一、牛病毒性腹泻－粘膜病病毒的分离鉴定（论文文献综述）
刘昱成[1]（2014）在《牛病毒性腹泻粘膜病病毒E2基因的克隆、表达及间接ELISA方法的初步建立》文中研究表明牛病毒性腹泻/粘膜病（Bovine Viral Diarrhea/Mucosal Disease，BVD/MD）是由牛病毒性腹泻病毒（Bovine Viral Diarrh Virus，BVDV）引起牛的以发热、消化道粘膜糜烂、溃疡、脱落、出血性炎症、腹泻、白细胞下降、繁殖障碍为主要特征的一种传染病。该病在养牛国家广泛流行，形成持续性感染，引起免疫抑制，易导致继发感染，给畜牧业生产造成巨大的经济损失。目前，世界各国对于该病的防控主要通过采取动物检疫、淘汰和免疫接种相结合的策略。在欧美发达国家釆取检疫和淘汰为主，免疫接种为辅的方法来防控该病，使得该病得到有效控制。然而，我国由于缺乏理想的商品化疫苗和检测产品，导致该病在我国很多地区广泛流行。因此，研发用于BVD防控的疫苗和检测试剂，制定并完善BVD的防控体系对于保障我国养牛业的持续健康发展具有重要的意义。本研究以BVDV-2SW分离株为研究对象，对该病毒E2基因进行了克隆，运用大肠杆菌和酵母表达体系表达E2基因，通过SDS-PAGE和Western blot分析表达的重组E2蛋白的反应原性，选择表达量高且反应原性强的重组E2蛋白作为ELISA包被抗原，初步建立了检测BVDV抗体的间接ELISA方法，为BVDV检测试剂的研发奠定前期基础。主要研究方法和结果如下：1. BVDV E2基因的克隆及原核表达。从BVDV-2SW株细胞培养液中提取病毒的总RNA，采用RT-PCR方法从总RNA中扩增出BVDV E2部分基因，扩增产物经EcoRI、Not I双酶切后插入原核表达载体pET-28a（+）和pET-32a（+）中，构建E2基因原核表达载体pET-28a-E2和pET-32a-E2；将其转化至工程菌BL21（DE3）中，在37℃、1.0mmol/L IPTG浓度条件下诱导表达。SDS-PAGE分析发现，在分子质量32kDa和44kDa的位置出现与预期大小一致的蛋白条带；Western blot分析表明表达的重组E2蛋白可以与抗BVDV抗体发生免疫学反应，证实表达的重组E2蛋白具有良好的反应原性。2. BVDV E2基因在毕赤酵母中的表达。通过RT-PCR方法扩增了BVDV E2部分基因，扩增产物经EcoR I、Not I双酶切后插入酵母表达载体pPIC9K中，构建了重组表达质粒pPIC9K-E2，经Sal I线性化后电击转化表达宿主毕赤酵母GS115。经PCR、表型及G418抗性筛选，成功获得具有G418抗性（1.0mg/mL）且表型为His+Mut+的阳性重组酵母转化子。阳性转化子经1.5%甲醇诱导，SDS-PAGE分析表明重组酵母可表达相对分子质量为23.2kDa的蛋白，与预期值相符合；Western blot分析表明表达的重组E2蛋白可以与抗BVDV抗体发生免疫学反应，证实表达的重组E2蛋白具有良好的反应原性。3.重组E2蛋白的纯化及间接ELISA方法的初步建立。从三种重组蛋白中选择了表达量最高，反应原性强的重组E2蛋白，对其进行纯化，用纯化的E2重组蛋白为包被抗原，初步建立了间接ELISA检测方法。通过检测，证实所建立的间接ELISA检测方法具有较好的特异性与敏感性。
赵洪哲[2]（2019）在《牛病毒性腹泻病毒抗体间接ELISA方法的建立》文中研究说明本研究为建立牛病毒性腹泻病毒（BVDV）抗体间接ELISA方法,根据GenBank公布的BVDVE2基因序列,利用DNAstar等软件进行生物信息学分析,截取抗原性和亲水性较高的序列,将其进行稀有密码子优化,串联信号肽序列后送公司合成并连接到原核表达载体pET-32a（+）,构建重组质粒pET-32a-Opti-E2,鉴定正确后,转化至E.coli BL21（DE3）宿主菌,IPTG 诱导表达,经 SDS-PAGE 和 Western Blot 分析,成功获得大小为43 kDa BVDV E2基因的可溶性蛋白。应用可溶性表达的E2蛋白作为包被抗原,建立并优化了检测BVDV抗体的间接ELISA方法,命名为Opti-E2-ELISA。采用受试者工作特征曲线方法对203份血清的S/P值进行分析,确定Opti-E2-ELISA的阴阳性临界值为0.21。当S/P值为0.21时,此方法的敏感性为96.97%,特异性为97.65%。用Opti-E2-ELISA方法检测牛传染性鼻气管炎病毒阳性血清、牛口蹄疫病毒阳性血清、布鲁菌阳性血清、牛副结核分支杆菌阳性血清,结果均为阴性,表明此方法特异性良好。批间批内重复性试验结果显示:变异系数均小于10%,表明所建立的Opti-E2-ELISA方法具有良好的敏感性、特异性、重复性。与商品化的BVDV抗体检测试剂盒IDEXX对比,符合率为97.5%。
郜玉钢[3]（2005）在《鹿源BVDV分离鉴定、E0基因的克隆与表达及免疫原性研究》文中研究指明1 从吉林省长春市双阳区梅花鹿流产胎儿肝脏病料中分离出的病毒,接种于MDBK传代细胞后出现了BVDV典型而规律的细胞病变,其理化特性与BVDV相同,致细胞病变作用可被BVDV国际标准株C24V株的牛阳性血清所阻断,电镜负染观察病料接种MDBK细胞的F1代浓缩病毒液,可见典型的BVDV粒子形态,从F1代浓缩病毒液中分别扩增出402bp(NS2-3)和706bp（E0）的目的片段,证明该毒株是BVDV,命名为CCSYD株。 2 对从吉林不同地区分离的4株（CCSYD株,CCJYD株、CCKCD株、JLCYD株）BVDV的NS2-3基因外源序列插入区进行了RT-PCR扩增、克隆和测序,并与BVDV其他株进行了同源性分析,CCSYD株属基因Ⅰb亚型,CCJYD株、CCKCD株、JLCYD株属待定基因型。 3 将CCSYD株BVDV的E0基因RT-PCR扩增目的片段进行了克隆和测序,将其与已报道的瘟病毒代表株相应序列做了比较,预测了E0蛋白的抗原表位、亲水性和等电点等。以E0基因为判定依据,CCSYD分离株也为基因Ⅰb亚型,E0基因的核苷酸序列可做为BVDV基因分型的依据。 4 成功构建了原核表达质粒pET28a/E0,重组菌在IPTG诱导下能表达目的蛋白,其含量占菌体总蛋白的9.25%。 5 成功构建了真核表达质粒PAX1/E0,并用脂质体转染BHK-21细胞,RT-PCR法检测到E0目的基因在BHK-21细胞进行了转录,间接ELISA法检测到已表达目的蛋白。 6 用梅花鹿源BVDV基因苗（PVAX1/E0）不同免疫剂量和免疫次数免疫家兔,既可产生体液免疫又可产生细胞免疫应答。基因苗高剂量组比低剂量组体液免疫应答水平和细胞免疫应答水平高,基因苗免疫次数对体液免疫应答水平和细胞免疫应答均无影响。免疫的第42天基因苗免疫组抗体水平达到高峰,基因苗免疫组（免疫剂量1mg/ml以上）BVDV抗体应答水平高于CCSYD灭活苗和C24V灭活苗免疫组,但免疫家兔的28天以前的结果则相反;免疫家兔产生的细胞免疫应答水平基因苗组均低于CCSYD灭活苗和C24V灭活苗免疫组。 7 采用组织细胞培养方法,测试了利巴韦林、黄芪、鱼腥草、干扰素a2b、莪术油、双黄连粉针剂在MDBK细胞体外培养中的最大安全浓度（最低稀释度）分别为(214)、（25）、（28）、（25）、（27）、（27）。药物抗梅花鹿源BVDV作用由强到弱的顺序:莪术油、鱼腥草、黄芪、干扰素、利巴韦林、双黄连。
张光辉[4]（2004）在《河南省肉牛规模化养殖场牛病毒性腹泻的诊断与防制技术研究》文中认为牛病毒性腹泻（Bovine viral diarrhea，BVD）是由牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）引起的，主要侵害牛、羊、鹿、牦牛、猪等动物的一种重要的传染病，临床主要表现为发热、黏膜糜烂、溃疡、白细胞减少、腹泻、咳嗽及怀孕母牛流产或畸形胎儿。世界每年死于BVDV感染的牛不少于500万头，占牛饲养总数的0.5％～1％。随着我国养牛业的迅速发展，国外品种不断引进，该病在我国发生、流行呈上升趋势。早在20世纪60年代，我国的云南、山东、四川等地就有类似该病发生。目前，该病在河南也普遍存在。为找到一种快速诊断BVD的方法，有效地控制其蔓延，做好防制工作，减少BVD对河南省肉牛业造成的损失，本论文从以下几个方面进行了研究： 1、河南省牛病毒性腹泻流行病学调查 从河南省唐河、内乡等15个县市的不同牛群随即采集血样671份，从养牛业比较发达的南阳、周口、安阳3市部分规模化肉牛场随机采集645份血样，分别用牛病毒性腹泻抗体和抗原ELISA试剂盒检测，结果表明：671份血样中，154份为抗体阳性，阳性率为22.95％；645份血样中100份为BVDV阳性，其检出率为15.50％，从而证实BVD在河南省广泛存在。 2、河南省牛病毒性腹泻病毒地方株的分离及鉴定 从河南省不同地区规模化肉牛场BVD疑似病例中采集病料，将处理好的病料接种MDBK细胞，并盲传四代，分离得到两株可产生细胞病变的病毒，经电镜观察、理化特性鉴定、琼脂扩散试验和中和试验，确定两株病毒均为BVDV，分别将其命名为HN-1株和HN-2株。动物回归试验进一步证实了所分离的两株病毒均为BVDV。 3、分泌抗牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立与鉴定 在MDBK细胞上增殖BVDV HN-1株，用蔗糖密度梯度离心法纯化病毒，然后免疫BALB／c小鼠。应用单克隆抗体技术，制备脾细胞并与NS0骨髓瘤细胞融合。经间接ELISA筛选，用有限稀释法亚克隆，得到4株能分泌BVDV单克隆抗体的杂交瘤细胞林：3A8、3C7、3C11、3E9。经鉴定，3A8、3C7、3E9株分泌的单克隆抗林为IgG1亚类，3C11，株为IgG2a亚类。杂交瘤细胞的平均染色体数目为99条。3A8、3C7、3C11株分泌的抗体与CSFV，BDV发生交叉反应，与BCV、BRV无交叉反应，而3C11株河南省肉牛规模化养殖场病毒性腹泻病的诊断与防制技术研究分泌的抗体与以上四种病毒均不发生交叉反应，显示出较好的特异性。这些单克隆杭体的获得为BVD的研究及诊断方法的建立莫定了基础. 4、牛病毒性腹泻病毒单克隆杭体双夹心ELISA的建立及其应用 用3C:l株，按常规方法制备腹水、提纯IgG，与已制备的兔抗BVDV IgG建立了检测BvDv的单克隆杭体双夹心ELISA。该方法与病毒分离试验对比，阳性符合率为86.67%，阴性符合率为100%;与中和试验对比，阳性符合率为93.33%，阴性符合率为100%。该方法最低病毒检出量为20on留ml。用该方法与商品化EusA试剂盒同时对比检测牛全血100份，二者阳性检出符合率为96.巧%。初步应用该方法对河南省南阳、周口、安阳3市肉牛场的562头份牛全血的检测结果表明，牛群BVDV的感染率为1 7.08%。该方法具有良好的特异性、敏感性及稳定性，能够较好地用于BVDV的监测，具有良好的应用前景。 5、牛病毒性腹泻囊素油乳剂灭活疫苗的研制 将BVDV HN一1株在MDBK细胞上增殖、浓缩、灭活，并与免疫增强剂一一囊素共同乳化研制出BVD囊素油乳剂苗。对其物理性状、安全性、保存期等进行检测，初步应用该疫苗进行免疫试验，并和常规灭活苗以及弱毒苗进行免疫效果比较。试验结果表明:该疫苗合格、安全，保存期达到12个月;产生的抗体水平较高且维持时间长，免疫效果和保护率优于常规灭活苗和弱毒苗. 6、肉牛规模化养殖场病毒性腹泻防制措施的制定及实施效果分析 根据BvD流行病学特征，结合本研究成果，从品种选育、饲养管理、饲料营养、环境调控、免疫预防、兽医卫生等方面制定了一套BvD防制措施。并在河南的南阳、周口、安阳3市部分肉牛场进行了实施，实施效果表明:试验牛场BVD感染率、发病率、牛场整体病死率均有所下降，在一定程度上控制了该病的流行和传播，提高了肉牛的生产性能，取得了显着的经济效益和社会效益。关健词:牛病毒性腹泻;牛病毒性腹泻病毒;流行病学;分离鉴定;单克隆杭体;双杭夹心ELISA;囊素油乳剂苗;防制措施
刘亚刚[5]（2004）在《猪瘟疫苗防制奶牛、牦牛病毒性腹泻/粘膜病的研究》文中进行了进一步梳理牛病毒性腹泻／粘膜病（Bovine Viral Diarrhea／Mucosal Disease BVD／MD）是由牛病毒性腹泻／粘膜病病毒（BVDV／MDV）引起的以发热，消化道粘膜糜烂、溃疡、脱落、出血性炎症、腹泻、白细胞下降、繁殖障碍为主要特征的一种传染病，该病易形成持续性感染，引起免疫抑制，导致继发感染，给养牛业造成巨大的影响。本研究首先通过对四川部分地区奶牛、牦牛病毒性腹泻／粘膜病进行了流行病学研究和病原分离鉴定，再依据牛病毒性腹泻／粘膜病病毒与猪瘟病毒在免疫学上具有同源性的特点，介绍了猪瘟兔化弱毒苗的研制和生产过程，并用其对不同种属和日龄的牛进行了不同剂量的免疫，分别从免疫应答及其对牛的生产性能和安全性等方面进行了研究，旨在为用猪瘟兔化弱毒苗预防和控制牛病毒性腹泻／粘膜病提供理论依据。主要研究结果如下： 1 本研究应用微量中和试验等方法，对四川部分地区奶牛、牦牛进行了血清学研究，结果表明奶牛BVD／MD血清阳性率平均为34.8％，其中成年牛为40％左右，小犊牛为25％；牦牛的血清阳性率平均为37.5％，个别地区阳性率达60％以上，表明四川地区该病流行严重。应用免疫电镜、荧光抗体法等方法从发病牦牛中分离出的病原（牦牛Ⅰ号毒株），经各种理化特性测定，发现其与标准毒株(Oregon C24V株)在理化特性和许多生物特性上是一致的，所不同的是牦牛Ⅰ号毒株属非致细胞病变的NCP—BVDV，但接种奶犊牛后能复制出典型的BVD／MD病例，说明牦牛群感染的BVDV既有CP型又有NCP型，存在两种不同的生物型，且这两种生物型能相互转化。四川大学博士论文 2为了更好地了解和掌握猪瘟兔化弱毒苗的性能和效力，我们深入疫苗研究机构单位调查了猪瘟疫苗的研制和检验过程;并通过调查比较，最终选择猪瘟兔化弱毒乳兔组织冻干苗（猪瘟活疫苗I）作为试验苗，该苗具有良好的抗原性，免疫效果优于细胞苗，价格合适（每头份0.12元）比淋脾苗便宜，有利于推广应用。 3用猪瘟乳兔组织苗作试验苗，以不同的剂最（3一25头份）对大小奶牛、耗牛（包括公、母牛）进行颈部皮下注射，前后观察15天，测定体温、饮食量和产奶量，观察精神状况和不良反应情况等.其主要结果如下:（1）1一n月龄小犊牛每头注射18头份猪瘟苗后，其精神、体温、饮食正常，无一头出现不良反应和死亡;（2）对怀孕1一7月龄的8头母牛，每头注射10头份猪瘟苗后，其精神、体温、饮食正常，无一出现流产和死胎，跟踪调查发现每头怀孕母牛均正常产犊;（3）给成年耗牛（含公、母和怀孕牛）每头注射25头份猪瘟苗后，其精神、体温、饮食正常，无一出现不良反应，对产奶量无影响;（4）随机选择4头产奶牛，每头注射10头份猪瘟苗，每天早、中、晚测定产奶量，注苗前3天头平产奶量为14.625公斤，注苗后第1一4天头平产奶量为14.7公斤。证明猪瘟苗对牛安全，不影响产奶量，可用于怀孕母牛。 4血常规检查结果如下:（l）不论是大牛还是小牛，不论是未注苗的对照牛还是注射了猪瘟苗的试验牛，其红细胞数、白细胞数及血色素均在正常值范围内，对照组与试验组无显着差异（P>0 .05）:（2）不论是大牛还是小牛，注射了猪瘟苗的试验牛淋巴细胞均比对照组的高，小牛试验组为82.7%，比其对照组（67.3%）高出15.4个百分点，大牛试验组为80.25%，L匕对照组（63.5%）高出16.75个百分点，相反，中性分叶细胞和嗜酸性细胞有较大幅度的变化，这种变化可能是由于注射猪瘟兔化弱毒苗引起，表明猪瘟苗可以激发和提高牛的免疫应答作用。（3）不论是对照组还是试验组，小牛的红细胞总数和淋巴细胞比例均比大牛的偏高，这可能与脐带供氧有一定的关系。 5应用微量中和试验，反相中和试验，E一玫瑰花环试验和淋巴细胞转化 （MTT）试验，对牛注苗后的免疫应答进行测定，结果:（l）受试牛注苗后巧天有50%的小牛和83.3%的大牛产生保护性中和抗体，18天时100%产生抗体，45天左右时抗体产生达到高峰期（均在128以上），240天时大、小牛均有6既以上能检出BvDV/MD抗体;（2）抗体产生滴度维持的时间长短与注射疫苗的剂四川大学博士论文量呈一定正相关，在抗BVD/MD结果中，体液免疫起主导作用，细胞免疫起辅助作用。牛注射猪瘟苗后二周左右产生免疫力，45天左右为抗体产生的高峰期，免疫保护期至少在8个月以上，免疫保护力在75%一100%之间，当抗体滴度达1:32或l:64时推测可抵抗自然和人工感染;（3）反相中和试验表明己知的猪瘟阳性血清能中和oregon CZ在标准毒株。中和效价多在64一128之间。表明BvDv和HCv确有共同抗原的存在;（4）E一玫瑰花环率大牛对照组平均为36.125%，注苗后45天平均为40.25%，97天时平均为38.4%，240天平均为37.5%，小牛对照组平均为25%，注苗后97天时平均为32%，240天平均为30.3%，可见T淋巴细胞增殖不显着，淋转试验（MTT）结果与此大体一致，表明注苗对细胞免疫有一定的促进作用，但在抗BVD/MD传染中，只起辅助作用。 6根据调查研究结果，研究制订了猪瘟苗预防BVD/MD的免疫程序和综合防制措施。免疫程序为公牛配种前1个月，母牛临产前1个月每头注射10头份，此后每隔10一12月注射一次，小犊牛于1一3月首免（3头份），6一8?
张宁,秦建华,赵博伟,张富梅,胡晓悦,赵月兰[6]（2008）在《牛病毒性腹泻-黏膜病诊断方法研究进展》文中指出牛病毒性腹泻-黏膜病是由黄病毒科、瘟病毒属的牛病毒性腹泻病毒引起的一种传染性疾病。该病以发热、黏膜糜烂、溃疡、白细胞减少、腹泻、怀孕母牛流产或产畸型胎儿为主要特征。该文就近几年来国内外对该病的实验室诊断方法,包括病毒分离、血清学试验、电镜观察、免疫荧光技术、聚合酶链反应技术等的研究概况进行了综述。
赵月兰,杨汉春,左玉柱,秦建华,刘占民,范京惠,张宁[7]（2006）在《河北省奶牛牛病毒性腹泻/粘膜病病毒的分离鉴定》文中认为从河北省某规模化奶牛场牛病毒性腹泻/粘膜病（BVD/MD）疑似病例中采集病料,将处理好的病料接种MDBK细胞,盲传9代,得到了不产生细胞病变的病毒。琼脂扩散试验表明本病毒能与牛病毒性腹泻病毒（BVDV）OregonC24标准阳性血清反应,出现沉淀线;细胞培养物用BVD/MD荧光抗体染色检测,可见到荧光着染的特异性细胞,荧光颗粒出现于胞浆中。双抗体夹心ELISA检测病毒抗原结果BVDVOregonC24VP/N为3.141,分离毒P/N为3.012,P/N>2,与BVDVOregonC24V结果一致;电镜观察到圆形、直径为40～60nm,有囊膜,囊膜表面有突起的病毒粒子,与BVDV颗粒基本一致。经RT-CR检测,扩增出了唯一的315bp的目的条带,进一步证实为牛病毒性腹泻/粘膜病病毒。
孔繁德,陆承平[8]（2005）在《牛病毒性腹泻-粘膜病的最新研究进展》文中指出
郑全[9]（2004）在《梅花鹿粘膜病病毒的分离鉴定》文中研究说明本研究用吉林省某鹿场母鹿流产胎儿的肝脏病料，经MDBK细胞适应培养，获得一株病毒（命名为MDVCC-deer6）。该分离毒能在MDBK细胞上形成有规律的病变，其病变形态与病变时间同标准株牛病毒性腹泻-粘膜病病毒一致。电镜负染观察，病毒粒子呈典型粘膜病病毒形态。血凝试验表明，该病毒对鸡、兔、猪和绵羊的红细胞均无血凝性；毒力测定，该病毒的TCID50为10-5.5。理化学研究表明，该病毒对氯仿、乙醚敏感；胰酶试验中，经37℃，1小时处理的病毒，仍然能够在MDBK细胞上生长，但毒力下降3.2个滴度。耐酸性试验中，病毒在pH3.0经37℃作用1小时，毒力下降4.4个滴度；耐碱性试验中，病毒在pH9.0经37℃作用1小时，毒力下降0.4个滴度。耐热性试验中，该病毒在恒定温度50℃，设定不同时间，从30分钟到70分钟，毒力均有不同程度下降。其中，50℃作用30分钟，病毒平均下降0.6个滴度；50℃，70分钟，病毒平均下降3.7个滴度；恒定温度56℃，设定不同时间，从30分钟到70分钟，毒力也均有不同程度下降。其中，56℃作用30分钟，病毒平均下降2个滴度；56℃，70分钟，病毒完全灭活。中和试验表明，粘膜病病毒特异阳性血清能完全中和该分离毒。综上实验结果，可初步确定该分离毒属于粘膜病病毒。 分子生物学鉴定方面，选用MDV标准株的高度保守的P125区序列设计引物。合成该引物，选择梅花鹿母鹿的流产胎儿肝组织原代病料和该分离毒的各代细胞培养物，均成功地扩增出了约400bp目的片段，与国际标准毒株一致，而未接毒MDBK对照细胞PCR的扩增结果为阴性。 本研究首次从梅花鹿流产胎儿中分离出MDV，揭示梅花鹿亦可感染MDV。MDV不仅能引起梅花鹿的腹泻，同时还能造成梅花鹿母鹿的流产。本研究为梅花鹿的粘膜病防制工作提供了重要的信息资料和理论依据，同时也丰富了粘膜病病毒的研究内容。
张宝宁[10]（2006）在《牛病毒性腹泻—粘膜病病毒的分离、RT-PCR鉴定、NS2-3区基因克隆及变异分析》文中提出采取疑似牛病毒性腹泻-粘膜病的流产奶牛粪便及血凝块,处理后接种MDBK细胞,获得一株病毒。该分离毒能在MDBK细胞上形成有规律的病变,其病变效应与BVDV标准毒株相同。用双抗体夹心ELISA方法检验其余未发现病变的细胞培养物,结果均为阴性,没有分离出NCP型BVD毒株。 以牛病毒性腹泻病毒OregonC24V毒株全基因为模板,选择BVDV NS2-3基因重要区设计合成引物,对分离毒进行RT-PCR扩增,得到一条长约为665bp的片段。该分离毒基因组中无插入序列。 将此分离毒回归2月龄健康犊牛,接毒25天后扑杀剖检。犊牛表现为典型的急性病毒性腹泻症状和病变。采取脾、骨髓、肠淋巴结及血液接种MDBK细胞,细胞病变出现时间缩短,程度加剧。将此细胞毒进行RT-PCR检测,扩增出相应的665bp的片段,指示动物回归试验成功。 将PCR的扩增产物克隆到pMD18载体上,构建重组克隆质粒pMD18-T/NS2-3并转化入JM109工程菌,筛选后对重组质粒进行双酶切鉴定和PCR鉴定。结果表明,得到的阳性重组子中含有NS2-3基因重要区基因,且是正确插入到载体中的。对克隆片段进行测序,并与其它已发表的BVDV毒株进行比较,进行同源性分析。结果表明,此次分离的野毒株NS2-3重要区核苷酸序列与79.8%-100%,推导的氨基酸序列与Oregon C24V、ILLC、Osloss、VEDEVAC株同源性为83.2%-100%。由于该毒株与VEDEVAC株核苷酸序列及推导的氨基酸序列同源性均为100%,命名此野毒株为VEDEVAC-Like（HB）,属于BVDV Ib基因亚型。
二、牛病毒性腹泻－粘膜病病毒的分离鉴定（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、牛病毒性腹泻－粘膜病病毒的分离鉴定（论文提纲范文）
（1）牛病毒性腹泻粘膜病病毒E2基因的克隆、表达及间接ELISA方法的初步建立（论文提纲范文）
| 导师评阅表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 第二章 实验研究 |
| 实验一 BVDV E2蛋白基因的克隆及原核表达研究 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 目的基因的 RT-PCR 扩增 |
| 2.2 目的基因 DNA 测序结果及推导的氨基酸序列分析 |
| 2.3 重组质粒的 PCR 鉴定 |
| 2.4 重组表达载体pET-28a-E2和pET-32a-E2的鉴定 |
| 2.5 重组蛋白的诱导表达及鉴定 |
| 2.6 E2表达产物Western blot鉴定 |
| 3 讨论 |
| 实验二 BVDV E2 基因在毕赤酵母中的表达 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组质粒的酶切鉴定 |
| 2.2 重组质粒的 PCR 鉴定 |
| 2.3 阳性转化子的鉴定 |
| 2.4 目的蛋白的 SDS-PAGE 分析 |
| 2.5 目的蛋白的 Western blot 分析 |
| 3 讨论 |
| 实验三 BVDV E2 重组蛋白的纯化及间接 ELISA 方法的初步建立 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组蛋白的纯化 |
| 2.2 抗原最适包被浓度与血清最佳稀释度的确定 |
| 2.3 最佳封闭液和封闭时间的选择 |
| 2.4 酶标抗体最佳稀释浓度和最佳工作时间的选择 |
| 2.5 阴阳性临界值的确定 |
| 2.6 间接ELISA特异性试验结果 |
| 2.7 间接ELISA敏感性试验结果 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 在学校期间参与的研究课题 |
| 发表论文 |
（2）牛病毒性腹泻病毒抗体间接ELISA方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 引言 |
| 1.1 牛病毒性腹泻概述 |
| 1.2 牛病毒性腹泻病毒概述 |
| 1.2.1 病原特性 |
| 1.2.2 BVDV基因组特征 |
| 1.2.3 BVDV的分型 |
| 1.3 BVDV E2蛋白的研究进展 |
| 1.4 BVD诊断技术研究进展 |
| 1.4.1 病毒学检测技术 |
| 1.4.2 血清学检测 |
| 1.5 鉴定PI牛的诊断策略 |
| 1.6 本研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 血清及质粒 |
| 2.1.2 主要试验耗材 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 溶液的配置 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 E2基因生物信息学分析 |
| 2.2.2 E2基因密码子优化合成及重组载体的构建 |
| 2.2.3 E2基因诱导表达 |
| 2.2.4 E2蛋白的纯化 |
| 2.2.5 Western Blot鉴定 |
| 2.2.6 E2蛋白的透析及浓缩 |
| 2.2.7 E2蛋白浓度的测定 |
| 2.2.8 Opti-E2 ELISA方法的建立 |
| 2.2.9 临界值的确定与IDEXX试剂盒的对比 |
| 2.2.10 特异性试验 |
| 2.2.11 重复性试验 |
| 3 结果 |
| 3.1 E2基因基本理化性质分析结果 |
| 3.2 Protean分析结果 |
| 3.3 E2基因密码子优化合成及鉴定结果 |
| 3.4 E2重组菌诱导表达结果 |
| 3.5 E2蛋白的纯化结果 |
| 3.6 Western Blot鉴定结果 |
| 3.7 E2蛋白的透析及浓缩结果 |
| 3.8 E2蛋白浓度的测定结果 |
| 3.9 Opti-E2 ELTSA方法的优化结果 |
| 3.9.1 方阵法确定最佳抗原包被浓度及血清稀释浓度结果 |
| 3.9.2 最佳抗原包被液、包被条件的优化结果 |
| 3.9.3 最佳封闭液和封闭时间的优化结果 |
| 3.9.4 最佳血清稀释液和作用时间的优化结果 |
| 3.9.5 最佳酶标抗体的稀释液、工作浓度和作用时间的优化结果 |
| 3.9.6 最佳TMB作用时间的优化结果 |
| 3.9.7 ELISA最终反应条件的确定结果 |
| 3.9.8 临界值与IDEXX比较结果 |
| 3.10 特异性试验结果 |
| 3.11 重复性试验结果 |
| 3.11.1 蛋白批间重复试验结果 |
| 3.11.2 批内人员重复性试验结果 |
| 3.11.3 板间板内重复性试验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（3）鹿源BVDV分离鉴定、E0基因的克隆与表达及免疫原性研究（论文提纲范文）
| 内容提要 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 牛病毒性腹泻病的研究概况 |
| 1 牛病毒性腹泻病病原学 |
| 1.1 牛病毒性腹泻病毒分类位置 |
| 1.2 牛病毒性腹泻病毒的形态和理化特性 |
| 1.3 牛病毒性腹泻病毒基因组结构及功能 |
| 1.3.1 5′端非编码区 |
| 1.3.2 开放阅读框架区 |
| 1.3.3 3′端非翻译区 |
| 1.4 牛病毒性腹泻病毒基因组编码蛋白的结构及功能 |
| 1.4.1 N~(pro) |
| 1.4.2 E_0 |
| 1.4.3 E_0 |
| 1.4.4 E_1 |
| 1.4.5 E_2 |
| 1.4.6 P_7 |
| 1.4.7 NS_(2-3) |
| 1.4.8 NS_(4A)(P_(10))、NS_(4B)(P_(32))、NS_(5A)(P_(58))、NS_(5B)(P_(75)) |
| 2 牛病毒性腹泻病流行病学 |
| 2.1 牛病毒性腹泻病流行趋势和特点 |
| 2.2 牛病毒性腹泻病传染源、易感动物和传播途径 |
| 2.2.1 牛病毒性腹泻病传染源 |
| 2.2.2 牛病毒性腹泻病易感动物 |
| 2.2.3 牛病毒性腹泻病传播途径 |
| 2.3 牛病毒性腹泻病毒流行株的基因型分析 |
| 2.3.1 牛病毒性腹泻病毒国外流行株基因型 |
| 2.3.2 牛病毒性腹泻病毒我国流行株基因型 |
| 2.4 牛病毒性腹泻病流行原因 |
| 2.4.1 牛病毒性腹泻病毒与猪瘟病毒交叉感染 |
| 2.4.2 牛病毒性腹泻病毒基因型的多样性 |
| 2.4.3 牛病毒性腹泻病毒持续性感染 |
| 3 牛病毒性腹泻病临床类型 |
| 3.1 病毒性腹泻 |
| 3.2 持续性感染与免疫耐受 |
| 3.3 粘膜病 |
| 3.4 繁殖力下降 |
| 3.5 血小板减少和出血性综合症 |
| 4 牛病毒性腹泻病诊断技术 |
| 4.1 血清学中和实验 |
| 4.2 酶联免疫吸附实验(ELISA) |
| 4.3 分子生物学诊断技术 |
| 4.3.1 分子生物学诊断的基因区域 |
| 4.3.2 核酸杂交(NAH)技术 |
| 4.3.3 反转录—多聚酶链式反应(RT-PCR)技术 |
| 4.3.4 复合PCR诊断BVDV和HCV技术 |
| 5 牛病毒性腹泻病毒NCP型向CP型转化机制 |
| 5.1 外源序列的插入 |
| 5.2 自身的基因发生了重排和拷贝 |
| 5.3 外源细胞序列插入的同时伴有病毒基因的复制 |
| 5.4 缺陷干扰粒子(defectiveinterference，DI) |
| 5.5 点突变 |
| 6 牛病毒性腹泻病的综合防制 |
| 6.1 疫苗防制 |
| 6.1.1 灭活苗 |
| 6.1.2 弱毒苗 |
| 6.1.3 基因工程苗 |
| 6.2 药物防制 |
| 6.2.1 利巴韦林 |
| 6.2.2 芳香族阳离子化合物 |
| 6.2.3 复合物1453 |
| 6.2.4 干扰素 |
| 6.2.5 中药 |
| 综述二 基因免疫的研究概况 |
| 1 基因疫苗免疫机制 |
| 2 基因疫苗的组成 |
| 3 基因疫苗的特点 |
| 4 影响基因免疫效果的因素 |
| 4.1 载体质粒的影响 |
| 4.2 基因疫苗的免疫方法及途径影响 |
| 4.3 接种剂量、次数、容积及质粒质量的影响 |
| 4.4 保护性抗原基因及其所编码抗原结构的影响 |
| 4.5 基因疫苗质粒的高效导入的影响 |
| 4.6 基因疫苗免疫佐剂的影响 |
| 4.6.1 核酸质粒的免疫佐剂影响 |
| 4.6.2 细胞因子基因的影响 |
| 4.6.3 趋化因子和共刺激分子基因的影响 |
| 4.6.4 基因佐剂联合应用的影响 |
| 4.6.5 抗原靶向作用的影响 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验一 梅花鹿源牛病毒性腹泻病毒分离与鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料与仪器 |
| 1.2 病毒的分离培养和浓缩 |
| 1.3 病毒理化特性测定和病毒中和试验 |
| 1.3.1 病毒的毒力测定 |
| 1.3.2 病毒的理化学鉴定 |
| 1.3.3 中和试验鉴定 |
| 1.4 电镜负染观察 |
| 1.5 特异性引物设计与合成 |
| 1.6 病毒细胞培养物总RNA提取 |
| 1.7 反转录 |
| 1.8 PCR扩增 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 病毒的分离培养法鉴定结果 |
| 2.2 病毒理化特性测定结果 |
| 2.2.1 病毒的毒力测定结果 |
| 2.2.2 病毒的理化学鉴定结果 |
| 2.3 病毒中和试验结果 |
| 2.4 电镜负染观察鉴定结果 |
| 2.5 RT-PCR扩增鉴定结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 关于梅花鹿感染BVDV的来源 |
| 4 小结 |
| 实验二 梅花鹿源BVDV分离株NS_(2-3)基因重要区的克隆与分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 病毒培养和浓缩 |
| 1.3 RNA的提取及鉴定 |
| 1.4 引物的设计 |
| 1.5 反转录 |
| 1.6 PCR扩增 |
| 1.7 CDNA片段的克隆与鉴定 |
| 1.8 序列分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 梅花鹿源BVDV分离株RT-PCR扩增鉴定结果 |
| 2.2 梅花鹿源BVDV分离株NS_(2-3)基因重要区重组pMD18-T／NS_(2-3)克隆质粒PCR鉴定结果 |
| 2.3 梅花鹿源BVDV分离株NS_(2-3)基因重要区重组pMD18-T／NS_(2-3)克隆质粒酶切鉴定结果 |
| 2.4 梅花鹿源BVDV分离株NS_(2-3)基因重要区测序结果 |
| 2.5 梅花鹿源BVDV分离株NS_(2-3)基因重要区核苷酸序列分析结果 |
| 2.6 梅花鹿源BVDV分离株NS_(2-3)基因重要区氨基酸序列分析结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 关于梅花鹿源BVDV分离株致细胞病变机制 |
| 3.2 关于梅花鹿感染BVDV原因 |
| 3.3 关于梅花鹿BVDV分离株基因型 |
| 4 小结 |
| 实验三 梅花鹿源BVDV分离株E_0基因的克隆与序列分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 病毒培养和浓缩 |
| 1.2.2 RNA的提取 |
| 1.2.3 引物的设计 |
| 1.2.4 反转录 |
| 1.2.5 PCR扩增 |
| 1.2.6 cDNA片段的克隆与鉴定 |
| 1.2.7 序列分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 梅花鹿源BVDV分离株RT-PCR扩增结果 |
| 2.2 梅花鹿源BVDV分离株E_0基因重组pMD18-T／E_0克隆质粒PCR鉴定结果 |
| 2.3 梅花鹿源BVDV分离株E_0基因重组pMD18-T／E_0克隆质粒酶切鉴定结果 |
| 2.4 梅花鹿源BVDV分离株E_0基因测序结果 |
| 2.5 梅花鹿源BVDV分离株E_0基因序列同源性及系统进化树分析结果 |
| 2.6 梅花鹿源BVDV分离株E_0基因推导的氨基酸序列及同源性分析结果 |
| 2.7 梅花鹿源BVDV分离株E_0蛋白特性的预测及与其他瘟病毒毒株比较分析结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 关于梅花鹿源BVDV分离株基因型 |
| 3.2 关于梅花鹿和牛之问BVDV传播 |
| 3.3 关于用E_0基因核苷酸序列做BVDV基因分型依据 |
| 3.4 关于BVDV和猪瘟疫苗 |
| 3.5 关于E_0蛋白 |
| 4 小结 |
| 实验四 梅花鹿源BVDV分离株E_0基因原核表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 酶、抗体及Marker |
| 1.1.2 质粒和表达菌种 |
| 1.1.3 质粒的小量提取试剂 |
| 1.1.4 诱导表达试剂 |
| 1.1.5 SDS-PAGE试剂 |
| 1.1.6 Western-blotting试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 重组质粒pET-28a／E_0的构建 |
| 1.2.2 重组质粒pET-28a／E_0鉴定 |
| 1.2.3 诱导表达 |
| 1.2.4 蛋白质SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 1.2.5 westernb1otting分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 回收E_0基因片段结果 |
| 2.2 原核表达pET28a空载体电泳结果 |
| 2.3 原核表达载体与外源片段的定量比较结果 |
| 2.4 梅花鹿分离株E_0基因重组pET28a／E_0质粒的初选结 |
| 2.5 重组原核表达质粒PCR鉴定结果 |
| 2.6 重组原核表达质粒酶切鉴定结果 |
| 2.7 E_0基因表达产物SDS-PAGE的检测结果 |
| 2.8 E_0基因表达产物Western-blotting的检测结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 关于基因在大肠杆菌中的高效表达 |
| 4 小结 |
| 实验五 梅花鹿源BVDV分离株E_0基因的真核表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 DNA酶切、连接、反转录、PCR及回收试剂 |
| 1.1.2 质粒大量提取的试剂 |
| 1.1.3 真核表达质粒pVAX1／E_0转染BHK-21细胞材料及病毒株 |
| 1.1.4 ELISA法检测试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 重组真核表达质粒pVAX1／E_0的构建 |
| 1.2.2 真核表达工程菌pVAX1／E_0重组质粒的鉴定 |
| 1.2.3 真核表达质粒pVAX1／E_0转染BHK-21细胞 |
| 1.2.4 真核表达质粒pVAX1／E_0在真核细胞中表达的检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 真核表达质粒pVAX1转化工程菌的结果 |
| 2.2 pVAX1／E_0真核表达重组质粒PCR鉴定结果 |
| 2.3 pVAX1／E_0真核表达载体酶切鉴定结果 |
| 2.4 pVAX1／E_0大提质粒结果 |
| 2.5 RT-PCR法检测pVAX1／E_0在真核细胞中转录结果 |
| 2.6 间接ELISA法检测pVAX1／E_0在真核细胞中表达的结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 关于真核表达载体 |
| 3.2 关于基因疫苗质粒的高效导入 |
| 4 小结 |
| 实验六 梅花鹿源BVDV分离株基因苗的动物免疫试验 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 载体质粒 |
| 1.1.2 免疫学试剂 |
| 1.1.3 实验动物 |
| 1.1.4 质粒的大量提取试剂 |
| 1.1.5 ELISA法检测试剂 |
| 1.1.6 兔的淋巴细胞转化实验试剂与材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 基因苗、灭活苗的制备 |
| 1.2.2 兔的分组及各种疫苗的免疫剂量和次数 |
| 1.2.3 各种疫苗免疫家兔的抗体检测 |
| 1.2.4 T淋巴细胞转化实验 |
| 1.2.5 B淋巴细胞转化实验 |
| 1.2.6 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 梅花鹿源BVDV基因苗与灭活苗免疫家兔的抗体检测比较结果 |
| 2.2 梅花鹿源BVDV基因苗与灭活苗对家兔淋巴细胞增殖(A_(570))影响的结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 关于基因苗的优点 |
| 4 小结 |
| 实验七 梅花鹿源BVDV分离株敏感药物筛选的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 试验药物 |
| 1.1.2 MDBK细胞和BVDV病毒 |
| 1.1.3 主要化学试剂 |
| 1.1.4 试剂 |
| 1.1.5 主要仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 药物安全浓度测试试验 |
| 1.2.2 敏感药物筛选试验和MDBK单层细胞制备 |
| 2 结果 |
| 2.1 试验药物对MDBK细胞贴壁影响的结果 |
| 2.2 试验药物对MDBK细胞单层影响的结果 |
| 2.3 试验药物在MDBK细胞上最大安全浓度确定结果 |
| 2.4 先加药后加病毒方式药物抗BVDV效果比较结果 |
| 2.5 先加病毒后加药方式药物抗BVDV效果比较结果 |
| 2.6 药和病毒同时加方式药物抗BVDV效果比较结果 |
| 2.7 药物抗BVDV抑制率比较结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 关于中性红染料吸收法 |
| 3.2 关于药物对组织细胞的毒性 |
| 3.3 关于药物抗病毒作用量效关系 |
| 3.4 关于抗病毒的药物 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
（4）河南省肉牛规模化养殖场牛病毒性腹泻的诊断与防制技术研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 本文部分符号及缩略语的说明 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 牛病毒性腹泻研究进展 |
| 1 BVD的病原学 |
| 2 BVDV的分子生物学研究进展 |
| 3 BVD的流行病学 |
| 4 BVD的临床类型及其发生机理 |
| 5 BVD免疫机理的研究 |
| 参考文献 |
| 第二章 牛病毒性腹泻的实验室诊断技术及防制研究进展 |
| 1 BVD实验室诊断技术的研究 |
| 2 BVD的防制研究 |
| 参考文献 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第三章 河南省牛病毒性腹泻的流行病学调查 |
| 中文摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 英文摘要 |
| 第四章 河南省牛病毒性腹泻病毒地方株的分离及鉴定 |
| 中文摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 英文摘要 |
| 第五章 分泌抗牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立与鉴定 |
| 中文摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 英文摘要 |
| 第六章 牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体双夹心ELISA的建立及其应用 |
| 中文摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 英文摘要 |
| 第七章 牛病毒性腹泻囊素油乳剂灭活疫苗的研制 |
| 中文摘要 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 英文摘要 |
| 第八章 肉牛规模化养殖场病毒性腹泻防制措施的制定及实施效果分析 |
| 中文摘要 |
| 1 肉牛规模化养殖场BVD的防制措施 |
| 2 BVD防制措施的实施效果分析 |
| 3 小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 英文摘要 |
| 附录 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
（5）猪瘟疫苗防制奶牛、牦牛病毒性腹泻/粘膜病的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 四川部分地区奶牛、牦牛病毒性腹泻／粘膜病的流行病学与病原学研究 |
| 摘要 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 微量细胞中和试验 |
| 2.2.2 牦牛病料中病毒的分离培养与鉴定 |
| 2.2.3 奶牛及胎儿病料中病毒的分离与鉴定 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 图片和表格 |
| 表1-1 成都成年奶(公)牛血清BVD／MD抗体检测情况 |
| 表1-2 成都小奶牛血清BVDV抗体检出情况 |
| 表1-3 牦牛血清BVD抗体检出情况 |
| 图1-1 四川部分奶、牦牛BVDV抗体检出阳性率示意图 |
| 第二章 猪瘟兔化弱毒乳兔组织冻干苗的制备与质检 |
| 摘要 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 毒种的接种和家兔的测温观察 |
| 2.2.2 接种兔的剖杀及采毒 |
| 2.2.3 乳兔组织苗的制作 |
| 2.2.4 配苗 |
| 2.2.5 疫苗的检验 |
| 2.2.6 疫苗的用法和用量 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 牛注射猪瘟疫苗后的免疫应答及免疫保护性研究 |
| 摘要 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 微量细胞中和试验 |
| 2.2.2 反相微量细胞中和试验 |
| 2.2.3 交叉中和试验 |
| 2.2.4 奶牛E-玫瑰花环(全量法)试验 |
| 2.2.5 MTT检测奶牛外周血淋巴细胞增殖状况研究 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 图片和表格 |
| 表3-1 给奶、犊牛注射猪瘟乳兔组织苗后检出BVD抗体情况 |
| 表3-2 成年奶(公)牛注射猪瘟苗后不同时间检出BVD抗体情况表 |
| 表3-3 猪瘟血清与BVDV抗原交叉中和试验结果 |
| 表3-4 注射猪瘟苗后不同时间检出E—玫瑰花环率情况 |
| 表3-5 注苗前后细胞免疫检测结果 |
| 表3-6 奶犊牛注射猪瘟苗前后的细胞免疫情况 |
| 表3-7 猪瘟苗预防BVD／MD的免疫程序表 |
| 图3-1 奶(犊)牛注射猪瘟苗后不同时间检出BVD／MD抗体示意图 |
| 图3-2 注射猪瘟苗后不同时间牛E—玫瑰花环率比较 |
| 图3-3 奶(犊)中组淋转(MTT)试验OD值对比图 |
| 第四章 猪瘟乳兔组织苗对牛生产性能及安全性的研究 |
| 摘要 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 奶牛的短期安全性试验 |
| 2.2.2 牦牛短期安全性试验 |
| 2.2.3 奶牛注苗前后产奶量的测定 |
| 2.2.4 奶牛注苗前后体温测定 |
| 2.2.5 奶牛血常规及细胞分类计数 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 图片和表格 |
| 表4-1 奶牛短期性安全试验 |
| 表4-2 奶牛注射猪瘟苗前后体温测量结果 |
| 表4-3 注苗猪瘟兔化弱毒乳兔组织苗对产奶量的影响 |
| 表4-4 奶(犊)牛注射猪瘟苗前后血常规检测结果 |
| 第五章 猪瘟兔化弱毒苗对牛病毒性腹泻／粘膜病防制应用研究 |
| 摘要 |
| 1 引言 |
| 2 材料 |
| 3 方法 |
| 4 结果 |
| 4.1 四川的应用情况 |
| 4.2 青海牦牛应用情况 |
| 4.3 内蒙古奶牛应用情况 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 图片和表格 |
| 表5-1 猪瘟苗免疫效果的比较 |
| 表5-2 奶犊牛注射猪瘟苗后的免疫保护情况 |
| 文献综述：牛病毒性腹泻／粘膜病的研究进展 |
| 摘要 |
| 1 分类及同类成员相关研究进展 |
| 2 牛病毒性腹泻／粘膜病毒的分子生物学研究进展 |
| 3 BVDV／MDV CP型和NCP型的研究进展 |
| 4 牛病毒性腹泻／粘膜病免疫机理的研究进展 |
| 5 牛病毒性腹泻／粘膜病的临床类型与致病机理研究进展 |
| 6 牛病毒性腹泻／粘膜病的实验室诊断技术研究进展 |
| 7 牛病毒性腹泻／粘膜病的防治研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间获奖成果、发表的论文及出版的论着情况 |
| 声明 |
（6）牛病毒性腹泻-黏膜病诊断方法研究进展（论文提纲范文）
| 1 病毒分离鉴定 |
| 2 琼脂扩散试验 |
| 3 中和试验 |
| 4 动物接种法 |
| 5 电镜检查 |
| 6 免疫荧光技术 |
| 7 酶联免疫吸附试验 |
| 8 免疫过氧化物酶技术 |
| 9 核酸杂交技术 |
| 10 聚合酶链反应技术 |
| 11 结语 |
（8）牛病毒性腹泻-粘膜病的最新研究进展（论文提纲范文）
| 1 病原特性 |
| 1.1 病原的基本特性 |
| 1.2 病原的种类 |
| 1.3 病原的基因组结构 |
| 2 临床症状 |
| 3 流行病学 |
| 4 致病机理 |
| 5 病理变化 |
| 6 诊断方法 |
| 6.1 病毒分离 |
| 6.2 电镜技术 |
| 6.3 荧光抗体法 |
| 6.4 对流免疫电泳 |
| 6.5 琼脂扩散法 |
| 6.6 酶联免疫吸附试验 (ELISA) |
| 6.7 血清中和试验 (SNT) |
| 6.8 检测核酸方法 |
| 6.8.1 核酸探针 |
| 6.8.2 复合PCR检测 |
| 7 预防控制 |
| 7.1 BVDV防制现状 |
| 7.2 疫苗使用的利弊 |
| 7.3 我国防制BVDV现状 |
（9）梅花鹿粘膜病病毒的分离鉴定（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 试验 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 病毒的分离 |
| 1.2.2 病毒的形态学鉴定 |
| 1.2.3 病毒的生物学特性鉴定 |
| 1.2.4 病毒的理化学鉴定 |
| 1.2.5 病毒的中和实验鉴定 |
| 1.2.6 病毒的分子生物学鉴定 |
| 2 结果 |
| 2.1 病毒的分离培养结果 |
| 2.2 形态学鉴定结果 |
| 2.3 生物学特性鉴定结果 |
| 2.4 理化学鉴定结果结果 |
| 2.5 中和试验鉴定结果 |
| 2.6 病毒的分子生物学鉴定结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 关于病毒的危害及流行原因 |
| 3.2 关于病毒的的特性 |
| 3.3 关于细胞株的选择 |
| 3.4 关于病毒的来源 |
| 3.5 关于细胞培养过程中的防污染问题 |
| 3.6 关于提高病毒的分离率的问题 |
| 3.7 关于特异引物问题 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（10）牛病毒性腹泻—粘膜病病毒的分离、RT-PCR鉴定、NS2-3区基因克隆及变异分析（论文提纲范文）
| 1 引言 |
| 1.1 病原学 |
| 1.2 分子生物学特征 |
| 1.2.1 基因组结构 |
| 1.2.2 编码的蛋白 |
| 1.3 BVDV生物型转化的分子机制 |
| 1.3.1 外源细胞序列的插入 |
| 1.3.2 病毒自身基因的拷贝和重排 |
| 1.3.3 病毒基因重复复制和插入序列共同存在 |
| 1.3.4 缺陷干扰粒子 |
| 1.3.5 点突变 |
| 1.4 研究的目的意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 标准毒及标准阳性血清 |
| 2.1.2 MDBK细胞 |
| 2.1.3 实验动物 |
| 2.1.4 病料来源 |
| 2.1.5 细胞培养所需主要试剂 |
| 2.1.6 双抗体夹心ELISA所需的主要试剂 |
| 2.1.7 RT-PCR所需的主要化学试剂 |
| 2.1.8 RT-PCR所需的主要生物学试剂 |
| 2.1.9 克隆所需主要试剂 |
| 2.1.10 所需主要仪器 |
| 2.1.11 分析软件 |
| 2.1.12 主要溶液的配制 |
| 2.2 病毒培养及细胞毒浓缩 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 病料的处理 |
| 2.2.3 病毒的接种 |
| 2.2.4 病毒的浓缩 |
| 2.3 双抗体夹心ELISA检测BVDV抗原 |
| 2.4 RT-PCR方法检测BVDV抗原 |
| 2.4.1 引物的设计合成 |
| 2.4.2 病毒RNA的提取 |
| 2.4.3 反转录合成cDNA |
| 2.4.4 PCR扩增 |
| 2.4.5 扩增产物的检测 |
| 2.5 动物回归试验 |
| 2.6 扩增片段的克隆及序列分析 |
| 2.6.1 扩增产物的纯化 |
| 2.6.2 重组质粒pMD18-T／NS2-3的构建 |
| 2.6.3 重组子的筛选及质粒的提取 |
| 2.6.4 重组质粒的鉴定 |
| 2.6.5 克隆片段的测序及同源性分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 细胞培养及病毒增殖结果 |
| 3.2 双抗体夹心ELISA检测结果 |
| 3.3 RT-PCR检测结果 |
| 3.4 动物回归试验结果 |
| 3.4.1 试验犊牛症状及病理变化 |
| 3.4.2 试验犊牛病料细胞培养结果 |
| 3.4.3 试验犊牛病料细胞培养浓缩毒RT-PCR结果 |
| 3.5 重组质粒pMD18-T／NS2-3的酶切鉴定及PCR鉴定 |
| 3.6 扩增片段的序列测定及同源性分析结果 |
| 3.6.1 核苷酸序列测定结果 |
| 3.6.2 氨基酸序列测定结果 |
| 3.6.3 系统发生分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 病料的来源 |
| 4.2 CP型BVDV的致病类型 |
| 4.3 病毒的分离培养 |
| 4.4 RT-PCR扩增NS2-3基因重要区 |
| 4.4.1 引物的设计 |
| 4.4.2 RNA的提取 |
| 4.5 NS2-3基因重要区序列分析 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的学术论文 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
四、牛病毒性腹泻－粘膜病病毒的分离鉴定（论文参考文献）
- [1]牛病毒性腹泻粘膜病病毒E2基因的克隆、表达及间接ELISA方法的初步建立[D]. 刘昱成. 石河子大学, 2014(03)
- [2]牛病毒性腹泻病毒抗体间接ELISA方法的建立[D]. 赵洪哲. 内蒙古农业大学, 2019(01)
- [3]鹿源BVDV分离鉴定、E0基因的克隆与表达及免疫原性研究[D]. 郜玉钢. 吉林农业大学, 2005(04)
- [4]河南省肉牛规模化养殖场牛病毒性腹泻的诊断与防制技术研究[D]. 张光辉. 南京农业大学, 2004(02)
- [5]猪瘟疫苗防制奶牛、牦牛病毒性腹泻/粘膜病的研究[D]. 刘亚刚. 四川大学, 2004(01)
- [6]牛病毒性腹泻-黏膜病诊断方法研究进展[J]. 张宁,秦建华,赵博伟,张富梅,胡晓悦,赵月兰. 动物医学进展, 2008(02)
- [7]河北省奶牛牛病毒性腹泻/粘膜病病毒的分离鉴定[J]. 赵月兰,杨汉春,左玉柱,秦建华,刘占民,范京惠,张宁. 中国动物检疫, 2006(11)
- [8]牛病毒性腹泻-粘膜病的最新研究进展[J]. 孔繁德,陆承平. 福建畜牧兽医, 2005(03)
- [9]梅花鹿粘膜病病毒的分离鉴定[D]. 郑全. 吉林农业大学, 2004(04)
- [10]牛病毒性腹泻—粘膜病病毒的分离、RT-PCR鉴定、NS2-3区基因克隆及变异分析[D]. 张宝宁. 河北农业大学, 2006(08)