一、高效提取血细胞DNA的体会（论文文献综述）
王蕊蕊[1]（2021）在《SVWC在家蝇抗菌免疫中的作用》文中进行了进一步梳理先天免疫（Innate immunity）是无脊椎动物的主要免疫途径。无脊椎动物依赖模式识别受体（Pattern Recognition Receptors,PRRs）精准地实现自我/非我识别,这是宿主防御病原体的基本步骤,也是触发免疫反应的关键。Single von Willebrand factor C-domain proteins（SVWC）是最近发现于节肢动物中的蛋白家族,其特征是具有单一的von Willebrand因子C（VWC）型结构域。在标准的哺乳动物VWC结构域中具有10个保守的半胱氨酸残基,而SVWC只含有其中8个半胱氨酸残基。有报道SVWC家族成员能应答细菌刺激和营养状况改变时等环境胁迫而做出反应。本研究以家蝇（Musca domestica）为主要研究对象,鉴定了一个新的SVWC基因,命名为MdSVWCIA-1,RNAseq显示家蝇幼虫MdSVWCIA-1在细菌刺激后显着上调,提示MdSVWCIA-1可能参与家蝇抗菌免疫,但是作用机制并不明晰。因此,本研究对家蝇SVWC家族进行系统的生物信息学分析,并从基因水平与蛋白水平探究MdSVWCIA-1在家蝇先天免疫中的功能。研究成果如下:1.生物信息学分析发现MdSVWCIA-1为小分子分泌型蛋白,并具有SVWC结构域及其8个保守半胱氨酸残基。2.基于qPCR的空间表达谱分析发现,MdSVWCIA-1主要在幼虫脂肪体和肠道中表达;受到细菌Escherichia coli或Staphylococcus aureus刺激后,幼虫体内MdSVWCIA-1转录水平显着升高。3.利用RNAi技术敲低幼虫MdSVWCIA-1表达,并注射细菌进行免疫刺激。干扰组较对照组（dsGFP）幼虫存活率和酚氧化酶活性降低,同时抗菌肽（muscin,diptericin,attacin,cecropin）基因和NF-κB样转录因子（dorsal）基因的表达水平也显着降低,提示MdSVWCIA-1对体液免疫具有调控作用。4.利用大肠杆菌表达系统获得重组蛋白rMdSVWCIA-1。将rMdSVWCIA-1与E.coli包被后注射到家蝇体内,机体内清除细菌的能力显着增强。体外实验发现rMdSVWCIA-1具有结合细菌和酵母的活性、Ca2+依赖的凝集活性以及调理血细胞吞噬活性。进一步的ELISA实验证实rMdSVWCIA-1对LPS、Lys-PGN、DAP-PGN、D-半乳糖、D-甘露聚糖、β-1,3-葡聚糖等具有广谱的结合能力。免疫荧光实验发现,rMdSVWCIA-1能够结合于血细胞表面,推测血细胞膜上存在MdSVWCIA-1的特异识别的受体,与MdSVWCIA-1一起调控吞噬作用。综上研究结果,我们认为MdSVWCIA-1可能是一种新型的模式识别受体,通过结合PAMP介导病原识别,进而通过凝集反应、调理吞噬和促进抗菌肽合成等功能参与细胞免疫和体液免疫调控,在宿主抗菌免疫过程中发挥作用。
郭育[2]（2021）在《中华鲎血液中凝血相关蛋白的制备及应用》文中研究指明中华鲎是一种古老的海洋生物。中华鲎的先天免疫系统完全依赖于一套独特且有效的凝血系统。凝血系统的凝血级联反应主要由Factor C（FC）、Factor G（FG）、Factor B（FB）以及Proclotting Enzyme（PCE）等4种凝血血蛋白和一种凝固蛋白原组成的。该系统为一种由内毒素激活FC途径,另外一种由（1,3）-β-D-葡聚糖激活FG途径。天然的鲎血制品广泛地应用于药品和食品的内毒素和真菌葡聚糖的检验、医疗器械、临床医学研究等多个领域。但由于鲎资源过度消耗,导致鲎的数量急剧减少。2019年,中华鲎已经被列入到世界自然保护联盟（IUCN）红色名录——濒危（EN）。因此,鲎试剂的制备需要通过其他的方法替代天然鲎血获得鲎试剂的原材料。本课题实验旨在通过在大肠杆菌工程菌中表达异源蛋白获得凝血蛋白,来构建检测内毒素或（1,3）-β-D-葡聚糖的反应体系,使检测更加灵敏、特异性更强,从而替代提取天然鲎血,解决生产鲎试剂原材料短缺的问题。本论文通过大肠杆菌表达系统分别异源表达FGα、FGβ和PCE等凝血因子蛋白,构建特异性检测（1,3）-β-D-葡聚糖的单一途径反应体系。通过改变诱导条件、与分子伴侣素CpkA共表达、设计融合标签肽等实验方法提高FGα和PCE的可溶性表达。对诱导表达的包涵体进行体外复性实验,利用得到的复性蛋白构建检测（1,3）-β-D-葡聚糖的反应体系,并测定不同凝血因子组合（双因子和三因子）的反应体系的肽酶活性;我们还尝试利用分子伴侣素辅助FGα和PCE体外复性。结果表明,我们在Esherichia coli BL21（DE3）中分别成功表达出FGα、FGβ和PCE重组蛋白,但主要以包涵体形式存在。分子伴侣素在体内/体外都能辅助鲎凝血因子折叠。标签肽/分子伴侣素共表达体系可提高FGα的可溶性表达:FGα’可溶性表达提高2倍;FGα’与分子伴侣素MA4386共表达,可溶性表达提高7.5倍。三种鲎凝血因子蛋白的复性均有活性,在1M和2M的尿素浓度范围内都具有肽酶活性,并在2M尿素环境中活性最高,其中CpkB辅助复性的FG a+PCE双因子检测体系具有最高的（1,3）-β-D-葡聚糖诱导的肽酶活性9.6 U/mg,且高于鲎试剂的比活为0.9 U/mg;此外非葡聚糖糖类无法诱导肽酶活性实验表明双因子检测体系对（1,3）-β-D-葡聚糖的高特异性。本实验成功表达了三种鲎凝血因子蛋白,并应用标签肽/分子伴侣素共表达体系提高了FGα的可溶性表达;最终构建了一个高活力、高特异性地用于检测（1,3）-β-D-葡聚糖反应体系。
战君菲[3]（2021）在《镉和砷对菲律宾蛤仔毒性的剂量-效应关系研究》文中研究表明镉（Cd）和砷（As）是近海典型污染物,对海洋生态系统健康构成威胁。因此,深入研究Cd和As对海洋生物毒性的剂量-效应关系,并筛选敏感生物标志物指示近海Cd、As污染具有重要意义。本研究利用Meta分析探究海洋双壳贝类对Cd暴露的响应特征。基于Meta分析的结果选择菲律宾蛤仔整体组织为研究对象开展室内Cd、As暴露实验,利用转录组学、代谢组学等组学技术筛选响应指标,并结合组织病理损伤和生化等指标,利用基准剂量法（BMD）对响应指标的剂量-效应关系进行模型拟合,以期深入揭示Cd和As的毒性效应机制。同时,根据最优模型计算各生物指标的BMD值,筛选单调且灵敏响应的指标作为Cd和As毒性的生物标志物。主要研究结果如下:1.Meta分析揭示了海洋双壳贝类对Cd暴露的响应特征按照剔除和纳入标准,共纳入87篇相关文献,获得2042个数据。按照物种、组织、毒性效应指标以及暴露浓度进行Meta分组分析。结果显示,海洋双壳贝类对Cd暴露表现出显着的物种差异,其中蛤对Cd暴露响应程度最大,而各组织响应程度并未表现出显着差异;海洋双壳贝类体内各类生物指标的响应程度存在显着差异,其中解毒和基因毒性相关的指标响应程度最大;暴露浓度是导致Cd毒性差异的主要因素,随暴露浓度的升高,海洋双壳贝类生物指标响应程度显着增加;氧化应激和解毒相关的多个指标对Cd暴露浓度呈现多样化的剂量-效应关系,其中金属硫蛋白（MT）呈现先上升后基本不变的剂量-效应关系,谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）和丙二醛（MDA）的剂量-效应曲线均呈倒U型,尤其GPx表现出典型的低剂量刺激、高剂量抑制的毒物兴奋效应,而超氧化物歧化酶和过氧化氢酶未表现出明显的剂量依赖效应。2.Cd对菲律宾蛤仔毒性的剂量-效应关系根据环境相关浓度及96 h半致死浓度设定Cd暴露梯度浓度（0、3、9、27、81和243μg/L）,实验室条件下暴露菲律宾蛤仔14 d。利用转录组学、代谢组学等技术对蛤仔整体组织响应基因、代谢物等指标进行高通量筛选,同时测定金属离子、酶活、组织病理损伤及细胞凋亡等毒理学指标。结果显示,随Cd暴露浓度升高,Cd在蛤仔体内富集量逐渐增加,必需金属含量也随之发生变化,且剂量效应曲线呈现多样性。结合转录组学分析,发现Cd暴露在基因调控水平对离子内稳态的影响非常有限,Cd主要通过竞争必需金属离子转运体和必需金属离子结合蛋白干扰离子内稳态。而必需金属含量的改变以及Cd对关键酶活性中心必需金属元素的竞争结合,导致相关基因（如漆酶laccase、谷氨酰胺转移酶TGs、金属还原酶STEAP、钙调蛋白calmodulin等）的异常表达。结合KEGG和GO富集分析发现,Cd暴露干扰细胞内氧化还原的平衡,引起氧化应激,激活细胞凋亡等信号通路,影响菲律宾蛤仔细胞粘附、肽交联、蛋白水解等正常生物学功能。此外,代谢组学、酶活力分析结果显示,Cd暴露以剂量依赖的方式影响了三羧酸（TCA）循环、糖酵解、氨基酸代谢以及氧化磷酸化等关键代谢途径。利用BMD方法对多种响应指标的剂量-效应关系进行模型拟合,并计算BMD值。结果发现,TGs、MT、STEAP和laccase等DEGs呈单调变化,且BMD值较低,是理想的基因生物标志物。菲律宾蛤仔对Cd暴露最敏感的GO条目和KEGG通路分别为肽交联和细胞粘附通路。代谢组学和酶活力分析结果显示,丙氨酸、葡萄糖、AMP的含量变化和琥珀酸脱氢酶（SDH）的活力呈典型毒物兴奋效应;谷氨酰胺和葡萄糖-1-磷酸的含量变化以及己糖激酶（HK）和柠檬酸合酶（CS）的活力变化呈单调下调,其中CS活力是理想的酶类生物标志物。而谷胱甘肽（GSH）含量和谷胱甘肽巯基转移酶（GST）活力等传统生物标志物呈非单调的剂量-效应关系,不宜作为菲律宾蛤仔响应Cd暴露的生物标志物。3.As（Ⅴ）对菲律宾蛤仔毒性的剂量-效应关系根据环境相关浓度及96 h半致死浓度设定As（Ⅴ）暴露梯度浓度（0、0.2、0.5、1.25、2.5和5 mg/L）,实验室条件下暴露菲律宾蛤仔14 d。利用高效液相色谱联用电感耦合等离子体质谱法测定菲律宾蛤仔体内砷形态及其含量,结果显示,随As（Ⅴ）暴露浓度的升高,有机砷含量基本不变,无机砷As（Ⅴ）和As（Ⅲ）含量增加,表明菲律宾蛤仔体内发生了As（Ⅴ）到As（Ⅲ）的转化。转录组学分析显示,在高浓度As（Ⅴ）暴露组硫氧还蛋白、GST和3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）等参与As（Ⅴ）转化生成As（Ⅲ）过程的酶基因均显着上调,表明菲律宾蛤仔通过上调关键酶的转录表达促进体内累积的As（Ⅴ）转化生成As（Ⅲ）。进一步整合转录组和代谢组结果,发现菲律宾蛤仔通过促进GSH的合成、增加对过氧化物等ROS的清除能力等方式抵抗无机砷富集引起的氧化应激。As（Ⅴ）暴露促进蛤仔体内糖酵解反应、TCA循环和氧化磷酸化等过程,为机体提供更多的能量,且关键差异代谢物和DEGs与As（Ⅴ）的暴露浓度呈现多样化的剂量-效应关系;鞘脂类去饱和酶（DEGS）、羟基类固醇脱氢酶（HSD17B6）、羟基丁酸脱氢酶（bdh）基因均显着上调表达,表明As（Ⅴ）暴露还促进脂肪酸氧化代谢等途径,为TCA循环提供更多的乙酰辅酶A。最高浓度As（Ⅴ）暴露组磷酸胆碱含量显着降低,也提示As（Ⅴ）暴露导致菲律宾蛤仔能量代谢紊乱。此外,As（Ⅴ）暴露还干扰了氨基酸代谢。利用BMD方法对多种响应指标的剂量-效应关系进行模型拟合,并计算BMD值。GST、组织蛋白酶L（CTSL）、ATP结合盒转运蛋白（ABCC）、和mae B等多个DEGs的表达倍数均呈单调曲线,且BMD值较低,因此可作为As（Ⅴ）对菲律宾蛤仔毒性的生物标志物。通过对拟合到最佳模型的DEGs进行富集分析,发现对As（Ⅴ）暴露最敏感的GO条目和KEGG通路分别为半胱氨酸型肽酶活性和吞噬作用。4.Cd和As（Ⅴ）对菲律宾蛤仔毒性作用机制比较Cd和As暴露均干扰了菲律宾蛤仔TCA循环、糖酵解以及氧化磷酸化等关键代谢过程,且均表现出毒物兴奋效应;Cd和As（Ⅴ）均通过消耗GSH破坏细胞内氧化还原平衡,诱导氧化应激;菲律宾蛤仔鳃和消化腺的病理损伤指数均随Cd和As（Ⅴ）暴露剂量单调增加,菲律宾蛤仔消化腺组织对Cd和As（Ⅴ）暴露较鳃组织更敏感。同时,Cd和As（Ⅴ）对菲律宾蛤仔的毒性作用机制存在较大差异。Cd暴露导致葡萄糖、ATP和AMP等主要能量代谢物质的含量呈非单调变化,但As（Ⅴ）暴露后蛤仔体内葡萄糖、ATP和AMP的含量并未发生改变;对Cd和As（Ⅴ）暴露敏感的GO条目和KEGG通路完全不同;As（Ⅴ）还表现出对菲律宾蛤仔的生殖内分泌干扰效应。
贺健[4]（2021）在《马麝源兔出血症病毒VP60互作宿主细胞蛋白的筛选及初步鉴定》文中研究指明马麝病毒性出血症（Moschus chrysogaster viral hemorrhagic disease,Mc VHD）是由马麝源兔出血症病毒（Rabbit haemorrhagic disease virus,RHDV）所引起的一种以马麝肝、肺等多脏器充血、出血及坏死为主要特征的急性、致死性动物传染病。目前,该病已对马麝人工繁育的发展造成了严重威胁。该病毒是一种首次在马麝种群中分离鉴定到的兔出血症病毒。研究表明它与经典RHDV基因组结构相同,属RHDV G2基因型;并且VP60蛋白作为RHDV的结构蛋白,与RHDV的致病性和免疫原性关系密切。因此,研究与马麝源RHDV相互作用的宿主细胞蛋白将对探究该病毒的感染机制和开展Mc VHD的防控具有重要意义。基于此,本研究将开展以下工作:（1）马麝源RHDV互作宿主细胞蛋白的筛选。以健康未免疫新西兰大白兔作为动物模型采集血液分离红细胞后,继而进行兔肝、脾、肾、肺各脏器原代细胞的制备,并以灭活的马麝源RHDV作为诱饵蛋白,应用免疫共沉淀（Co-IP）结合质谱分析方法对RHDV的互作宿主细胞蛋白进行筛选和生物信息学分析。结果表明:a.在肝、脾、肺、肾、红细胞5个试验组中共有88个差异蛋白被鉴定筛选,其中肝细胞组中差异蛋白数量最多为56个。b.肝细胞组中差异蛋白的生物信息学分析表明:差异蛋白主要由膜蛋白、角蛋白等组成,且具有结合能力和各种酶活性;并且差异蛋白主要参与碳水化合物运输、代谢以及蛋白质修饰等过程;另外参与新陈代谢通路的差异蛋白远高于参与其他4类信号转导通路的蛋白。（2）马麝源RHDV结构蛋白VP60和宿主细胞相关蛋白的原核表达及鉴定。经筛选将ANXA2、EF-1α、Trx作为与马麝源RHDV结构蛋白VP60潜在互作的宿主细胞蛋白。进而在完成PGEX-GST-His双标签原核表达载体构建的基础上,以Gen Bank中相应基因序列为模板,设计引物并扩增相应目的基因,进而构建重组表达载体PGEX-GST-VP60-His、PGEX-GST-ANXA2、PGEX-GST-Trx、PGEX-GST-EF-1α,并将鉴定正确的重组载体分别转化至大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达。最后对所有重组蛋白分别进行纯化和Western blot鉴定。结果显示:所构建的PGEX-GST-His双标签原核表达载体与预期相符;VP60、ANXA2、Trx、EF-1α各基因扩增产物大小分别为1740 bp、1020 bp、318 bp和1389 bp,经比对所有扩增产物均未发生氨基酸位点突变;所有重组蛋白可分别在大肠杆菌BL21（DE3）中成功表达,且均为可溶性表达;Western blot鉴定所有重组蛋白均正确表达且与预期符合。（3）马麝源RHDV互作宿主细胞蛋白的初步鉴定。利用His-Pull down技术对与马麝源RHDV结构蛋白VP60相互作用的宿主细胞蛋白进行鉴定。结果表明结构蛋白VP60与ANXA2蛋白在体外可发生直接相互作用,而Trx蛋白、EF-1α蛋白可分别与对照组GST-His重组蛋白以及试验组GST-VP60-His重组蛋白均发生结合。鉴于GST标签蛋白的影响,VP60蛋白在体外是否分别可与Trx蛋白、EF-1α蛋白发生直接相互作用还需进一步验证。本研究通过Co-IP结合质谱分析成功在所有试验组中共筛选出88个差异蛋白,且肝细胞组中所筛选的56个差异蛋白主要参与碳水化合物运输、代谢以及蛋白质修饰等过程。将ANXA2、Trx、EF-1α3种蛋白质作为与马麝源RHDV潜在互作的宿主细胞蛋白。通过原核表达成功获得VP60、ANXA2、Trx、EF-1α重组蛋白,所有蛋白均表达正确,且为可溶性表达。在此基础上,利用His-Pull down方法确定了马麝源RHDV VP60蛋白与ANXA2蛋白可在体外直接结合;而EF-1α、Trx蛋白与VP60蛋白的互作关系需进一步研究。本研究结果为马麝源RHDV感染机制的深入研究及McVHD的有效防控奠定了基础。
郭钟扬[5]（2021）在《新型细胞推片与释放系统的关键技术研究》文中研究说明从外周血中识别并分离富集有核红细胞是当前在无创产前诊断领域的热门研究方向,所收集到的有核红细胞可应用于对唐氏综合征、神经管缺陷、单基因疾病等出生缺陷的早期诊断和筛查。但现有研究的方法大多依赖于有核红细胞表面抗原与特异性抗体结合的免疫亲和技术,存在着成本高、分离纯度低、操作流程复杂等缺点。针对于此,为了实现外周血中有核红细胞的识别与释放,开发安全有效的非侵入式技术分离有核红细胞用于产前胎儿疾病诊断,本文提出了一种基于细胞单层推片技术和近红外光热响应水凝胶材料的有核红细胞识别释放方法。设计并搭建了两套应用于有核红细胞涂片识别和释放环节的实验装置。实现了有核红细胞的单层平铺、识别与定点释放。为有核红细胞的分离富集提供了一种低成本、易操作、无需依赖抗体的创新技术思路,在产前筛选诊断领域中具备广阔的应用前景。本文主要研究内容如下:（1）以光响应水凝胶材料为基底建立了自动化细胞涂片制备装置。首先,设计了细胞涂片制备装置的机械结构,并基于STM32单片机开发运动控制程序,优化推片角度和速度参数,制备水凝胶膜基底涂片。其次,在温敏水凝胶明胶中引入二维材料MXene,结合MXene的近红外光热转换特性,在水凝胶膜表面实现近红外光响应。然后,在水凝胶基底膜表面进行全血推片实验,优化血液推片参数,制备得到可释放全血单层细胞涂片,并验证其细胞平均分布密度较标准片提升19.3%。（2）构建了用于识别释放有核红细胞的显微成像和激光聚焦系统。首先,设计并建立了集成式光路结构,可便捷地实现明场显微成像模式和激光聚焦释放模式的切换。其次,在明场显微模式下依据细胞形态学特征对有核红细胞进行识别定位。然后,808 nm激光器的光源经过准直镜和会聚镜聚焦到细胞涂片表面,产生光热效应进行细胞释放。最后,经过激光聚焦系统的调控,得到了光斑直径为300 μm的细胞定点释放区域。
陈家奎[6]（2021）在《slc20a1b调控斑马鱼造血干祖细胞的功能研究及机制初探》文中提出造血过程是一个复杂而且贯穿生命始终的过程,与生物体的衰老、疾病和肿瘤发生等都息息相关。由于成熟血细胞的寿命很短,因此我们终生需要造血干祖细胞来补充多谱系祖细胞和各个造血谱系的成熟细胞。造血干细胞的自我更新能力,为临床上治疗血液相关疾病提供了极大的方便,给患者带来了福音。同时,造血干祖细胞能够分化成淋巴细胞祖细胞,粒系祖细胞,髓系祖细胞,巨核红系祖细胞。这些祖细胞最后分化成成熟的血细胞,形成整个生命体造血系统,能够维持氧气运输和免疫相关功能。造血干祖细胞的产生、维持、扩增、分化、成熟等过程是受多种基因和转录因子所调控的。如果造血干细胞受到影响而使得其数目或者功能发生异常,则往往会引起许多相关疾病。因此,通过深入了解造血干细胞的发育过程,理清造血干祖细胞的分化成熟和稳态维持的调控网络机制,对治疗相关的血液疾病至关重要。斑马鱼是作为研究器官发育、人类遗传性相关疾病、造血发育和血液性相关疾病的理想模式生物,因为其基因组与脊椎动物具有高度的相似性和保守性。因此,本文通过运用斑马鱼在遗传学,胚胎期发育和活体成像等方面的优势,来探究造血干祖细胞的发育调控新机制,并期望借此揭示相关疾病的致病机理,为临床上治疗相关疾病做出贡献。在实验室的前期工作中,已通过正向遗传学筛选获得了一个突变体smu07,本文我们首先利用定位克隆技术将突变基因锁定为slc20a1b基因。此外,通过CRISPR/Cas9的方法,我们获得了一个slc20a1b突变体,并发现其能够完美地模拟smu07的表型。通过对smu07突变体造血表型的完整分析,我们发现该突变体中存在造血干祖细胞的发育缺陷。通过对突变体中的磷酸盐浓度进行检测,我们发现造血干祖细胞的缺陷并非来源于潜在的slc20a1b磷酸盐共转运体转运功能的改变。进一步地,通过对造血缺陷表型的探究,我们发现造血干祖细胞以细胞自主的方式造成了smu07的突变表型。而且,该突变体的造血干祖细胞同时存在着细胞死亡增多和细胞增殖减少的现象。通过以上研究,本文揭示了slc20a1b在造血干祖细胞的早期发育过程中发挥重要的作用。本研究还丰富了我们对造血干祖细胞发育调控网络的理解,为相关血液疾病的治疗和药物筛选提供了思路。
戴晓玲[7]（2021）在《日本沼虾六个甲壳肽的免疫功能研究》文中提出日本沼虾（Macrobrachium nipponense）又叫做青虾,是重要的经济类淡水食用虾,营养丰富,在中国有很大的市场。近年来,由于环境污染和追求高产的集约化水产养殖,日本沼虾的养殖中出现了许多由微生物感染的疾病。据报道引起虾的流行性病害的病原体有很多,包括病毒和细菌。因此,虾的先天性免疫抗病机制的研究受到了广泛的关注。甲壳肽（Crustin）是一种甲壳动物体内的抗菌肽,在先天性免疫系统中通过各种信号通路中的转录因子调节其转录水平,以达到防御外来病原入侵的作用。本课题研究了六个Crustin免疫基因在日本沼虾先天性免疫防御机制中的作用,研究结果如下:1.Crustin作为一种抗菌肽,对甲壳动物的先天免疫起至关重要的作用。这项研究中,从日本沼虾中克隆了两种富含甘氨酸（glycine,Gly）的Crustin基因,分别称为Mn-Gly-Cru1和Mn-Gly-Cru2。这些Crustin属于Ⅱ型Crustin,具有典型的Ⅱ型Crustin结构。Mn-Gly-Cru1的全长cDNA为677 bp,包含一个576 bp大小的开放阅读框（ORF）,编码191个氨基酸。Mn-Gly-Cru2的全长cDNA为727 bp,ORF为573 bp,编码190个氨基酸。所构建的系统树表明Mn-Gly-Cru1和Mn-Gly-Cru2都属于Ⅱa型亚科。RT-PCR分析表明,Mn-Gly-Cru1和Mn-Gly-Cru2广泛分布在各种组织中。qRT-PCR结果表明,Mn-Gly-Cru1主要在鳃组织中表达,而Mn-Gly-Cru2在血细胞中最高表达。Mn-Gly-Cru1和Mn-Gly-Cru2的转录本均对细菌或白斑综合症病毒（white spot syndrome virus,WSSV）刺激有反应。注射ds MnRelish 48 h后,MnRelish被敲低,之后检测甲壳肽,发现Mn-Gly-Cru1和Mn-Gly-Cru2的表达随之被抑制。在WSSV,副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）或金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）刺激之后,MnRelish,Mn-Gly-Cru1和Mn-Gly-Cru2的表达均上调。然而,与对照组（只细菌或WSSV刺激,细菌或WSSV刺激加ds GFP注射）相比,在Relish沉默的虾体内,细菌刺激6 h或WSSV刺激36 h后,MnRelish,Mn-Gly-Cru1和Mn-Gly-Cru2的表达水平下调。结果表明,Mn-Gly-Cru1和Mn-Gly-Cru2在日本沼虾的先天性免疫防御细菌和WSSV机制中起重要作用,并且这两个基因的表达受到Relish转录因子的调控。2.Carcinin是甲壳肽家族的成员,在甲壳动物的先天免疫中发挥着关键性作用。在这项研究中,确定了两种在日本沼虾体内通过选择性剪切产生的异构体（MnCarc1和MnCarc2）。MnCarc1和MnCarc2 cDNA的全长分别为1554和1495bp,带有687和609 bp的开放阅读框,分别编码228和202个氨基酸。Carcinin的基因组有9个外显子和8个内含子。MnCarc1转录本包含全部9个外显子,而MnCarc2仅包含8个外显子,缺少外显子4。MnCarc1和MnCarc2蛋白包含信号肽,富含半胱氨酸（cysteine,Cys）区域和乳清酸性蛋白（WAP）结构域。系统发育树表明,MnCarc1和MnCarc2并没有与其他Crustins和Carcinins聚集,MnCarc1和MnCarc2单独形成一个亚组。MnCarc1和MnCarc2广泛分布在各种组织中。在日本沼虾血细胞和肠道中,WSSV、副溶血弧菌和金黄色葡萄球菌刺激后的多个时间点,MnCarc1和MnCarc2的表达明显上调。进一步的研究表明,敲低MnDorsal或MnStat转录因子可以显着抑制病毒或细菌刺激引起的MnCarc1和MnCarc2表达上调。此外,重组MnCarc1和MnCarc2蛋白可以与各种细菌和多糖结合,并在体外抑制金黄色葡萄球菌以及副溶血弧菌的生长。这项研究表明,Carcinin参与了日本沼虾的先天性免疫。3.在日本沼虾体内克隆到两个Crustin基因,分别命名为MnCru174和MnCru191。它们的全长分别为740和781 bp,带有525和576 bp的ORF,分别编码174和191个氨基酸。MnCru174和MnCru191基因组序列都含有两个外显子和一个内含子,其蛋白都包含信号肽、富含Cys区域、富含Gly区域和WAP域。系统发育树表明,MnCru174,MnCru191与MnCru3聚合为一个分支,进化的距离很近。MnCru174和MnCru191广泛分布于各免疫组织。在日本沼虾的血细胞、鳃和胃组织中,经过WSSV、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌刺激后的多个时间点,MnCru174和MnCru191的转录水平均显着上升。利用RNAi实验将MnCru174和MnCru191沉默后能够显着增加机体内WSSV的拷贝数和金黄色葡萄球菌及副溶血弧菌菌落的数量。此外,重组MnCru174和MnCru191蛋白可以与多种细菌和多糖结合。这项研究表明,MnCru174和MnCru191在日本沼虾防御细菌及病毒入侵过程中发挥重要的免疫作用。本论文以日本沼虾作为研究对象,对其六个Crustin的功能作深入的研究。有两个方面的意义,一是通过对日本沼虾体内的Crustin基因（Mn-Gly-Cru1,Mn-Gly-Cru2,MnCarc1,MnCarc2,MnCru174,MnCru191）的研究,丰富甲壳动物先天性免疫的理论。二是通过本研究为诠释日本沼虾先天免疫信号通路的分子调控机理奠定一定的基础,同时也为日本沼虾病害防治提供理论支持。
汤万波[8]（2021）在《Hlf标记的胚胎新生造血干细胞的功能及命运研究》文中研究说明造血干细胞是包括髓系细胞和淋系细胞在内的多种成熟血细胞的主要来源。小鼠胚胎发育过程中,造血干细胞主要起源于胚胎期第10.5天（embryonic day,E10.5）的主动脉-性腺-中肾区（aorta-gonad-mesonephros region,AGM）区,此时主动脉内皮经过内皮造血转化过程产生造血细胞。在该过程中,一小群特化的生血内皮细胞的形态逐渐由内皮细胞样的扁平转变为造血细胞样的圆形,并通过出芽的方式集结形成造血簇。簇中包含了造血干细胞前体,它们最终会发育为成熟造血干细胞并迁移至胎肝扩增,随后定植到骨髓。在胚胎造血干细胞发育过程中,由于缺乏特异性表面标志分子,一直无法精确捕获造血干细胞及其相关群体。我们前期研究筛选获得高特异性表面标志,结合单细胞诱导移植体系,首次在单细胞水平高效富集造血干细胞前体,并结合单细胞转录组测序,系统解析了造血干细胞发育全程的单细胞动态分子表达特征。本课题进一步挖掘造血干细胞发育全程的单细胞转录组数据,针对胚胎期早期内皮细胞、造血干细胞前体、胎肝和成体造血干细胞群体的单细胞分子表达特征进行分析,得到造血干细胞特化过程中表达上调的基因集合,从中筛选出从造血干细胞前体到造血干细胞阶段逐渐上调并显着高表达在造血干细胞中的Hlf基因（hepatic leukemia factor,Hlf）。新近研究显示Hlf分子特异性的表达在胎肝及成体造血干细胞中,提示Hlf分子亦可能特异性标记胚胎早期的造血干细胞前体和造血干细胞,为此我们构建了 Hlf-tdTomato荧光报告小鼠和Hlf-CrexER谱系示踪小鼠。我们针对新构建的Hlf-tdTomato荧光报告小鼠进行表达图谱的鉴定,组化染色结果显示:在E10.5 AGM区中共表达RUNX1和CD31的造血相关群体表达Hlf-tdTomato,而CD31+的内皮层细胞基本不表达Hlf-tdTomato。流式结果也表明,E10.5 AGM 区内皮细胞群体（CD31+CD41-CD43-CD45-）不表达 Hlf-tdTomato,造血簇（CD31+Kit+）中有超过40%的细胞表达Hlf-tdTomato;E11的AGM区中有接近40%的CD45-造血干细胞前体和几乎所有的CD45+造血干细胞前体都表达Hlf-tdTomato。我们进一步通过诱导移植实验发现:在E10.5的CD31+CD45+Kit+群体中,仅Hlf-tdTomato+亚群在诱导/移植后3到4周存在髓系和淋系重建,而CD31+CD45-Kit+群体中,Hlf-tdTomato+和 Hlf-tdTomato-亚群在移植后3到4周均出现髓系和淋系重建,表明Hlf表达能特异性富集功能性CD45+造血干细胞前体。此外,E11造血簇细胞（CD3 1+Kit+）进行体外孵育后的产物分析结果显示:只有Hlf+细胞能产生造血干细胞表型样的细胞。以上功能实验表明Hlf-tdTomato表达能进一步有效富集CD45+造血干细胞前体。继而,利用新构建Hlf-CrexER与ROSA26报告小鼠杂交,通过在早期胚胎发育的不同时间点进行诱导,对表达Hlf-CrexER的细胞群体进行谱系示踪,以探究早期胚胎Hlf-CrexER阳性细胞对胎肝各造血干祖细胞群体和成体外周血贡献的动力学变化。使用 Lin-Sca-1+Mac-1lowCD201+（LSM201）、CD45+CD201+CD48-CD150+（ESLAM）和 Lin-Sca-1+Kit+CD48.CD150+（LSKSLAM）的表面标志组合进行胎肝造血干细胞的分析,我们发现E8.5诱导后,胎肝造血干细胞基本未被标记上,而E9.5、E10.5、E11.5和E13.5诱导后,胎肝造血干细胞标记比例呈现逐步上升,尤其E9.5和E10.5诱导后,标记比例均值出现跃升。对诱导后出生的成年小鼠外周血各谱系标记比例的持续检测发现,E9.5诱导后外周血各谱系标记比例均值约2%,显着低于E10.5诱导后（约20%）,表明该时间段随着Hlf表达强度的逐渐上升,可能充分标记了 AGM区的造血干细胞前体及造血干细胞群体。因为AGM区造血干细胞前体及造血干细胞群体起源于内皮细胞,我们进一步通过Tie2-Dre与Hlf-CrexER进行交配得到组成型小鼠,再与ROSA26报告小鼠杂交,即可将Hlf标记更加特异性的限定在早期内皮细胞。通过胎肝造血干细胞检测,我们发现组成型小鼠在胎肝造血干细胞中的标记比例不如诱导型中E13.5中造血干细胞标记比例高,并且通过对出生后小鼠外周血各谱系示踪记录比较,发现组成型小鼠外周血各谱系标记比例也低于诱导型小鼠外周血各谱系的标记比例。总之,本研究通过单细胞转录组分析,筛选到在造血干细胞前体、胎肝造血干细胞和成体造血干细胞中特异性表达的Hlf分子,并构建了 Hlf-tdTomato荧光报告小鼠和Hlf-CrexER谱系示踪小鼠。通过荧光报告小鼠模型我们对胚胎早期造血干细胞前体进行了进一步标记分析,并利用谱系示踪模型揭示了不同发育时间点Hlf分子表达标记细胞的造血命运以及对胎肝造血干细胞贡献的动力学变化。并且构建的小鼠模型可与多种基因型小鼠联合使用,谱系示踪小鼠与Confetti小鼠的联合使用能对造血干细胞的起源异质性进行研究,利用荧光报告小鼠可以探究造血干细胞在骨髓微环境中的定位及其与其他分子间相互作用的机制,这对研究造血干细胞的起源及其应用具有重要的借鉴意义。
赵同德[9]（2020）在《芪胶升白胶囊防治化疗相关白细胞减少临床研究与机制探讨》文中研究表明目的化疗后白细胞减少是影响化疗方案执行的重要原因,本课题采用多中心、随机、双盲、双模拟、阳性药物平行对照临床研究设计,以气血两虚证的肺癌、乳腺癌患者为研究对象,以芪胶升白胶囊、安多霖胶囊、化疗为干预措施,监测化疗后全血细胞计数、气血两虚证积分变化,评价芪胶升白胶囊防治化疗相关白细胞减少的疗效;进一步以环磷酰胺诱导的白细胞减少小鼠模型为研究对象,以芪胶升白胶囊为干预措施,通过细胞生物学及分子生物学技术,观察小鼠白细胞计数、脾脏指数、胸腺指数、骨髓增生程度、细胞因子表达等变化,探讨芪胶升白胶囊促进化疗后白细胞复常的机制,为推广中成药辅助治疗肿瘤性疾病提供临床及实验依据。方法1.临床研究:采用多中心、随机、双盲、双模拟、阳性药物平行对照临床研究设计,拟纳入8个中心260例肺癌、乳腺癌具有气血两虚证并拟行化疗的患者,按脱落率不超过20%,拟纳入312例,中央随机按2:1的比例进入观察组（芪胶升白胶囊组）及对照组（安多霖胶囊组）。肺癌患者应用含顺铂/卡铂方案,乳腺癌应用含多西他赛/紫杉醇方案。观察组口服芪胶升白胶囊,对照组口服安多霖胶囊,两组患者均口服包装编盲药物每次4粒,每日3次,两组疗程均为1个化疗周期（20天）。入组前3天填写一般资料,采集血常规、评价气血两虚证积分及安全性指标,化疗第5±1天、10±1天、15±1天、20±1天采集血常规,第20±1天评价气血两虚证积分及安全性。主要疗效指标分别使用FAS、PPS进行统计,次要疗效指标使用PPS进行统计。课题来源于国家科技重大专项项目重大新药创制“苗药芪胶升白胶囊再评价研究”（课题编号:2014ZX09301308007）。本研究已通过本院伦理委员会审查,审批号ECPJ-BDY-2015-09。主要疗效指标为4级、3/4级、1-4级中性粒细胞（NE）下降发生率;次要疗效指标包括白细胞（WBC）及NE最低值、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）使用率、后续化疗延期率、各访视点WBC、NE变化情况及复常率。根据本次化疗的疗程数、基线WBC计数、患者年龄分别进行分层统计,对影响1-4级NE下降发生的相关因素进行逻辑回归分析。气血两虚证积分量化,对气血两虚证候总积分改善率、单项症状改善率、各项症状积分的差值,进行组间及组内比较。2.实验研究:①造模:应用ICR小鼠制备白细胞减少模型。5-6周龄ICR小鼠,腹腔注射环磷酰胺100mg/kg连续给药3天。②分组给药:以白细胞减少模型鼠为研究对象,芪胶升白胶囊为干预措施。将ICR小鼠随机分组,每组10只（5雄5雌）,分为模型组、中药低剂量组、中剂量组、高剂量组,正常空白组、正常中药组共6组。中药低、中、高剂量组分别予芪胶升白胶囊0.5、1.0、2.0g/Kg,正常中药组为正常小鼠灌胃芪胶升白胶囊1.0g/Kg,模型组及正常空白组予等体积蒸馏水灌胃,连续17天。各中药组于造模前3天开始灌胃芪胶升白胶囊,除正常两组外,注射环磷酰胺造模。③观察指标:给药第7天开始隔日采集血常规,第17天处死动物,眼眶取血,制备骨髓涂片,称重计算脾指数、胸腺指数,观察骨髓增生程度,ELISA方法检测脾组织IL-2、IL-4、IL-6、GM-CSF以及血清GM-CSF含量,Western Blot法检测脾组织GM-CSF蛋白表达。结果1.临床研究:2016年3月-2018年3月共纳入309例肺癌、乳腺癌具有气血两虚证的患者。观察组及对照组基线资料无明显差异（P>0.05）。（1）主要疗效指标:全数据集（FAS）287例（观察组192例、对照组95例）,符合方案集（PPS）共252例（观察组175例、对照组77例）。4级、3/4级、1-4级NE下降率,观察组与对照组,在FAS中分别为14.6%vs15.5%、31.2%vs 31.7%,73.2%vs 73.5%;在 PPS 中分别为 13.4%vs15.5%、29.4%vs 30.5%,71.9%vs 72.7%,FAS 及 PPS 中两组差异均无统计学意义（P>0.05）。FAS中第1周期化疗的患者,4级NE下降率观察组为4.5%,明显低于对照组的37.5%（P<0.05）;3/4级NE下降率观察组为13.6%,明显低于对照组的50.0%（P<0.05）。（2）次要疗效指标:①WBC、NE的最低值、G-CSF使用率、后续化疗延期率,观察组与对照组均无明显差异（P>0.05）;②在第2周期化疗的患者中,观察组化疗第5±1天的WBC、NE计数（×109/L）分别为（6.29±1.87）、（4.79±1.92）,均明显高于对照组（3.75±1.08）、（2.26±0.75）,（P<0.01）;③头晕眼花症状为化疗后1-4级NE下降的独立危险因素。（3）肺癌单病种分析:纳入肺癌患者168例（观察组114例,对照组54例）,FAS中161例（观察组109例,对照组52例）,PPS中138例（观察组98例,对照组40例）。4级、3/4级、1-4级NE下降率,观察组与对照组,在FAS中分别为6.6%vs6.1%、28.8%vs25.7%、65.5%vs 68.3%,差异均无统计学意义（P>0.05）。化疗第5±1天,观察组WBC明显高于对照组。NE下降的独立影响因素为KPS评分、头晕眼花症状。（4）乳腺癌单病种分析:纳入乳腺癌141例（观察组96例,对照组45例）,FAS中126例（观察组83例,对照组43例）,PPS中114例（观察组77例,对照组37例）。4级、3/4级、1-4级NE下降率,观察组与对照组,在FAS中分别为24.6%vs28.0%、34.4%vs40.0%、83.3%vs 81.5%,均无明显差异（P>0.05）。NE回升幅度,观察组明显高于对照组,第3周期及以上化疗者更为突出。≥60岁的患者,观察组WBC降低幅度明显低于对照组,老年患者获益更明显。（5）中医疗效指标,FAS共309例（观察组210例、对照组99例）。PPS共266例（观察组185例、对照组81例）。芪胶升白胶囊能显着改善气血两虚证,避免药毒损耗气血。①两组患者气血两虚证候总积分及各单项症状积分均较治疗前明显降低（P<0.001）。②两组患者气血两虚证候总积分改善率差异无统计学意义（P>0.05）。③观察组心悸失眠症状改善率明显高于对照组（P=0.01）。④基线气血两虚证候总积分≥10分者:观察组心悸失眠症状改善率显着高于对照组（P<0.01）;观察组心悸失眠、神疲乏力积分回落幅度优于对照组（P<0.05）。（6）安全性指标:共有309例患者进入安全性分析,观察组210例,对照组99例。①观察组4例患者发生4次,对照组3例患者发生3次,经关联性判定“可能及以上”的人数为0。②HGB稳定率,观察组与对照组分别为81.0%vs81.2%;PLT稳定率,观察组与对照组分别为94.0%vs93.0%,均无明显差异（P>0.05）。2.实验研究:成功建立白细胞减少小鼠模型。60只SPF级ICR小鼠,随机分为6组,每组10只,分别为模型组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组、正常空白组、正常中药组。①白细胞计数:中药给药后第7天,模型组、中药低、中、高剂量组、正常空白组、正常中药组白细胞（×109/L）分别为4.03±0.92、3.48±1.71、3.60±1.34、3.91±1.52、9.96±1.94、11.41±3.63,各组与正常空白组比较差异（P<0.05）。给药第15天,中药高剂量组白细胞计数高于模型组,给药第17天,中药中、高剂量组白细胞计数高于模型组（P<0.05）。②骨髓增生程度:以正常空白组为参照,模型组增生程度明显减低,高剂量组骨髓增生程度已接近正常。③脾脏指数、胸腺指数:中药低、中、高剂量组的脾脏指数、胸腺指数均高于模型组（P<0.05）。④脾组织IL-2、IL-4:模型组IL-2、IL-4含量均低于正常空白组及正常中药组（P<0.05）;中药高剂量组IL-2、IL-4含量均高于模型组（P<0.05）。⑤脾组织GM-CSF含量:模型组GM-CSF含量明显低于正常空白组及正常中药组（P<0.05）;中药中、高剂量组GM-CSF含量（ng/L）分别为0.99±0.14、0.81±0.11,均明显高于模型组0.33±0.05（P<0.01）。Western blot检测中、高剂量组GM-CSF蛋白表达水平明显提高。⑥血清GM-CSF含量:模型组血清GM-CSF含量明显低于正常空白组及正常中药组（P<0.01）;中药低、中、高剂量组 GM-CSF 含量（ng/L）分别为 358.75±20.02、350.19±28.28、323.60±34.44,均高于模型组 290.02±43.74（P<0.05）。结论芪胶升白胶囊能有效防治化疗相关白细胞减少,改善气血两虚证,通过调控粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子等提高造血功能,促进化疗后白细胞及中性粒细胞复常。
杨茗涵[10]（2020）在《血蚶细胞外信号调节激酶（ERK）的克隆与功能鉴定》文中研究表明血蚶是亚太地区一种经济价值较高的贝类,其生长的水环境中具有多种病原微生物,常常导致血蚶爆发大规模病害,对血蚶产业发展造成影响。血蚶完全依靠先天免疫防御病原体。然而,关于血蚶对各种病原菌的免疫反应的报道却很少。MAPK信号级联是应对环境刺激最重要的信号转导途径之一,ERK信号通路作为MAPK家族中最重要的成员,参与了许多细胞生理过程,对生命起着至关重要的作用。ERK活性的调节对细胞增殖来说非常重要,ERK1和ERK2在哺乳动物和大多数脊椎动物中提供ERK活性。ERK1和ERK2的氨基酸序列总体上只有17%的差异。ERK1和ERK2之间的一个明显区别是哺乳动物中的ERK2蛋白分子量明显大于ERK1蛋白。迄今为止,所有无脊椎动物中只发现了一种ERK。在本文中,我们对血蚶的全长转录组分析发现血蚶中也只有一种ERK同源物。我们采用快速扩增cDNA方法,克隆并鉴定了血蚶的ERK同源物并命名为TgERK。TgERK的全长cDNA序列长度为1,644 bp,在N端有一个保守的S＿TKc结构域（残基21-309）。进化树分析表明TgERK和其它软体动物的ERK亲缘关系较近。TgERK mRNA在所有受检组织中普遍表达,且在血细胞中表达水平最高。脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）和溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）刺激可以提高血蚶体内TgERK的表达水平,这与体外感染血蚶血细胞实验结果一致。病原菌入侵也上调了ERK信号通路下游基因的表达,如CREB、c-Fos和SIRT1。此外,TgERK基因沉默导致这些下游基因表达降低。ERK抑制剂U0126对血蚶血细胞增殖具有抑制作用,该抑制作用呈剂量依赖性。综上所述,我们的研究表明,TgERK是血蚶对病原体入侵产生免疫反应的重要调节因子,这加强了我们对血蚶先天免疫的认识。
二、高效提取血细胞DNA的体会（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、高效提取血细胞DNA的体会（论文提纲范文）
（1）SVWC在家蝇抗菌免疫中的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 家蝇概况 |
| 1.2 昆虫免疫系统 |
| 1.2.1 昆虫模式识别受体分类 |
| 1.2.2 昆虫免疫系统中主要信号通路 |
| 1.2.3 昆虫细胞免疫 |
| 1.2.4 昆虫体液免疫 |
| 1.3 SVWC家族简介 |
| 1.3.1 SVWC家族序列特征 |
| 1.3.2 SVWC家族研究进展 |
| 1.4 本研究目的及意义 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验菌种与载体 |
| 2.1.3 实验主要试剂 |
| 2.1.4 实验引物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 MdSVWCIA-1 基因序列分析 |
| 2.2.2 家蝇总RNA提取及cDNA制备 |
| 2.2.3 细菌刺激和RNA干扰 |
| 2.2.4 MdSVWCIA-1 基因表达模式分析 |
| 2.2.5 RNAi并细菌刺激后抗菌肽基因、免疫通路关键因子表达量分析 |
| 2.2.6 RNAi并细菌刺激后酚氧化酶活性分析 |
| 2.2.7 RNAi并细菌刺激后家蝇幼虫存活率 |
| 2.2.8 MdSVWCIA-1 基因克隆与载体构建 |
| 2.2.9 rMdSVWCIA-1 制备 |
| 2.2.10 rMdSVWCIA-1 与微生物的结合能力分析 |
| 2.2.11 rMdSVWCIA-1与PAMPs的结合能力分析 |
| 2.2.12 rMdSVWCIA-1 促进微生物凝集活性检测 |
| 2.2.13 rMdSVWCIA-1 与家蝇血细胞体内清除功能分析 |
| 2.2.14 rMdSVWCIA-1 与家蝇血细胞体内吞噬功能分析 |
| 2.2.15 rMdSVWCIA-1 与血细胞结合检测 |
| 2.2.16 数据分析 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 MdSVWCIA-1 基因序列及生物信息学分析 |
| 3.2 MdSVWCIA-1 基因在家蝇不同组织表达模式分析 |
| 3.3 MdSVWCIA-1 基因在细菌刺激后表达模式分析 |
| 3.4 RNAi并细菌刺激后抗菌肽基因、免疫通路关键因子表达量分析 |
| 3.5 RNAi并细菌刺激后酚氧化酶活性分析 |
| 3.6 RNAi并细菌刺激后家蝇幼虫存活率 |
| 3.7 rMdSVWCIA-1 的表达与纯化 |
| 3.8 rMdSVWCIA-1与微生物及PAMPs的结合能力分析 |
| 3.9 rMdSVWCIA-1 促进微生物凝集的活性分析 |
| 3.10 rMdSVWCIA-1 促进家蝇血细胞体内清除功能分析 |
| 3.11 rMdSVWCIA-1促进家蝇血细胞吞噬功能分析 |
| 3.12 rMdSVWCIA-1 与血细胞表面结合 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间取得的科研成果 |
（2）中华鲎血液中凝血相关蛋白的制备及应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 中华鲎 |
| 1.2 鲎的凝血机制 |
| 1.3 凝血因子蛋白 |
| 1.4 鲎试剂 |
| 1.5 中华鲎凝血蛋白的异源表达研究 |
| 1.6 研究的目的及意义 |
| 1.7 研究方法及策略 |
| 第二章 鲎凝血因子蛋白的原核表达 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验菌种及质粒 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 实验药品 |
| 2.1.4 试剂及配方 |
| 2.2 实验内容 |
| 2.2.1 FGα、FGβ和PCE质粒的提取 |
| 2.2.2 感受态的制备及转化 |
| 2.2.3 FGα、FGβ和PCE的诱导表达 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 FGα原核表达结果 |
| 2.3.2 FGβ的原核表达结果 |
| 2.3.3 PCE的原核表达结果 |
| 2.4 结果讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 标签肽/分子伴侣素共表达体系辅助鲎凝血因子蛋白的原核可溶性表达及蛋白质纯化 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 质粒及菌株 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 实验药品 |
| 3.1.4 试剂及配方 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 FGα和PCE与分子伴侣素CpkA的共转化 |
| 3.2.2 共转菌株的表达及诱导条件的优化 |
| 3.2.3 融合标签肽的FGα/分子伴侣素共表达体系的构建 |
| 3.2.4 FGα’的蛋白纯化 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 FGα和PCE与分子伴侣素CpkA共表达体系的验证 |
| 3.3.2 FGα’的重组质粒的验证及共表达的结果 |
| 3.3.3 FGα’的蛋白纯化 |
| 3.4 结果讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 应用于检测真菌(1,3)-β-D-葡聚糖的鲎凝血因子反应体系的构建 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 质粒及菌株 |
| 4.1.2 实验仪器 |
| 4.1.3 实验药品 |
| 4.1.4 试剂及配方 |
| 4.2 实验内容 |
| 4.2.1 FGα、FGβ和PCE的体外复性 |
| 4.2.2 FGα、FGβ和PCE的性质表征 |
| 4.2.3 分子伴侣素参与FGα和PCE的体外复性 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 FGα、FGβ和PCE的复性结果 |
| 4.3.2 FGα、FGβ和PCE的性质表征结果 |
| 4.3.3 CpkA或 CpkB参与FGα和PCE体外复性结果 |
| 4.3.4 不同肽酶活性反应体系的最高活性对比 |
| 4.4 结果讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第5 章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间取得的成果 |
| 致谢 |
（3）镉和砷对菲律宾蛤仔毒性的剂量-效应关系研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 中国近海镉、砷污染的来源及现状 |
| 1.1.1 Cd、As污染的来源 |
| 1.1.2 中国近海Cd和As污染现状 |
| 1.2 Cd和As毒性机制的研究进展 |
| 1.2.1 Cd毒性机制的研究进展 |
| 1.2.2 As毒性机制的研究进展 |
| 1.3 海洋双壳贝类在重金属污染监测及毒理效应研究中的应用 |
| 1.3.1 海洋双壳贝类是理想的海洋环境监测生物 |
| 1.3.2 Cd对海洋双壳贝类的毒理效应研究进展 |
| 1.3.3 As对海洋双壳贝类的毒理效应研究进展 |
| 1.4 剂量-效应关系概要及其在生态毒理学研究中的应用 |
| 1.4.1 剂量-效应关系的类型 |
| 1.4.2 基准剂量方法 |
| 1.4.3 基于组学技术的剂量-效应关系研究进展 |
| 1.5 Meta分析概要及其在生态领域研究中的应用 |
| 1.5.1 Meta分析的基本步骤 |
| 1.5.2 Meta分析在生态学研究领域的应用 |
| 1.6 本论文的研究意义、内容及技术路线 |
| 1.6.1 研究意义 |
| 1.6.2 研究内容 |
| 1.6.3 技术路线 |
| 第2章 Cd对海洋双壳贝类毒性效应的Meta分析 |
| 2.1 资料与方法 |
| 2.1.1 文献检索及筛选 |
| 2.1.2 数据提取 |
| 2.1.3 效应值的选取及统计分析 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 文章检索和数据提取结果 |
| 2.2.2 Cd对海洋双壳贝类毒性效应的物种差异 |
| 2.2.3 Cd对海洋双壳贝类毒性效应的组织差异 |
| 2.2.4 海洋双壳贝类应对Cd暴露毒性效应指标的响应特征 |
| 2.2.5 Cd暴露浓度对海洋双壳贝类毒性效应的影响 |
| 2.2.6 响应指标与Cd的剂量-效应关系 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 Cd对海洋双壳贝类毒性的物种、组织特异性 |
| 2.3.2 Cd对海洋双壳贝类毒性效应指标的剂量-效应关系 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 Cd对菲律宾蛤仔毒性的剂量-效应关系研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试剂与仪器 |
| 3.1.2 Cd暴露实验 |
| 3.1.3 样品采集和处理 |
| 3.1.4 Cd富集量及必需金属元素含量测定 |
| 3.1.5 转录组测序及生物信息学分析 |
| 3.1.6 基于核磁共振技术的代谢组学分析 |
| 3.1.7 酶活性及GSH含量检测 |
| 3.1.8 组织病理损伤评价及细胞凋亡测定 |
| 3.1.9 剂量-效应关系模型拟合及BMD值计算 |
| 3.1.10 统计分析 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 菲律宾蛤仔整体组织中Cd及必需金属元素含量 |
| 3.2.2 菲律宾蛤仔整体组织转录组对Cd暴露的响应 |
| 3.2.3 菲律宾蛤仔整体组织代谢组对Cd暴露的响应 |
| 3.2.4 菲律宾蛤仔整体组织酶活及GSH等指标对Cd暴露的响应 |
| 3.2.5 Cd暴露导致的菲律宾蛤仔鳃和消化腺细胞凋亡及组织损伤 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 Cd对菲律宾蛤仔离子内稳态的影响机制 |
| 3.3.2 Cd诱导菲律宾蛤仔氧化应激的机制 |
| 3.3.3 Cd对菲律宾蛤仔代谢动态平衡的影响机制 |
| 3.3.4 Cd诱导菲律宾蛤仔细胞凋亡及组织损伤的机制 |
| 3.3.5 Cd对菲律宾蛤仔毒性的剂量-效应关系 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 As(V)对菲律宾蛤仔毒性的剂量-效应关系研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试剂与仪器 |
| 4.1.2 As(Ⅴ)对菲律宾蛤仔的96h半致死浓度测定 |
| 4.1.3 As(Ⅴ)暴露实验 |
| 4.1.4 样品采集和处理 |
| 4.1.5 总砷及砷形态含量测定 |
| 4.1.6 转录组测序及生物信息学分析 |
| 4.1.7 基于质谱技术的代谢组分析 |
| 4.1.8 组织病理损伤评价 |
| 4.1.9 BMD建模及计算 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 菲律宾蛤仔整体组织中总砷及各砷形态含量 |
| 4.2.2 菲律宾蛤仔整体组织转录组对As(Ⅴ)暴露的响应 |
| 4.2.3 菲律宾蛤仔整体组织代谢组对As(Ⅴ)暴露的响应 |
| 4.2.4 As(Ⅴ)暴露导致的菲律宾蛤仔鳃和消化腺组织病理损伤 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 菲律宾蛤仔体内砷形态的转化机制 |
| 4.3.2 As(Ⅴ)诱导菲律宾蛤仔体内氧化应激的机制 |
| 4.3.3 As(Ⅴ)对菲律宾蛤仔生殖内分泌干扰效应 |
| 4.3.4 As(Ⅴ)对菲律宾蛤仔代谢动态平衡的影响机制 |
| 4.3.5 As(Ⅴ)对菲律宾蛤仔毒性的剂量-效应关系 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 主要结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 研究展望 |
| 参考文献 |
| 附录 纳入Meta分析中的文献目录 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（4）马麝源兔出血症病毒VP60互作宿主细胞蛋白的筛选及初步鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Summary |
| 常用外文缩略词 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 麝科动物及其相关研究 |
| 1.1 麝科动物的分类 |
| 1.2 麝科动物的分布 |
| 1.3 国内麝科动物种群数量变化 |
| 1.4 麝香的应用价值 |
| 1.5 马麝的生活习性特点 |
| 1.6 马麝疾病研究现状 |
| 2 马麝病毒性出血症研究现状 |
| 2.1 病原学特征 |
| 2.2 临床症状及病理变化 |
| 2.3 流行病学 |
| 3 蛋白互作技术 |
| 3.1 免疫共沉淀技术 |
| 3.2 Pull-down技术 |
| 3.3 等温滴定量热法 |
| 4 本研究的目的及意义 |
| 第二章 马麝源兔出血症病毒互作宿主蛋白的筛选 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株及试验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 试剂及培养基的配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 马麝源RHDV悬液的制备 |
| 2.2 马麝源RHDV免疫原的制备 |
| 2.3 鼠源多克隆抗体的制备 |
| 2.4 马麝源RHDV多克隆抗体的纯化及浓缩 |
| 2.5 宿主细胞膜蛋白的提取 |
| 2.6 免疫共沉淀及考马斯亮蓝染色 |
| 2.7 LC-MS/MS及生物信息学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 马麝源RHDV免疫原的制备 |
| 3.2 马麝源RHDV的鼠源多克隆抗体纯化鉴定 |
| 3.3 宿主细胞膜蛋白的提取 |
| 3.4 免疫共沉淀复合物SDS-PAGE检测 |
| 3.5 质谱鉴定结果 |
| 3.6 差异蛋白质功能分析 |
| 3.6.1 GO富集分析 |
| 3.6.2 COG富集分析 |
| 3.6.3 KEGG富集分析 |
| 4 讨论 |
| 第三章 马麝源兔出血症病毒结构蛋白VP60 和宿主相关蛋白的原核表达及鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株、菌种、载体 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 试剂及培养基的配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 PGEX-GST-His双标签表达载体的构建 |
| 2.1.1 引物设计 |
| 2.1.2 PGEX-GST-His双标签表达载体的构建 |
| 2.2 马麝源RHDV VP60基因原核表达载体的构建 |
| 2.2.1 引物设计 |
| 2.2.2 马麝源RHDV总RNA的提取及反转录 |
| 2.2.3 马麝源RHDV VP60基因的PCR扩增 |
| 2.2.4 PGEX-GST-VP60-His原核表达载体的构建 |
| 2.3 兔源ANXA2、EF-1α、Trx基因原核表达载体的构建 |
| 2.3.1 引物设计 |
| 2.3.2 兔肝脏组织总RNA的提取及反转录 |
| 2.3.3 兔源ANXA2 基因的Overlap PCR扩增 |
| 2.3.4 兔源EF-1α、Trx基因的PCR扩增 |
| 2.3.5 ANXA2、EF-1α及Trx基因原核表达载体的构建 |
| 2.4 马麝源RHDV结构蛋白VP60和兔源重组蛋白的诱导表达 |
| 2.5 马麝源RHDV结构蛋白VP60和兔源重组蛋白的纯化 |
| 2.6 重组蛋白的Western blot检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 PGEX-GST-His双标签表达载体的构建 |
| 3.2 马麝源RHDV VP60基因的RT-PCR扩增 |
| 3.3 重组表达质粒PGEX-GST-VP60-His的鉴定 |
| 3.4 兔源ANXA2、EF-1α及Trx基因的RT-PCR扩增 |
| 3.5 兔源ANXA2 基因原核表达载体的鉴定 |
| 3.6 兔源EF-1α和Trx基因原核表达载体的鉴定 |
| 3.7 重组蛋白表达、纯化的SDS-PAGE分析 |
| 3.7.1 马麝源RHDV VP60重组蛋白的诱导表达及纯化 |
| 3.7.2 兔源ANXA2重组蛋白的诱导表达及纯化 |
| 3.7.3 兔源EF-1α重组蛋白的诱导表达及纯化 |
| 3.7.4 兔源Trx重组蛋白的诱导表达及纯化 |
| 3.8 重组蛋白的Western blot鉴定 |
| 4 讨论 |
| 第四章 马麝源兔出血症病毒互作宿主细胞蛋白的初步鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌种 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 试剂及培养基的配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 重组蛋白的诱导表达及纯化 |
| 2.2 结构蛋白VP60互作宿主细胞蛋白的His-Pull down鉴定 |
| 2.3 结构蛋白VP60互作蛋白的Western blot分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 结构蛋白VP60互作宿主细胞蛋白的His-Pull down鉴定 |
| 3.1.1 VP60蛋白与GST蛋白互作的SDS-PAGE分析 |
| 3.1.2 VP60蛋白与ANXA2蛋白互作的SDS-PAGE分析 |
| 3.1.3 VP60蛋白与EF-1α蛋白互作的SDS-PAGE分析 |
| 3.1.4 VP60蛋白与Trx蛋白互作的SDS-PAGE分析 |
| 3.2 His-Pull down结果的Western blot分析 |
| 4 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附表1 差异蛋白汇总 |
| 作者简介 |
| 在读期间发表论文研究成果等 |
| 导师简介 |
（5）新型细胞推片与释放系统的关键技术研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 课题背景及意义 |
| 1.2 国内外研究现状 |
| 1.2.1 无创产前诊断技术研究进展 |
| 1.2.2 有核红细胞的分离富集研究进展 |
| 1.2.3 自动化细胞涂片技术研究进展 |
| 1.2.4 光响应水凝胶材料研究进展 |
| 1.2.5 目前研究中尚存在的问题与不足 |
| 1.3 论文研究内容与组织结构 |
| 第2章 技术原理与设计要求 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 技术原理 |
| 2.2.1 全血单层细胞推片技术 |
| 2.2.2 光响应水凝胶 |
| 2.2.3 基于细胞形态学的有核红细胞识别 |
| 2.2.4 激光聚焦技术 |
| 2.3 装置设计要求 |
| 2.3.1 可释放细胞涂片制备装置 |
| 2.3.2 有核红细胞识别与释放装置 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 可释放细胞涂片制备装置实现方案 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 装置设计与搭建 |
| 3.2.1 硬件结构 |
| 3.2.2 微结构推片载台 |
| 3.2.3 运动控制系统 |
| 3.3 实验分析 |
| 3.3.1 实验流程 |
| 3.3.2 光响应凝胶基底的制备与表征 |
| 3.3.3 全血单层细胞涂片的制备与评估 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 有核红细胞识别与释放装置实现方案 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 装置设计与搭建 |
| 4.2.1 集成式光路结构 |
| 4.2.2 软件集成 |
| 4.3 实验分析 |
| 4.3.1 实验流程 |
| 4.3.2 基于细胞形态的有核红细胞识别 |
| 4.3.3 近红外激光照射细胞释放 |
| 4.3.4 激光聚焦优化细胞释放 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 总结与展望 |
| 5.1 全文总结 |
| 5.2 研究展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果 |
（6）slc20a1b调控斑马鱼造血干祖细胞的功能研究及机制初探（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 1.1 斑马鱼作为模式生物的概述 |
| 1.2 造血发育的过程 |
| 1.3 定向造血发育的调控 |
| 1.4 钠、磷酸盐转运体(sodium phosphate cotransporter)概述 |
| 1.5 斑马鱼造血发育研究常用方法 |
| 1.6 本文研究意义、目的和研究思路 |
| 第一章 slc20a1b是smu07突变体的致变基因 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 实验仪器 |
| 1.1.3 实验试剂 |
| 1.1.4 试剂配制 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 养殖斑马鱼常规技术 |
| 1.2.2 定位克隆筛选突变位点(Positional Colony) |
| 1.2.3 探针制备 |
| 1.2.4 斑马鱼胚胎的整体原位杂交技术的步骤 |
| 1.2.5 通过CRISPR/Cas9技术敲除slc20a1b |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 通过初始定位得出突变位点位于斑马鱼10号染色体上 |
| 1.3.2 精细定位(Fine mapping)筛选到11个候选基因 |
| 1.3.3 测序鉴定smu07突变体的致变基因为slc20a1b |
| 1.3.4 验证slc20a1b是smu07突变体的致变基因 |
| 1.4 结论 |
| 1.5 讨论 |
| 第二章 slc20a1b突变导致造血干祖细胞的减少 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.1.4 试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 苏丹黑B对胚胎进行染色 |
| 2.2.2 slc20a1b~(smu07)突变体的基因型鉴定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 smu07突变体的原始造血不受影响 |
| 2.3.2 smu07突变体的定向造血严重缺陷 |
| 2.4 结论 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 slc20a1b调控斑马鱼造血干祖细胞发育的机制初探 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 实验试剂 |
| 3.1.4 实验过程中试剂的配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 进化树和蛋白同源性序列比对分析保守性 |
| 3.2.2 smu07突变体磷酸盐的测定 |
| 3.2.3 Foscarnet(膦甲酸钠)模拟smu07表型 |
| 3.2.4 利用qPCR分析基因表达状况 |
| 3.2.5 胚胎期细胞移植实验(cell transplantation) |
| 3.2.6 TUNEL染色法检测细胞死亡 |
| 3.2.7 流式细胞荧光分选(Fluorescence-activated cell sorting,FACS)样品制备 |
| 3.2.8 5-溴脱氧尿嘧啶核苷检测细胞增殖 |
| 3.2.9 激光扫描共聚焦荧光显微镜活体成像观察 |
| 3.2.10 Bulk RNA-seq的文库构建 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 slc20a1b在斑马鱼中与哺乳动物高度保守 |
| 3.3.2 smu07突变体中磷酸盐浓度不发生改变 |
| 3.3.3 藤甲酸钠(Foscarnet)不能够模拟smu07的表型 |
| 3.3.4 slc20a1b在斑马鱼中广泛表达 |
| 3.3.5 slc20a1b调控造血干祖细胞发育是通过细胞自主的方式 |
| 3.3.6 smu07突变体中造血干祖细胞的缺陷部分原因是细胞死亡导致 |
| 3.3.7 细胞分裂期受损导致smu07突变体胚胎期造血干祖细胞发育缺陷 |
| 3.4 结论 |
| 3.5 讨论 |
| 全文总结和展望 |
| 参考文献 |
| 附录一 英文缩列词表 |
| 附录二 q-PCR引物序列 |
| 附录三 核酸序列 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
（7）日本沼虾六个甲壳肽的免疫功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 日本沼虾 |
| 1.1.1 日本沼虾概述 |
| 1.1.2 日本沼虾病害 |
| 1.2 无脊椎动物先天性免疫 |
| 1.2.1 细胞免疫 |
| 1.2.2 体液免疫 |
| 1.3 无脊椎动物抗菌肽 |
| 1.3.1 无脊椎动物抗菌肽作用机制 |
| 1.3.2 虾的抗菌肽种类 |
| 1.3.3 果蝇的抗菌肽种类 |
| 1.4 Crustin |
| 1.4.1 Crustin分类 |
| 1.4.2 Crustin研究进展 |
| 1.5 本研究目的、内容以及意义 |
| 1.6 实验技术路线 |
| 第二章 Mn-Gly-Cru1和Mn-Gly-Cru2基因的克隆及鉴定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验动物、病毒、菌株及载体 |
| 2.2.2 主要试剂和仪器 |
| 2.2.3 日本沼虾免疫刺激 |
| 2.2.4 总RNA提取,cDNA合成和基因组DNA提取 |
| 2.2.5 日本沼虾Mn-Gly-Cru1,2的cDNA序列和基因组序列 |
| 2.2.6 序列生物信息学分析 |
| 2.2.7 组织分布与表达模式 |
| 2.2.8 Mn-Gly-Cru1,2基因的干扰 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 日本沼虾Mn-Gly-Cru1, 2的cDNA全长序列和基因组序列 |
| 2.3.2 Mn-Gly-Cru1,2的系统发育分析及多序列比对 |
| 2.3.3 Mn-Gly-Cru1,2的组织分布 |
| 2.3.4 Mn-Gly-Cru1,2被不同病原体刺激的表达模式 |
| 2.3.5 ds Relish介导的RNA干扰和MnRelish沉默后对Crustin转录的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 Carcinin异构体在日本沼虾先天性免疫防御中的功能研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 实验动物、病毒、菌株及载体 |
| 3.2.2 主要试剂和仪器 |
| 3.2.3 日本沼虾免疫刺激 |
| 3.2.4 总RNA 提取,cDNA合成和基因组DNA提取 |
| 3.2.5 日本沼虾MnCarc1,2的cDNA序列和基因组序列 |
| 3.2.6 序列生物信息学分析 |
| 3.2.7 组织分布与表达模式 |
| 3.2.8 MnCarc1,2基因的干扰 |
| 3.2.9 重组MnCarc1,2蛋白的表达和纯化 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 日本沼虾两个Carcinin异构体的全长序列 |
| 3.3.2 日本沼虾两个Carcinin异构体的基因组结构 |
| 3.3.3 日本沼虾两个Carcinin异构体的系统发育分析及多序列比对 |
| 3.3.4 两个Carcinin异构体的组织分布 |
| 3.3.5 两个Carcinin异构体被微生物感染后的表达模式分析 |
| 3.3.6 在病原感染过程中转录因子被敲除后抑制两个Carcinin异构体的表达 |
| 3.3.7 纯化的MnCarc1和MnCarc2蛋白与细菌的结合 |
| 3.3.8 纯化的MnCarc1和MnCarc2蛋白与多糖的结合 |
| 3.3.9 纯化的MnCarc1和MnCarc2蛋白在体外对细菌生长的抑制作用 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 MnCru174和MnCru191在先天性免疫中的功能分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 实验动物、病毒、菌株及载体 |
| 4.2.2 主要试剂和仪器 |
| 4.2.3 日本沼虾免疫刺激 |
| 4.2.4 总RNA 提取,cDNA合成和基因组DNA 提取 |
| 4.2.5 日本沼虾MnCru174,191的cDNA序列和基因组序列 |
| 4.2.6 序列生物信息学分析 |
| 4.2.7 组织分布与表达模式 |
| 4.2.8 MnCru174,191基因的干扰 |
| 4.2.9 干扰后病毒拷贝数的检测 |
| 4.2.10 干扰后体内细菌清除实验 |
| 4.2.11 MnCru174和MnCru191重组蛋白的表达纯化 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 日本沼虾MnCru174,191的cDNA全长序列和基因组序列 |
| 4.3.2 MnCru174和MnCru191系统发育分析 |
| 4.3.3 MnCru174和MnCru191的组织分布 |
| 4.3.4 MnCru174和MnCru191被微生物感染后表达模式的分析 |
| 4.3.5 MnCru174和MnCru191干扰效率检测 |
| 4.3.6 沉默MnCru174和MnCru191检测病毒拷贝数 |
| 4.3.7 沉默MnCru174和MnCru191进行细菌清除实验 |
| 4.3.8 纯化的MnCru174和MnCru191蛋白可以结合细菌 |
| 4.3.9 纯化的MnCru174和MnCru191蛋白可以结合多糖 |
| 4.4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 硕士期间发表学术论文以及成果 |
| 致谢 |
（8）Hlf标记的胚胎新生造血干细胞的功能及命运研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 造血干细胞前体特征基因的筛选及小鼠构建 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 实验设计 |
| 1.3 实验材料 |
| 1.3.1 实验动物 |
| 1.3.2 实验试剂与抗体 |
| 1.3.3 仪器和耗材 |
| 1.4 实验方法 |
| 1.4.1 小鼠胚胎发育节点划分 |
| 1.4.2 小鼠胚胎取材及解离成单细胞 |
| 1.4.3 流式分析和分选 |
| 1.4.4 实验用溶液配制 |
| 1.5 实验结果 |
| 1.5.1 造血干细胞前体中特异表达基因的筛选 |
| 1.5.2 构建Hlf-tdTomato和Hlf-CrexER小鼠模型 |
| 第二章 HIf表达群体的造血干细胞潜能 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验设计 |
| 2.3 实验材料 |
| 2.3.1 实验动物 |
| 2.3.2 实验试剂与抗体 |
| 2.3.3 仪器和耗材 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 小鼠胚胎发育节点划分 |
| 2.4.2 小鼠胚胎取材及解离成单细胞 |
| 2.4.3 流式分析和分选 |
| 2.4.4 试剂配制 |
| 2.4.5 免疫组织化学 |
| 2.4.6 OP9-DL1共培养 |
| 2.4.7 孵育产物分析 |
| 2.4.8 尾静脉移植 |
| 2.4.9 移植受体小鼠外周血嵌合检测 |
| 2.4.10 基因型鉴定 |
| 2.4.11 凝胶电泳 |
| 2.5 实验结果 |
| 2.5.1 利用Hlf-tdTomato小鼠进行Hlf基因的表达图谱鉴定 |
| 2.5.2 E10.5时期Hlf-tdTomato小鼠对造血干细胞前体富集检测 |
| 2.5.3 E11时期Hlf-tdTomato小鼠对造血干细胞前体的富集检测 |
| 第三章 表达Hlf的造血干细胞对胚体发育中造血贡献的动力学研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验设计 |
| 3.3 实验材料 |
| 3.3.1 实验动物 |
| 3.3.2 实验试剂与抗体 |
| 3.3.3 仪器与耗材 |
| 3.4 实验方法 |
| 3.4.1 小鼠胚胎发育节点划分 |
| 3.4.2 小鼠胚胎取材及解离成单细胞 |
| 3.4.3 流式分析 |
| 3.4.4 试剂配制 |
| 3.4.5 免疫组织化学 |
| 3.4.6 全胚胎免疫荧光 |
| 3.4.7 外周血5系检测 |
| 3.4.8 小鼠给药方式 |
| 3.4.9 基因型鉴定 |
| 3.4.10 凝胶电泳 |
| 3.5 实验结果 |
| 3.5.1 对新构建Hlf-CrexER遗传谱系示踪小鼠进行表达谱鉴定 |
| 3.5.2 胚胎早期Hlf表达细胞在E10.5、E11.5造血事件中的贡献 |
| 3.5.3 绘制胚胎早期不同时间点Hlf表达细胞对胎肝中造血干细胞贡献的动力学研究 |
| 3.5.4 描绘胚胎早期不同时间点Hlf标记细胞对成体外周血中各血系贡献的动力学特点 |
| 第四章 利用双谱系示踪系统研究胚胎期造血发育 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验设计 |
| 4.3 实验材料 |
| 4.3.1 实验动物 |
| 4.3.2 实验试剂与抗体 |
| 4.3.3 仪器与耗材 |
| 4.4 实验方法 |
| 4.4.1 小鼠胚胎发育节点划分 |
| 4.4.2 小鼠胚胎取材及解离成单细胞 |
| 4.4.3 流式分析 |
| 4.4.4 试剂配制 |
| 4.4.5 外周血各系检测 |
| 4.4.6 基因型鉴定 |
| 4.4.7 凝胶电泳 |
| 4.5 实验结果 |
| 4.5.1 利用双谱系示踪系统小鼠研究Hlf在早期胚胎中的造血贡献 |
| 4.5.2 利用双谱系示踪系统小鼠研究Hlf在胎肝中的造血贡献 |
| 4.5.3 利用双谱系示踪系统小鼠研究Hlf在外周血中的造血贡献 |
| 第五章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 作者在学期间取得的学术成果 |
| 主要简历 |
| 致谢 |
（9）芪胶升白胶囊防治化疗相关白细胞减少临床研究与机制探讨（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一: 化疗相关血细胞减少现代医学治疗进展 |
| 1 肺癌及乳腺癌常用化疗药物的血液学毒性 |
| 2 常用化疗方案的血液学毒性 |
| 3 化疗相关中性粒细胞减少症的治疗进展 |
| 4 总结 |
| 参考文献 |
| 综述二: 化疗相关血细胞减少的中医药防治进展 |
| 1 单味中药 |
| 2 中药药对 |
| 3 经典组方 |
| 4 自拟组方的临床研究 |
| 5 中成药 |
| 6 中药注射制剂 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第二部分 芪胶升白胶囊防治化疗相关白细胞减少临床研究 |
| 研究方案及内容 |
| 研究结果 |
| 1 入组情况及病例分布 |
| 2 人口学资料与基线资料 |
| 3 疗效指标 |
| 4 分病种统计-肺癌 |
| 5 分病种统计-乳腺癌 |
| 6 中医疗效指标 |
| 7 不良反应及安全性 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 芪胶升白胶囊促进化疗后白细胞复常机制研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 1 结论 |
| 2 创新点 |
| 3 不足、改进与展望 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）血蚶细胞外信号调节激酶（ERK）的克隆与功能鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1 血蚶养殖现状 |
| 1.1 血蚶简介 |
| 1.2 血蚶的生长与繁殖 |
| 1.3 血蚶养殖 |
| 1.4 蚶类的营养评价 |
| 1.5 海洋贝类养殖的发展问题 |
| 2 ERK基因结构和功能 |
| 2.1 MAPK简介 |
| 2.2 ERK基因简介 |
| 2.3 ERK蛋白结构特征 |
| 2.4 ERK的结构-功能关系 |
| 2.5 ERK与癌症 |
| 2.6 MAPK信号通路功能研究的常用研究方法 |
| 3 溶藻弧菌和LPS简介 |
| 3.1 溶藻弧菌简介 |
| 3.2 LPS简介 |
| 4 本实验研究目的与意义 |
| 4.1 技术路线 |
| 4.2 研究目的和意义 |
| 第二章 血蚶细胞外信号调节激酶(ERK)的克隆与功能鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 分子相关实验方法 |
| 1.3 细胞相关实验 |
| 1.4 dsRNA的制备 |
| 1.5 蛋白质相关实验方法 |
| 1.6 血蚶相关实验方法 |
| 1.7 序列分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 TgERK序列的克隆 |
| 2.2 TgERK序列的分析 |
| 2.3 基因TgERK在细胞内的定位 |
| 2.4 TgERK组织分布分析 |
| 2.5 不同处理下TgERK表达水平的变化 |
| 2.6 不同处理下Tg ERK下游基因m RNA水平的变化 |
| 2.7 ERK抑制剂对血蚶血细胞存活率的影响 |
| 3 结论与讨论 |
| 参考文献 |
| 硕士期间发表的论文 |
| 致谢 |
四、高效提取血细胞DNA的体会（论文参考文献）
- [1]SVWC在家蝇抗菌免疫中的作用[D]. 王蕊蕊. 河北大学, 2021(09)
- [2]中华鲎血液中凝血相关蛋白的制备及应用[D]. 郭育. 长春理工大学, 2021(02)
- [3]镉和砷对菲律宾蛤仔毒性的剂量-效应关系研究[D]. 战君菲. 中国科学院大学(中国科学院烟台海岸带研究所), 2021(01)
- [4]马麝源兔出血症病毒VP60互作宿主细胞蛋白的筛选及初步鉴定[D]. 贺健. 甘肃农业大学, 2021(09)
- [5]新型细胞推片与释放系统的关键技术研究[D]. 郭钟扬. 中国科学技术大学, 2021(08)
- [6]slc20a1b调控斑马鱼造血干祖细胞的功能研究及机制初探[D]. 陈家奎. 南方医科大学, 2021
- [7]日本沼虾六个甲壳肽的免疫功能研究[D]. 戴晓玲. 南京师范大学, 2021
- [8]Hlf标记的胚胎新生造血干细胞的功能及命运研究[D]. 汤万波. 军事科学院, 2021(02)
- [9]芪胶升白胶囊防治化疗相关白细胞减少临床研究与机制探讨[D]. 赵同德. 北京中医药大学, 2020(04)
- [10]血蚶细胞外信号调节激酶（ERK）的克隆与功能鉴定[D]. 杨茗涵. 自然资源部第三海洋研究所, 2020(01)