456,P=0.001）,农民旋毛虫抗体阳性率最高3.37%（28/831）,医务工作者最低0.21%（1/467）。献全血和血小板人群的旋毛虫阳性率差异无统计学意义（χ2=0.204,P=0.651）。偶吃生食或半生食物肉类的人群旋毛虫抗体阳性率高于从不吃生食或半生食物肉类的人,差别有统计学意义（χ2=32.198,P=0.001）;加工生肉与熟食所用刀和板,不分开使用者旋毛虫抗体阳性率高于分开使用者,差别有统计学意义（χ2=20.574,P=0.001）。结论1.成功建立了 ELISA法检测小鼠血清旋毛虫IgG和IgM抗体以及检测献血者旋毛虫IgG抗体,通过增加TMB显色剂的浓度,降低ES抗原的包被量,从而提高其敏感性和特异性,该法不但适用于旋毛虫病的诊断和流行病学调查,而且可减少大量献血者旋毛虫抗体检测的费用。2.郑州市献血人群中旋毛虫感染率属于低流行区,36岁以上人群感染率较高,男性感染率大于女性,小学文化程度以及农民感染率最高。旋毛虫感染率还与不良饮食和卫生习惯不当有关,应加强卫生宣传和检疫防控工作。
翟铖铖[4]（2018）在《旋毛虫不同发育时期抗原基因的克隆表达与诊断特性研究》文中研究表明旋毛虫病是一种危害严重的食源性人兽共患寄生虫病,呈世界性分布。从发现至今已近200年,但每年在世界各地仍有大量病例并引起多起暴发。由于旋毛虫病的临床症状不具有特异性,所以不易诊断,尤其是早期诊断,至今仍没有一种快速、准确、便捷的诊断方法。本研究旨在找到一种敏感性高、特异性好、又能大量制备的优质抗原,可用于研制旋毛虫病的免疫学诊断制剂。目的:本研究基于以往研究基础所获得的旋毛虫不同发育时期的4个强反应原性抗原基因,进行体外克隆表达,获得大量高纯度的基因重组蛋白,利用ELISA技术对人工感染不同剂量、不同时间的鼠血清中旋毛虫特异性抗体水平进行检测,并利用人体旋毛虫病人血清进行诊断效果的初步鉴定,筛选出可用于旋毛虫免疫学诊断的基因重组抗原,为进一步建立起有效的旋毛虫病免疫学诊断方法奠定研究基础。方法:根据NCBI-Gene注册的不同发育时期的4个基因序列,即感染后6h肠道幼虫期（inML6h）的类半胱氨酸蛋白酶抑制因子（cysteine proteinase inhibitors-like,CPIL）基因Wn10、成虫Ad3期丝氨酸蛋白酶（serine protease,SP1）基因Zh68、新生幼虫期（NBL）特异性丝氨酸蛋白酶（serine protease,SP2）基因T668、肌幼虫期（ML）丝氨酸蛋白酶抑制因子（Serpin）基因Wm5,利用生物信息学方法预测4个基因编码蛋白的结构功能与抗原表位,并利用原核表达系统进行体外大量表达与纯化,获得纯度较高的基因重组蛋白,分别命名为P1、P2、P3和P4;进一步通过ELISA方法,利用基因重组蛋白对人工感染不同旋毛虫剂量、不同时间的鼠血清中旋毛虫特异性抗体水平进行检测;同时,利用旋毛虫病人血清分别对4个发育时期的ES抗原、基因重组抗原及市面上的旋毛虫诊断试剂盒进行诊断效果的比较;利用SPSS 22.0对所得数据进行统计学分析。结果:根据生物信息学的预测结果,4个基因所编码的蛋白都为亲水性蛋白,SP2有一个跨膜区,CPIL、SP1和SP2都含有信号肽,都具有众多抗原表位,且挑选出优势抗原表位。利用原核表达系统及蛋白纯化技术,成功获得了 4个纯度较高的基因重组蛋白。进一步利用ELISA方法结果表明:1)对鼠血清的检测结果显示,在IgM水平上,4个重组蛋白检测的抗体水平都较低或阴性;在IgG水平上,P1在低剂量和高剂量分别在第10天和第8天检测出阳性,在感染后第11-45天均为阳性且维持较高水平,感染早期低剂量组抗体水平明显高于高剂量组,P2、P3、P4最早分别在第10天、第14天、第16天可检测出阳性,在感染剂量上没有P1差别明显,且整体阳性检测水平低于P1。2)对病人血清诊断结果显示,在IgM抗体水平上,4种ES抗原、P2及P3都能诊断出全部旋毛虫病人的IgM抗体;在IgG抗体水平上,4种ES抗原、P4和IgG诊断试剂盒均能诊断出全部旋毛虫病病人的IgG抗体。结论:利用鼠血清的检测,4个重组蛋白对旋毛虫病IgG抗体都有较好的诊断效果,其中感染6小时肠道幼虫期的类半胱氨酸蛋白酶抑制因子（P1）可作为早期感染诊断的候选抗原,肌幼虫期的丝氨酸蛋白酶抑制因子（P4）可作为中晚期感染诊断的候选抗原,同时发现P1在感染低剂量明显高于高剂量的抗体水平,推测其可能参与旋毛虫感染引起的宿主免疫抑制功能,为研制旋毛虫病的阻断剂和保护剂提供重要的参考价值;利用旋毛虫病人血清对4个基因重组蛋白的诊断特性进行鉴定,P2和P3可作为旋毛虫病IgM抗体检测的候选诊断抗原,P4可作为旋毛虫病IgG抗体检测的候选诊断抗原;P1和P4的诊断特性及应用价值还需要进一步完善和深入研究。
庄金秋,梅建国,张颖,姚春阳,李峰[5]（2017）在《猪旋毛虫病诊断方法研究进展》文中指出猪旋毛虫病是严重危害人类健康和畜牧业发展的人畜共患寄生虫病。猪旋毛虫对于肉品卫生影响严重,是我国肉品首检和必检项目。文章从病原学、血清学和分子生物学方面概述了猪旋毛虫病最新诊断方法,以期为肉品检疫人员、广大养殖业主及兽医科研工作者更好地诊断和防治该病提供参考。
邢海[6]（2016）在《新疆地区草食动物弓形虫和旋毛虫感染情况调查》文中研究指明刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）是专性细胞内寄生虫,也是内源性机会致病性寄生虫,引起的弓形虫病（Toxoplasmosis）可感染几乎所有的温血动物（包括人）。全球人弓形虫的感染率高达30%,我国人弓形虫的平均感染率约为8%。旋毛虫病是旋毛形线虫（Trichinella spiralis）引起的人畜共患病,该病可感染人和多种动物（包括草食动物）,是我国肉制品的强制性检验检疫项目。全球至少有1100万人感染旋毛虫病,我国有3.38%人感染。我国新疆地区,草食动物养殖业是当地的特色和支柱产业,该地区也是马、牛和羊等动物肉制品的主要产区和消费区,开展草食动物弓形虫病和旋毛虫病等食源性人畜共患病的调查十分必要,具有重要的公共卫生意义。本文开展了以下工作:1、草食动物（马、牛和羊）弓形虫感染情况调查采用酶联免疫吸附试验（ELISA）对从新疆部分地区采集的409份马血清、204份牛血清以及47份羊血清进行弓形虫特异抗体检测。结果显示马、牛和羊的血清阳性率分别为:5.38%、0%和0%进一步数据分析发现,马弓形虫感染率与年龄有关,随着年龄的增长,马弓形虫感染率明显增加。2、草食动物（马、牛和羊）旋毛虫感染情况调查采用ELISA方法对从新疆部分地区采集的马、牛和羊660份血清样品进行旋毛虫特异性抗体检测。结果显示马、牛和羊的血清阳性率分别为:3.42%、3.43%和4.26%。进一步数据分析发现,马旋毛虫感染情况与性别和年龄无关。3、流产马子宫分泌物弓形虫病原检测采用本实验室根据弓形虫ITS-1序列设计特异性引物,从而建立的弓形虫PCR检测方法,对血清学检测阳性的流产马子宫分泌物进行弓形虫病原检测。结果从10份可疑样品中均检出弓形虫核酸。
李雪莲[7]（2016）在《环介导等温扩增（LAMP）技术检测旋毛虫DNA的研究》文中指出旋毛虫病（Trichinellosis）是一种较为严重的人兽共患寄生虫病,主要因宿主生食或半生食了含有旋毛虫幼虫囊包的肉类引起。该病地理分布广泛,在过去的两个世纪里,全球许多地区有旋毛虫病暴发流行的报道,被称为再度肆虐的感染性疾病。旋毛虫是组织内寄生线虫,目前主要采用传统病原学诊断方法,但肌肉活检及尸体膈肌压片镜检的相关调查数据较少,对各地人群旋毛虫病患病率的评估很困难。血清学检查虽然可行,但有诸多不足,如价格较贵、抗体检测存在窗口期、与其他寄生虫病易发生交叉反应等,往往需要做更昂贵的免疫印迹实验。目前核酸分子检测技术的应用日趋广泛,随着检测成本的降低,检测过程更加标准化和自动化,此类技术将越来越多地应用于寄生虫病的早期诊断、现场快速检测及流行病学调查等各个方面。环介导等温扩增技术（Loop-mediated Isothermal Amplification,简称LAMP）,是日本学者Notomi发明的一种体外核酸等温扩增技术,这种技术需要特殊设计的46条引物来特异性识别目标片段,在具有链置换活性的DNA聚合酶作用下在很短的时间内扩增靶序列,同时产生副产物焦磷酸镁,可通过浊度的变化来直接判断阴阳性结果。因此具有特异、快速、高效、简便的特点。本论文将LAMP技术应用于旋毛虫感染小鼠不同组织样本中旋毛虫DNA的快速检测,研发了旋毛虫LAMP快速检测试剂盒,使其更适宜于现场和基层医疗单位的旋毛虫快速检测。以前的研究表明,PCR法检测血液中旋毛虫DNA具有一定的早期诊断价值。而本研究过程中通过建立高、中、低3种不同剂量旋毛虫感染小鼠模型,收集感染早期阶段的肌肉、血液、粪便样本进行LAMP检测,验证了该方法的高度敏感性和特异性,特别是对于肌肉中幼虫密度非常低时,该技术更突显其重要的检测和诊断价值。本论文研究证明LAMP法比PCR法更敏感、快速、简便,有望在提高人及动物旋毛虫病的早期诊断,旋毛虫病的现场检测、肉类检疫及流行病学调查等领域发挥更大作用。材料和方法1旋毛虫虫种、实验动物、基因组DNA的提取本实验所用的虫种,旋毛虫河南猪源株（Trichinella spiralis,T1）,北方旋毛虫（T.nativa,T2）、伪旋毛虫（T.pseudospiralis,T4）、南方旋毛虫（纳氏旋毛虫,T.nelsoni,T7）,来自国际旋毛虫参考中心（International Trichinella Reference Centre,ITRC）本实验室昆明小鼠传代保种。其他人体寄生蠕虫标本,包括似蚓蛔线虫、蛲虫、鞭虫、十二指肠钩口线虫、华支睾吸虫、布氏姜片虫、日本血虫、猪带绦虫、牛带绦虫、曼氏迭宫绦虫,均由本实验室保存。6w龄健康雄性昆明小鼠（SPF级）,体重20g25g,购买并饲养于军事医学科学院实验动物中心。旋毛虫及其他样本基因组DNA的提取采用天根公司的血液/组织/粪便基因组DNA提取试剂盒。2 LAMP引物设计及最佳引物筛选靶基因为NCBI Gen Bank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）上公开的旋毛虫1.6kb重复DNA序列（Gen Bank:X06625.1）,将其Blast（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov）特异性比对。选用Primer Explorer V4设计软件（EIKEN CHEMICAL CO.,LTD,Tochigi,Japan）设计引物（http://primerexplorer.jp/e/）,共设计出16套引物,以旋毛虫的基因组DNA为模板,在相同的条件下进行LAMP扩增,筛选最佳引物。3 LAMP法检测旋毛虫特异性评价以旋毛虫（T1）、乡土旋毛虫（T2）、伪旋毛虫（T4）、纳氏旋毛虫（T7）基因组DNA作为阳性对照,双蒸水为阴性对照,其他10种人体寄生虫（似蚓蛔线虫、鞭虫、蛲虫、十二指肠钩口线虫、布氏姜片虫、华支睾吸虫、日本血吸虫、猪带绦虫、牛带绦虫、曼氏迭宫绦虫）的基因组DNA为特异性对照进行LAMP反应,用实时浊度仪和钙黄绿素颜色反应两种方法检测结果。4 LAMP法检测旋毛虫核酸浓度的敏感性及与PCR法的比较为验证筛选出的最佳引物的敏感性,并与PCR法的敏感性相比较,提取100条旋毛虫肌肉幼虫基因组DNA,经核酸定量后以10倍梯度进行稀释,DNA的浓度范围为3,620 ng/μl至3.62 fg/μl,每个LAMP反应中加入2μl的DNA模板,LAMP法进行敏感性评价。同时以TS2F3和TS2B3为引物,以相同浓度的旋毛虫DNA为模板,PCR法进行敏感性评价。5 LAMP法检测单条旋毛虫幼虫的敏感性及与PCR法的比较提取10条旋毛虫肌幼虫基因组DNA,定容于1ml的PBS溶液中,以10倍梯度稀释,使浓度范围相当于每1ml PBS溶液中含100.00001条幼虫DNA,每个LAMP反应中加入2μl的DNA模板。用LAMP法和PCR法进行敏感性评价。6旋毛虫不同模拟样本核酸提取方法的比较评价DNA提取试剂盒和Chelex法提取旋毛虫肌肉、血液、粪便模拟样本基因组DNA的效果。分别将1条旋毛虫肌幼虫加入50μl健康小鼠血液,200mg健康小鼠粪便,250mg健康小鼠肌肉组织,分别用天根公司的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒和Chelex裂解液提取基因组DNA进行LAMP检测,评价两种方法提取的单条旋毛虫DNA模板的扩增效率。7评价封闭剂对LAMP反应和钙黄绿素显色效果的影响检测封闭剂是否影响LAMP反应及钙黄绿素的显色效果,将熔点为42℃的精炼固态石蜡融化后导入模具,制成直径与反应管相同的柱状固态石蜡块,设计6组对照实验比较添加或不添加石蜡及钙黄绿素对LAMP反应的影响。8 LAMP试剂盒检测小鼠肌肉中旋毛虫DNA（1）将10条旋毛虫肌幼虫加入1g健康小鼠肌肉组织,充分研磨后提取基因组DNA,以10倍梯度进行稀释,使浓度范围相当于每1g肌肉组织中含100.00001条幼虫,每个反应加入2μl的DNA模板,用LAMP法和PCR法评价肌肉模拟样本的敏感性。（2）6w龄健康雄性昆明小鼠18只,随机分成3组,每组6只,用灌胃法感染旋毛虫。组Ⅰ:阴性对照组;组Ⅱ:每只小鼠感染10条肌幼虫;组Ⅲ:每只小鼠感染50条肌幼虫;LAMP法检测感染后第20d的小鼠肌肉样本。9 LAMP试剂盒检测小鼠血液中旋毛虫DNA6w龄健康雄性昆明小鼠15只,随机分成3组,每组5只,用灌胃法感染旋毛虫。每组小鼠分别感染10条、100条、300条肌肉幼虫,建立低、中、高度感染小鼠动物模型。感染后第1d20d每天采集每只小鼠尾静脉血50μl,每天5个血液样本,共300个样本提取基因组DNA进行LAMP检测。10 LAMP试剂盒检测小鼠粪便中旋毛虫DNA6w龄健康雄性昆明小鼠15只,随机分成3组,每组5只,用灌胃法感染旋毛虫。每组小鼠分别感染10条、100条、300条肌幼虫,感染后第1d20d每组小鼠每天采集粪便样本,分成4份样本,共240个样本提取基因组DNA进行LAMP检测。11统计分析使用软件SPSS 17.0对血液、粪便样本的LAMP检测数据进行卡方检验统计分析,检验水平为α=0.05。结果1最佳引物筛选通过对靶序列Blast比对,旋毛虫1.6kb DNA重复序列具有很好的特异性,根据该序列共设计了16套引物,在相同的条件下进行LAMP扩增,15套可以扩增出靶基因,尤其添加了环引物后扩增效率提高了1/3,其中TS2套引物最先发生LAMP反应,且扩增效率最高,作为最佳引物进行下一步的实验。2特异性实验只有阳性对照组旋毛虫（T1）、乡土旋毛虫（T2）、伪旋毛虫（T4）、纳氏旋毛虫（T7）的基因组DNA作为模板时发生LAMP扩增,而阴性对照组其他10余种人体寄生蠕虫的基因组DNA和水作为模板时均没有发生扩增。实时浊度仪和钙黄绿素颜色反应两种方法检测结果一致,实验说明TS2套引物具有很好的属特异性。3 LAMP法检测旋毛虫核酸浓度的敏感性及与PCR法的比较LAMP法可检测到DNA的最低浓度为362 fg/μl,以TS2F3和TS2B3为引物,PCR反应产物是225bp大小的扩增条带,经测序为目的片段。PCR法检测到的最低浓度为3.62 pg/μl,因此LAMP法比PCR法的敏感性高出10倍以上。4 LAMP法检测单条旋毛虫的敏感性及与PCR法的比较LAMP法检测单条旋毛虫肌幼虫的灵敏性为0.001条/ml,PCR法的灵敏性为0.01条/ml,验证了LAMP法比PCR法敏感性高出10倍以上结论。5旋毛虫样本不同核酸提取方法的比较用天根公司的血液/组织/粪便基因组DNA提取试剂盒和Chelex裂解液提取含1条幼虫的血液、粪便、肌肉模拟样本DNA,经LAMP检测均为阳性,两种方法提取的DNA模板的扩增效率差异不显着。6评价封闭剂的影响加封闭剂组与不加封闭剂组的LAMP检出时间不变,显示封闭剂不抑制LAMP扩增效率;加钙黄绿素组的封闭剂对LAMP检出时间不变,显示封闭剂不抑制添加了钙黄绿素的LAMP扩增效率。7 LAMP试剂盒检测小鼠肌肉中旋毛虫DNA（1）LAMP法检测每克肌肉组织含10条幼虫的DNA,最低可检测到0.01条/g,PCR法为0.1条/g,可见LAMP法比PCR法的敏感性高出10倍以上。（2）分别感染10条、50条肌幼虫组第20d的小鼠肌肉样本,2组LAMP检测均为阳性结果,检出率为100%（6/6）,未感染组小鼠肌肉样本均为阴性结果。8 LAMP试剂盒检测小鼠血液中旋毛虫DNA（1）为LAMP检测小鼠轻度感染（10条幼虫）组1d20dpi的血液样本,每天5份样本,共100份样本,最早于第9dpi的样本中检测到旋毛虫特异DNA,第9d、10d、13d、18d20dpi每天的阳性率为20%（1/5）;第15d、17dpi每天的阳性率为40%（2/5）。（2）LAMP检测小鼠中度感染（100条幼虫）组1d20dpi的血液样本,每天5份样本,共100份样本,最早于第1dpi的样本中检测到旋毛虫特异DNA,第1d、3d、11d、12d、15dpi每天的阳性率为20%（1/5）;第7d、8d、10d、17d、19d、20dpi每天的阳性率为40%（2/5）。（3）LAMP检测小鼠重度感染（300条幼虫）组1d20dpi的血液样本,每天5份样本,共100份样本,最早于第3dpi的样本中检测到旋毛虫特异DNA,第4d、5d、9d、13d、14d、16d、20dpi每天的阳性率为20%（1/5）,第3dpi的阳性率为40%（2/5）,第8d、10d、11d、19dpi的阳性率为60%（3/5）,第15dpi的阳性率为80%（4/5）。（4）3组不同感染度小鼠LAMP阳性率间的差异没有统计学意义（c（17）=4.899,P=0.086）,LAMP检测血液样本的阳性率与感染程度没有相关性。轻度感染小鼠不同天数间的LAMP检测阳性率差异无统计学意义（c（17）=20.000,P=0.395）;中度感染小鼠不同天数间的LAMP阳性率差异无统计学意义（c（17）=23.459,P=0.218）;高度感染小鼠不同天数间的LAMP阳性率差异有统计学意义（c（17）=31.393,P=0.037）。当轻度感染时LAMP检测阳性率与检测时间没有相关性,当重度感染时LAMP检测阳性率与检测时间有一定的相关性,第8d15dpi检出率较高。9 LAMP试剂盒检测小鼠粪便中旋毛虫DNA（1）LAMP检测小鼠轻度感染组（10条幼虫）第1d20dpi的粪便样本,每天4个样本,共80份样本,最早于第6dpi的样本中检测到旋毛虫特异DNA,分别在第611d、1319dpi的粪便样本中检测出阳性样本;其中第610d、1315d、17dpi每天的阳性率为25%（1/4）,第11d、18d、19dpi每天的阳性率为50%（2/4）。（2）LAMP检测小鼠中度感染（100条幼虫）组1d20dpi的粪便样本,每天4个样本,共80个样本,最早于第2dpi的样本中检测到旋毛虫特异DNA,分别在第2、4、5、7d、920dpi的粪便样本中检测出阳性样本;其中第2d、4d、9d、11d、19d、20dpi每天的阳性率为25%（1/4）,第10d、14d、18dpi每天的阳性率为50%（2/4）,第5d、7d、12d、13d、1517dpi每天的阳性率为75%（3/4）。（3）LAMP检测小鼠重度感染（300条幼虫）组1d20dpi的粪便样本,每天4个样本,共80个样本,最早于第2dpi的样本中检测到旋毛虫特异DNA,分别在第220dpi的粪便样本中检测出阳性样本;其中第2d、3d、6d、9d、18dpi每天的阳性率为25%（1/4）,第5d、14d、19dpi每天的阳性率为50%（2/4）,第4d、7d、8d、10d、13d、15d、16d、20dpi每天的阳性率为75%（3/4）,第11d、12d、17dpi每天的阳性率为100%（4/4）。（4）3组小鼠LAMP阳性率间的差异具有统计学意义（c（17）=14.823,P=0.001）,阳性率与感染剂量有相关性（rs=0.500,P<0.001）,阳性率随感染剂量的增加而升高（F=20.492,P<0.001）。轻度感染组不同天数间的阳性率差异无统计学意义（c（17）=15.761,P=0.673）;中度感染组不同天数间的阳性率差异无统计学意义（c（17）=27.389,P=0.096）;重度感染组不同天数间的阳性率差异无统计学意义（c（17）=27.389,P=0.096）。可以看出LAMP检测粪便样本的阳性率与感染后检测时间没有相关性。结论1.本论文发明的旋毛虫LAMP快速检测试剂盒,可在60min内完成反应。具有良好的敏感性和特异性。有望应用于旋毛虫病的现场检测、肉类检疫及流行病学调查等领域。2.应用该试剂盒,对不同剂量旋毛虫感染小鼠早期阶段的肌肉、血液、粪便样本进行检测,可以在低剂量感染小鼠的早期各种来源的样本中检测到旋毛虫DNA,具有较高的检出率。3.LAMP试剂盒检测旋毛虫小鼠血液样本的阳性率与感染程度没有发现相关性。当轻度感染时阳性率与检测时间没有发现相关性,当重度感染时阳性率与检测时间有相关性,第8d15dpi检出率较高。4.LAMP试剂盒检测旋毛虫小鼠粪便样本的阳性率与感染程度有相关性,阳性率随感染剂量的增加而升高,与感染后检测时间没有发现相关性。
葛兰云,耿明杰,周淑芹,周启扉,加春生,姜文博[8]（2013）在《肉用动物旋毛虫检测方法研究进展》文中研究指明旋毛虫病（trichinosis）是一种严重的人兽共患寄生虫病,肉品卫生检验中将旋毛虫检疫列为首要、必要项目。本文对肉用动物旋毛虫检测方法进行了综述,对更好地进行旋毛虫检验,做好动物性食品的卫生管理,控制人畜共患病的发生具有重要意义。
杨秀丽[9]（2012）在《旋毛虫早期抗原基因诊断方法的建立》文中研究说明旋毛虫病是全世界投入控制费用最高的人兽共患寄生虫病之一，给食品安全、人类健康和生猪业发展带来了巨大的威胁。法规的旋毛虫病检验方法为镜检法和集样消化法，而这两种方法漏检率高，操作过程繁琐并且存在各种制约因素。ELISA是目前最为敏感的检测方法，而目前所广泛选用的基于虫体所获得的抗原如ES抗原、CAg和可溶性抗原等存在组分复杂、不利于大规模生产、制备过程繁琐等弊端，此外，还存在严重的交叉反应和诊断盲区（感染后19天前无法检出）。相比之下，基因重组蛋白所具备的成分单一，特异性强，纯度高，易于体外批量生产等优点使其成为候选诊断抗原的最佳来源，近年来成为人们的研究热点。本实验室已分别从新生幼虫、成虫、肌幼虫cDNA文库中成功筛选出具有期特异性的高丰度高反应原性优势抗原基因。本实验在此基础上选取了：肠道第一期幼虫（inML）半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因T625-55，成虫Ad3期丝氨酸蛋白酶家族基因L23，以及新生幼虫期（NBL）丝氨酸蛋白酶基因WN18，三种旋毛虫早期抗原基因作为诊断抗原基因，利用其原核表达后纯化的重组蛋白作为抗原，优化各种反应条件，检测感染不同天数的旋毛虫的猪阳性血清，分别建立了ELISA检测方法。并在三种早期重组抗原蛋白的最佳条件下，优化组合建立了猪旋毛虫病早期相关抗原的ELISA检测方法。实验结果表明混合早期重组抗原可以最早检出13天的血清，经初步检测，所建立的早期相关抗原的ELISA检测方法具有很好的特异性和敏感性。很好的解决了早期免疫诊断盲区（感染后19天前）的问题。
王蕾[10]（2012）在《应用shotgun技术对旋毛虫侵入相关蛋白的初步筛选》文中指出旋毛形线虫[Trichinella spiralis （Owen,1835） Railliet,1895],简称旋毛虫,是一种成虫和幼虫分别寄生在同一宿主的小肠和骨骼肌细胞内的线虫。旋毛虫引起的旋毛虫病（trichinellosis）是一种危害非常严重的食源性人兽共患寄生虫病。当人或动物生食或半生食含旋毛虫的肉类后,幼虫在胃液的作用下被消化脱囊释放出来,迅速进入小肠中的多细胞内龛中。在感染性第一期幼虫钻入肠道柱状上皮细胞内龛后,称之为旋毛虫肠道感染性第一期幼虫（L1）；经29-36h完成4次蜕皮（L1-L4）后发育为成虫,雌雄交配,96h后产出新生幼虫,新生幼虫经血循环移行到肌肉组织,幼虫在肌肉中可以生存数年而保持感染性。因此,脱囊幼虫（肠道感染性第1期幼虫）侵入肠粘膜内继续发育或是被宿主从肠道排出,是旋毛虫能否导致宿主感染与致病的关键步骤。尽管旋毛虫侵入肠上皮细胞的体外模型已建立,但是感染性幼虫对肠上皮细胞的识别,侵入和移行的机制均不完全清楚。本研究模拟旋毛虫感染宿主的环境,将感染性幼虫与小肠上皮细胞在体外共培养,对培养前后的虫体蛋白和细胞蛋白进行SDS-PAGE分离,联合Western blot挑选出有差异的条带,采用shotgun液相色谱串联质谱系统进行鉴定,将质谱分析得到的数据应用SEQUEST软件及数据库搜索完成蛋白质的鉴定,检测旋毛虫感染性幼虫在侵入小肠上皮细胞前后虫体蛋白和细胞蛋白的变化,并对鉴定出的蛋白质从分子功能、生物学途径、亚细胞定位三个方面进行GOA分类。幼虫与细胞接触后早期表达的蛋白可能是其侵入的相关蛋白,幼虫早期表达的蛋白抗原对本病的早期诊断也可能具有重要价值。这些研究将为更深入了解旋毛虫侵入肠上皮细胞机制提供有力的数据支持和参考。材料与方法1.旋毛虫虫种、实验动物及细胞系本实验所用的旋毛虫为河南省南阳猪源旋毛虫（Trichinella spiralis）,由本室昆明小鼠传代保种。20只雄性6周龄昆明小鼠（清洁级）,体重20g-25g,均购自郑州大学医学院实验动物中心。人回盲肠癌细胞HCT-8[HRT-18]购于中国科学院细胞库。2.旋毛虫肌幼虫的收集与激活将旋毛虫肌幼虫按照300条/只经口感染50只昆明小鼠,42 d后脱颈椎处死。膈肌压片镜检证实感染成功后,剥皮、除内脏和脂肪,用搅拌器搅碎至肌肉完全搅碎。采用人工消化法消化4 h,按贝氏法收集肌幼虫。将收集的肌幼虫用含5%人胆汁的PBS在37℃5%C02条件下孵育2-3 h,用PBS洗涤3次后,加入含抗生素的PBS中37℃孵育1h备用。3.细胞培养将HCT-8细胞接种在RPMI-1640完全培养基中,在37℃5%CO2培养箱培养,2-3 d即可形成致密的单细胞层,此时用于接种肌幼虫。在接种前1d按照常规方法给细胞换液,以及时去除死细胞,保证细胞状态良好。4.旋毛虫虫体蛋白和HCT-8细胞蛋白的SDS-PAGE分析及Western blot鉴定将激活的肌幼虫与RPMI-1640培养基按5000条/ml的比例混合后加入长满HCT-8细胞的75m1培养瓶中,37℃5%CO2条件下培养18h后,去除培养基与幼虫,收集肌幼虫,加入0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化后收集细胞,按比例分别加入RIPA裂解液提取虫体蛋白和细胞蛋白。BCA法测得虫体蛋白和细胞蛋白后,利用SDS-PAGE及蛋白质印迹（Western blot）进行分析。5. LC-MS/MS分析根据Western blot的结果,比对胶上相匹配的差异条带。用手术刀片将胶上差异部分切割下来,胰酶酶解、抽提肽段,酶解后得到的肽段提取物使用LC-MS/MS系统进行分析,质谱设备为Finnigan线性离子阱串联质潜仪LTQ.microspray模式。质谱仪配置C-18反相色谱柱,流动相A相为0.1%溶于超纯水的甲酸,B相为0.1%溶于乙睛水溶液中的甲酸。肽段混合物的洗脱梯度：2%～80%,洗脱时间60min,重复三次。串联质谱分析包括一个全扫描（fullMS scan）和十个串联扫描（MS/MS scan）。6.质谱数据分析和处理数据搜索引擎为Bioworks version3.2 software（SEQUSET, Thermo Electron）软件进行数据库搜索。肽段数据经SEQUEST过滤、匹配,只有分值较高的肽段被保留。过滤参数为：当Charge+1, Xcorr≥1.9;当Charge+2, Xcorr≥2.2;当Charge+3, Xcorr≥3.75;其中DelCN≥0.1。最后得到胰酶消化的蛋白质信息列表数据。7. InterPro注解和GO分类使用EXPASY工具在线分析蛋白质的基本理化性质（包括分子量Mr、等电点pI等）,最后用图表进行展示。使用InterProscan软件完成对蛋白序列的搜索。采用GO工具,从生物学途径、亚细胞定位及分子功能三方面对蛋白质表达谱进行功能分析及分类,并通过WEGO在线分析展示各部分分布。结果1.幼虫与HCT-8细胞培养后虫体蛋白的SDS-PAGE与Western blot分析SDS-PAGE结果表明,在培养基中培养18h的虫体抗原有41条蛋白带。HCT-8细胞与幼虫培养后的虫体蛋白增加了9条蛋白带（15、29、31、35、37、58、69、121和132 kDa）,减少了4条蛋白带（12、17、40、51 kDa）。Western blot结果显示,幼虫在培养基中孵育18h后虫体蛋白能够被旋毛虫感染鼠血清识别的有18条带,分子量范围为18 kDa-135 kDa,幼虫和HCT-8细胞孵育后与仅在培养基中孵育的幼虫相比,被旋毛虫感染鼠血清多识别了7条蛋白带（21、28、30、36、58、77和123 kDa）,少识别了3条蛋白带（23、51、97 kDa）。2.LC-MS/MS分析和鉴定旋毛虫幼虫蛋白旋毛虫感染性幼虫和HCT-8细胞共孵育后,被感染旋毛虫鼠血清识别的3条蛋白带被从胶上切离下来,分子量分别为21、36及58 kDa。应用shotgun LC-MS/MS和生物信息学分析,共有211个非冗余蛋白质被鉴定出来。在高可信度蛋白质当中,有67.8%的蛋白相对分子量范围为20 kDa～65 kDa。对于等电点来说,有123种（58.3%）蛋白质的等电点范围为4～7,58种（28.9%）蛋白的等电点范围为8～10。少于8.5%的蛋白等电点范围为7～8,10种（3.8%）蛋白质具有较高的等电点（大于10）。3.旋毛虫幼虫蛋白根据GO进行功能分类对鉴定出的旋毛虫的211种蛋白,利用GO工具,从生物学过程、分子功能和细胞定位三个方面进行分类。旋毛虫蛋白的分子功能共分为10大类,其中催化活性（75种蛋白,17.5%）和蛋白结合（110种蛋白,25.6%）是两大主要功能。大部分的细胞和代谢过程与大分子的合成和降解有关,尤其是糖类,核苷酸和蛋白可能是感染性幼虫在发育和生长过程中释放出来的。在211种蛋白中,139种蛋白位于细胞中,105种位于细胞器中。4.HCT-8细胞与幼虫培养后细胞蛋白的SDS-PAGE与Western blot分析SDS-PAGE结果表明,正常的HCT-8细胞有44条蛋白带。HCT-8细胞与幼虫培养后的细胞蛋白与正常HCT-8细胞蛋白相比增加了5条蛋白带（19、34、61、128和132 kDa）,减少了1条蛋白带（118 kDa）。Western blot结果显示,正常HCT-8细胞的蛋白能够被旋毛虫感染鼠血消识别的有5条带,分子量范围为30～129 kDa; HCT-8细胞与幼虫培养后与培养前的HCT-8细胞相比,被旋毛虫感染鼠血清多识别了4条蛋白带（24、35、61和115 kDa）。5. LC-MS/MS分析HCT-8细胞蛋白HCT-8细胞与幼虫共孵育后,被旋毛虫感染鼠血清多识别的细胞蛋白的分子量分别为24、35、61 kDa,将这3条蛋白带通过shotgun LC-MS/MS进行进一步分析。共有64种非冗余蛋白被鉴定出来。有43种蛋白（67.2%）分子量范围分布在10～70 kDa。等电点的范围为4.7～10.92,其中有26种蛋白（40.6%）的等电点在5～6。6.HCT-8细胞与幼虫共孵育后增加的蛋白通过GO进行基因分类利用GO工具,64种非冗余蛋白中共有54种蛋白质的功能已知。肠上皮细胞与幼虫共孵育后细胞中的旋毛虫蛋白有注解的与细胞成分有关。其中46种蛋白在细胞中,35种在细胞器中。根据GO的分子功能分类,共可分为7大类,其中结合功能（43,79.6%）和催化活性（23,42.6%）仍然是两大主要功能。大部分的蛋白参与了生物进程,主要是细胞过程、新陈代谢、生物进程的调控及应激和信号传导。结论1.旋毛虫幼虫与HCT-8细胞培养后,被感染鼠血清多识别的7条虫体蛋白带（21、28、30、36、58、77和123 kDa）可能是幼虫与细胞接触后分泌的新蛋白；少识别的3条蛋白带（23、51、97 kDa）可能是被HCT-8细胞释放的蛋白酶水解掉的虫体蛋白或是虫体发育过程中期特异性蛋白的改变。2.HCT-8细胞与旋毛虫幼虫与培养后,被感染鼠血清多识别的4条细胞蛋白带（24、35、61和115 kDa）,可能是进入细胞内的虫体分泌蛋白。3.对6条蛋白带（虫体蛋白的21、36和58 kDa及细胞蛋白的24、35和61kDa）应用shotgun分别鉴定出了211种和64种旋毛虫蛋白,初步建立了可能与旋毛虫侵入肠上皮细胞有关的蛋白质组数据库,为旋毛虫幼虫侵入蛋白的进一步筛选与鉴定奠定了基础。
二、应用改进消化法检测冷冻猪肉中旋毛虫（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、应用改进消化法检测冷冻猪肉中旋毛虫（论文提纲范文）
（1）应用表面增强拉曼光谱和上转换发光免疫层析技术检测旋毛虫的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1 章 旋毛虫及旋毛虫病研究进展 |
| 1.1 旋毛虫及其生活史 |
| 1.2 旋毛虫病 |
| 1.3 旋毛虫检测方法的研究进展 |
| 第2 章 SERS在生物检测中的概况及应用 |
| 2.1 SERS概况 |
| 2.2 SERS在生物检测中的应用 |
| 第3章 UCP-ICA在生物检测中的概况及应用 |
| 3.1 UCP概况 |
| 3.2 UCP-ICA在生物检测中的应用 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1 章 基于SERS建立旋毛虫病快速筛查模型及评价 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验动物和旋毛虫 |
| 1.1.2 主要试剂、耗材 |
| 1.1.3 主要实验仪器 |
| 1.1.4 主要溶液的配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 旋毛虫ML收集 |
| 1.2.2 旋毛虫感染模型构建和血清样本制备 |
| 1.2.3 银纳米颗粒制备和表征 |
| 1.2.4 血清SERS光谱测量和收集 |
| 1.2.5 光谱数据处理和多元统计分析 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 旋毛虫ML收集后鉴定 |
| 1.3.2 银纳米颗粒表征结果 |
| 1.3.3 SERS测试结果 |
| 1.3.4 血清SERS多元统计分析 |
| 1.3.5 血清SERS官能团发掘 |
| 1.4 讨论 |
| 1.4.1 SERS光谱 |
| 1.4.2 统计分析 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 旋毛虫UCP-ICA制备及其优化 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 旋毛虫虫种和实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂、耗材 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 旋毛虫ML收集及其ES抗原制备 |
| 2.2.2 旋毛虫ML-ES抗原鉴定 |
| 2.2.3 UCNPs-ES/山羊抗兔IgG制备与表征 |
| 2.2.4 旋毛虫UCP-ICA建立与优化 |
| 2.2.5 Ts-UCP-ICA的操作流程 |
| 2.2.6 阈值(cut-off)确立 |
| 2.2.7 Ts-UCP-ICA检测不同感染剂量阳性血清的效果评价 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 旋毛虫ML-ES抗原的鉴定结果 |
| 2.3.2 UCNPs-ES/山羊抗兔IgG偶联表征 |
| 2.3.3 Ts-UCP-ICA建立与优化 |
| 2.3.4 Ts-UCP-ICA-cut-off值确定 |
| 2.3.5 Ts-UCP-ICA检测不同感染剂量阳性血清的结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 Ts-UCP-ICA评价 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 Ts-UCP-ICA制备 |
| 3.2.2 特异性分析 |
| 3.2.3 单盲测试分析 |
| 3.2.4 一致性评价 |
| 3.2.5 稳定性分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 特异性分析结果 |
| 3.3.2 单盲测试结果 |
| 3.3.3 一致性评价 |
| 3.3.4 稳定性分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介及在学期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）我国旋毛虫病流行病学诊断治疗及防治措施研究进展（论文提纲范文）
| 1 流行病学 |
| 2 诊断 |
| 2.1 病原学诊断 |
| 2.2 免疫学诊断 |
| 2.2.1 抗体检测 |
| 2.2.2 循环抗原检测 |
| 2.2.3 分子生物学检查 |
| 3 治疗 |
| 4 防控措施 |
| 4.1 加强健康教育 |
| 4.2 加强肉类检疫 |
| 4.3 改善养猪方法 |
| 5 结语 |
（3）旋毛虫ELISA检测方法的建立及其血清流行病学的应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文名词对照表 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 1.1 旋毛虫虫种 |
| 1.2 实验小白鼠 |
| 1.3 试验血清 |
| 1.4 仪器耗材 |
| 1.5 实验试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 旋毛虫肌幼虫的收集 |
| 2.2 人工消化液的配置 |
| 2.3 排泄分泌ES抗原的制备 |
| 2.4 Bradford法测蛋白含量 |
| 2.5 ELISA操作方法 |
| 2.6 小鼠血清旋毛虫ELISA法实验条件优化 |
| 2.7 人血清旋毛虫ELISA法实验条件优化 |
| 2.8 献血人群中旋毛虫感染率的流行病学调查 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 旋毛虫肌幼虫显微镜观察结果 |
| 3.2 小鼠血清旋毛虫IgG抗体ELISA方法的建立 |
| 3.3 小鼠血清旋毛虫IgM抗体ELISA方法的建立 |
| 3.4 人血清旋毛虫IgG抗体ELISA方法的建立 |
| 3.5 献血人群中旋毛虫感染情况分析 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 全球旋毛虫病流行现状及检测方法研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历、硕士期间发表的学术论文 |
| 主要学习经历 |
| 主要经历 |
| 致谢 |
（4）旋毛虫不同发育时期抗原基因的克隆表达与诊断特性研究（论文提纲范文）
| 缩略词对照表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 1 研究背景 |
| 2 研究目的与意义 |
| 3 研究内容 |
| 4 技术路线 |
| 第一部分 旋毛虫四个抗原基因编码蛋白的生物信息学分析 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 不同发育时期抗原基因的克隆表达与蛋白纯化 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三部分 基因重组蛋白对鼠血清中旋毛虫特异性抗体的动态观察 |
| 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第四部分 基因重组蛋白对人旋毛虫病诊断效果的鉴定 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 研究总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附件 |
（5）猪旋毛虫病诊断方法研究进展（论文提纲范文）
| 1 病原学诊断方法 |
| 1.1 压片镜检法 |
| 1.2 集样消化法 |
| 2 血清学诊断方法 |
| 2.1 凝集试验 |
| 2.2 间接荧光抗体试验 |
| 2.3 沉淀试验 |
| 2.4 免疫酶染色试验 |
| 2.5 酶联免疫吸附试验 |
| 2.6 胶体金免疫层析试纸条法 |
| 3 分子生物学诊断方法 |
| 4 小结 |
（6）新疆地区草食动物弓形虫和旋毛虫感染情况调查（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 弓形虫病概述 |
| 1 弓形虫病原学和生活史 |
| 2 弓形虫病的流行情况 |
| 2.1 马弓形虫病流行情况 |
| 2.2 牛弓形虫病流行情况 |
| 2.3 羊弓形虫病流行情况 |
| 2.4 人弓形虫病流行情况 |
| 3 弓形虫病的实验诊断 |
| 3.1 病原学诊断 |
| 3.2 免疫学诊断 |
| 3.3 分子生物学诊断 |
| 第二章 旋毛虫病概述 |
| 1 旋毛虫病原学和生活史 |
| 2 旋毛虫病的流行情况 |
| 2.1 马旋毛虫病流行情况 |
| 2.2 牛、羊旋毛虫病流行情况 |
| 2.3 人旋毛虫病流行情况 |
| 3 旋毛虫病的诊断 |
| 3.1 病原学诊断 |
| 3.2 免疫学诊断 |
| 3.3 分子生物学诊断 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第三章 新疆地区草食动物弓形虫感染情况调查 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第四章 新疆地区草食动物旋毛虫感染情况调查 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第五章 流产马子宫分泌物弓形虫检测 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 PCR检测结果 |
| 2.2 阳性样品测序结果和分析 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（7）环介导等温扩增（LAMP）技术检测旋毛虫DNA的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 1前言 |
| 1.1 旋毛虫病的研究背景 |
| 1.1.1 旋毛虫病的流行及危害 |
| 1.1.2 旋毛虫的生活史 |
| 1.1.3 旋毛虫分类鉴定方法 |
| 1.1.4 旋毛虫病常用的分子检测技术 |
| 1.2 LAMP技术背景 |
| 1.2.1 LAMP技术原理 |
| 1.2.2 LAMP引物设计 |
| 1.2.3 LAMP反应过程 |
| 1.2.4 LAMP结果判定 |
| 1.2.5 LAMP技术在病原生物检测中的应用 |
| 1.3 LAMP技术检测旋毛虫DNA的实验流程 |
| 1.3.1 寻找靶基因 |
| 1.3.2 分析靶序列 |
| 1.3.3 设计LAMP引物 |
| 1.3.4 筛选最佳引物 |
| 1.3.5 评价最佳引物的特异性 |
| 1.3.6 评价最佳引物的敏感性 |
| 1.3.7 利用模拟样本评价引物敏感性 |
| 1.3.8 选择样本核酸提取方法 |
| 1.3.9 引入封闭剂防止污染 |
| 1.3.10 组装旋毛虫检测试剂盒 |
| 1.4 参考文献 |
| 2 旋毛虫LAMP检测试剂盒的研制 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 旋毛虫虫种、寄生虫标本、实验动物来源 |
| 2.1.2 主要试剂和仪器 |
| 2.1.3 主要试剂的组成和配置 |
| 2.1.4 旋毛虫小鼠动物模型的建立 |
| 2.1.5 旋毛虫肌肉幼虫的收集和计数 |
| 2.1.6 核酸定量的方法步骤 |
| 2.1.7 靶基因的选择 |
| 2.1.8 LAMP引物设计 |
| 2.1.9 LAMP反应体系及条件 |
| 2.1.10 LAMP反应检测方法 |
| 2.1.11 PCR反应体系及引物选择 |
| 2.1.12 封闭剂制作及使用方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 最佳引物筛选 |
| 2.2.2 评价引物特异性 |
| 2.2.3 引物敏感性评价及与PCR法的比较 |
| 2.2.4 两种核酸提取方法的比较 |
| 2.2.5 评价封闭剂对LAMP反应和钙黄绿素（FD）显色效果的影响 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 2.5 参考文献 |
| 3 LAMP试剂盒检测小鼠肌肉旋毛虫DNA |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 旋毛虫及小鼠 |
| 3.1.2 旋毛虫感染动物模型的建立及样本制备 |
| 3.1.3 主要试剂及仪器 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 模拟肌肉样本的敏感性实验及与PCR的比较 |
| 3.2.2 不同感染剂量小鼠肌肉样本敏感性实验 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 3.5 参考文献 |
| 4 LAMP检测小鼠血液中旋毛虫DNA |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 旋毛虫及小鼠 |
| 4.1.2 旋毛虫感染动物分组及样本制备 |
| 4.1.3 主要试剂及仪器 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 小鼠轻度感染组 1d～20dpi血液样本检测 |
| 4.2.2 小鼠中度感染组 1d～20dpi血液样本检测 |
| 4.2.3 小鼠重度感染组 1d～20dpi血液样本检测 |
| 4.2.4 LAMP检测血液样本结果的统计分析 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 4.5 参考文献 |
| 5 LAMP检测小鼠粪便中旋毛虫DNA |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 旋毛虫及小鼠 |
| 5.1.2 旋毛虫感染动物分组及样本制备 |
| 5.1.3 主要试剂及仪器 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 小鼠轻度感染组 1d～20dpi粪便样本检测 |
| 5.2.2 小鼠中度感染组 1d～20dpi粪便样本检测 |
| 5.2.3 小鼠重度感染组 1d～20dpi粪便样本检测 |
| 5.2.4 LAMP检测粪便样本结果的统计分析 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 5.5 参考文献 |
| 全文结论 |
| 综述：LAMP技术在病原生物检测中的研究与应用 |
| 参考文献 |
（8）肉用动物旋毛虫检测方法研究进展（论文提纲范文）
| 1 引言 |
| 2 旋毛虫检测方法 |
| 2.1 压片镜检法 |
| 2.2 集样消化法 |
| 2.3 液相基因芯片检测 |
| 2.4 ELISA检测 |
| 2.5 免疫荧光技术 |
| 2.6 胶体金检测技术 |
| 2.7 DNA检测技术 |
| 3 结语 |
（9）旋毛虫早期抗原基因诊断方法的建立（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 旋毛虫的生物学及流行病学 |
| 1.1 生活史及生物学特性 |
| 1.2 流行病学概括 |
| 第2章 旋毛虫病的控制和预防 |
| 2.1 旋毛虫病的控制 |
| 2.2 旋毛虫病的预防 |
| 第3章 旋毛虫病的研究进展 |
| 3.1 旋毛虫病的诊断 |
| 3.2 旋毛虫病检测方法 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 旋毛虫早期相关抗原基因包涵体蛋白的纯化及鉴定 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 旋毛虫早期抗原基因蛋白 ELISA 方法的建立 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（10）应用shotgun技术对旋毛虫侵入相关蛋白的初步筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 1 引言 |
| 2 材料方法 |
| 2.1 主要试剂 |
| 2.2 主要仪器 |
| 2.3 主要试剂配置 |
| 2.4 旋毛虫虫种和实验动物 |
| 2.5 旋毛虫肌幼虫的收集 |
| 2.6 旋毛虫肌幼虫的激活 |
| 2.7 细胞培养 |
| 2.8 虫体蛋白的制备 |
| 2.9 HCT-8细胞蛋白的提取 |
| 2.10 BCA法测蛋白浓度 |
| 2.11 虫体蛋白和细胞蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳分析 |
| 2.12 虫体蛋白和细胞蛋白Western blot鉴定 |
| 2.13 蛋白质胶内酶解和抽提肽段 |
| 2.14 LC-MS/MS分析 |
| 2.15 蛋白的搜索鉴定和生物信息学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 蛋白浓度的检测结果 |
| 3.2 幼虫与HCT-8细胞培养后虫体蛋白的SDS-PAGE及Western blot |
| 3.3 虫体蛋白在线色谱分析结果 |
| 3.4 LC-MS/MS分析和鉴定旋毛虫肌幼虫蛋白 |
| 3.5 旋毛虫幼虫的高丰度蛋白 |
| 3.6 旋毛虫幼虫蛋白根据GO进行功能分类 |
| 3.7 HCT-8细胞与幼虫培养后细胞蛋白的SDS-PAGE及Western blot |
| 3.8 细胞蛋白在线色谱分析结果 |
| 3.9 LC-MS/MS分析HCT-8细胞蛋白 |
| 3.10 鉴定细胞中所含旋毛虫蛋白的理论二维分布 |
| 3.11 HCT-8细胞与幼虫共孵育后增加的蛋白通过GO进行基因分类 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
四、应用改进消化法检测冷冻猪肉中旋毛虫（论文参考文献）
- [1]应用表面增强拉曼光谱和上转换发光免疫层析技术检测旋毛虫的研究[D]. 李健. 吉林大学, 2021
- [2]我国旋毛虫病流行病学诊断治疗及防治措施研究进展[J]. 杨小迪,徐常艳,王舒颖,高宏宇,梁金宝. 中国血吸虫病防治杂志, 2020(05)
- [3]旋毛虫ELISA检测方法的建立及其血清流行病学的应用研究[D]. 刘佳璇. 郑州大学, 2020(02)
- [4]旋毛虫不同发育时期抗原基因的克隆表达与诊断特性研究[D]. 翟铖铖. 中国疾病预防控制中心, 2018
- [5]猪旋毛虫病诊断方法研究进展[J]. 庄金秋,梅建国,张颖,姚春阳,李峰. 猪业科学, 2017(09)
- [6]新疆地区草食动物弓形虫和旋毛虫感染情况调查[D]. 邢海. 南京农业大学, 2016(04)
- [7]环介导等温扩增（LAMP）技术检测旋毛虫DNA的研究[D]. 李雪莲. 郑州大学, 2016(08)
- [8]肉用动物旋毛虫检测方法研究进展[J]. 葛兰云,耿明杰,周淑芹,周启扉,加春生,姜文博. 中国动物检疫, 2013(11)
- [9]旋毛虫早期抗原基因诊断方法的建立[D]. 杨秀丽. 吉林大学, 2012(01)
- [10]应用shotgun技术对旋毛虫侵入相关蛋白的初步筛选[D]. 王蕾. 郑州大学, 2012(09)