一、蛋白激酶A在培养胎鼠皮层神经元缺氧凋亡中的作用（论文文献综述）
覃芸芸[1]（2021）在《Roflupram通过抑制神经元自噬减轻脑缺血损伤的作用及机制研究》文中研究指明目的:脑卒中（stroke）是一种急性的脑损伤疾病,主要表现为脑血管病变引起的脑组织损伤及相关神经功能损伤。目前美国食品药品监督管理局（FDA）仅批准组织纤溶酶原激活剂（tPA）用于脑缺血损伤的治疗。因tPA治疗的局限性,所以寻找新的治疗策略尤为重要和迫切。研究表明抑制磷酸二酯酶4（phosphodiesterase 4,PDE4）对脑缺血损伤有保护作用,而且可通过自噬对脑缺血损伤发挥调控作用,但具体机制尚未明确。基于PDE4、脑缺血损伤和自噬之间的密切关系,本研究旨在考察Roflupram（ROF）在脑缺血损伤中对自噬的调控作用及机制。方法:（1）进行小鼠海马神经元细胞（HT-22）和原代皮层神经元培养,利用无糖培养基和缺氧小室建立氧糖剥夺（oxygen and glucose deprivation,OGD）模型;采用乳酸脱氢酶检测试剂盒（LDH）和Cell Counting Kit-8（CCK-8）细胞活力测试盒检测ROF对OGD造模后细胞毒性和细胞活力的影响;通过免疫印迹法（Western blotting）检测ROF对OGD造模后细胞神经生长相关蛋白-43（GAP-43）和突触蛋白1（Synapsin-1）的影响;通过四甲基罗丹明乙酯（TMRE）试剂盒和MitoSOX试剂盒检测ROF对OGD造模后细胞线粒体功能的影响;通过转染PDE4B siRNA（siPDE4B）来进一步验证抑制PDE4对OGD诱导的HT-22细胞毒性的作用。（2）通过Western blotting检测ROF对OGD造模后神经元细胞中自噬相关蛋白如微管相关蛋白轻链3（LC3）、自噬底物蛋白sequestosome 1（p62）和Beclin-1蛋白表达水平的影响;通过溶酶体荧光探针（LYT）和CYTO自噬检测试剂盒检测ROF对OGD造模后神经元细胞中酸性囊泡和自噬囊泡的影响;通过Western blotting检测ROF对OGD造模后神经元细胞中蛋白激酶B（AKT）和雷帕霉素靶蛋白（mTOR）磷酸化水平的影响;给予自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）干预,通过LDH法和CYTO染色检测3-MA的作用;给予AKT抑制剂MK-2206和mTOR抑制剂雷帕霉素（Rapamycin,RAPA）干预,通过LDH法和Western blotting检测两者的作用。（3）采用线栓法在SD大鼠上构建大脑中动脉阻塞（middle cerebral artery occlusion,MCAO）导致的局灶性脑缺血模型;大鼠缺血2 h后腹腔注射2 mg/kg ROF,再灌注24 h后进行神经功能评分;再灌注24 h后进行TTC染色,测定大鼠脑梗死面积测定;采用Western blotting检测ROF对MCAO造模后自噬相关蛋白和突触相关蛋白的影响。结果:（1）利用无糖培养基和缺氧小室建立OGD模型,给予ROF（20 μM）处理HT-22细胞和原代皮层神经元后,均降低细胞毒性和提高细胞活力。（2）Western blotting结果发现,ROF减少OGD诱导的HT-22细胞中突触相关蛋白GAP-43和Synapsin-1的丢失。（3）TMRE和MitoSOX染色结果显示,ROF逆转OGD诱导的HT-22细胞内线粒体膜电位水平的降低以及线粒体中超氧阴离子水平的升高。（4）敲低PDE4B逆转OGD诱导的HT-22细胞毒性的升高。（5）Western blotting、LYT和CYTO染色结果发现,ROF减少OGD造模后上调的细胞LC3Ⅱ和Beclin-1的表达水平、增加下调的细胞p62水平、增加AKT在Ser 473位点的磷酸化水平、增加mTOR在Ser 2448的磷酸化水平、减少细胞酸性囊泡和自噬囊泡,阳性对照药Rolipram能发挥一致的作用。（6）LDH、Western blotting和CYTO染色结果显示,自噬抑制剂3-MA可降低OGD造模后的细胞毒性,与ROF的作用一致;ROF联用3-MA可进一步降低自噬囊泡数量。（7）LDH 和 Western blotting 结果显示,AKT 抑制剂 MK-2206 和 mTOR 抑制剂RAPA均能阻断ROF的作用。（8）TTC染色和神经功能评分结果显示,ROF降低MCAO大鼠脑梗死面积和神经功能评分,改善MCAO大鼠的神经功能症状。（9）Western blotting结果显示,ROF降低MCAO大鼠局灶性脑缺血后皮层缺血半暗带区自噬相关蛋白LC3Ⅱ和Beclin-1的表达水平、升高GAP-43、Synapsin-1和突触后密度蛋白95（PSD95）的表达水平。结论:PDE4抑制剂ROF能减轻OGD诱导的神经元损伤,其机制可能是通过AKT/mTOR信号通路抑制神经元自噬以及改善突触功能。ROF能改善MCAO大鼠的神经功能症状,其机制可能与抑制自噬和上调突触相关蛋白进而改善突触功能有关。
任非非[2]（2021）在《基于AMPK/SIRT1/PGC-1α通路研究醒脾解郁方对抑郁大鼠海马神经元突触重塑的影响》文中研究说明目的:观察AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路介导的线粒体生物合成对抑郁大鼠海马神经元突触可塑性的影响及醒脾解郁方干预效应。方法:实验研究分为四部分。第一部分:140只雄性SD大鼠随机分为空白组（CON）、模型组（MOD）、醒脾解郁方组（XPJYF）、草酸艾司西酞普兰组（EOT）、醒脾解郁方联合草酸艾司西酞普兰组（XPJYF+EOT）。每组根据应激时间各分为3w、6w组。除CON外,其余各组采用慢性束缚应激（CRS）造模,共21d。各组造模的同时给予相应药物干预。造模前及造模第3 w、6 w时进行行为学观察。造模3 w时评价脾虚程度,结合行为学实验,评价模型成功与否。取材后以HE染色和尼氏染色观察海马CA1区神经元病理变化及XPJYF干预效应。第二部分:大鼠分组及干预同研究一。取材后观察海马CA1区神经元突触及线粒体超微结构;分析线粒体及神经元突触体视学指标;高尔基染色观察神经元轴树突分支变化;提取海马突触体,免疫荧光染色观察突触重塑蛋白表达;Western blot检测线粒体合成蛋白含量;检测海马线粒体呼吸链酶复合物Ⅰ～Ⅳ及线粒体酶活性。第三部分:制备XPJYF低、中、高剂量组含药血清;体外分离、培养原代海马神经元细胞并鉴定;采用CCK8法进行XPJYF细胞毒性实验;建立皮质酮（CORT）诱导海马神经元损伤模型,分为 CON、CORT、CORT+X（H）、（M）、（L）、CORT+E、CORT+E+X（H）、（M）、（L）共9组。以细胞免疫荧光观察SYN、PSD-95表达及海马神经元线粒体成像;Western blot检测线粒体生物合成及突触重塑蛋白表达;ELISA及RT-PCR检测5-HT、DA及其受体情况。第四部分:大鼠分组及干预同研究一。取材后以免疫荧光三标染色观察海马CA1区NeuN/CD31/GFAP表达;RT-PCR检测海马AMPK/SIRT1/PGC-1α通路基因表达;免疫组化及 Western blot 检测 NeuN、GFAP、VEGF、Collagen Ⅳ蛋白表达。结果:1.第一部分1.1宏观表征:造模前大鼠状态良好,反应灵敏,活动自如。造模3 w后,反应降低,神态倦怠,活动减少,毛发干枯或发黄,粪便逐渐变稀,至6 w时表现更明显,各用药组较模型组有改善。1.2体质量变化:模型各组大鼠体重较空白组降低（P<0.01）。与模型组比较,各用药组体重增加（P<0.01,P<0.05）。与中药组比较,西药3 w、联合各组体重增加（P<0.01,P<0.05）,西药6 w组降低（P<0.05）。联合各组体重较西药组增加（P<0.01,P<0.05）。1.3行为学:模型各组糖水偏好率（SPT）较空白组降低（P<0.01）,强迫游泳不动时间（FST）延长（P<0.01）。与模型组比较,西药、联合各3 w及各用药6w组SPT升高,FST缩短（P<0.01,P<0.05）。联合各组SPT较中药、西药组升高（P<0.01,P<0.05）,FST缩短（P<0.01,P<0.05）。与同组别基线比较,各组各时间点SPT降低（P<0.01）,模型各组及中药、西药各6 w组FST延长（P<0.01,P<0.05）。1.4血清淀粉酶、尿D-木糖排泄率比较:造模3 w后血清淀粉酶和尿D-木糖排泄率均降低（P<0.01）,至造模6周时更低（P<0.01）。1.5海马CA1区病理改变:HE染色:空白组海马CA1区神经元数量、分布、形态均无异常,圆形胞核清晰居中。模型3w组神经元数量减少,排列及形态不规则,细胞大小不一,部分呈三角形,细胞核深染、固缩,核仁显示不清;至6w时损伤进一步加重。各用药组有不同程度改善,以中药6 w组和联合组较为明显。尼氏染色:空白组海马CA1区神经元正常分布,胞质内可见丰富的尼氏小体,近胞核处呈“虎斑样”,远端呈细颗粒样,核仁清晰。模型3 w组细胞排列散乱,胞质内尼氏小体减少。至6w时,损伤加重,细胞皱缩明显,部分细胞尼氏体减少,并可见中央性染色质溶解现象。各用药组损伤逐渐恢复,以西药3 w组及中药6 w组明显。2.第二部分2.1神经元超微结构:正常组神经元突起较多,线粒体正常,突触结构完整,突触小泡较多。造模3 w后,线粒体肿胀,嵴断裂,突触小泡数量减少。至造模6 w,损伤加重,突触间隙显示不清,突触小泡减少,聚集分布,线粒体膜破坏,嵴断裂,基质空泡样变。各用药组上述损伤减轻。2.2线粒体体视学:模型各组Vvm较空白组升高（P<0.01）,NM、δ、δm降低（P<0.01）。与模型组比较,各给药组Vvm降低（P<0.01,P<0.05）,各6 w组NM升高（P<0.01）,中药、联合各组及西药6 w组δ、δm升高（P<0.01,P<0.05）。较中药组,西药6 w组δ、联合6 w组Vvm降低（P<0.01）,联合各组δm升高（P<0.01,P<0.05）。2.3突触体视学:模型各组数密度（Nv）、面密度（Sv）、突触小泡面数密度（NS）均较空白组降低（P<0.01）。中药、联合各6 w组Nv、Sv、Ns较模型组升高（P<0.01,P<0.05）。2.4高尔基染色:模型各组Sholl交点数及树突棘较空白组减少（P<0.01）。中药、联合各组Sholl交点数较模型组增多（P<0.01,P<0.05）,中药、西药各6 w组及联合各组树突棘密度升高（P<0.01,P<0.05）,且联合6 w组较中药、西药各6w组升高（P<0.05）。2.5突触体突触重塑蛋白:与空白组比较,模型3 w组GAP-43、PSD-95增加（P<0.01）,6w组降低（P<0.05）,各组SYN、syntaxin 1均降低（P<0.01）。与模型组比较,中药、联合各组及西药3 w组GAP-43、PSD-95增加（P<0.01,P<0.05）,中药、联合各组SYN升高（P<0.01）,中药、西药及联合各6 w组syntaxin 1升高（P<0.01,P<0.05）。与中药组比较,西药6 w组SYN降低（P<0.05）,联合6 w组GAP-43增加（P<0.01）。2.6线粒体生物合成蛋白:模型各组SIRT1、PGC-1α、AMPK-α1、Tfam、NRF1较空白组均降低（P<0.01）。与模型组比较,西药3 w组SIRT1和AMPK-α1、联合各组SIRT1、PGC-1α、Tfam升高（P<0.01,P<0.05）。与中药组比较,联合3 w组AMPK-α1、6w组PGC-1α表达升高（P<0.01）。3.第三部分3.1细胞毒性实验:经免疫荧光鉴定,培养的海马神经元符合神经元细胞特征。经CCK8实验,确定醒脾解郁方含药血清浓度为高剂量组10%、中剂量组10%和低剂量组20%,作用时间确定为24h。3.2线粒体生物合成蛋白表达:与CON组比较,CORT组、CORT+E组SIRT1、PGC-1α、NRF1、Tfam 降低（P<0.01）。与 CORT 组比较,CORT+X 的 H、M 组 SIRT1、NRF1、Tfam 升高（P<0.01）,CORT+E 组 SIRT1 降低（P<0.05）,CORT+X（H）组PGC-1α 升高（P<0.01）。与 CORT+E 组比较,CORT+E+X（H）组 PGC-1α、Tfam 升高（P<0.05）,CORT+E+X（M）组 NRF1、Tfam 升高（P<0.01）。3.3突触重塑蛋白表达:与CON组比较,CORT组、CORT+E组GAP-43、SYN、PSD-95 降低（P<0.01）。与 CORT 组比较,CORT+X 的 H、M 各组 GAP-43、SYN 升高（P<0.01）,CORT+X（H）组 PSD-95 升高（P<0.01）。与 CORT+E 组比较,CORT+E+XPJYF 的 H、M、L 组 GAP-43、SYN、PSD-95 升高（P<0.01,P<0.05）。3.4 5-HT、DA及其受体mRNA含量:与CON组比较,CORT组、CORT+E组5-HT、DA、5-HT1AR mRNA、DRD1 mRNA 降低（P<0.01）。与 CORT 组比较,CORT+X（H）组 5-HT、DA 升高（P<0.05）,CORT+E 组 5-HT 降低（P<0.05）,CORT+X 的 H、M组 5-HT1AR mRNA、DRD1 mRNA 升高（P<0.01）。与 CORT1+E 组比较,CORT+E+X（H）组 5-HT 升高（P<0.05）,CORT+E+XPJYF 的 H、M、L 组 5-HT1AR mRNA、DRD1 mRNA 升高（P<0.01,P<0.05）。4.第四部分4.1线粒体合成基因表达:模型各组SIRT1 mRNA、PGC-1α mRNA较空白组降低（P<0.01）。与模型组比较,各给药组 SIRT1 mRNA、PGC-1αmRNA、AMPK-α1 mRNA 均升高（P<0.01）,中药6w组、西药及联合各组NRF1 mRNA升高（P<0.01）,西药3 w组、中药及联合各组Tfam mRNA表达均升高（P<0.01,P<0.05）。与中药组比较,联合各组SIRT1 mRNA、PGC-1α mRNA、NRF1 mRNA 均升高（P<0.01）,西药 3 w 组 SIRT1 mRNA升高（P<0.01）。4.2突触微环境蛋白表达:模型各组NeuN、GFAP、VEGF较空白组降低（P<0.01）。与模型组比较,中药及联合各组NeuN、GFAP、VEGF均升高（P<0.01,P<0.05）,西药各组GFAP升高（P<0.01）,西药3 w组VEGF升高（P<0.01）。与中药组比较,西药各组GFAP 降低（P<0.05）,联合各组 GFAP 升高（P<0.01）,联合 3 w 组 VEGF 升高（P<0.05）。结论:1.慢性束缚应激3周时,动物模型符合肝郁脾虚型抑郁症标准,脑内海马CA1区神经元损伤,且随应激时间延长,损伤程度加重。中药醒脾解郁方和西药草酸艾司西酞普兰均可不同程度减轻神经元损伤,改善抑郁样行为,中药的远期保护优势较西药明显,且以两者联合应用作用更为显着;2.抑郁模型大鼠脑内海马CA1区神经元突触超微结构破坏,线粒体损伤,突触重塑功能降低,与AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路介导的线粒体生物合成减少直接相关。中药醒脾解郁方和西药草酸艾司西酞普兰均可动态调控该信号通路,促进海马神经元突触重塑,但二者作用的优势环节不同,西药在调节神经递质方面更具优势,而中药在改善线粒体功能方面更为明显,且中药的远期作用效果优于西药。3.抑郁症海马神经元突触微环境中星形胶质细胞、微血管内皮细胞及微血管基底膜损伤,与神经元突触重塑相关。中药醒脾解郁方可通过调控AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路增加线粒体生物合成,保护突触微环境,促进抑郁症神经重塑,作用较西药草酸艾司西酞普兰更具优势,且中西药联合应用效果显着。
方琼[3]（2021）在《牛磺酸促进生长受限胎鼠近远期脑发育及机制研究》文中指出背景:胎儿生长受限（FGR）是导致患儿近期和远期神经发育障碍的主要原因之一。FGR脑发育近期损伤表现为脑内神经干细胞（NSC）增殖分化减少,细胞构成比、突触连接异常,脑代谢异常;远期为运动学习障碍,神经行为异常。胎儿NSC分化是脑发育基础,海马是学习认知关键部位。补充牛磺酸激活蛋白激酶A（PKA）-环磷酸腺苷反应结合蛋白（CREB）通路改善FGR胎脑发育,相关机制尚待深入研究;对远期海马神经细胞、代谢功能、突触发育、学习认知影响亦不明确。本研究建立FGR胎鼠NSC模型和幼鼠模型,采用分子生物、脑功能、行为学检测手段,探讨牛磺酸促进FGR胎脑NSC分化机制;研究其保护FGR幼鼠海马神经元,改善代谢水平;增加海马突触素（Syn）表达,促进幼鼠认知发育。方法:全程饥饿法建立FGR胎鼠模型,脑室管膜下区组织解离培养成神经球,分对照组、FGR组、牛磺酸组、H89（PKA抑制剂）组和牛磺酸+H89组。CCK8及细胞计数法检测NSC增殖力;免疫荧光法检测NSC分化神经元和星形胶质细胞;RT-PCR和Western blot（WB）检测分化细胞表达PKA、CREB和脑源性神经营养因子（BDNF）mRNA及蛋白。建立FGR幼鼠模型,分对照组、FGR组、产前牛磺酸组（FGR孕鼠孕7天后补充至分娩）和生后牛磺酸组（FGR新生鼠生后补充14天）,MRS分析14天幼鼠海马细胞代谢特点;免疫组化和WB法观察海马区神经细胞组成。28天幼鼠行感觉运动能力测试,检测海马区Syn蛋白表达。结果:FGR组胎鼠NSC增殖分化能力低,分化Tuj-1（+）神经元比例低于对照组,GFAP（+）星形胶质细胞比例增高。牛磺酸提高分化NSC表达PKA、CREB、BDNF mRNA和蛋白,增加Tuj-1（+）神经元比例,降低GFAP（+）细胞比例。14天FGR幼鼠海马NAA/Cr和Gln/Cr、NeuN蛋白表达降低,Cho/Cr和mI/Cr、GFAP蛋白表达增高。产前补充牛磺酸,提高FGR幼鼠海马NAA/Cr、NeuN蛋白表达,接近对照组（p>0.05）,生后补充值低于对照组（p<0.05）。产前和生后补充均可降低FGR幼鼠海马Cho/Cr和mI/Cr、GFAP蛋白表达。海马区NAA/Cr与NeuN蛋白、mI/Cr与GFAP蛋白表达成正相关（p<0.05）。FGR组28天幼鼠悬吊、平衡木实验分数及海马区Syn蛋白表达降低,产前补充牛磺酸提高FGR幼鼠测试分及Syn蛋白表达,接近对照组（p>0.05）,生后补充值低于对照组（P<0.05）。功能学测试分数与海马区Syn蛋白表达呈正相关（p<0.05）。结论:牛磺酸激活PKA-CREB-BDNF信号通路促进FGR胎脑NSC增殖分化,改善神经元/胶质细胞比例。产前补充牛磺酸通过提高FGR幼鼠海马神经元/胶质细胞比例,改善海马代谢水平;同时,还能通过增加FGR幼鼠海马区Syn表达,促进突触发育,提高感觉运动能力,促进认知发育。
刘洁[4]（2020）在《生后早期PM2.5染毒所致脑功能障碍及其机制研究》文中研究指明第一部分生后早期PM2.5染毒对大鼠脑功能及结构的影响目的:探索生后早期细颗粒物（Fine particulate matter,PM2.5）染毒对大鼠脑功能与海马结构的影响。方法:将Sprague–Dawley（SD）新生大鼠随机分为四组（n=20/组）,其中,高剂量染毒组、低剂量染毒组、生理盐水组,于生后第3天（Postnatal Day3,PND3）到PND15分别给予大鼠10mg/kg、2mg/kg PM2.5悬液、生理盐水连续滴鼻,每日1次,空白对照组（n=20/组）,仅将大鼠拿出笼位,不作任何处理。于大鼠幼年期（PND28）和成年期（PND60）时分别进行以下实验:（1）高架十字迷宫、强迫游泳、Morris水迷宫实验,评估各组大鼠的焦虑状态、抑郁样行为、空间学习记忆能力;（2）苏木素-伊红（Hematoxylin-Eosin,HE）染色和尼氏染色观察各组大鼠海马CA1和CA3区的形态结构变化。（3）另采用18日龄SD胎鼠,构建海马神经元原代培养体系,在神经元培养的第3天,分别给予0、10、50和250μg/mlPM2.5连续染毒,在培养第4天和第7天,利用CCK8实验检测各组海马神经元活性的变化;在培养第7天,免疫荧光观察各组神经元形态。结果:（1）高架十字迷宫实验:到幼年期,高剂量染毒组和低剂量染毒组大鼠的开放臂进入次数百分比均低于生理盐水组,以高剂量染毒组为着（p均<0.05）;而至成年期,仅高剂量染毒组大鼠的开放臂进入次数百分比、开放臂停留时间百分比均低于生理盐水组（p均<0.05）;（2）强迫游泳实验:高剂量PM2.5染毒后,成年期大鼠的不动潜伏期明显短于生理盐水组（p<0.05）;（3）Morris水迷宫实验:高剂量染毒组大鼠在幼年期时,与生理盐水组相比,定位航行实验训练的第4天和第5天中的逃避潜伏期均显着延长（p<0.01、p<0.05）;空间探索实验中的跨越平台次数明显减少（p<0.05）;（4）HE染色和尼氏染色:不同剂量PM2.5染毒大鼠,幼年期均出现PM2.5染毒大鼠海马CA1区和CA3区均出现细胞排列松散、细胞层数减少以及尼氏小体减少的改变,且以高剂量染毒组为着,而在成年期,仅有高剂量染毒组大鼠存在类似改变。（5）原代培养体系中,NF200阳性细胞大于90%,证明海马神经元原代培养体系构建成功;（6）CCK8检测显示,与对照组相比,神经元培养第4天时,50μg/ml PM2.5染毒组和250μg/ml PM2.5染毒组的神经元活性均降低,以250μg/ml PM2.5染毒组为着（p<0.01、p<0.001）,在培养第7天,两个染毒组的神经元活性均进一步下降（p<0.05、p<0.001）;（3）免疫荧光显示50μg/ml PM2.5染毒组神经元稍呈聚团生长表现,250μg/ml PM2.5染毒后,细胞数明显减少,失去正常的形态,聚团现象严重,细胞间分界不明,故选取50μg/ml作为PM2.5的染毒浓度,进行后续机制研究。结论:生后早期PM2.5染毒可导致大鼠情绪行为改变,空间学习记忆能力下降以及海马结构损伤;PM2.5染毒可影响海马神经元活性与形态结构;PM2.5的神经毒性作用呈剂量依赖性和时间依赖性,染毒剂量越大或染毒时间越长,脑损伤越重,高剂量PM2.5染毒所致的脑损伤可持续至成年期。第二部分突触损伤在PM2.5染毒所致脑功能障碍中的作用目的:探究PM2.5染毒对海马组织和海马神经元突触结构与功能的影响。方法:将SD大鼠随机分为PM2.5高、低剂量染毒组、生理盐水组和空白对照组（n=28/组）,参照第一部分方法建立相关模型,分别于幼年期（PND28）和成年期（PND60）,采用电生理实验检测各组大鼠海马Schaffer侧枝-CA1神经通路的长时程增强（Long term potentiation,LTP）;透射电镜观察各组大鼠海马突触超微结构;Western blot实验检测突触后致密蛋白95（postsynaptic density-95,PSD95）、生长相关蛋白43（Growth associated protein-43,GAP43）、突触素（synaptophysin,SYP）的蛋白表达水平。同时,将原代培养海马神经元分为对照组和PM2.5染毒组,染毒组在神经元培养的第3天,给予50μg/ml PM2.5连续染毒24h和96h,在培养第7天,采用透射电镜检测两组神经元突触形态;并分别在培养第4天和第7天后,采用免疫荧光和Western blot检测两组神经元PSD95、GAP43、SYP蛋白的表达量。结果:（1）电生理实验:与生理盐水组相比,高剂量和低剂量PM2.5染毒后,幼年期大鼠海马的Schaffer侧枝-CA1神经通路LTP均降低（p<0.001、p<0.01）,而成年期,仅高剂量染毒组大鼠海马的Schaffer侧枝-CA1神经通路LTP明显降低（p<0.001）;（2）经透射电镜观察,高剂量PM2.5染毒后,大鼠在幼年期和成年期的海马突触个数、突触致密物厚度以及突触前膜活性带长度均显着少于生理盐水组（P均<0.05）;（3）Western blot实验:与生理盐水组相比,高剂量PM2.5染毒后,幼年期大鼠海马PSD95蛋白、GAP43蛋白、SYP蛋白的表达量均显着降低（p<0.01或<0.001）,而低剂量PM2.5染毒后,仅PSD95蛋白表达显着下降（p<0.05）;至成年期,仅高剂量染毒组的PSD95蛋白和SYP蛋白的表达量显着低于生理盐水组（p均<0.05）。（4）透射电镜显示与对照组相比,PM2.5染毒后,神经元突触前膜活性带长度缩短,突触后致密物厚度变薄;（5）免疫荧光和Western blot实验结果均提示,与对照组相比,在神经元培养第4天,染毒组PSD95、GAP43和SYP蛋白的表达量均显着降低（p分别<0.001、0.05、0.01）;至培养第7天,三种突触蛋白的表达量均进一步下降（p<0.001或p<0.01）。结论:PM2.5染毒可损伤海马组织和海马神经元的突触结构与功能,减少突触蛋白的表达,染毒剂量越大或染毒时间越长,突触损伤越重,但随着脱毒时间的延长,PM2.5所致的突触损伤有一定程度的缓解。第三部分PKA/CREB/BDNF信号通路在PM2.5染毒所致脑损伤中的作用目的:探索PKA/CREB/BDNF信号通路是否参与PM2.5染毒所致脑损伤,调控PKA/CREB/BDNF信号通路能否影响PM2.5所致的脑损伤。方法:将SD大鼠随机分为高剂量染毒组、低剂量染毒组、生理盐水组和空白对照组（n=12/组）,参照第一部分方法建立相关模型,于幼年期（PND28）和成年期（PND60）,采用Western blot检测蛋白激酶A（protein kinase A,PKA）和c AMP反应元件结合蛋白（c AMP-response element binding protein,CREB）的蛋白磷酸化水平以及脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor,BDNF）的蛋白表达量。同时,将原代培养的神经元分为对照组和PM2.5染毒组,染毒组在神经元培养的第3天,给予50μg/ml PM2.5连续染毒24h和96h,在培养第4天和第7天,用Western blot检测两组PKA/CREB/BDNF通路蛋白的表达水平。当明确PKA/CREB/BDNF信号通路参与PM2.5致神经元损伤后,利用CCK8和Western blot实验筛选synaptamide（通路激活剂）的最佳干预浓度,再将原代培养3天的神经元分为4组进行相应干预:对照组、PM2.5染毒组（50μg/ml PM2.5）、synaptamide干预组（50μg/ml PM2.5+10μM synaptamide）和H-89（通路抑制剂）干预组（50μg/ml PM2.5+30μM H-89）,各组连续干预24h和96h,在培养第4天和第7天,用CCK8检测各组神经元的细胞活性,用免疫荧光和Western blot检测各组神经元PSD95、GAP43、SYP蛋白的表达,在培养第7天用透射电镜检测各组神经元突触超微结构。结果:（1）Western blot显示,与生理盐水组相比,高剂量PM2.5染毒后,幼年期大鼠海马PKA和CREB蛋白的磷酸化水平以及BDNF蛋白的表达量均显着降低（p<0.01或<0.001）,而低剂量PM2.5染毒后,CREB蛋白的磷酸化水平和BDNF的蛋白的表达量均明显下降（p均<0.05）;至成年期,仅高剂量染毒组的PKA和CREB蛋白的磷酸化水平以及BDNF蛋白的表达明显低于生理盐水组（p均<0.05）。（2）Western blot显示,与对照组相比,在神经元培养第4天和第7天,PM2.5染毒组PKA和CREB蛋白磷酸化水平以及BDNF的表达量均显着降低（P均<0.05）;（3）Western blot显示10μM synaptamide干预组的PKA蛋白磷酸化水平较0.1μM synaptamide干预组和对照组显着升高（p<0.05、p<0.001）,与对照组比较,10μM和1μM synaptamide干预组的CREB蛋白磷酸化水平均明显升高（p<0.001、p<0.01）,10μM synaptamide干预组的BDNF蛋白表达显着增加（p<0.01）,故选取10μM作为synaptamide的干预浓度;（4）Western blot表明在神经元培养第4天,与PM2.5染毒组相比,synaptamide干预组的PKA蛋白、CREB蛋白的磷酸化水平以及BDNF表达量均显着升高（p均<0.05）,H-89干预组的PKA蛋白、CREB蛋白的磷酸化水平以及BDNF表达水平均明显降低（p均<0.05）;（5）CCK8检测显示在神经元培养第4天,synaptamide干预组神经元活性较PM2.5染毒组明显增高（p<0.01）,至培养第7天,synaptamide干预组神经元活性仍高于PM2.5染毒组,但低于对照组（p<0.01、p<0.05）;（6）透射电镜显示synaptamide干预组神经元的突触后致密物厚度较PM2.5染毒组明显增加,突触活性带长度较对照组缩短;（7）免疫荧光和Western blot实验结果均提示在神经元培养第4天,与PM2.5染毒组相比,synaptamide干预组神经元PSD95、GAP43和SYP蛋白表达量均显着增加（p均<0.05）,H-89干预组神经元PSD95和SYP蛋白表达量均明显减少（p均<0.05）,至培养第7天,与对照组相比,synaptamide干预组神经元PSD95和SYP蛋白表达水平均显着升高（p均<0.05）,H-89干预组神经元PSD95蛋白表达水平明显降低（p<0.05）。结论:PM2.5染毒可抑制海马组织和海马神经元的PKA/CREB/BDNF信号通路,促进PKA/CREB/BDNF信号通路可缓解PM2.5所致的神经元活性降低,而抑制PKA/CREB/BDNF信号通路对PM2.5所致的神经元活性降低无显着影响,促进PKA/CREB/BDNF信号通路可缓解PM2.5所致的突触损伤,而抑制PKA/CREB/BDNF信号通路可加重PM2.5所致的突触损伤程度。
王梦丹[5]（2019）在《CDK5激活蛋白p35/p25对EGFR-GSK3β通路的调控作用及机制研究》文中提出CDK5是脯氨酸定向介导的丝/苏氨酸激酶,是众所周知的大蛋白家族-细胞周期蛋白依赖性激酶（CDKs）中的一种。主要功能是通过对大量底物蛋白的磷酸化参与神经细胞的迁移分化、轴突导向、突触发生与传递以及神经元的存活等。CDK5的活化主要依靠在神经系统特异表达的两个激活因子:p35和p39。在一些病理条件下或在外界刺激下（如脑缺血、兴奋性氨基酸（Glutamate）和氧化应激（H2O2）等）,钙蛋白酶（calpain）就会被激活,p35会被calpain切割形成p25,p25比p35更稳定,并且可以过度激活CDK5,从而诱导神经元凋亡和突触功能紊乱。在本文中,我们重点阐述了CDK5激活蛋白p35/p25对EGFR-GSK3β通路的调控作用及机制研究。阿尔茨海默病（Alzheimer disease,AD）也叫老年痴呆,是一种严重的神经退行性疾病,其主要病理为β-淀粉样蛋白形成的淀粉样斑块沉积和tau蛋白过度磷酸化形成的神经纤维缠结（NFTs）。糖原合成激酶3β（Glycogen Synthase Kinase 3β,GSK3β）和CDK5蛋白是阿尔茨海默病发生发展过程中两个十分重要的激酶,它们有相似的结构和功能,并且都可以诱导Tau蛋白的过度磷酸化,产生神经纤维缠结（NFTs）。由于GSK3β与CDK5结构高度相似,所以我们就产生疑问,CDK5的激活蛋白是否也可以调控GSK3β的活性引起其活性改变导致阿尔茨海默病。我们研究了GSK3β与p35、p25之间的的相互作用,结果发现p25而非p35能与GSK3β紧密结合。我们进一步研究发现p25结合GSK3β以后可显着激活其蛋白活性。接下来通过蛋白片段化结合实验,发现p25与GSK3β的N端和C端都能结合,说明p25与GSK3β之间的相互作用区域结合非常紧密不易被打破,更加证实了p25和GSK3β的结合的调控作用。在对p25如何激活GSK3β信号通路的研究中,EGFR-GSK3β信号通路引起了我们的注意。表皮生长因子（EGFR）是跨膜酪氨酸激酶型受体。我们研究发现与p35蛋白相比,过表达p25更能显着提高EGFR蛋白水平。我们在神经元中进一步验证了上述结果。同时,我们也发现p25能够与EGFR结合进而提高EGFR的蛋白水平。接下来,我们将上述的分子通路分别在AD和中风的小鼠模型中进行了检测。我们发现在AD小鼠模型皮层中EGFR蛋白水平和GSK3β活性显着升高,与我们之前在体外的研究结果一致;在中风模型中,AKT、GSK3β蛋白发生了明显降低。这为后期我们对神经退行性疾病的干预和治疗做好了准备。总之,我们发现p25可以调控EGFR和GSK3β两种蛋白分子,这个发现使我们对于EGFR、GSK3β在调控神经凋亡中的作用有了更深的了解。我们的研究结果验证了之前人们对于CDK5激活蛋白p35/p25在神经退行性疾病中的作用以及了解到p25对EGFR及下游蛋白GSK3β的活性如何产生影响,这为以后阿尔茨海默病的防治提供了新的理论基础和药物开发靶点。
朱蓓蕾[6]（2018）在《ERK通路介导的高尔基体应激在脑缺血再灌注损伤中的作用及机制》文中认为研究背景:脑缺血再灌注损伤（Cerebral ischemia-reperfusion injury,CIRI）是指脑血流中断后恢复灌注,在改善缺血组织血供、挽救濒死神经细胞的同时,对神经细胞产生快速的级联反应损伤,通过一系列复杂作用,最终导致神经细胞凋亡的病理过程。CIRI是急性缺血性卒中（acute ischemic stroke,AIS）常见并发症。CIRI发病机制复杂,氧化应激（Oxidative Stress,OS）是其中最主要的病理反应。文献报道高尔基体（Golgi apparatus,GA）在氧化应激中参与转导应激信号,触发调亡,称之为GA应激（Golgi Apparatus Stress,GAS）。目前已有研究发现MAPK/ERK通路在氧化应激中激活,通过磷酸化高尔基体结构蛋白GRASP65,导致高尔基体解聚、裂解。但现有研究以离体细胞试验居多,在CIRI中是否也可通过ERK通路引起GA应激研究更少。丁苯酞（消旋-3-正丁基苯酞,Dl-3-n-butylphthalide NBP）是我国自行研制的治疗脑缺梗死的药物,动物研究证实具有减轻小血管痉挛、改善缺血区微循环,提高缺血区脑灌注、保护神经元线粒体、抑制血小板聚集等多种作用,常用于CIRI。是目前全球唯一具有线粒体保护作用的脑微循环重构剂,但其是否对同为细胞器的高尔基体具有保护作用不得而知。研究目的:旨在在离体细胞及在体动物水平证实CIRI中是否存在ERK通路激活,通过高尔基体结构蛋白GRASP65的磷酸化,介导高尔基体应激,从而导致高尔基体解聚。进而探寻氧化应激发生的新靶点和新机制,为减轻CIRI寻找切实有效的干预靶点。并探讨NBP是否可通过抑制ERK通路减轻GA应激。研究方法:培养小鼠大脑皮层神经元细胞;建立氧糖剥夺/复氧（Oxygen-glucosedeprivation/reoxygenation,OGD/R）模型;CCK8法检测细胞活性;免疫荧光激光共聚焦观察OGD/R模型高尔基体形态变化及GRASP65、pGRASP65的表达,明确CIRI中是否存在高尔基应激。在此基础上再进行两部分研究。第一部分离体细胞试验:分为对照组、OGD/R组、药物预处理组;其中OGD/R组、药物预处理组按时间点不同分为4h、12h、24h三个亚组;干预药物丁苯酞（DL-3-n-butylphthalide,NBP）。免疫荧光激光共聚焦观察各组GRASP65、pGRASP65的表达及高尔基体形态。Western blot技术检测各组GRASP65、pGRASP65、ERK及pERK的表达。第二部分在体动物试验:采用改良四血管阻断法建立脑缺血再灌注（Ischemia-reperfusion,I/R）的ICR小鼠模型。分成假手术组、I/R对照组、预处理组、治疗组、预处理+治疗组;干预药物NBP。HE染色法观察再灌注5d后的各组小鼠神经细胞形态学变化。TTC染色法估算再灌注5d后各组小鼠脑组织缺血体积。神经损害严重程度评分量表（neurological severity score,NSS）14分制评价再灌注5d后的各组小鼠神经行为学。分别用黄嘌呤氧化酶法、TBA比色法测定再灌注5d后各组小鼠脑组织中SOD、MDA含量。Western blot技术检测各组再灌注5d后各组小鼠脑组织中ERK、pERK、GRASP65及pGRASP65的表达。结果:在OGD/R模型中,免疫荧光激光共聚焦发现高尔基体形态发生变化,显示在CIRI中存在高尔基体应激。离体细胞部分:Western blot检测:ERK、GRASP65在各组中表达无明显变化（P>0.05）。pERK、pGRASP65在各组中的表达出现了明显变化:在OGD/R组中,pERK、pGRASP65在12h和24h表达均较对照组有显着升高（P<0.01）。NBP预处理后,pERK、pGRASP65在12h和24h表达均较同时间点OGD/R组显着降低（P<0.01）,提示阻断ERK活化可以抑制CIRI中GRASP65的磷酸化。免疫荧光激光共聚焦:在正常对照组中,GRASP65荧光标记的高尔基体结构较紧密,pGRASP65未见明显表达。OGD/R4h组pGRASP65出现表达,提示部分GRSP65发生磷酸化;OGD/R12h组pGRASP65表达增强;OGD/R24h组pGRASP65表达较12h组无明显改变。同时OGD/R组见高尔基体结构松散,部分碎裂。NBP预处理后,pGRASP65表达较同时间点OGD/R组显着降低（P<0.01）,提示NBP干预可以抑制GRASP65磷酸化。同时高尔基体结构也较OGD/R组有改变,未见明显高尔基体碎裂。提示抑制ERK的活化可改善高尔基体在氧糖剥夺/复氧损伤中的形态。在体动物部分:再灌注5d后的各组小鼠NSS评分结果:I/R组显着高于假手术组、NBP预处理+治疗组及预处理组（P<0.01及P<0.05）;I/R组与NBP治疗组NSS评分相比无显着性差异（P>0.05）。再灌注5d后各组小鼠的HE染色结果:假手术组细胞排列紧密,细胞核形态正常,染色均匀;I/R组细胞排列松散,神经元变性;NBP干预后各组细胞形态明显较I/R组改善。预处理+治疗组优于预处理组优于I/R组。再灌注5d后各组小鼠的TTC染色结果:假手术组红染面积均匀,几乎所有组织均染色,提示几乎无梗死;I/R组梗死体积较假手术组显着增多（P<0.01）;NBP干预后各组梗死体积较I/R组显着减少（P<0.01）。再灌注5d后各组小鼠脑组织中SOD含量结果:I/R组SOD表达水平显着低于假手术组（P<0.01）;NBP干预各组SOD表达水平显着高于I/R组（P<0.01）。再灌注5d后各组小鼠脑组织中MDA含量结果:I/R组MDA表达水平显着高于假手术组（P<0.01）;NBP干预各组MDA表达水平都有所降低,I/R组显着高于NBP预处理+治疗组及预处理组（P<0.01及P<0.05）;I/R组与NBP治疗组MDA含量无显着性差异（P>0.05）。Western blot检测再灌注5d后各组小鼠脑组织中ERK、pERK、GRASP65及pGRASP65的表达结果:ERK、GRASP65在各组中表达无显着差异（P>0.05）;pERK的表达在各组中出现了显着差异:I/R组与假手术组相比显着增高（P<0.01）,与NBP干预各组相比显着增高（P<0.01及P<0.05）,pGRASP65在各组的变化趋势与pERK一致。结论:1.ERK通路在CIRI中被激活,参与介导了CIRI,阻断ERK的活化对CIRI具有延缓和减轻作用。2.CIRI中GRASP65在ERK的介导下发生磷酸化。3.CIRI中高尔基体结构发生改变（即高尔基体应激）,其变化与ERK介导的GRASP65磷酸化相关联。4.NBP可能通过阻断ERK信号通路介导的GRASP65的磷酸化过程减轻CIRI。
霍帅[7]（2016）在《N-甲基-D-天门冬氨酸受体对慢性脑缺血大鼠神经突触可塑性的调节作用》文中研究指明目的:1.探索N-甲基-D-天门冬氨酸型受体亚单位NR2A和NR2B在脑缺血后对神经突触的可塑性的调节作用,以揭示NR2A和NR2B亚基对脑神经突触可塑性长时程增强的调节机制。2.探究在发生脑缺血情况下,与突触可塑性相关的生长相关蛋白43（growth associated protein-43,GAP-43）、突触后致密蛋白95（postsynaptic density protein-95,PSD-95）和突触体素（synaptophysin,Syn）含量的变化及其与脑神经突触之间的关系。方法:选取120只Wistar大鼠按照随机数表法分为对照组（60只）和脑缺血组（60只）,依据改良型大鼠双侧颈总动脉持久性结扎（two-vessel-occlusion,2VO）方法构建慢性脑缺血大鼠模型,对照组大鼠不结扎颈总动脉及迷走神经,采用Western blot检测法检测脑缺血组大鼠脑海马内N-甲基-D-天门冬氨酸型受体亚单位NR2A和NR2B的表达水平。选择5 Hz/16s低频刺激作为阈值刺激及100 Hz/s高频刺激诱导海马CA1区长时程增强形成并通过神经信号的放大记录场电位的变化过程。通过免疫组化染色对突触后致密物质,生长相关蛋白和突触体素进行染色,并在显微镜下特定观察相应物质的细胞形态。通过比较脑缺血组和对照组中以上指标的表达变化来评价大鼠脑缺血后体内相关物质的变化情况,并对这些相应物质的指标与神经突触可塑性的机制进行分析和阐述。结果:1.慢性脑缺血后0-12h大鼠大脑海马中NR2A表达水平逐渐降低,且在脑缺血12h后NR2A表达水平显着低于0h和4h（P<0.01）;而NR2B脑缺血后4h达到峰值,脑缺血12h达到最低点。2.采用何种刺激的方式（高频或者低频）都不能诱导长时程增强的形成,结果显示NR2B对条件刺激诱导的长时程增强的形成具有一定的抑制作用;而NR2A对条件刺激长时程增强具有促进的作用。3.在对照组中未见明显GAP-43的阳性表达的细胞,脑缺血组大鼠1h时内就开始出现了阳性的表达,阳性细胞较对照组显着增多（P<0.05）。同时在脑缺血组中12h与4h与1h比较阳性颗粒数增加（P<0.05）。4.在对照组中可见明显PSD-95的阳性表达的细胞,脑缺血组中PSD-95阳性表达12h与4h和1h显着的降低（P<0.05）;同时脑缺血组中PSD-95阳性细胞数4h组要显着的低于1h组（P<0.05）;电镜下可以看见:PSD-95主要分布于神经细胞体、树突及轴突样纤维上,对照组中可以看见阳性细胞呈圆形、椭圆形或三角形,树突样纤维分支较多,轴突样纤维呈细长的形态;通过显微镜可以发现,脑缺组的神经细胞出现的是肿胀,同时树突的分支出现了消失的状态,部分细胞核深染。5.脑缺血组的突触体素P38的含量明显的低于对照组（P<0.05）。脑缺血组中突触素P38的含量12h与4h和1h显着的降低（P<0.05）;同时脑缺血组中P38阳性细胞数4h组要显着的低于1h组（P<0.05）;光镜下,对照组海马CA1区P38免疫反应产物呈棕黄色颗粒状或者点状,主要位于神经毡内、神经元胞体微染,胶质细胞、白质及血管不被染色,在脑缺血组中可以看见反应颗粒减少,较稀疏、较细、染色浅淡,且随着时间的增加免疫反应产物的平均光密度逐渐下降。结论:1.NR2B对条件刺激诱导的长时程增强形成有抑制作用;而NR2A对条件刺激长时程增强形成具有促进的作用。2.GAP-43可能是发生脑缺血后积极促进脑组织损伤后修复并对神经突触可塑性有正向调节的重要物质。3.PSD-95可能是在脑缺血应激状态下神经突触长时程增强形成机制中发挥重要作用的物质。4.突触体素P38可能是参与神经突触可塑性的重要的物质。
何伟亮[8]（2016）在《Shh蛋白对皮层神经元神经突起的生长作用及其相关机制研究》文中进行了进一步梳理目前,脑血管病已成为人类死亡的首要疾病,并且具有患病率高、致残率高、死亡率高、复发率高的特点,其中脑梗死约占脑血管病的85%,因此研究和防治脑梗死具有极其重要的社会意义。据报道对脑梗死的的治疗效果不尽如人意,脑梗死后神经功能的损伤是患者致残的主要原因。神经元突起损伤是导致神经功能障碍的重要原因。如何促进神经元突起的生长是脑梗死后期治疗的关键。脑梗死导致脑组织受到不同程度的损伤,神经网络结构被破坏,从而导致神经功能受损。而神经可塑性又可以促使形成新的丰富神经网路结构并能修复病变,从而改善缺血脑组织的神经功能。因此研究给予药物等加强神经修复的作用显得尤为重要。由于神经元突起对于神经网络结构的修复具有重要意义,因此,寻找能够有效促进神经元突起生长的药物,是当前面临的重要并且热点课题。Sonic hedgehog（Shh）是分泌性糖蛋白因子,在胚胎和神经系统发生、发育和分化中可调控神经细胞的增殖、分化和轴突的形成。国内外研究报道大鼠脑缺血中,Shh可通过调节神经细胞的增殖、分化和突起的形成发生来促进神经元可塑性,并且参与调控脑组织室下区神经再生。然而,到目前为止,查阅大量文献后发现Shh蛋白对大脑皮层神经元细胞神经突起的作用及其机制仍未明确,仍需深入研究,这对增强神经环路的研究具有重要意义。氧化应激是脑梗死的重要病理生理机制,应用氧化应激模型有助于理解脑梗死的发病机理并开展相关治疗。因此本课题利用皮层神经元的氧化应激模型来模拟脑梗死后皮层神经元的损伤,研究Shh蛋白对氧化应激下皮层神经元细胞的保护作用。线粒体是能量产生的主要场所,可在控制神经重构包括神经分化、神经突生长、神经递质释放以及树突重构等的基本过程中发挥着重要的作用。线粒体功能失调可能在脑梗死后神经重塑中具有重要作用。调节脑梗死后线粒体的形态和功能可以介导神经突起的生长,而神经突起的生长是一个能量消耗的过程,需要足够的能量供应,因此,能量的代谢和线粒体与神经突起的生长高度相关。研究报道激活经典的shh调节的信号通路可以增加线粒体活性。但是关于shh对于氧化应激后皮层神经元线粒体的影响报道较少,仍需深入研究。综上所述,本研究首先利用孕15-18天c57bl/6胎鼠确立小鼠皮层神经元细胞的原代培养模型,其次利用此模型观察shh蛋白对皮层神经元神经突起的生长的促进作用,并探讨其可能的影响机制,最后利用皮层神经元的氧化应激模型来模拟脑梗死,观察shh对皮层神经元的活性和神经突起的作用,并从线粒体和能量代谢的角度探讨shh对氧化应激下皮层神经元及其突起发挥保护作用的机制。本研究分为三部分,现将各部分内容概述如下。第一部分小鼠皮层神经元细胞的原代培养及细胞鉴定目的:通过对孕15-18天内c57bl/6胎鼠皮层神经元的原代培养,掌握小鼠皮层神经元的原代培养方法,并观察细胞的形态学;利用免疫细胞化学鉴定所培养的细胞是否为神经元细胞,以备后续实验。方法:c57bl/6雌雄小鼠交配获取孕15-18天胎鼠,麻醉后断头取脑,于预冷1×hbss溶液的平皿中,在解剖显微镜下取出完整的大脑及小脑,夹除小脑,将大脑半球放入盛有预冷的1×hbss溶液的平皿中,在解剖显微镜下剥离脑膜,分离出皮层组织。将其剪碎放入15ml塑料离心管离心管内加入3mlpapain消化液（新鲜配制）,37°c孵育箱内孵育1530分钟弃去papain消化液,加入3mlhibernatee洗涤,反复直至变成细胞悬液,200rpm离心3分钟,弃去上清,加入含2%b27的neurobasal培养液,制成单细胞悬液,种植于poly-l-lysine处理过的培养皿中,于湿润的培养箱中培养（37℃,5%co2）,并于不同时间点于显微镜下观察所培养的原代皮层神经元细胞的生长情况并记录。取培养1天皮层神经元,4%多聚甲醛固定,0.3%triton-x100破膜打孔作用15分钟,10%驴血清室温封闭45分钟,加入抗鼠神经元特异性烯醇化酶（neuronspecificenolase,nse）和兔抗鼠的胶质细胞中间丝蛋白胶质纤维酸性蛋白（glialfibrillaryacidicprotein,gfap）一抗4℃过夜,然后加入驴抗小鼠fitc（1:200）,驴抗兔tritc（1:200）,37℃,1h,荧光封片剂后于荧光显微镜下观察神经元并鉴定神经元细胞。结果1皮层神经元细胞刚接种时的细胞为圆形,2小时后开始贴壁,培养至68小时后,少数神经元细胞可见有明显的细胞突起的生成。培养第24小时后,神经元细胞胞体清晰、丰满,胞体呈现锥体或星形,光晕的轮廓较明显,细胞突起增长。培养第2天,细胞胞体增大,更清晰,突起明显变长,而且突起之间形成了一定的联系。培养第3天,绝大多数神经元细胞的突起已经相互连接,并形成网络结构。2本实验应用免疫荧光法检测发现nse标记的神经元细胞在视野中出现较多,并显示出完整的神经元形态,而且细胞胞体丰满,突起生长较多;视野中未发现gfap标记的胶质细胞。结论1本实验利用无血清培养法成功建立了小鼠大脑皮层神经元细胞的原代培养模型,具有稳定性高、纯度高和存活率高的皮层神经元细胞,是一种研究神经科学的理想模型。2本试验利用免疫荧光法对所培养神经元细胞的鉴定结果提示对胎鼠脑皮层细胞进行原代培养获得的神经元细胞存活率高,纯度高,为后续实验打下了良好的基础。第二部分shh蛋白对皮层神经元神经突起的作用及与bdnf机制研究目的:观察shh蛋白对小鼠皮层神经元细胞神经突起的生长作用,并探讨shh蛋白对皮层神经元神经突起的作用及其相关的可能机制。方法:取孕15-18天的c57bl/6小鼠的原代培养的皮层神经元进行实验,分为对照组、不同浓度的shh（5,50,500ng/ml）组、shh信号通路抑制剂环耙明（cyclopamine,cpm）组、cpm+shh组和酪氨酸激酶抑制剂k252a+shh组。抑制剂在加入shh蛋白前30min提前加入,药物作用于神经元细胞24小时后进行后续实验。利用免疫荧光法检测神经元细胞中shh受体（ptch）的表达;β-tubulin免疫荧光细胞化学染色法测定shh对皮层神经元神经突起的生长长度;rt-qpcr法检测神经元细胞中shh和ptch基因水平表达;rt-qpcr和western-bloting法检测神经元细胞中bdnf基因和蛋白水平表达;免疫荧光细胞化学染色法测定神经元神经突bdnf的含量;按照bdnf试剂盒说明书采用elisa法测定神经元培养液中bdnf的含量。结果1首先证实shh受体—ptch在皮层神经元细胞存在,提示shh蛋白可能对调节皮层神经元神经突的生长具有生物学效应。250ng/ml和500ng/ml的shh蛋白组能够明显促进神经元神经突起的生长（p<0.05）。特别有趣的是,50ng/ml的shh蛋白组对神经突起的生长的促进作用更加明显,因此,后续实验选用shh浓度为50ng/ml进行。3与单用shh蛋白组相比,shh和cpm共同作用后能够显着降低神经突起的长度（p<0.05）,提示shh介导的神经突起的生长作用部分能被cpm阻断。4shh蛋白干预均能够诱导细胞中shh和ptch的基因表达增加,给予cpm后,shh诱导细胞中shh和ptch基因表达增加均部分被抑制（p<0.05）。5shh蛋白干预能够使神经元细胞bdnf在mrna和蛋白水平上增加,给予cpm后,shh介导的bdnf的表达增加被抑制（p<0.05）。6shh蛋白干预能够使神经元细胞的神经突起中bdnf表达增加,与cpm联用后,这种增加部分被抑制。7shh蛋白干预能够使细胞培养液中bdnf的含量也增加,给予cpm后,细胞培养液中bdnf的含量增加也被抑制（p<0.05）。8与单用shh组相比,k252a和shh联合作用组对皮层神经元神经突起的生长长度有所降低,差异具有统计学意义（p<0.05）。结论:本试验结果显示小鼠皮层神经元细胞中存在shh受体-ptch,并且shh蛋白能够促进皮层神经元神经突起的生长,shh蛋白可能部分通过激活shh信号通路实现其对脑皮层神经元的神经突起的促生长作用;此外shh蛋白还可能通过促进bdnf的表达来发挥其对神经突起的促生长作用,最终实现shh蛋白的神经保护作用。第三部分shh蛋白对氧化应激下皮层神经元活性和神经突起的作用及其线粒体机制研究目的:观察shh蛋白对氧化应激下小鼠皮层神经元细胞的活性影响和神经突起的生长作用的影响,观察shh蛋白对氧化应激下皮层神经元细胞中活性氧（reactiveoxygenspecies,ros）、超氧化物岐化酶（superoxidedismutase,sod）及丙二醛（malondialdehyde,mda）的影响,并检测shh蛋白对氧化应激下线粒体形态和功能的影响以及对能量代谢和线粒体氧化呼吸链复合物酶ii的影响,进而探讨shh蛋白对氧化应激下皮层神经元的活性和神经突起的作用及其可能的线粒体和能量代谢机制。方法:取孕15-18天c57bl/6小鼠的胎鼠,取其皮层组织,进行细胞原代培养。皮层神经元培养24小时后,加入100umh2o2处理2h,然后换液继续以神经元培养液培养,体外模拟脑缺血模型。实验分为对照组、h2o2组、h2o2+shh组进行后续实验。利用cck-8法检测shh蛋白对氧化应激下皮层神经元的细胞活性的影响;利用β-tubilin免疫荧光细胞化学染色法测定shh蛋白对氧化应激下皮层神经元神经突的长度的作用;western-bloting检测各组皮层神经元细胞中gap-43蛋白水平表达和免疫荧光细胞化学染色法测定各组中皮层神经元细胞gap-43的表达;利用用活性氧检测试剂盒测定各组神经元细胞内的ros的表达变化,结果为所检测得的荧光值与对照组的荧光度的比值（%ofcontrol）表示;根据sod和mda说明书的说明步骤测定shh蛋白对各组细胞中sod活性和mda的含量表达变化;通过透射电镜观察各组中皮层神经元线粒体形态的改变;利用线粒体膜电位检测试剂盒（jc-1）检测各组神经元细胞线粒体膜电位（mmp）的变化情况。利用atp活性试剂盒检测各组皮层神经元atp活性的变化情况;利用线粒体呼吸链复合物酶ii试剂盒分析各组神经元细胞线粒体呼吸链复合物酶ii活性。结果1cck-8法检测结果h2o2能够降低神经元细胞的活性,当加入shh蛋白后,细胞活性的能力增强,50,500ng/ml的shh能显着促进氧化应激的神经元细胞存活率。2与对照组相比,神经元受到h2o2作用后,其神经突起的生长损伤（p<0.05）,而在h2o2作用后加用shh蛋白后神经元神经突的生长得到一定程度的恢复（p<0.05）,结果具有统计学差异。应用免疫荧光和westernblot法检测细胞中gap-43的实验结果显示h2o2作用于神经元细胞后gap-43的表达降低,而加入shh蛋白后其表达升高,差异具有统计学意义（p<0.05）,进一步证实shh蛋白能改善氧化应激损伤的皮层神经元神经突起的生长。3与对照组相比,h2o2作用于皮层神经元后,其细胞内ros含量升高,sod活性下降,mda含量升高,而给予shh蛋白干预后,神经元细胞内ROS含量下降,SOD活性上升,MDA含量下降（P<0.05）。4透射电镜显示,与对照组相比,H2O2作用后神经元内的线粒体损伤严重,线粒体肿胀,空泡化,并且结构也破损。当加入Shh蛋白干预后,线粒体形态得到一定程度的恢复,空泡化和肿胀的线粒体减少。MMP结果显示,与对照组相比,H2O2作用于皮层神经元后,神经元细胞的MMP下降,而给予Shh蛋白干预后,神经元细胞的MMP较之上升（P<0.05）。5 ATP检测结果显示,H2O2组细胞的ATP的量与对照组相比明显下降,Shh蛋白干预后,神经元细胞的ATP量有所好转,差异具有统计学意义（P<0.05）。6 H2O2作用于神经元后线粒体呼吸链复合物酶II的活性下降,而在氧化应激后给予Shh蛋白治疗后,其活性较H2O2组好转（P<0.05）。结论:本试验利用氧化应激模型模拟脑缺血状态,研究发现Shh蛋白能促进氧化应激的皮层神经元的存活和神经突起的生长。Shh蛋白可能通过降低ROS,上调SOD的活性,减少MDA含量,也通过修复线粒体复合物酶II的活性逆转氧化应激导致的能量的生成障碍,并能保护皮层神经元的线粒体形态和功能对氧化应激状态下的神经元起到保护和营养（促神经突起生长）的作用。
李萌[9]（2016）在《胰高血糖素样肽-1类似物发挥神经保护作用及其机制研究》文中指出第一部分:小鼠原代神经元体外培养与纯度鉴定目的:细胞培养技术是基础医学研究中重要的实验方法,原代培养是指从机体直接取下细胞、组织和器官后立即进行培养。目前对大脑神经元的形态特征、物质代谢、生理和药理过程的研究主要集中在细胞水平和分子水平。原代培养的方法可对单个神经细胞的结构和功能进行研究,提供了体内生长过程在体外重现的机会,是一种有效反映在体神经元活动的实验模型。原代神经细胞培养能较长时间观察细胞的形态和功能变化,易于施行如物理、化学或生物刺激等实验条件,作用更加直接,并且便于各种神经疾病在细胞和分子水平机制的探讨。由于神经元是一种高度分化的细胞,动物出生后一般不分裂,因此建立一种可靠、稳定、简单易行的原代神经元培养方法十分必要。为了解决这一问题,本研究在参考既往培养方法的基础上,探讨简便、可行的新生小鼠皮质神经细胞原代培养模型,旨在为进一步从细胞分子水平上研究动物中枢系统病变奠定基础。方法:从胎龄16天的C57BL/6胎鼠脑组织提取皮层神经元细胞,显微镜下分离,置于含有2mg/ml木瓜蛋白酶的D-Hank’s平衡盐溶液中37℃15分钟,用含10%胎牛血清的DMEM培养液终止反应。接种于事先用多聚赖氨酸浸泡过的孔板内,加入Neurobasal/B27无血清维持液,在37℃和5%CO2条件下培养细胞。于接种2h后半量换液为Neurobasal/B27无血清维持液,细胞生长24h后用于后续试验。以NSE染色鉴定神经元细胞,GFAP染色鉴定星形胶质细胞。利用免疫荧光法鉴定GLP-1R存在。结果:1倒置相差显微镜观察:神经元细胞呈圆形或椭圆形,体积小,胞体发亮,周边光晕明显,立体感强,细胞突起长,细胞间连接多。2荧光显微镜观察:NSE抗体染色,荧光为绿色,存在于大多数细胞的胞质和突起中。GFAP抗体染色,仅有零星细胞的胞浆和突起有绿色荧光染色。3 Anti-β-tubuliⅢ染色显示清晰的神经元,细胞浆呈绿色,胞体为梭形或多角形。使用GLP-1R抗体进行细胞免疫荧光鉴定,可见有红色荧光。图像融合后发现,GLP-1R在细胞内广泛表达,说明原代培养神经元细胞表达GLP-1R。第二部分:利拉鲁肽对神经细胞突起长度的影响目的:胰高血糖素样肽-1（glucagon-likepeptide-1,GLP-1）受胃肠道食物主要为碳水化合物等营养物质刺激,由小肠L细胞（内分泌细胞）分泌的一种重要肠激素相关肽,由胰高血糖素原基因转录并翻译加工而成,主要被二肽基肽酶IV（DPP-IV）降解,经肾排泄。GLP-1具有血糖依赖性促胰岛素分泌,通过抑制α细胞不适当分泌胰高血糖素、促进胰岛β细胞分泌胰岛素、延缓胃排空及抑制食欲等多种调节手段控制机体血糖的稳态。同时,GLP-1还通过改善β细胞功能、抑制β细胞死亡、促进β细胞增殖,使胰岛素合成增加,进一步延缓甚至逆转2型糖尿病的发展。以肠促胰素为基础的2型糖尿病治疗方案已在临床广泛应用。GLP-1主要通过GLP-1受体（glucagon-likepeptide-1 Receptor,GLP-1R）发挥多种生物学作用。GLP-1R于胰腺、肺、脑、心和肾脏等器官中广泛存在,正是其广泛的分布决定了作用的广泛性。在对啮齿类动物和人类心血管组织的研究中发现GLP-1可以结合心血管部位表达的GLP-1R,说明GLP-1在心血管系统中发挥作用[1];对大鼠肺组织的研究证明了GLP-1在产生表面蛋白、建立肺结构及成熟中十分重要,近期研究显示,利拉鲁肽可能通过抑制过度激活的肺组织局部RAAS抑制TGF-β1来改善肺间质纤维化[2];对肾功能的基础实验结果证实,肠促胰素可修复2型糖尿病患者肾损伤,其机制包括抑制肾素-血管紧张素系统的激活、减少尿白蛋白、减轻炎性反应、改善肾脏循环以及减轻肾纤维化等[3]。随着GLP-1各种胰腺外作用的发现,其中GLP-1对脑组织的研究格外引人关注。近期小鼠研究显示,如阿尔兹海默病（Alzheimer’s disease,AD）、帕金森疾病（Parkinson’s disease,PD）、萎缩性脊髓侧索硬化症（Amyotrophic Lateral Sclerosis,ALS）和卒中等神经退行性疾病,GLP-1具有保护记忆和突触可塑性,减少炎症反应的作用。并且GLP-1还可有效保护大鼠海马神经元细胞不受谷氨酸诱导的死亡和铁诱导的细胞凋亡。动物研究显示,GLP-1R基因敲除小鼠较野生型小鼠学习能力底下、对红藻氨酸诱导的惊厥更易感。另外,也有研究报道Exendin-4,GLP-1R激动剂,在神经突起数量和长度、细胞骨架重组和电生理学方面对人神经母细胞瘤具有保护作用。以上众多研究均显示GLP-1类似物对神经系统发挥正向作用,但多数是对动物行为学的评估,离体研究较少,从细胞水平上有哪些变化尚未明确,加入药物是否在细胞水平、分子水平直接发生变化,以及发生变化的作用机制也鲜有研究。由于神经系统是各个神经元相互联系的功能整合体,通过反馈环路调节自身功能,包含一系列多分枝神经元与临近神经元的突触-轴突接触。有研究显示震颤患者相对于健康者表现出树突棘密度和树突复杂性降低,可见神经生长也是神经发育、再生、分化及对损伤反应的重要步骤。因此本研究选用神经突起长度作为检测神经作用的指标。方法:细胞接种24h后,向无血清培养液中加入不同浓度利拉鲁肽,使培养液中药物终浓度分别为10n M、100n M、1μM,对照组加入等量PBS。使用免疫荧光显像,观察不同浓度下利拉鲁肽对神经突起长度的影响,对神经突起进行长度测量,所得数据输入统计学软件SPSS13.0中进行分析比较。结果:1利拉鲁肽促进神经突起增长具有剂量反应关系。不同浓度利拉鲁肽（10n M,100n M,1μM）处理神经细胞24h后检测神经突起长度,结果显示各处理组神经突起平均长度显着长于对照组（P<0.05）,分别为30.21±6.64μm,34.90±6.15μm,29.37±5.10μm,对照组:21.29±4.07μm。并且在后续试验中,选择100n M作为干预剂量。2 MEK–ERK信号通路抑制剂U0126抑制利拉鲁肽诱导的神经突起长度增长。实验将细胞随机分组,依次为对照组、利拉鲁肽组、抑制剂组及利拉鲁肽+抑制剂组。细胞培养24h后,检测神经突起长度:利拉鲁肽+抑制剂组（23.89±7.02μm）神经突起平均长度显着低于单独应用利拉鲁肽组（31.95±1.04μm）（P<0.05）,但仍比对照组（20.43±3.90μm）平均神经突起长度长（P<0.05）;另外,抑制剂组（21.01±3.20μm）与对照组神经突起平均长度无统计学差异（P>0.05）;利拉鲁肽组神经突起平均长度显着长于对照组,与前述试验结果一致。第三部分:利拉鲁肽促进神经突起生长的机制研究目的:细胞外调节激酶（Extracellular signal regulated kinases,ERK）作为丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen activated protein kinase,MAPK）家族的重要成员之一,与细胞的生长、分化和增殖密切相关,主要包括P-ERKl和P-ERK2。磷酸化ERK（Phosphorylated extracellular signal regulated kinases,p-ERK）是ERK的活化形式。Ras最先被相关生长因子受体和胞浆中酪氨酸激酶等激活,活化的Ras使c-Raf,MEK,ERK激活,由胞浆转移至细胞核的p-ERK,作用于核内数种转录因子和核蛋白,随后激活后续一系列转录过程,参与细胞的生长、发育、增殖、分化和凋亡。作为重要的核转录因子,c AMP反应序列结合蛋白（c AMP response element binding protein,CREB）对启动子中具有环磷酸腺苷反应单元（CRE）的基因转录进行调节,在神经元再生、突触形成以及学习记忆等方面具有重要作用,是细胞内多种信号通路的关键成分。大量研究显示,GLP-1类似物利拉鲁肽可通过激活Akt、MEK1/2,对甲基丙酮醛刺激下人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y具有保护作用。GLP-1保护糖尿病小鼠β细胞由于细胞因子诱导的所致凋亡、保护阿尔兹海默病小鼠记忆损伤均通过MEK-ERK途径。许多证据也表明,ERK信号途径可以引起CREB磷酸化,p38MAPK途径参与此过程。ERK、CREB等作为普遍存在于细胞内的重要因子,本实验探讨利拉鲁肽是否通过此信号途径影响细胞功能,并利用U0126（MEK-ERK通路）抑制剂阻断假设通路进行验证。方法:探讨MEK-ERK信号通路相关基因在利拉鲁肽促进神经突起生长作用中的表达。将原代神经元随机分组为对照组、利拉鲁肽组、MEK-ERK通路抑制剂U0126组及利拉鲁肽+U0126组,利用Western blot和ELISA技术,检测各组ERK、p-ERK和CREB表达。结果:1 MEK-ERK信号途径参与利拉鲁肽诱导的神经突起长度增长。Western Blot结果显示,利拉鲁肽组p-ERK表达较对照组表达明显增多,利拉鲁肽+抑制剂组表达量降低（P<0.05）。然而,抑制剂组与对照组间p-ERK表达水平无明显差异（P>0.05）。2磷酸化CREB是利拉鲁肽调节神经突起生长的关键下游分子。ELISA检测结果显示,抑制剂组与对照组p-CREB表达无明显差异（U0126组:5.58±0.61 ng/ml;对照组:5.28±0.82 ng/ml,P>0.05）。利拉鲁肽促进p-CREB表达,此作用可被U0126部分抑制（利拉鲁肽组:11.31±1.35ng/ml;U0126+利拉鲁肽组:7.84±2.78 ng/ml,P<0.05）。第四部分:利拉鲁肽对高糖环境下神经细胞的影响及其机制研究目的:临床及基础实验中均发现,糖尿病与神经系统疾病密切相关。痴呆的危险性在糖尿病患者中明显增加,如发生记忆和学习等脑功能损害。流行病学研究结果表明伴有胰岛素抵抗症状的糖尿病患者发展为阿尔茨海默病者约占30.65%。由于高血糖导致自由基增加、氧化应激反应增强、内皮细胞功能紊乱、糖基化终末产物在血管壁累积、醛糖还原酶活性增加导致细胞内持续高渗等,最终造成细胞死亡。雷帕霉素靶蛋白（Mammalian target of rapamycin,m TOR）作为细胞内重要的调节基因,通过对细胞能量的合成与代谢、蛋白质的合成与降解、细胞周期等多种途径的调节干预,在其生长、增殖、分化与凋亡等过程中发挥重要的作用。许多关于中枢神经系统的研究显示,一些神经系统退行性疾病种存在异常m TOR信号转导通路和神经元细胞减少或丧失。细胞死亡包括两种形式,即细胞凋亡和细胞坏死。细胞凋亡的具体机制目前尚未明了,但促凋亡蛋白Bax与抗凋亡蛋白Bcl-2两者之间的平衡,在细胞的凋亡过程中起到了十分重要的作用。本研究通过体外培养胎鼠原代皮层神经元细胞,观察不同浓度GLP-1类似物（利拉鲁肽）对神经突起长度的作用及MEK-ERK信号通路相关基因表达的影响,就GLP-1对神经元细胞的作用机制进行初步探讨,随后将细胞置于高糖环境模拟糖尿病神经系统疾病,再次探讨利拉鲁肽对神经细胞活性的影响,并关注药物对凋亡的作用,为GLP-1类药物应用于糖尿病及神经疾病的治疗提供新的思路。方法:将原代神经元置于高糖培养基中,加入不同浓度利拉鲁肽,使培养液中药物终浓度分别为10-9M、10-8M、10-7M、10-6M,10-5M,10-4M,对照组加等量生理水,使用CCK-8法检测细胞活性。随后将细胞随机分为对照组,高糖组,高糖+利拉鲁肽。使用Hoechst 33342染色观察细胞凋亡情况,利用Western blot和RT-PCR进一步检测相关蛋白表达:Akt、m TOR、HIF-1a、Bcl-2、Bax和claudin-5,观察药物对各蛋白表达的影响。结果:1利拉鲁肽部分减弱高糖对神经元的损害作用。CCK-8实验检测高糖环境下利拉鲁肽对细胞活性的作用,结果显示:以标准培养基培养神经元作为对照,细胞活性100%,高糖组神经活性降低（31.78±2.81）,加入不同浓度利拉鲁肽细胞活性增加（10-9M:32.20±4.03;10-8M:43.98±4.06;10-7M:74.92±5.59;10-6M:63.29±8.18;10-5M:52.00±6.01;10-4M:30.89±2.08）,呈剂量依赖性,10-7M作用最为明显,但仍低于对照组,各组间有统计学差异（P<0.05）。由此可见,高糖对神经元活性具有损害作用,利拉鲁肽可部分缓解高糖所致的损伤,10-7M作用最为明显,后续试验中选择10-7M作为干预剂量。2 Hoechst 33342凋亡核染色证明利拉鲁肽减弱高糖对神经细胞的凋亡作用。正常细胞核Hoechst 33342染色呈淡蓝色,有深染的蓝色颗粒,而凋亡细胞的细胞核呈分叶、碎片状,被染成浓集的亮蓝色。实验显示,高糖下细胞呈现典型的凋亡形态学特征,胞体逐渐变得空瘪,细胞核皱缩,部分呈碎状浓染。加入利拉鲁肽后,现象有所缓解。计数200个细胞,对照组凋亡数为24个（凋亡率12%）,高糖组凋亡数为62个（凋亡率31%）,高糖利拉鲁肽组凋亡数为41个（凋亡率20.5%）。3利拉鲁肽通过Akt/m TOR/HIF-1a通路神经细胞凋亡因子Bcl-2、Bax进行调节。Western blot和RT-PCR结果显示:与对照组相比,高糖组Akt、m TOR和HIF-1a各指标蛋白和m RNA表达降低,加入最佳剂量利拉鲁肽后,蛋白和m RNA水平显着增加,差异均有统计学意义（P<0.05）。与对照组相比,高糖组较对照组Bcl-2蛋白和m RNA表达降低,加入利拉鲁肽后表达增加,但仍低于对照组,差异有统计学意义（P<0.05）。高糖组Bax蛋白和m RNA较对照组表达升高,加入利拉鲁肽后,蛋白和m RNA表达降低,差异有统计学意义（P<0.05）。4高糖与利拉鲁肽对Claudin-5表达无明显影响。Claudin-5是反应血脑屏障功能的重要指标,离体研究中高糖与利拉鲁肽对其蛋白表白和m RNA表达均无明显改变,差异无统计学差异（P>0.05）。结论:1原代培养的胎鼠大脑皮层细胞中富含神经元细胞,形态良好,胶质细胞含量少,达实验要求。神经元细胞存在GLP-1受体。2利拉鲁肽促进小鼠皮层神经元细胞突起增长,在一定范围内呈浓度依赖性。MEK-ERK通路抑制剂U0126可部分阻断利拉鲁肽对神经突起生长的促进作用,表明利拉鲁肽通过激活受体MEK-ERK途径发挥促突起增长作用。3利拉鲁肽通过激活ERK磷酸化发挥对神经突起增长的促进作用,其下游重要的核转录因子p-CREB参与此过程。4高糖抑制神经细胞活性,利拉鲁肽可部分减少高糖造成的细胞活性抑制,在一定范围内呈浓度依赖性。利拉鲁肽通过Akt/m TOR/HIF-1a通路减少高糖诱导的神经细胞凋亡。高糖与利拉鲁肽对血脑屏障相关因子claudin-5表达无明显影响。
吴尤佳[10]（2014）在《EphA5在先天性甲状腺功能减低大鼠脑中的表达及DNA甲基化调控》文中研究表明目的：建立先天性甲状腺功能减低大鼠模型、培养原代胎鼠海马神经元及分组干预。方法：1.取妊娠日（Gestational day, GD） G0天孕大鼠，随机分为三组，甲减组从G9天开始给予母鼠含0.02%MMI的清洁饮用水直至仔鼠全部处死；T4治疗组给予母鼠含0.02%MMI的清洁饮用水同甲减组，且从分娩日（Postnatal day, PD）第7天即P7天开始每日对仔鼠实施腹腔皮下注射甲状腺素（T4）；对照组一直给予清洁饮用水。2.观察母鼠及仔鼠一般生物学特性，动态监测其体重变化及血清甲状腺激素水平。3.在P0,3,7,14,21天分别收集上述三组仔鼠海马、大脑皮层、小脑，一部分存放于-80℃冰箱中备用，待作基因及蛋白分析；另一部分行石蜡包埋切片，待作免疫荧光染色。4.于G17天取甲减组和对照组胎鼠，断头分离海马，用含B27、谷氨酰胺的Neurobasal无血清培养液培养原代海马神经元，倒置相差显微镜下观察海马神经元的形态变化。取培养7d的海马神经元，用MAP-2进行鉴定及纯度计算。5.按照培养液不同，将培养的甲减组胎鼠海马神经元分为三组：T3组用含T3的培养液，Azadc组用含5-氮杂-2’-脱氧胞苷（Azadc）的培养液，Hypo-组用无血清培养液；并将同期培养的对照组胎鼠海马神经元作为对照组。镜下观察不同培养液干预对甲减组海马神经元生长的影响，并用MTT比色法测定以上四组海马神经元的活力。结果：1.母鼠在G18天时，对照组的体重明显高于甲减组与治疗组（P<0.05）；仔鼠出生后，三组母鼠体重均骤然下降，随后在整个哺乳期体重逐渐增加，但对照组的母鼠体重增加速度高于甲减组与治疗组，且在P3,7,14,21天对照组的母鼠体重明显高于甲减组与治疗组（P<0.05）。母鼠血清甲状腺激素测定结果显示在哺乳期末，甲减组和治疗组母鼠的血清FT3、FT4水平无显着差异（P>0.05），但均显着低于对照组水平（P<0.05）。2.甲减组和治疗组较对照组仔鼠体形小、行动迟缓、反应迟钝、毛发萌出晚且光泽度降低。开始睁眼和完全睁眼的时间甲减组均迟于对照组和治疗组。对照组仔鼠出生体重显着高于甲减组和治疗组（P<0.05）；治疗组的仔鼠体重在P14天已显着高于甲减组但仍低于对照组（P<0.05）；直至P21天，治疗组仔鼠体重与对照组已无显着差异（P>0.05）。仔鼠甲状腺激素测定结果显示：治疗组的仔鼠血清FT3、FT4水平在P14天，显着高于甲减组水平（P<0.05），但仍显着低于对照组水平（P<0.05）；直至P21天，治疗组的仔鼠血清FT3、FT4水平已达到对照组水平（P>0.05），均显着高于甲减组水平（P<0.05）。3.镜下观察海马神经元的形态变化，结果发现甲减组海马神经元与对照组比较，在同一时间点细胞胞体体积较小，突起形成的长度较短、突起的支数较少，突起形成的网络密集程度较低；但是细胞纯度均能达到96%以上。甲减组海马神经元经不同药液干预后突起增多增长、网络密集程度提高；MTT比色分析显示：Azadc组和T3组的细胞活力均显着高于Hypo-组，但这三组的细胞活力均显着低于对照组（P<0.05）。结论：母鼠、仔鼠甲状腺激素水平及一般生物学特性表明先天性甲减组及治疗组大鼠模型均成功建立。细胞形态学的观察、鉴定及活力测定表明原代正常和甲减胎鼠海马神经元培养及药物分组干预成功。目的：研究ephrin-A5/EphA5信号通道及下游关键分子NMDAR-1（NR1）、PSD95、CaMKII在先天性甲减大鼠脑中的表达特征，并初步探讨ephrin-A5/EphA5信号通道与甲状腺激素缺乏致突触发生障碍的关系。方法：1.分别于P0,3,7,14,21天，应用实时定量RT-PCR技术分析甲减组、治疗组、对照组海马、大脑皮层、小脑组织ephrin-A5/EphA5及该通道下游关键分子NMDAR-1（NR1）、PSD95、CaMKII的mRNA表达水平，通过Western Blot方法进行验证后，进一步运用免疫荧光染色检测其蛋白表达水平。2.取培养7d的对照组和甲减组胎鼠海马神经元（包括T3组和Hypo-组），应用实时定量RT-PCR技术分析ephrin-A5/EphA5及该通道下游关键分子NMDAR-1（NR1）、PSD95、CaMKII的mRNA表达水平，通过Western Blot方法进行验证后，进一步运用免疫荧光染色检测其蛋白表达水平。结果：1.在先天性甲减大鼠脑中，ephrin-A5、EphA5、NR1、PSD95、CaMKII基因和蛋白水平均下调且呈现显着的时空特征。（1）在不同实验组之间比较的结果表明：P0P21，ephrin-A5、EphA5、NR1、PSD95、CaMKII基因和蛋白的表达水平在甲减组海马、大脑皮层及小脑中均显着低于对照组（P<0.05），且下降幅度最大的时间点集中在P7天（除了小脑中的NR1）；P0P7，治疗组的表达水平在海马、大脑皮层及小脑与甲减组无显着差异（P>0.05），P14P21，治疗组的表达水平已显着高于甲减组但仍低于对照组（P<0.05）。（2）在不同脑组织之间比较的结果表明：P0P21，甲减组、治疗组、对照组的ephrin-A5、EphA5、NR1、PSD95、CaMKII基因和蛋白的表达水平在海马最高、大脑皮层其次、小脑最低，且在甲减组的海马中表达水平下降幅度最大。（3）在发育的不同时间点之间比较的结果表明：ephrin-A5、EphA5、NR1、PSD95、CaMKII在甲减组的海马、大脑皮层及小脑中的表达水平显着升高的时间点较对照组延迟，且峰值出现的时间点延迟或消失。2.在原代培养的海马神经元中，Hypo-组ephrin-A5、EphA5、NR1、PSD95、CaMKII基因和蛋白的表达水平显着低于对照组（P<0.05）；T3组的表达水平已显着高于Hypo-组但仍低于对照组（P<0.05）。结论：Ephrin-A5/EphA5信号通道可能参与了先天性甲减大鼠神经元的突触发生障碍；甲状腺素替代治疗不能完全逆转ephrin-A5/EphA5及该通道下游关键分子NR1、PSD95、CaMKII表达水平的下调。目的：检测先天性甲减大鼠海马中EphA5基因启动子DNA甲基化水平，探讨DNA甲基化与先天性甲减大鼠海马中EphA5表达调控的关系。方法：1.取P7天的甲减组及对照组大鼠海马组织各6份，及培养7d甲减组及对照组的海马神经元作为样本。2.应用BSP克隆测序法检测样本的EphA5启动子CPG岛DNA甲基化水平；应用试剂盒测定样本的DNMT活力。3.取培养7d的甲减组胎鼠海马神经元（包括Azadc组和Hypo-组），检测其EphA5启动子CPG岛DNA甲基化水平，同时应用实时定量RT-PCR技术和WesternBlot法分别检测EphA5基因mRNA和蛋白的表达水平。结果：1.先天性甲减大鼠海马和原代培养的甲减组海马神经元中，EphA5启动子CPG岛DNA甲基化水平均显着高于对照组（t=10.15,13.74; p<0.001），与EphA5-mRNA表达水平均呈明显负相关（r=-0.957,-0.831; p<0.05）。2.先天性甲减大鼠海马和原代培养的甲减组海马神经元中，DNMT活力均显着高于对照组（t=36.01,63.17; p<0.001），与EphA5-mRNA表达水平均呈明显负相关（r=-0.998,-0.831; p<0.05）。3. Azadc组与Hypo-组比较： EphA5基因DNA甲基化水平显着下降（t=7.33,p<0.05），而EphA5基因mRNA和蛋白水平均显着上调（t=7.07,6.42; p<0.05）。结论：DNA甲基化参与了先天性甲减大鼠海马中EphA5表达的调控，去甲基化治疗可上调先天性甲减大鼠海马神经元中EphA5的表达。
二、蛋白激酶A在培养胎鼠皮层神经元缺氧凋亡中的作用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、蛋白激酶A在培养胎鼠皮层神经元缺氧凋亡中的作用（论文提纲范文）
（1）Roflupram通过抑制神经元自噬减轻脑缺血损伤的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 Roflupram对氧糖剥夺诱导的神经元损伤的保护作用 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 小结 |
| 第二章 Roflupram对氧糖剥夺诱导的神经元损伤的保护作用的机制研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 小结 |
| 第三章 Roflupram对脑缺血损伤大鼠的保护作用及机制研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 小结 |
| 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词表 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（2）基于AMPK/SIRT1/PGC-1α通路研究醒脾解郁方对抑郁大鼠海马神经元突触重塑的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 抑郁症现代医学研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 抑郁症中医药研究进展 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 前言 |
| 1. 抑郁症病理机制中的线粒体损伤 |
| 2. 线粒体能量代谢障碍与突触可塑性损伤 |
| 3. 线粒体生物合成异常与抑郁症神经元突触重塑 |
| 4. 从“脾”论治抑郁症或成为中医治疗的新途径 |
| 参考文献 |
| 实验一 醒脾解郁方对肝郁脾虚抑郁大鼠行为学及海马神经元损伤的保护作用研究 |
| 概述 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 实验二 基于AMPK/SIRT1/PGC-1α介导的线粒体生物合成研究醒脾解郁方对抑郁大鼠海马神经元突触重塑的影响 |
| 概述 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 实验三 基于AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路探讨醒脾解郁方含药血清对皮质酮诱导海马神经元损伤突触重塑的影响 |
| 概述 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 实验四 基于AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路探讨突触微环境对抑郁大鼠海马神经元突触重塑的影响及醒脾解郁方干预效应 |
| 概述 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 结语 |
| 一、研究总结 |
| 二、初步结论 |
| 三、存在不足 |
| 四、创新点 |
| 五、展望 |
| 第四部分 附录 |
| 附录1: 致谢 |
| 附录2 攻读学位期间发表的学术论文及参与课题情况 |
| 附录3 个人简历 |
（3）牛磺酸促进生长受限胎鼠近远期脑发育及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 牛磺酸激活PKA-CREB-BDNF信号通路促进生长受限胎鼠神经干细胞分化研究 |
| 1 实验材料及方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二部分 牛磺酸对生长受限胎鼠海马远期代谢影响 |
| 1 实验材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第三部分 牛磺酸对生长受限胎鼠远期感觉运动及海马突触素表达影响 |
| 1 实验材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 综述 生长受限胎儿脑损伤与牛磺酸的研究进展 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词表 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
（4）生后早期PM2.5染毒所致脑功能障碍及其机制研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 生后早期PM2.5染毒对大鼠脑功能及结构的影响 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 突触损伤在PM2.5染毒所致脑功能障碍中的作用 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 PKA/CREB/BDNF信号通路在PM2.5染毒所致脑损伤中的作用 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间的研究成果及发表的学位论文 |
（5）CDK5激活蛋白p35/p25对EGFR-GSK3β通路的调控作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文对照表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 阿尔茨海默病 |
| 1.2 中风 |
| 1.3 CDK5蛋白及其功能 |
| 1.4 CDK5激活蛋白及其功能 |
| 1.5 EGFR蛋白及其功能 |
| 1.6 EGFR分区及其功能作用 |
| 1.7 AKT蛋白及其功能 |
| 1.8 GSK3β蛋白及其功能 |
| 1.9 论文研究意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞 |
| 2.1.2 动物 |
| 2.1.3 DNA和质粒 |
| 2.1.4 抗体 |
| 2.1.5 试剂及耗材 |
| 2.1.6 溶液配制 |
| 2.1.7 配制培养基 |
| 2.1.8 主要实验设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 质粒构建 |
| 2.2.2 细胞培养 |
| 2.2.3 原代神经元提取与培养 |
| 2.2.4 免疫印迹反应 |
| 2.2.5 免疫共沉淀实验 |
| 2.2.6 GST pull down实验 |
| 2.2.7 细胞免疫荧光 |
| 2.2.8 胚胎电转技术 |
| 2.2.9 小鼠脑立体定位注射 |
| 2.2.10 组织冰冻切片及免疫荧光染色 |
| 2.2.11 中风模型建立 |
| 2.2.12 Long Term Potentiation (LTP)的记录 |
| 2.3. 统计方法 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 p25结合GSK3 β导致GSK3β过度激活 |
| 3.2 p25能够结合GSK3 β的N端和C端 |
| 3.3 p25比p35更能显着提高AKT和EGFR蛋白水平 |
| 3.4 p25能够提高EGFR蛋白水平 |
| 3.5 p25能够与EGFR蛋白结合 |
| 3.6 过表达EGFR导致GSK3 β过度激活 |
| 3.7 EGFR蛋白水平和GSK3β活性在AD小鼠中显着升高 |
| 3.8 中风模型中下游信号分子变化 |
| 3.9 总结与讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（6）ERK通路介导的高尔基体应激在脑缺血再灌注损伤中的作用及机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 缺血再灌注损伤对高尔基体形态的影响 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 离体细胞模型:ERK通路在缺血再灌注损伤中激活及其对GRASP65表达的影响 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 在体动物模型:ERK通路在缺血再灌注损伤中激活及其对GRASP65表达的影响 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间公开发表的论文 |
| 缩略词简表 |
| 致谢 |
（7）N-甲基-D-天门冬氨酸受体对慢性脑缺血大鼠神经突触可塑性的调节作用（论文提纲范文）
| 中英文对照表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 实验材料及方法 |
| 1.1 动物及材料 |
| 1.2 造模及取材 |
| 1.3 采用化学发光法检测NR2A和NR2B表达量 |
| 1.4 NR2A和NR2B海马表达量与低（高）频刺激诱导长时程增强 |
| 1.5 采用免疫组化法染色检测PSD-95、GAP-43、P38含量 |
| 1.6 试剂、仪器 |
| 1.7 统计学方法 |
| 实验结果 |
| 2.1 慢性脑缺血模型大鼠海马组织中N-甲基-D-天门冬氨酸型受体亚单位NR2A和NR2B的表达水平情况 |
| 2.2 低频刺激后慢性脑缺血模型大鼠海马组织中N-甲基-D-天门冬氨酸型受体亚单位NR2A和NR2B的表达水平情况 |
| 2.3 高频刺激后慢性脑缺血模型大鼠海马组织中N-甲基-D-天门冬氨酸型受体亚单位NR2A和NR2B的表达水平情况 |
| 2.4 免疫组化染色检测各组海马区GAP-43阳性细胞数量情况 |
| 2.5 免疫荧光检测各组PSD-95阳性细胞分布情况 |
| 2.6 免疫组化法测定各组海马区突触素P38免疫反应物吸光度值 |
| 讨论 |
| 3.1 NMDA受体及其亚单位与神经突触可塑性的调节关系 |
| 3.2 NMDA受体亚单位对脑神经突触可塑性LTP的调节关系 |
| 3.3 PSD-95与突触可塑性的关联及分析 |
| 3.4 GAP-43与突触可塑性的关联及分析 |
| 3.5 突触体素P38与突触可塑性的关联及分析 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表论文 |
（8）Shh蛋白对皮层神经元神经突起的生长作用及其相关机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 小鼠皮层神经元细胞的原代培养及细胞鉴定 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 Shh蛋白对皮层神经元神经突起的作用及其与BDNF机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 Shh蛋白对氧化应激下皮层神经元活性和神经突起的作用及其线粒体机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 Shh信号通路对脑梗死后神经修复的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）胰高血糖素样肽-1类似物发挥神经保护作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 小鼠原代神经元体外培养与纯度鉴定 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 利拉鲁肽对神经细胞突起长度的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 利拉鲁肽促进神经突起生长的机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 利拉鲁肽对高糖环境下神经细胞的影响及其机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 GLP-1 在神经系统的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）EphA5在先天性甲状腺功能减低大鼠脑中的表达及DNA甲基化调控（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 先天性甲减大鼠模型的建立及原代胎鼠海马神经元的培养 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 Ephrin-A5/EphA5 信号通道在先天性甲减大鼠脑中的表达 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 先天性甲减大鼠脑中 EphA5 基因的 DNA 甲基化调控 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 英文缩写词表 |
| 博士生期间完成的论文 |
| 博士生期间承担科研项目情况 |
| 致谢 |
四、蛋白激酶A在培养胎鼠皮层神经元缺氧凋亡中的作用（论文参考文献）
- [1]Roflupram通过抑制神经元自噬减轻脑缺血损伤的作用及机制研究[D]. 覃芸芸. 南方医科大学, 2021
- [2]基于AMPK/SIRT1/PGC-1α通路研究醒脾解郁方对抑郁大鼠海马神经元突触重塑的影响[D]. 任非非. 北京中医药大学, 2021(01)
- [3]牛磺酸促进生长受限胎鼠近远期脑发育及机制研究[D]. 方琼. 南方医科大学, 2021
- [4]生后早期PM2.5染毒所致脑功能障碍及其机制研究[D]. 刘洁. 重庆医科大学, 2020(01)
- [5]CDK5激活蛋白p35/p25对EGFR-GSK3β通路的调控作用及机制研究[D]. 王梦丹. 厦门大学, 2019(09)
- [6]ERK通路介导的高尔基体应激在脑缺血再灌注损伤中的作用及机制[D]. 朱蓓蕾. 苏州大学, 2018(04)
- [7]N-甲基-D-天门冬氨酸受体对慢性脑缺血大鼠神经突触可塑性的调节作用[D]. 霍帅. 延安大学, 2016(02)
- [8]Shh蛋白对皮层神经元神经突起的生长作用及其相关机制研究[D]. 何伟亮. 河北医科大学, 2016(08)
- [9]胰高血糖素样肽-1类似物发挥神经保护作用及其机制研究[D]. 李萌. 河北医科大学, 2016(08)
- [10]EphA5在先天性甲状腺功能减低大鼠脑中的表达及DNA甲基化调控[D]. 吴尤佳. 苏州大学, 2014(10)