一、巴斯德毕赤酵母表达系统（论文文献综述）
陆文怡[1]（2020）在《不同碳源对毕赤酵母生长代谢与自噬的影响》文中进行了进一步梳理巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris,P.pastoris）由于具有受甲醇诱导的强启动子醇氧化酶Ⅰ（alcohol oxidase 1,AOX1）的强启动子（AOX1 promoter,PAOX1）,成为最常用的真核外源蛋白表达系统之一。PAOX1在以甲醇为碳源时会高效表达,而以甘油为碳源时会被抑制。因此甲醇是毕赤酵母发酵最常用的碳源。而利用甲醇对毕赤酵母进行发酵培养时发现,细胞的生长状态明显不如在甘油等碳源中培养。菌体生长情况直接影响发酵过程中外源蛋白的产量。因此本课题旨在深度挖掘不同碳源对酵母生长状态的调控机理,从而优化毕赤酵母的甲醇利用系统,改善菌体生长情况,提高蛋白表达量。而细胞自噬是细胞应对外界压力保持自身稳态的重要过程,细胞的自噬水平直接影响到细胞的生长状态。所以本课题研究了不同碳源对细胞自噬的影响,发现碳源能够通过细胞自噬调控细胞的生长状态。通过检测毕赤酵母在不同碳源中的菌体密度,碳源代谢速度,并利用q RT-PCR技术和化学发光法检测自噬相关基因和蛋白对碳源变化的响应。相较于甘油,当碳源转变为甲醇时,细胞内宏自噬相关基因及其对应的蛋白表达量上升,过氧化物酶自噬相关基因及其对应的蛋白表达量下降。甲醇中宏自噬水平提高,菌体生长缓慢,而过氧化物酶体自噬水平降低,AOX1的酶活提高。由此可得,碳源可以通过细胞自噬影响细胞生长代谢。此外本课题对比了野生型菌株与敲除甘油转运体GT1的菌株P.pastorisΔGT1（简称ΔGT1）细胞自噬受碳源调控的规律,发现甲醇和甘油引起的ΔGT1细胞内自噬相关基因表达变化的差值低于野生型菌株,蛋白的表达结果也与上述实验结果相符。从自噬角度解释了GT1基因的敲除,缓解了甘油和甲醇对细胞自噬调控的差异,进一步论证了自噬水平的调控是不同碳源引起细胞生长状态改变的主要原因之一。在上述理论基础上,本文通过敲除Atg30基因,过表达Pex1基因,过表达Pex6基因,构建了十株能够抑制过氧化物酶体自噬的毕赤酵母突变株。发现突变株的酶活相比野生型菌株都有明显的提升,其中同时敲除Atg30基因,过表达Pex1和Pex6基因的突变株酶活提高最为明显:以甲醇为碳源培养24 h后,对三个基因都进行改造的突变株内,AOX1酶活比野生型提高了1.8倍。在敲除了GT1的基础上对三个基因进行改造后的突变株,酶活比野生型菌株提高了2.5倍。因此不同碳源通过自噬调控影响毕赤酵母生长代谢的研究,可以应用于毕赤酵母的蛋白工业生长中。本文开发出一株能高效表达PAOX1的突变株,有效提高了外源蛋白的产量,优化了酵母表达系统。
张奕昀[2]（2020）在《基于理性设计和基因剂量效应提高米根霉脂肪酶基因ROL的表达水平》文中提出米根霉（Rhizopus oryzae）脂肪酶相比于其他的酶在空间上的选择性更强,即“双亲性”——位置和立体的选择。每种酶都有独特的应用领域和价值,脂肪酶也不例外,在能源化工、食品制造、化学合成等跨领域学科中,都能找到它的应用踪迹。另一方面,由于高效脂肪酶的工艺相对复杂,导致生产成本相对较高,随之而来的弊端就是限制了其在生物柴油、粮食加工、有机合成等领域的发展。同时为了说明,在占据市场竞争力、更贴合环保理念、更突显经济节约等方面,酶的优势远远高于化学法,利用基因工程、分子生物学、蛋白质工程等技术手段,人为构建一株酶活力相对较高、蛋白表达量相对优异的脂肪酶基因工程菌株,拟在提高脂肪酶在实际工业生产中的应用水平,显得格外迫切和必要。根据Gen Bank（1LGY）中的原始基因序列,我们的脂肪酶基因是人工合成的,它来源于米根霉,属于微生物来源的一类。尽管在实验中,我们也尽可能的做了改造,提高它的外源表达水平,但是除去人为因素,其他因素也比较多,需要将多种技术手段,综合起来考虑。我们着重探究了,基因剂量、结构域优化对其表达程度的影响。选取了毕赤酵母作为表达宿主,结合发酵工艺、产酶条件等方面,对重组体的活性及蛋白含量做了测定,情况如下。1.原始ROL基因重组表达菌株在摇瓶发酵水平下的最高酶活和蛋白含量分别为260 U/mL,0.14 mg/mL,优化后,指标有一定的提升,酶活和蛋白含量分别为560 U/mL,0.28 mg/mL。2.对优化后的脂肪酶基因构建多拷贝串联体,单拷贝脂肪酶ROL平均酶活为205 U/mL,二拷贝脂肪酶ROL平均酶活为960 U/mL,三拷贝重组菌ROL平均酶活为1,250 U/mL。单拷贝脂肪酶ROL平均蛋白含量为0.24 mg/mL,二拷贝脂肪酶ROL平均蛋白含量为0.37 mg/mL,三拷贝脂肪酶ROL平均蛋白含量为0.42 mg/mL。可见,随着基因剂量的提高,酶活力和蛋白含量均呈现递增趋势。3.对多拷贝摇瓶发酵最优的重组菌株进行50L发酵罐条件下的产酶试验。发酵罐条件下,其活性最高的为26,500 U/mL,与原始基因最优单拷贝酶活相较,酶活力提高101倍,蛋白含量提高20倍。就目前以上的一些数据能够从一定程度上反应,对外源基因进行必要的分子改造,能赋予酶一些新的特性。朝着人们所期望的方向发展,这些技术手段,包括,累积基因拷贝数,这会涉及到构建高拷贝载体,另外,也可以进行蛋白结构域优化,包括增加蛋白质的稳定性等。考虑到影响毕赤酵母表达的因素较多,往往单一的优化因素,在定向改造中的效果十分有限,因此,在实际的操作中需要联合多种技术手段才能达到预期的实验效果。
刘毓均[3]（2020）在《反刍动物胃溶菌酶的重组表达、发酵参数优化、纯化及抗菌机制研究》文中认为为了利用酵母菌株表达重组反刍动物胃溶菌酶,本实验以反刍动物（黄牛、牦牛、藏绵羊、藏山羊）胃溶菌酶基因为研究对象,构建并筛选了能分泌表达重组胃溶菌酶的酵母菌株,最终获得60余株重组酵母菌。发酵上清的SDS-PAGE电泳结果表明,重组反刍动物胃溶菌酶分子量为15 KDa,与理论值接近。发酵上清中重组黄牛胃溶菌酶（recombinant bovine stomach Lysozyme,rbs LYZ）和重组藏山羊胃溶菌酶（recombinant tibetan goat lysozyme,rgs LYZ）酶活性高于其他反刍动物胃溶菌酶。以重组毕赤酵母菌株（G6-1）为研究对象,研究发酵参数、基因拷贝数对重组黄牛胃溶菌酶表达的影响。（1）运用因子筛选试验（Plackett-Burman）对发酵参数进行筛选结果表明:发酵参数（装液量、诱导时间、甲醇浓度及接种量）显着影响重组黄牛溶菌酶的表达（P<0.05）。（2）进一步运用响应面法研究了装液量等发酵参数对重组黄牛胃溶菌酶活性的影响,发现当装液量:42 m L,甲醇浓度:1.1%,诱导时间:89 h时,重组黄牛胃溶菌酶的活性最高（415.2 U/m L）,相较于优化前重组牛胃溶菌酶活性提高了约1.1倍。（3）运用q PCR方法研究基因拷贝数对rbs LYZ活性的影响,发现随着重组酵母菌株中bs LYZ基因拷贝数的增加,rbs LYZ的活性随之增加。（4）与阴性对照相比,重组黄牛胃溶菌酶对藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌及溶壁微球菌具有较好的抑菌作用;而对铜绿假单胞菌、蜡样芽孢杆菌和大肠杆菌无抑制作用。利用解脂耶氏酵母（Polh菌株）系统重组表达牦牛胃溶菌酶。结果表明重组牦牛胃溶菌酶（recombinant yak stomach lysozyme 1a,rys LYZ1a）的分子量约为15KDa;培养72 h时rys LYZ1a表达量最高;利用CM-Sepharose FF柱层析等纯化方法获得了电泳纯级rys LYZ1a,比活性为1855.42 U/mg。在电镜下观察到rys LYZ1a通过破环金黄色葡萄球菌的细胞壁而发挥抑菌作用;rys LYZ1a能有效抵抗胃蛋白酶的降解,其在模拟猪胃液中处理4 h后仍有部分保持完整。本研究为高原反刍动物胃溶菌酶的广泛应用奠定基础。
赵禹,赵雅坤,刘士琦,李建,李圣龙,肖冬光,于爱群[4]（2020）在《非常规酵母的分子遗传学及合成生物学研究进展》文中指出先进的合成生物学技术与传统的分子遗传学技术的结合更有助于实现酵母底盘细胞的快速改造和优化。酵母合成生物学研究最早开始于常规酵母——酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）,近些年来又迅速扩展至一些非常规酵母,包括巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris）、解脂耶氏酵母（Yarrowialipolytica）、乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）和多形汉逊酵母（Hansenula polymorpha）等。借助合成生物学技术与工具,目前科学家们已经成功开发出了能够高效生产生物材料、生物燃料、生物基化学品、蛋白质制剂、食品添加剂和药物等工业产品的重组非常规酵母工程菌株。本文系统总结了合成生物学工具（主要是基因组编辑工具）、合成生物学组件（主要是启动子和终止子）和相关分子遗传学方法在上述非常规酵母系统（底盘细胞）中的最新研究进展和应用情况,并讨论了其他合成生物学技术在这些非常规酵母表达系统中的潜在适用性和应用前景。这为研究人员利用合成生物学方法在这一新型非模式微生物底盘细胞中设计和构建各种高附加值工业产品的异源合成模块并最终实现目标化合物的高效生物合成提供了科学的理论指导。
吴静雯[5]（2019）在《α-factor信号肽及其N-糖基化修饰对毕赤酵母外源蛋白分泌的影响》文中研究表明毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统因其兼具真核生物和原核生物的特点,自投入使用以来,已成功使用该系统表达了超过1000种的外源蛋白。作为外源蛋白表达系统,表达量是其最核心的评价指标之一。在毕赤酵母中,虽然有一些蛋白能得到高分泌表达,但多数蛋白在毕赤酵母中分泌表达量只能达到mg/L级。因此,如何找到一种普适性的方法,提高毕赤酵母中信号肽引导的外源蛋白分泌表达量,这对于完备毕赤酵母表达系统具有重要的意义。信号肽是分泌蛋白进入分泌通道重要先决条件,对蛋白的分泌表达有重要影响。本研究从信号肽入手,以增强型绿色荧光蛋白（EGFP）为报告蛋白,研究S.cerevisiae、K.pastoris和K.phaffii三种酵母α-factor信号肽及其前导肽对报告蛋白分泌表达的影响。研究发现,S.cerevisiaeα-factor信号肽可以很好的引导EGFP的分泌表达,而K.pastoris和K.phaffiiα-factor信号肽对EGFP分泌表达效率低下;S.cerevisiaeα-factor信号肽引导的外源蛋白胞外表达量是K.pastoris和K.phaffii的98.2倍和13.5倍。从外源蛋白胞内滞留、蛋白降解、基因整合拷贝数、转录水平、密码子偏好性等方面对S.cerevisiae、K.pastoris和K.phaffii三种α-factor信号肽进行分析,发现K.pastoris和K.phaffii的α-factor信号肽对EGFP分泌表达效率低下并非是这些原因造成。对三种α-factor信号肽潜在N-糖基化位点进行分析,发现S.cerevisiaeα-factor信号肽的前导肽上存在三个N-糖基化位点,而在K.pastoris和K.phaffii的α-factor上没有N-糖基化位点。将S.cerevisiaeα-factor前导肽三个N-糖基化位点上的N突变成Q,使之不能被N-糖基化,其表达量下降了近50.3%。同时,在K.pastoris和K.phaffiiα-factor前导肽上引入一个N-糖基化位点后,表达量有显着提高,分别提高了31.5倍和5.2倍。这些结果说明α-factor前导肽的N-糖基化修饰有助于外源蛋白的分泌表达,K.pastoris和K.phaffiiα-factor信号肽不能很好引导外源蛋白的分泌是由于缺少N-糖基化而引起的。进一步以S.cerevisiaeα-factor信号肽为模型,研究前导肽上N-糖基化的数量和位置对分泌表达的影响,结果表明,前导肽上N-糖基化的数量和位置对表达量没有明显影响。本研究为提高外源蛋白在毕赤酵母中的表达量提供了技术手段,也为进一步的机制研究奠定很好的前期基础,同时,也为外源蛋白在毕赤酵母中分泌表达所需的信号肽提供了更多的选择。
王旺[6]（2019）在《毕赤酵母工程菌产植酸酶的发酵优化及放大》文中提出植酸酶（E.C.3.1.3.8 phytase）是催化植酸（肌醇六磷酸）及植酸盐水解成肌醇与磷酸（或磷酸盐）的一类酶的总称。大量研究表明,在禽类日粮中添加植酸酶可减少饲料中磷的添加量,这对提高畜牧生产效益及减轻环境污染有重要意义。目前已开发出商品化的植酸酶制剂,植酸酶作为饲料添加剂已应用于实际生产,而植酸酶产量供给有限,限制了植酸酶的应用,因此植酸酶生产相关的研究工作大多围绕提高植酸酶的产量而展开。毕赤酵母表达系统是一种成熟且应用广泛的真核表达系统,以毕赤酵母作为宿主菌高密度发酵表达植酸酶可以显着提升植酸酶的产量。外源蛋白的表达水平与所用菌株的特性、外源基因拷贝数及稳定性等因素相关,同时发酵过程中的优化是下游生产过程中提高产率、降低生产成本的重要途径。本研究的思路是根据Invitrogen公司提供的《毕赤酵母实验操作手册》和《毕赤酵母发酵工艺手册》,在摇瓶水平对培养基主要成分和发酵条件进行单因素多梯度优化,找到最适水平。得到毕赤酵母工程菌产植酸酶在摇瓶水平中的最适条件分别为诱导时间120h、诱导pH为5.5,诱导甲醇添加量1.5%、装液量10%、诱导温度28℃,为高密度发酵罐发酵提供数据参考基础。经过优化后,毕赤酵母工程菌产植酸酶的能力明显优于优化前,产酶能力提升了31.9%。然后以摇瓶发酵得到的优化工艺条件为基础,在3L和15L发酵罐中放大发酵并优化了诱导温度和初始诱导pH两个因素。找出毕赤酵母工程菌产植酸酶高密度发酵适宜条件以提高植酸酶的表达量,优化条件下的毕赤酵母工程菌发酵产植酸酶的酶活力明显高于未优化前,3L罐最高酶活可达到18708 U/mL,比未优化前提高38.3%,而15 L罐植酸酶酶活最高达到23189 U/mL,相较于3L罐水平,菌种生长OD600提高了10.5%,植酸酶酶活提高了24.0%此外,本研究在15L罐发酵水平优化了毕赤酵母工程菌在诱导产酶阶段的甲醇流加速率。为了确定植酸酶发酵过程中最合适的甲醇流加速率,通过控制3.5 g/（L·h）、5.5 g/（L·h）、7.5 g/（L·h）这3种甲醇流加速率,探讨不同甲醇流加速率条件下的毕赤酵母工程菌的植酸酶产量。结果表明,在甲醇流加速率为5.5 g/（L·h）条件下,发酵结束时,植酸酶酶活达到26386 U/mL,是3.5 g/（L·h）甲醇流加速率的106.83%、7.5 g/（L·h）甲醇流加速率的122.17%,该甲醇流加速率对发酵生产植酸酶最有利。本论文对表达植酸酶的重组毕赤酵母发酵条件进行优化,探索出合适的发酵工艺,同时通过对发酵过程中相关参数的测定,缓解了重组毕赤酵母发酵过程中存在的多拷贝重组菌诱导阶段生长缓慢、植酸酶表达活性低等问题,为植酸酶的大规模工业化生产提供技术和理论指导。
张宝玲[7]（2019）在《球孢白僵菌Endothiapepsin-like蛋白的毕赤酵母表达及酶活性的检测》文中研究指明Endothiapepsin蛋白是一种天冬氨酸蛋白水解酶,最初是从植物病菌丝状子囊菌栗疫菌（Endothia parasitic）分离鉴定的。然而在球孢白僵菌（Beauveria bassiana）基因组中也存在着编码endothiapepsin-like蛋白的基因（BbeapA）,本实验室在前期关于不同致病性球孢白僵菌菌株在早期阶段侵染家蚕表皮比较转录组学的研究中发现endothiapepsin-like蛋白和其他一些天冬氨酸蛋白酶在高毒力菌株GXsk1011中是上调表达的,但是该蛋白在致病过程中的作用以及其他一些功能在球孢白僵菌中尚未有报道。本实验在前期将编码endothiapepsin-like蛋白的基因进行了克隆和测序的基础上,将其氨基酸序列与来源于栗疫菌的endothiapepsin（CAA37944）、球孢白僵菌Bb2860菌株的endothiapepsin-like（XP008601085）、家蚕的病原aspergillopepsin A-like天冬氨酸蛋白酶（XP022385274）和烟曲霉的aspergillopepsin F（XP753324）的氨基酸序列进行多重比对,发现球孢白僵菌GXsk1011菌株的endothiapepsin-like蛋白在其C端保守结构域处有一个氨基酸发生了突变,即由Ser/Thr变为Gly,故是否是因为保守区存在氨基酸的突变才将其命名为endothiapepsin-like蛋白呢?问题的关键是这种突变对endothiapepsin-like蛋白的活性是否有影响,该蛋白在侵染家蚕过程中发挥了怎样的作用都是未知的。因此,本实验将球孢白僵菌GXsk1011菌株的endothiapepsin-like蛋白通过毕赤酵母表达系统进行了真核表达,并进行了重组蛋白的酶活性检测,本文的主要研究结果如下:1.BbeapA基因的克隆（无信号肽）及其生物信息学分析提取球孢白僵菌GXsk1011菌株的RNA,反转录成cDNA,根据毕赤酵母表达载体pPIC9K和pPICZαA的多克隆位点设计引物,以该cDNA为模板克隆无信号肽的BbeapA基因并对其做进一步生物信息学分析。通过多重序列比对发现endothiapepsin-like蛋白的C端保守结构域位点的一个Ser/Thr突变为Gly;通过软件对该蛋白在线预测其分子量大小为40 kD;N-糖基化位点预测发现该蛋白在第134个氨基酸处具有糖基化位点;三维结构预测发现该蛋白在89和276位处具有天冬氨酸残基催化位点。2.重组Endothiapepsin-like蛋白在毕赤酵母中的表达将克隆的无信号肽的BbeapA基因分别与毕赤酵母表达载体pPIC9K和pPICZαA连接,转化至毕赤酵母感受态细胞GS115中,构建重组酵母菌株GS115/pPIC9K-BbeapA和GS115/pPICZαA-BbeapA。对该重组菌株用甲醇作为唯一碳源诱导发酵,将发酵上清进行SDS-PAGE凝胶电泳检测,结果显示和对照菌株相比,两种重组菌株均在40 kDa和45 kDa出现了两条明显的条带,且无明显差异,因此选用重组菌株GS115/pPIC9K-BbeapA进行后续实验。将重组菌株GS115/pPIC9K-BbeapA用甲醇诱导发酵120 h后,发酵上清用硫酸铵盐析沉淀并进行Western blotting验证和Ni-NTA亲和层析,SDS-PAGE凝胶电泳结果显示依然出现了两条带,一条带在40 kD处,另一条在45 kD处;在发酵初期45 kD处的条带比较明显,40 kD处的条带的亮度比较暗,而在发酵后期则40 kD处的条带比较明显,45 kD处的条带会越来越弱直至消失。因此推测45 kD处的条带可能为目的蛋白被糖基化所致,而40 kD处的条带可能是目的蛋白的糖基化链断裂所致,因此推测两条带均为目标蛋白。3.重组Endothiapepsin-like蛋白酶活性的检测对纯化的重组endothiapepsin-like蛋白进行酶活性的测定,首先以酪蛋白为底物检测其活性,当温度为40℃,pH为4.0时重组endothiapepsin-like蛋白的活力达到83.55 U/mg。其次以家蚕表皮作为底物检测重组endothiapepsin-like蛋白对家蚕体壁蛋白质的降解能力,发现重组endothiapepsin-like蛋白作用家蚕表皮时对表皮蛋白的释放能力比对照磷酸缓冲液（PBS）提高了的1.4倍（P<0.01）,定量SDS-PAGE电泳检测显示endothiapepsin-like蛋白作用家蚕表皮后发挥了明显的降解作用,在10 kD以下的位置明显聚集了很多小分子蛋白。扫描电镜对家蚕体壁结构进一步分析显示重组endothiapepsin-like蛋白处理的家蚕体壁其表皮沟壑比PBS对照组要深,表面更加清洁光滑。结果表明:球孢白僵菌endothiapepsin-like蛋白仍然具有很强的酶活性,对家蚕体壁可发挥降解作用并可能参与了家蚕表皮的侵染过程,结合本实验室前期对该基因的敲除以及功能验证,表明该蛋白酶也是球孢白僵菌一种重要的毒力因子。
战春君[8]（2018）在《甘油抑制巴斯德毕赤酵母PAOX1机制研究》文中研究说明巴斯德毕赤酵母作为目前重要的外源蛋白表达体系,其已经被广泛应用于大量外源蛋白例如Clostridium botulinumF型神经毒素Hc、Trameta versicolor漆酶纤维二糖脱氢酶等的表达。而在这一过程当中,醇氧化酶启动子(promoter of alcohol oxidase,PAOX1)作为一类受甲醇诱导调控的强启动子,目前被大量用于外源蛋白表达,但是该启动子受到甲醇的严格调控即当培养基中仅含有甲醇状况下,PAOX1才会发挥启动功效,当培养基中存在甘油或者葡萄糖等碳源时,PAOX1会被强烈抑制。基于此,目前通过PAOX1表达外源蛋白过程中一般采用两步发酵方法,这一策略不仅极大地延长了发酵时间,增加发酵成本,并且由于甲醇代谢为甲醛过程需要氧气参与,导致甲醇在代谢过程中耗氧量增大、而产能少,同时甲醇代谢过程伴随着大量有害代谢产物如甲醛,过氧化氢,二羟丙酮等的大量生成,上述不足极大地限制了PAOX1的应用。由于目前对甘油抑制PAOX1机制尚不清楚,因此针对PAOX1应用中缺陷并无完善的解决方案。在本研究当中我们通过生物信息学以及实验方法对巴斯德毕赤酵母当中甘油抑制PAOX1机制进行初步探讨,其主要结论如下:（1）首次在巴斯德毕赤酵母中发现甘油转运体并确定其具有转运甘油功能。通过查阅SGD数据（Saccharomyces Genome Database,SGD）,在巴斯德毕赤酵母基因组当中找到与酿酒酵母甘油转运体（sugar transporter 1,STL1）相似度较高的序列（67.8%）,并命名为P.pGLT1（glycerol transporter 1,GLT1）,通过NCBI数据库对两者氨基酸保守序列进行分析发现,STL1与GLT1均属于转运膜蛋白超家族（major facilitator superfamily,MFS）,这暗示其在甘油运输方面可能具有相同功能;通过跨膜结构域分析发现,Glt1p蛋白与Stl1p蛋白类似,均是一个具有12次跨膜区域的跨膜蛋白。亚细胞定位结果显示,Glt1p蛋白在巴斯德毕赤酵母以及粟酒裂殖酵母当中均为膜蛋白,Glt1p在粟酒裂殖酵母当中异源回补实验结果表明,Glt1p蛋白可以赋予粟酒裂殖酵母转运甘油的功能,这表明,GLT1基因在巴斯德毕赤酵母当中是作为一个甘油转运体发挥作用。（2）通过荧光定量PCR等实验证明Mxr1p蛋白可以通过与PGLT1结合抑制GLT1基因转录进而降低胞内甘油含量从而最终实现PAOX1甘油去阻遏效应。通过通过荧光定量PCR方法测定GLT1基因在（35）mxr1缺失突变体以及Methanol expression regulator 1（MXR1）过表达菌株当中mRNA表达量,结果表明,与野生型当中GLT1基因mRNA表达量相比,GLT1基因在（35）mxr1缺失突变体中表达量显着升高（4倍）,在MXR1过表达菌株中表达量下降（20%）;同时通过测定上述菌株在甘油培养基,甘油与甲醇混合培养基以及甲醇培养基中alcohol oxidase 1（Aox1p）酶活发现,与野生型菌株中Aox1p酶活(0.40 U?OD600-1)以及蛋白表达量相比,在甲醇存在状况下Aox1p酶活以及蛋白表达量在（35）mxr1缺失突变体(0.06 U?OD600-1)中显着下降（约为15%）,在MXR1过表达菌株中显着升高(1.15 U?OD600-1)（约为287%）;通过凝胶迁移率实验发现,Mxr1p蛋白可以与甘油转运体启动子(promoter of glycerol transporter 1,PGLT1)上的5’-CYCC-3’核酸序列结合;这表明MXR1基因可以通过与PGLT1结合来抑制GLT1基因mRNA表达,同时促进AOX1基因表达。（3）GLT1可以通过增加胞内甘油含量抑制MXR1基因转录,从而导致PAOX1甘油阻遏效应。测定MXR1基因在（35）glt1缺失突变体以及GLT1过表达菌株当中mRNA表达量,在甘油存在条件下,GLT1基因缺失可以促进MXR1基因mRNA表达而GLT1基因过表达则会抑制MXR1基因mRNA表达;通过测定上述菌株中Aox1p蛋白表达量以及酶活发现,在甘油存在条件下,GLT1基因缺失可以促进Aox1p蛋白表达量以及酶活(0.34 U?OD600-1)升高,而GLT1基因过表达则会抑制Apx1p蛋白表达量以及酶活(0.04 U?OD600-1);通过测定GLT1基因缺失突变体以及过表达菌株细胞中甘油含量发现,GLT1缺失会降低细胞内甘油含量而GLT1基因过表达则会促进细胞内甘油含量升高;这表明GLT1基因可以通过提高细胞内甘油含量抑制MXR1基因表达量进而抑制AOX1基因表达。（4）在甲醇培养条件下找到与Mxr1p蛋白相互作用的新蛋白Tkl1p,并阐明其与Mxr1p形成蛋白复合体可以通过促进重要中间产物5-磷酸木酮糖的形成促进甲醛代谢。通过蛋白质拉下实验（pull down assay）以及质谱分析发现,在以甘油作为唯一碳源条件下,Mxr1p蛋白可以与巴斯德毕赤酵母当中的某些蛋白相互作用,在甲醇作为唯一碳源条件下,Mxr1p蛋白可以与UDP-glucose pyrphosphorylase基因、translation elongation factor 1-alpha基因、imidazoleglycerol-phosphate dehydratase基因、transketolase（TKL）基因相互作用;通过酵母双杂交实验发现,Mxr400AA蛋白在酿酒酵母细胞中可以与Tkl1p蛋白相互作用而Mxr150AA蛋白则不能与Tkl1p蛋白相互作用,这表明,Mxr1p蛋白与Tkl1p蛋白相互作用的位点集中在150AA至400AA区域;通过HPLC方法测定不同甲醛浓度下木酮糖含量发现,在Tkl1p过表达系统中加入纯化后Mxr1p蛋白,木酮糖含量显着高于其他对照组,其原因主要可能是Tkl1p与Mxr1p蛋白形成的复合体可以促Fructose-6phosphate（F6P）与Glycaraldehyde-3-phosphate（GAP）进入NOG（no oxidized glycolysis pathway）途径,进而促进D-Xylulose-5-phosphate（Xu5P）的再生,而过多的Xu5P则可以通过磷酸酶去磷酸化间接行促进木酮糖生成。（5）新型巴斯德毕赤酵母表达系统可以在一定程度上缓解甘油对于PAOX1抑制效应,促进外源蛋白表达。通过构建包含有enhanced green fluorescent protein（EGFP）、Human Serum Albumin（HSA）基因的野生型巴斯德毕赤酵母和（35）glt1突变体,评价构建的甘油去阻遏新型巴斯德毕赤酵母表达系统。在摇瓶水平上发现,Egfpp蛋白以Hsap蛋白在（35）glt1突变体中表达量显着高于其在野生型巴斯德毕赤酵母中蛋白表达量（2.5-3.5倍）;在5 L发酵罐水平上,Hsap蛋白在（35）glt1突变体中表达量同样高于其在野生型巴斯德毕赤酵母当中蛋白表达量（约为野生型中表达量的4倍）;并且在实验中发现,在甘油与甲醇混合培养基中Egfpp蛋白在（35）glt1突变体表达量与其在甲醇培养基中表达量接近,但是在甘油与甲醇混合培养基中,（35）glt1突变体生物量显着高于其在甲醇培养基中生物量,这表明,所构建的突变体在甘油与甲醇混合培养基中不仅可以保持外源蛋白表达量与在甲醇培养基中接近,同时可以通过提高生物量来间接提高外源蛋白表达总量。
王少曼[9]（2018）在《密码子优化对毕赤酵母表达单宁酶酶学性质和构象影响研究》文中研究说明单宁酶（Tannase,EC 3.1.1.20）可以催化水解单宁酸和没食子酸酯类中的酯键和缩酚酸键,水解产物为没食子酸、葡萄糖及多元醇类化合物,因而被广泛应用于食品、制革、饲料、制药等行业中。目前主要通过米曲霉、黑曲霉的深层液态和半固态发酵法生产单宁酶,存在产量低、纯化工艺复杂、生产成本高、经济效益低等缺点。随着现代分子生物学技术的发展,通过基因工程手段,克隆单宁酶基因到目的宿主菌株中,实现单宁酶的高效表达,无疑是解决工业化生产单宁酶难题的有效手段。毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统是近年来最为成功的真核表达系统之一,而外源基因序列自身的稀有密码子是外源基因在毕赤酵母中成功实现表达的一个瓶颈。稀有密码子的存在会严重降低m RNA与核糖体的结合能力,阻碍外源蛋白的翻译,影响外源蛋白的表达量和结构。通过密码子优化可提高外源蛋白的翻译效率,从而提高表达水平。本研究以Aspergillus oryzae NCU 002单宁酶为研究对象,对单宁酶基因密码子优化后转化至毕赤酵母GS115中,研究密码子优化对毕赤酵母分泌表达单宁酶的表达水平、酶学性质和空间构象的影响。主要研究结果如下:（1）以A.oryzae NCU 002基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到米曲霉单宁酶基因序列,对单宁酶基因序列分析后,发现该基因的密码子适应指数CAI值（0.65）偏低。根据毕赤酵母密码子的使用偏爱性,结合GC含量和m RNA二级结构,在不改变单宁酶原有氨基酸序列情况下进行DNA密码子优化,并将经过密码子优化后的单宁酶基因（Tanop）及野生型单宁酶基因（Tanwt）分别构建到表达载体p PICZαC上,形成重组质粒p PICZαC-Tanop和p PICZαC-Tanwt。将两种重组质粒分别转化至毕赤酵母GS115中,通过单宁酶活力定性鉴别平板和PCR鉴定方法分别筛选得到表达水平较高的含有Tanop基因、Tanwt基因的重组毕赤酵母各1株,分别命名为P.pastoris GS115/p PICZαC-Tanop8、P.pastoris GS115/p PICZαC-Tanwt10。甲醇诱导24 h后两株重组菌产单宁酶酶活分别为3.08 U/m L、2.34 U/m L。密码子优化后的重组毕赤酵母菌株P.pastoris GS115/p PICZαC-Tanop8产酶能力是含野生型基因的重组毕赤酵母菌株P.pastoris GS115/p PICZαC-Tanwt10产酶能力的1.32倍。（2）通过研究甲醇浓度、磷酸钾缓冲液p H值、接种量OD600、诱导温度、发酵时间对P.pastoris GS115/p PICZαC-Tanop8和P.pastoris GS115/p PICZαC-Tanwt10分泌表达重组单宁酶的影响,得出最佳发酵条件均为:甲醇浓度0.5%、磷酸钾缓冲液p H值3.0、接种量OD600 1.0、诱导温度22℃、发酵时间36 h。在此条件下,菌株P.pastoris GS115/p PICZαC-Tanop8最高产酶量为29.38 U/m L,是发酵条件优化前的9.54倍;菌株P.pastoris GS115/p PICZαC-Tanwt10最高产酶为19.02 U/m L,是发酵条件优化前的8.13倍。密码子优化后菌株P.pastoris GS115/p PICZαC-Tanop8产酶能力是含野生型基因的菌株P.pastoris GS115/p PICZαC-Tanwt10产酶能力的1.54倍,表明密码子优化提高了重组菌株的产酶能力。（3）将菌株P.pastoris GS115/p PICZαC-Tanop8和P.pastoris GS115/p PICZαC-Tanwt10的发酵粗酶液经过卷式膜超滤浓缩、硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析柱纯化后得到电泳纯的重组单宁酶,通过SDS-PAGE电泳得出Tanop重组单宁酶和Tanwt重组单宁酶的分子量均为59.5 k Da。Tanop重组单宁酶的比酶活为1362.67 U/mg,酶活回收率为8.5%,纯化倍数为10.65;Tanwt重组单宁酶的比酶活为975.23 U/mg,酶活回收率为13.1%,纯化倍数为15.37,表明密码子优化提高了重组单宁酶的比酶活。（4）比较了Tanop重组单宁酶和Tanwt重组单宁酶的酶学性质,得出结果如下:（1）p H值和温度对Tanop重组单宁酶和Tanwt重组单宁酶的影响不大,两者最适反应p H均为5.5,p H稳定范围均为p H 3.5～p H 8.0。两者最适反应温度均为35℃,温度稳定范围均为20℃～30℃。（2）K+、Na+、Li+、Mn2+、Ca2+对两种重组单宁酶酶活影响不大;高浓度的Co2+对两种重组单宁酶酶活起到激活作用;Mg2+、Zn2+对Tanop重组单宁酶和Tanwt重组单宁酶激活作用最强,高浓度时（10 mmol/L）分别激活提高至294.62%、288.57%和303.49%、280.89%;Cu2+对两种单宁酶酶活均有强烈抑制作用;低浓度的Hg2+、Fe3+、Al3+对两种重组单宁酶酶活均为激活作用,高浓度（10 mmol/L）表现为抑制作用。（3）表面活性剂（吐温-80、曲拉通X-100、SDS）和抑制剂（EDTA、DMSO、DTT）对Tanop重组单宁酶和Tanwt重组单宁酶的活性均有不同程度的抑制作用,SDS的抑制效果最强。（4）有机试剂甲醇、乙醇、丙三醇、正丁醇、丙酮、乙腈对Tanop重组单宁酶和Tanwt重组单宁酶酶活均有不同程度的抑制作用,随着浓度增加,甲醇、乙醇、丙三醇的抑制程度变化不明显,而正丁醇、丙酮、乙腈的抑制作用明显增强,乙腈的抑制作用最强烈。异戊醇对Tanop重组单宁酶有一定抑制作用,但对Tanwt重组单宁酶有轻微促进作用。（5）以没食子酸甲酯为反应底物,Tanop重组单宁酶的Km=8.84 mmol/L,Vmax=0.094μmol/min,Tanwt重组单宁酶的Km=11.12 mmol/L,Vmax=0.022μmol/min。（5）研究比较了Tanop重组单宁酶和Tanwt重组单宁酶的空间构象,得出结果如下:（1）圆二色谱结果显示Tanop重组单宁酶二级结构比例为14.4%α-螺旋、26.6%β-折叠、24.3%β-转角、34.8%无规则卷曲;Tanwt重组单宁酶则含有18.6%α-螺旋、19.4%β-折叠、24.4%β-转角、37.6%无规则卷曲。Mg2+和Zn2+的添加均使这两种重组单宁酶的α-螺旋比例增加,β-折叠比例减小,可能引起单宁酶活性位点附近的构象发生改变。（2）傅里叶红外光谱结果显示密码子优化前后的重组单宁酶的主要基团特征吸收峰种类没有发生明显变化,也没有明显的特征吸收峰波长发生位移。Mg2+和Zn2+的添加引起了Tanop重组单宁酶和Tanwt重组单宁酶的酰胺Ⅰ带特征峰波长的蓝移和红外吸收强度的增加。（3）荧光光谱结果显示,Tanop重组单宁酶在波长334.4 nm有最大荧光强度1428.6,高于Tanwt重组单宁酶在波长335.2 nm最大荧光强度1187.5。表明密码子优化引起了重组单宁酶中色氨酸和酪氨酸在重组单宁酶构象表面中所处的微环境产生变化。而Mg2+和Zn2+的添加对两种重组单宁酶的色氨酸和酪氨酸微环境均有一定影响。以上所有研究结果表明:密码子优化对重组单宁酶的影响表现在以下几方面:（1）密码子优化能提高重组单宁酶的表达量及比酶活;（2）密码子优化对重组单宁酶的最适反应p H和p H稳定性、最适反应温度和温度稳定性、有机溶剂耐性无明显影响,但是密码子优化降低了表面活性剂和抑制剂对重组单宁酶酶活的抑制作用,提高了高浓度金属离子Mg2+、Zn2+对重组单宁酶的促进作用;（3）密码子优化引起了重组单宁酶空间构象的微小变化,如二级结构β-折叠比例的升高、荧光强度的增加等,是提高单宁酶比酶活的重要原因。
刘洋[10]（2018）在《猪链球菌噬菌体裂解酶Ply5218功能域解析及体内抗菌活性研究》文中指出猪链球菌（Streptococcus suis）是一种人兽共患病原菌,感染仔猪可导致患关节炎、败血症和脑膜炎等,对养猪业以及公共卫生均构成非常严重的威胁。目前,对猪链球菌病菌的防控主要依赖抗生素治疗,但抗生素的滥用,导致临床分离的多数病原菌株呈现严重耐药和多重耐药特性,细菌耐药问题日趋严重,阻碍了该病的有效防控,因此发掘新的抗菌制剂尤为重要;来源于噬菌体的裂解酶（Lysin）具有高效、快速杀菌,特异性强,且不易产生耐药性等特点,是一种潜在的新型抗菌制剂。本研究基于猪链球菌噬菌体裂解酶Ply5218在体外裂菌和在小鼠体内抗感染的良好效果,应用Ply5218对发病仔猪进行治疗。选用20 kg大小的仔猪,采取“颈部攻击-裂解酶治疗”策略,评价Ply5218的体内抗感染效果。将16只仔猪随机分成四组,分别为攻击未治疗组、未攻击治疗组,攻击后立即治疗组和攻击后延迟1 h治疗组。攻击组仔猪均经颈部肌肉注射10 mL（1.4×10100 CFU/mL）复壮的猪链球菌2型（Streptococcus suis serotype 2,SS2）强毒株HA9801,然后分别立即注射10 mL（512 U/mL）裂解酶Ply5218或PBS;延迟治疗组仔猪在攻击1 h后颈部注射10 mL（512 U/ml）的裂解酶Ply5218进行治疗,记录仔猪的的存活状态、体温、血液细菌载量以及血液中促炎性细胞因子水平。结果显示攻击后立即注射裂解酶Ply5218能够有效控制仔猪链球菌感染,立即治疗组存活率达到75%,而对照组存活率为0%;存活仔猪体温逐渐恢复正常;血液中细菌载量逐渐下降;立即治疗3天内,治疗组促炎性细胞因子表达水平显着低于未治疗组,且立即治疗仔猪健康状况逐步恢复至正常水平。为了使裂解酶Ply5218能更便捷地应用于临床治疗,本研究对其递送途径进行了探究。通过分析、优化Ply5218的密码子,将优化后的裂解酶基因片段克隆至真核表达载体PPlczA,在X33酵母感受态细胞中诱导表达,并对酵母表达条件进行优化,实现Ply5218高效、大批量表达;ICR小鼠经SS2 HA9801腹腔攻击后,分别进行X33-Ply5218(Ply5218在酵母细胞X33中表达)酵母细胞、Ply5218蛋白、X33酵母细胞对照及PBS缓冲液对照的口服治疗,分别于24 h、48 h、72 h及96 h测定每组小鼠血液、肝脏及脾脏的细菌数。结果显示:酵母表达Ply5218的最佳条件为:28℃、诱导48 h（每隔24 h加入1%的甲醇）;口服X33-Ply5218酵母细胞组和Ply5218蛋白组,小鼠体内的细菌数与对照组相比显着减少,说明小鼠口服X33-Ply5218和Ply5218能有效抑制猪链球菌在小鼠体内的增殖与感染。为了进一步鉴定猪链球菌噬菌体裂解酶Ply5218的最小活性功能域及关键氨基酸位点,便于后期对裂解酶的改造和降低表达成本,本文对全长裂解酶Ply5218和催化结构域(Ply52181-147)进行截短并对可能与活性相关的关键氨基酸位点进行定点突变,研究截短与突变后各个裂解酶蛋白的裂菌活性。通过与全长裂解酶蛋白裂菌活性的对比,确定Ply5218的最小活性功能域及关键氨基酸。结果显示:截短片段Ply52181-147可在平板上形成裂菌圈,仍保持裂菌活性,而比该片段更短的截短片段则失去裂菌活性,推测Ply52181-147为Ply5218的最小活性相关功能域;第8、第58、第136和第142位的氨基酸突变后,裂菌活性部分降低,而第34和第144位的氨基酸突变后,则彻底失去裂菌活性。提示这些位点的氨基酸与裂解酶的裂菌活性密切相关。综上所述,猪链球菌噬菌体裂解酶Ply5218,在仔猪遭受细菌攻击后立即注射治疗,能有效控制猪链球菌感染;经密码子优化后,裂解酶Ply5218能在酵母细胞X33中表达,攻击了猪链球菌HA9801的小鼠,通过口服X33-Ply5218酵母细胞治疗,组织中细菌载量显着下降,呈现一定的保护力;通过截短与定点突变,发现Ply5218发挥作用的最小功能域为Ply52181-147,鉴定了6个与裂菌活性相关的关键氨基酸位点,研究结果为深入揭示Ply5218的裂菌机制和进一步改造、应用裂解酶提供了基础数据。
二、巴斯德毕赤酵母表达系统（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、巴斯德毕赤酵母表达系统（论文提纲范文）
（1）不同碳源对毕赤酵母生长代谢与自噬的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 毕赤酵母概述 |
| 1.1.1 醇氧化酶I(AOX1) |
| 1.1.2 甘油转运体(GT1) |
| 1.2 自噬 |
| 1.2.1 宏自噬 |
| 1.2.2 过氧化物酶体自噬 |
| 1.3 课题研究内容 |
| 1.3.1 课题来源和意义 |
| 1.3.2 本课题的主要研究内容 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌种和质粒 |
| 2.1.2 主要溶液 |
| 2.1.3 工具酶 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.1.5 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 毕赤酵母总DNA的提取 |
| 2.2.2 目的基因敲除质粒的构建 |
| 2.2.3 目的基因过表达质粒的构建 |
| 2.2.4 目的基因连接6×His标签的菌株构建 |
| 2.2.5 目的基因敲除或过表达的菌株的构建 |
| 2.2.6 碳源代谢情况测定 |
| 2.2.7 细胞生长状态测定 |
| 2.2.8 目的基因转录情况检测 |
| 2.2.9 目的蛋白表达情况检测 |
| 2.2.10 过氧化物酶体量的测定 |
| 2.2.11 AOX1 酶活性的测定 |
| 第三章 结果与讨论 |
| 3.1 不同碳源培养对毕赤酵母生长代谢的影响 |
| 3.1.1 不同碳源培养对毕赤酵母生长状态的影响 |
| 3.1.2 不同碳源培养对毕赤酵母代谢的影响 |
| 3.2 相关基因在碳源变化时的转录水平的变化 |
| 3.3 蛋白水平验证 |
| 3.3.1 目的基因连接6×His标签的菌株构建 |
| 3.3.2 相关蛋白在碳源变化时的表达水平的变化 |
| 3.4 相关基因的高低表达提高细胞内AOX1酶活 |
| 3.4.1 Atg30敲除菌株的构建 |
| 3.4.2 Pex1过表达菌株和Pex6过表达菌株的构建 |
| 3.4.3 敲除Atg30,过表达Pex1和Pex6的突变菌株的构建 |
| 3.4.4 相关基因的高低表达对AOX1酶活的影响 |
| 3.4.5 相关基因的高低表达对过氧化物酶体的影响 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文 |
（2）基于理性设计和基因剂量效应提高米根霉脂肪酶基因ROL的表达水平（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表（Abbreviation） |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 米根霉 |
| 1.2 脂肪酶简介 |
| 1.2.1 细菌及真菌脂肪酶 |
| 1.2.2 脂肪酶的催化机理及活性部位 |
| 1.3 米根霉脂肪酶的外源表达 |
| 1.4 脂肪酶的应用 |
| 1.4.1 脂肪与油类的酯交换 |
| 1.4.2 手性化合物拆分 |
| 1.4.3 生物柴油合成 |
| 1.4.4 功能性低聚糖制备 |
| 1.5 大肠杆菌表达系统研究进展 |
| 1.6 巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展 |
| 1.6.1 巴斯德毕赤酵母 |
| 1.6.2 巴斯德毕赤酵母表达系统 |
| 1.6.3 影响外源蛋白表达的因素 |
| 1.6.4 巴斯德毕赤酵母表达系统的应用前景 |
| 1.7 本课题的研究意义及主要内容 |
| 1.7.1 选题的目的及意义 |
| 1.7.2 主要研究内容 |
| 第2章 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 菌株与质粒 |
| 2.1.3 试剂、试剂盒以及酶和引物 |
| 2.1.4 主要培养基及主要溶液 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 由AOX1启动子驱动的脂肪酶基因工程菌株的构建 |
| 2.2.2 重组酵母工程菌株的构建 |
| 2.2.3 重组酵母工程菌株的诱导表达分析 |
| 2.2.4 多拷贝重组质粒的构建及诱导表达 |
| 2.2.5 脂肪酶基因ROL的密码子优化 |
| 2.2.6 脂肪酶基因ROL的理性设计及表达量分析 |
| 2.2.7 优化后脂肪酶基因ROL的多拷贝构建及表达量分析 |
| 2.2.8 优化后脂肪酶基因ROL在发酵罐条件下的表达水平评估 |
| 第3章 结果与分析 |
| 3.1 脂肪酶ROL重组子的构建及诱导表达 |
| 3.2 脂肪酶基因ROL的理性设计及表达量分析 |
| 3.3 优化后脂肪酶基因ROL的多拷贝构建及表达量分析 |
| 3.4 优化后脂肪酶基因ROL在发酵罐条件下的表达水平评估 |
| 第4章 结论与展望 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
（3）反刍动物胃溶菌酶的重组表达、发酵参数优化、纯化及抗菌机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第1章 反刍动物胃溶菌酶及其异源表达研究进展 |
| 1.1 反刍动物胃溶菌酶 |
| 1.1.1 反刍动物胃溶菌酶的结构 |
| 1.1.2 反刍动物胃溶菌酶氨基酸序列的适应性进化 |
| 1.1.3 反刍动物胃溶菌酶的制备 |
| 1.1.4 反刍动物胃溶菌酶异源表达的研究现状及应用 |
| 1.2 毕赤酵母表达系统 |
| 1.2.1 毕赤酵母表达系统简介 |
| 1.2.2 表达载体 |
| 1.2.3 宿主菌 |
| 1.3 提高重组毕赤酵母表达水平的分子策略 |
| 1.3.1 提高目的基因转录水平 |
| 1.3.2 提高目的基因的翻译水平 |
| 1.3.3 重组蛋白的分泌 |
| 1.4 重组毕赤酵母发酵过程参数优化 |
| 1.5 解脂耶式酵母表达系统 |
| 1.5.1 宿主菌 |
| 1.5.2 表达载体 |
| 1.6 结语 |
| 第2章 反刍动物胃溶菌酶真核表达载体的构建与筛选 |
| 2.1 试验材料、试剂与仪器 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 重组表达载体构建 |
| 2.2.2 重组表达质粒的扩增及酶切鉴定 |
| 2.2.3 电转化 |
| 2.2.4 重组酵母菌筛选及PCR鉴定 |
| 2.2.5 重组酵母菌株的诱导表达 |
| 2.2.6 SDS-PAGE分析 |
| 2.2.7 重组胃溶菌酶活性检测 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 目的基因的扩增及重组酵母菌株构建 |
| 2.3.2 重组酵母菌株的筛选及PCR鉴定 |
| 2.3.3 重组酵母菌株诱导上清的SDS-PAGE图谱分析 |
| 2.3.4 重组酵母菌株诱导上清的溶菌酶活性结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 发酵条件及基因剂量对牛胃溶菌酶表达的影响 |
| 3.1 试验材料、试剂与仪器 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 试剂 |
| 3.1.3 仪器 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 摇瓶培养 |
| 3.2.2 因子筛选试验(Plackett–Burman)设计 |
| 3.2.3 中心组合试验(Box–Behnken)设计 |
| 3.2.4 多拷贝重组酵母菌种的获得与筛选 |
| 3.2.5 重组酵母基因组提取 |
| 3.2.6 标准质粒构建及双标曲线建立 |
| 3.2.7 qPCR法检测基因拷贝数 |
| 3.2.8 重组胃溶菌酶活性检测 |
| 3.2.9 重组黄牛胃溶菌酶抗菌试验 |
| 3.3 试验结果 |
| 3.3.1 影响重组黄牛胃溶菌酶表达的因素筛选 |
| 3.3.2 中心组合试验(Box–Behnken)设计与响应面分析 |
| 3.3.3 重组毕赤酵母基因拷贝数的测定 |
| 3.3.4 拷贝数对重组毕赤酵母过量表达胃溶菌酶的影响 |
| 3.3.5 抗菌试验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 牦牛胃溶菌酶基因在解脂耶式酵母的表达及纯化 |
| 4.1 试验材料、试剂与仪器 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 试剂 |
| 4.1.3 仪器 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 重组表达载体构建 |
| 4.2.2 重组解脂耶式酵母菌株的构建及PCR验证 |
| 4.2.3 重组解脂耶式酵母菌株的表达 |
| 4.2.4 硫酸铵沉淀 |
| 4.2.5 透析 |
| 4.2.6 CM-Sepharose FF柱层析 |
| 4.2.7 重组牦牛胃溶菌酶蛋白浓度测定 |
| 4.2.8 重组牦牛胃溶菌酶活性测定 |
| 4.2.9 重组牦牛胃溶菌酶抗菌机制分析 |
| 4.2.10 重组牦牛胃溶菌酶稳定性分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 重组解脂耶式酵母的构建 |
| 4.3.2 重组解脂耶式酵母的表达 |
| 4.3.3 硫酸铵沉淀结果 |
| 4.3.4 CM-Sepharose FF柱层析 |
| 4.3.5 重组牦牛溶菌酶纯化结果 |
| 4.3.6 重组牦牛溶菌酶的抗菌作用 |
| 4.3.7 重组牦牛溶菌酶抗胃蛋白酶作用分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录一 攻读硕士期间发表的论文 |
| 附录二 反刍动物胃溶菌酶氨基酸序列 |
| 附录三 主要培养基及试剂的配制方法 |
| 致谢 |
（4）非常规酵母的分子遗传学及合成生物学研究进展（论文提纲范文）
| 1 非常规酵母简介 |
| 1.1 巴斯德毕赤酵母 |
| 1.2 解脂耶氏酵母 |
| 1.3 乳酸克鲁维酵母 |
| 1.4 多形汉逊酵母 |
| 2 非常规酵母的合成生物学组件 |
| 2.1 启动子 |
| 2.2 终止子 |
| 2.3 载体 |
| 3 非常规酵母基因组编辑方法的研究进展 |
| 3.1 Cre-loxP系统 |
| 3.2 CRISPR-Cas系统 |
| 4 结语和展望 |
（5）α-factor信号肽及其N-糖基化修饰对毕赤酵母外源蛋白分泌的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 绪论 |
| 1 巴斯德毕赤酵母表达系统的发展与优势 |
| 2 毕赤酵母菌株的发展与分类 |
| 3 毕赤酵母醇氧化基因和醇氧化酶启动子p AOX1-2 - |
| 3.1 毕赤酵母醇氧化基因 |
| 3.2 醇氧化酶启动子pAOX1 |
| 4 常用的巴斯德毕赤酵母表达载体 |
| 5 外源基因的整合方式 |
| 6 毕赤酵母前体蛋白转化酶Kex2 |
| 7 糖基化 |
| 7.1 酵母细胞内的糖基化类型 |
| 7.2 糖基化对蛋白的影响 |
| 7.3 毕赤酵母的糖基化的特点 |
| 7.4 毕赤酵母糖基化的缺点与现况 |
| 8 信号肽的发展与结构 |
| 8.1 信号肽假说 |
| 8.2 毕赤酵母信号肽分泌方式 |
| 8.3 毕赤酵母常用信号肽的类型 |
| 8.4 毕赤酵母常用信号肽的可能影响因素 |
| 8.5 毕赤酵母常用信号肽存在的一些问题 |
| 9 毕赤酵母表达系统的缺点 |
| 10 本研究的目的和意义 |
| 第一章 实验材料与方法 |
| 第一节 实验材料 |
| 1.1.1 菌株与质粒 |
| 1.1.2 常用的培养基 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要仪器及试剂盒 |
| 1.1.5 寡聚核苷酸引物 |
| 1.1.6 重组质粒列表 |
| 1.1.7 重组菌株列表 |
| 第二节 实验方法 |
| 1.2.1 质粒的转化 |
| 1.2.2 质粒DNA的提取 |
| 1.2.3 PCR反应 |
| 1.2.4 RT PCR和Realtime PCR |
| 1.2.5 点突变PCR |
| 1.2.6 酶切反应 |
| 1.2.7 连接反应 |
| 1.2.8 载体重组反应 |
| 1.2.9 酵母感受态细胞的制备 |
| 1.2.10 毕赤酵母的电转化 |
| 1.2.11 酵母细胞诱导培养与胞外蛋白收获 |
| 1.2.12 酵母胞内蛋白提取 |
| 1.2.13 酵母基因组提取 |
| 1.2.14 酵母RNA提取 |
| 1.2.15 WESTERN-BOLT |
| 第二章 实验结果 |
| 2.1 报告体系在毕赤酵母中的构建 |
| 2.2 K.pastoris和 K.phaffii的 α-factor信号肽在毕赤酵母中表达量低 |
| 2.3 GS115_(K.pa)-EGFP和 GS115_(K.ph)-EGFP菌株的低表达不是由于外源蛋白大量胞内滞留引起 |
| 2.4 GS115_(K.pa)-EGFP和 GS115_(K.pa)-EGFP菌株的低表达不是因为蛋白酶体降解增加引起 |
| 2.5 GS115_(K.pa)-EGFP和 GS115_(K.pa)-EGFP菌株的低表达不是由于基因拷贝数、转录水平低以及密码子偏好而引起 |
| 2.6 S.cerevisiaeα-factor信号肽N-糖基化有助于提高报告蛋白EGFP的分泌表达 |
| 2.7 S.cerevisiaeα-factor信号肽N-糖基化的位置和数量不影响EGFP的分泌表达 |
| 2.8 向K.pastoris和 K.phaffiiα-factor信号肽引入N-糖基化位点能有效提高EGFP分泌表达 |
| 2.9 引入N-糖基化的K.pastoris和 K.phaffiiα-factor信号肽表达量提高不是由于蛋白胞内滞留、基因组整合拷贝数和转录水平的变化而引起 |
| 第三章 分析与讨论 |
| 3.1 EGFP适合在毕赤酵母中作为研究分泌效率的报告蛋白 |
| 3.2 信号肽对外源蛋白分泌表达的影响 |
| 3.3 糖基化对外源蛋白分泌表达的影响 |
| 3.4 造成K.pastoris和 K.phaffii信号肽低表达可能的原因 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）毕赤酵母工程菌产植酸酶的发酵优化及放大（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 植酸酶的研究进展 |
| 1.1.1 植酸的简介 |
| 1.1.2 植酸酶的简介 |
| 1.1.3 植酸酶的分类 |
| 1.1.4 植酸酶的结构 |
| 1.1.5 植酸酶的理化性质 |
| 1.2 微生物植酸酶的研究进展 |
| 1.2.1 微生物植酸酶的来源 |
| 1.2.2 微生物植酸酶的生产 |
| 1.3 植酸酶的应用 |
| 1.3.1 植酸酶在食品工业中的应用 |
| 1.3.2 植酸酶在饲料中的应用 |
| 1.4 毕赤酵母表达系统研究进展 |
| 1.4.1 毕赤酵母表达系统简介 |
| 1.4.2 毕赤酵母的生物学特性 |
| 1.4.3 毕赤酵母的遗传学特性 |
| 1.5 影响毕赤酵母发酵的因素 |
| 1.5.1 培养基 |
| 1.5.2 温度 |
| 1.5.3 pH值 |
| 1.5.4 溶氧量 |
| 1.5.5 甲醇 |
| 1.6 本课题研究的意义与主要内容 |
| 1.6.1 本课题研究的意义 |
| 1.6.2 本课题研究的内容 |
| 第二章 赤酵母工程菌产植酸酶的摇瓶发酵工艺优化 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与设备 |
| 2.2.1 实验菌种 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 主要仪器与设备 |
| 2.2.4 培养基及溶液 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.0 培养方法 |
| 2.3.1 菌体浓度测定方法 |
| 2.3.2 植酸酶酶活测定方法 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 诱导时间对毕赤酵母工程菌生长和产酶的影响 |
| 2.4.2 诱导初始pH对毕赤酵母工程菌生长和产酶的影响 |
| 2.4.3 诱导温度对毕赤酵母工程菌生长和产酶的影响 |
| 2.4.4 装液量对毕赤酵母工程菌生长和产酶的影响 |
| 2.4.5 甲醇添加量对毕赤酵母工程菌生长和产酶的影响 |
| 2.4.6 混合补料对毕赤酵母工程菌GAY生长和产酶的影响 |
| 2.4.7 毕赤酵母工程菌产植酸酶摇瓶水平优化前后的对比 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 毕赤酵母工程菌产植酸酶的高密度发酵工艺优化 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与设备 |
| 3.2.1 实验菌种 |
| 3.2.2 主要试剂 |
| 3.2.3 主要仪器与设备 |
| 3.2.4 培养基及溶液 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 培养方法 |
| 3.3.2 菌体浓度测定方法 |
| 3.3.3 植酸酶酶活测定方法 |
| 3.3.4 SDS-PAGE分析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 3L罐水平毕赤酵母工程菌产植酸酶发酵放大 |
| 3.4.2 15L罐水平毕赤酵母产植酸酶发酵放大 |
| 3.4.3 15L罐水平毕赤酵母产植酸酶甲醇流加速率的优化 |
| 3.5 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 结论 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（7）球孢白僵菌Endothiapepsin-like蛋白的毕赤酵母表达及酶活性的检测（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 球孢白僵菌的简介 |
| 1.1.1 球孢白僵菌的生物学特性 |
| 1.1.2 球孢白僵菌的应用 |
| 1.1.3 球孢白僵菌的致病机理 |
| 1.2 球孢白僵菌蛋白酶的研究简介 |
| 1.2.1 蛋白酶在球孢白僵菌侵染过程中的作用 |
| 1.2.2 天冬氨酸蛋白酶概述 |
| 1.2.3 Endothiapepsin蛋白概述 |
| 1.3 巴斯德毕赤酵母表达系统 |
| 1.3.1 巴斯德毕赤酵母表达系统简介 |
| 1.3.2 巴斯德毕赤酵母表达系统的组成 |
| 1.3.3 影响外源蛋白表达的因素 |
| 第2章 引言 |
| 2.1 研究背景和意义 |
| 2.2 研究内容 |
| 2.3 技术路线 |
| 第3章 BbeapA基因(无信号肽)的克隆及生物信息学分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验菌株与载体 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 实验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 球孢白僵菌GXsk1011 的培养 |
| 3.2.2 球孢白僵菌GXsk1011 RNA的提取 |
| 3.2.3 RNA反转录c DNA第一链的合成 |
| 3.2.4 目的基因的克隆 |
| 3.2.5 生物信息学分析 |
| 3.3 结果分析 |
| 3.3.1 BbeapA基因(无信号肽)的克隆 |
| 3.3.2 阳性克隆的初步筛选及测序验证 |
| 3.3.3 生物信息学分析 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 第4章 重组Endothiapepsin-like蛋白在毕赤酵母中表达 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 菌株与载体 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 质粒的提取 |
| 4.2.2 基因BbeapA与 pPIC9K、pPICZαA载体的酶切和连接 |
| 4.2.3 连接产物转化大肠杆菌DH5α |
| 4.2.4 阳性克隆的筛选与鉴定 |
| 4.2.5 质粒的提取及线性化 |
| 4.2.6 毕赤酵母感受态细胞的制备 |
| 4.2.7 电穿孔转化GS |
| 4.2.8 转化子的筛选鉴定 |
| 4.2.9 高表达菌株的筛选 |
| 4.2.10 高表达菌株的鉴定 |
| 4.2.11 Endothiapepsin-like蛋白在毕赤酵母中的表达 |
| 4.2.12 发酵上清蛋白电泳及检测 |
| 4.2.13 Western Blotting检测 |
| 4.2.14 Ni-NTA亲和层析纯化目的蛋白 |
| 4.3 结果分析 |
| 4.3.1 表达质粒的构建和验证 |
| 4.3.2 重组酵母菌株的构建与筛选 |
| 4.3.3 高拷贝菌株的筛选 |
| 4.3.4 阳性克隆测序鉴定 |
| 4.3.5 发酵上清SDS-PAGE检测 |
| 4.3.6 发酵时间的确定 |
| 4.3.7 Western Blotting的检测 |
| 4.3.8 Ni-NTA纯化目的蛋白 |
| 4.4 小结与讨论 |
| 第5章 重组Endothiapepsin-like蛋白的活性检测 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 试验昆虫 |
| 5.1.2 实验试剂 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 天冬氨酸蛋白酶活力的测定 |
| 5.2.2 重组Endothiapepsin-like蛋白对家蚕体壁蛋白质的降解 |
| 5.2.3 重组Endothiapepsin-like蛋白对家蚕表皮降解的扫描电镜观察 |
| 5.3 结果分析 |
| 5.3.1 天冬氨酸蛋白酶活性的测定 |
| 5.3.2 重组Endothiapepsin-like蛋白对家蚕体壁蛋白质的降解 |
| 5.3.3 重组Endothiapepsin-like蛋白对家蚕体壁降解的扫描电镜观察 |
| 5.4 小结与讨论 |
| 第6章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 发表论文及参加的科研项目 |
（8）甘油抑制巴斯德毕赤酵母PAOX1机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩写词对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 巴斯德毕赤酵母表达系统 |
| 1.2.1 巴斯德毕赤酵母表达系统简介 |
| 1.2.2 巴斯德毕赤酵母表达系统优势 |
| 1.2.3 巴斯德毕赤酵母主要缺陷 |
| 1.3 巴斯德毕赤酵母碳源阻遏机制研究 |
| 1.3.1 碳源阻遏现象 |
| 1.3.2 巴斯德毕赤酵母葡萄糖抑制信号通路 |
| 1.3.3 巴斯德毕赤酵母转录因子研究 |
| 1.4 立题依据及意义 |
| 第二章 巴斯德毕赤酵母中甘油转运体鉴定 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料和方法 |
| 2.2.1 菌株质粒 |
| 2.2.2 培养基 |
| 2.2.3 分子以及化学试剂 |
| 2.2.4 主要仪器 |
| 2.2.5 主要溶液 |
| 2.2.6 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 巴斯德毕赤酵母中甘油转运体(glycerol transporter1,GLT1)生物信息学分析 |
| 2.3.2 甘油转运体Glt1p亚细胞定位载体构建及其亚细胞定位结果 |
| 2.3.3 甘油转运体异源回补实验载体构建及Glt1p蛋白功能验证 |
| 2.3.4 甘油转运体(GLT1)基因敲除盒构建及GLT1基因缺失突变体构建 |
| 2.3.5 GLT1基因缺失突变体以及野生型巴斯德毕赤酵母中AOX1基因mRNA相对表达量测定 |
| 2.3.6 GLT1缺失突变体以及野生型巴斯德毕赤酵母在不同培养基中生长曲线以及Aox1p酶活测定 |
| 2.3.7 Western-blotting测定GLT1缺失突变体以及野生型中Aox1p蛋白表达量 |
| 2.3.8 GLT1缺失突变体以及野生型菌株中甘油代谢速率测定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 Mxr1p和Glt1p在甘油抑制PAOX1途径中相互作用 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.2.1 菌株和质粒 |
| 3.2.2 培养基 |
| 3.2.3 分子以及化学试剂 |
| 3.2.4 主要仪器 |
| 3.2.5 主要溶液 |
| 3.2.6 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 MXR1敲除载体以及缺失突变体构建 |
| 3.3.2 MXR1过表达载体以及菌株构建 |
| 3.3.3 GLT1过表达载体以及菌株构建 |
| 3.3.4 GLT1基因在野生型以及不同突变体中mRNA相对表达量测定 |
| 3.3.5 MXR1基因在野生型以及不同突变体中mRNA相对表达量测定 |
| 3.3.6 AOX1基因在野生型以及不同突变体中mRNA相对表达量测定 |
| 3.3.7 野生型以及不同突变体中Aox1p酶活测定 |
| 3.3.8 Western方法测定Aox1p蛋白在野生型以及不同突变体中蛋白表达量 |
| 3.3.9 野生型以及不同突变体细胞中甘油含量测定 |
| 3.3.10 Mxr1p蛋白表达菌株构建及蛋白纯化 |
| 3.3.11 Mxr150AA蛋白与PGLT1相互作用凝胶迁移率(EMSA)实验 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 甲醇代谢通路中与Mxr1p互作蛋白的挖掘 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料与方法 |
| 4.2.1 菌株及质粒 |
| 4.2.2 培养基 |
| 4.2.3 分子以及化学试剂 |
| 4.2.4 主要仪器 |
| 4.2.5 主要溶液 |
| 4.2.6 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 Mxr150AA表达纯化 |
| 4.3.2 Mxr400AA表达纯化 |
| 4.3.3 Pulldown寻找与Mxr150/400AA蛋白相互作用蛋白 |
| 4.3.4 酵母双杂交BD载体构建 |
| 4.3.5 酵母双杂交AD载体构建 |
| 4.3.6 Mxr150/400AA酵母双杂交结果 |
| 4.3.7 MUT pathway基因在不同碳源条件下转录水平测定 |
| 4.3.8 Mxr1p蛋白与Tkl1p蛋白在甲醛同化进程中功能 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 新型巴斯德毕赤酵母表达系统构建及功能评价 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料与方法 |
| 5.2.1 菌株及质粒 |
| 5.2.2 培养基 |
| 5.2.3 分子以及化学试剂 |
| 5.2.4 主要仪器 |
| 5.2.5 主要溶液 |
| 5.2.6 实验方法 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 Hsap表达载体以及表达菌株构建 |
| 5.3.2 Egfpp表达载体以及表达菌株构建 |
| 5.3.3 △glt1突变体以及野生型巴斯德毕赤酵母Egfpp摇瓶外源蛋白表达 |
| 5.3.4 △glt1突变体以及野生型巴斯德毕赤酵母Hsap摇瓶外源蛋白表达 |
| 5.3.5 △glt1突变体以及野生型巴斯德毕赤酵母Hsap发酵罐外源蛋白表达 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 论文创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
（9）密码子优化对毕赤酵母表达单宁酶酶学性质和构象影响研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 单宁酶的研究进展 |
| 1.1.1 单宁酶的简介 |
| 1.1.2 单宁酶的微生物来源 |
| 1.1.3 单宁酶的酶学性质 |
| 1.1.4 单宁酶的结构特性 |
| 1.1.5 单宁酶的糖基化 |
| 1.1.6 单宁酶的分子生物学研究进展 |
| 1.2 巴斯德毕赤酵母表达系统 |
| 1.2.1 巴斯德毕赤酵母表达系统简介 |
| 1.2.2 巴斯德毕赤酵母表达的影响因素 |
| 1.2.3 密码子优化对外源蛋白在毕赤酵母中的影响 |
| 1.3 本课题的选题依据及研究内容 |
| 1.3.1 课题来源 |
| 1.3.2 选题依据 |
| 1.3.3 研究内容 |
| 1.3.4 创新点 |
| 第2章 米曲霉单宁酶基因的克隆及在毕赤酵母GS115中的表达 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 菌株和质粒 |
| 2.2.2 工具酶及试剂 |
| 2.2.3 引物 |
| 2.2.4 培养基及主要溶液 |
| 2.2.5 主要仪器设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 A.oryzae NCU002单宁酶基因的克隆 |
| 2.3.2 A.oryzae NCU002单宁酶原始基因序列的生物信息分析 |
| 2.3.3 A.oryzae NCU002单宁酶基因序列的密码子优化 |
| 2.3.4 重组表达载体pPICZαC-Tanop和pPICZαC-Tanwt的构建 |
| 2.3.5 重组表达载体pPICZαC-Tanop和pPICZαC-Tanwt的线性化与电转化 |
| 2.3.6 重组毕赤酵母GS115的筛选与PCR鉴定 |
| 2.3.7 重组毕赤酵母GS115/pPICZαC-Tanop和 GS115/pPICZαC-Tanwt的表达 |
| 2.3.8 生物量OD_(600)的测定 |
| 2.3.9 单宁酶酶活力测定 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 米曲霉单宁酶基因的扩增 |
| 2.4.2 米曲霉单宁酶基因的序列分析 |
| 2.4.3 米曲霉单宁酶基因的密码子优化 |
| 2.4.4 重组表达载体pPICZαC-Tanop和 pPICZαC-Tanwt的构建 |
| 2.4.5 重组表达载体pPICZαC-Tanop和 pPICZαC-Tanwt的线性化与电转化 |
| 2.4.6 重组毕赤酵母GS115平板筛选 |
| 2.4.7 重组毕赤酵母GS115的PCR鉴定 |
| 2.4.8 重组毕赤酵母GS115的诱导表达 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 重组毕赤酵母GS115高效表达单宁酶发酵条件优化及单宁酶的分离纯化 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 菌株 |
| 3.2.2 实验主要试剂 |
| 3.2.3 主要溶液 |
| 3.2.4 主要仪器设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 蛋白质浓度的测定 |
| 3.3.2 甲醇浓度对重组单宁酶分泌表达的影响 |
| 3.3.3 不同pH磷酸钾缓冲液对重组单宁酶分泌表达的影响 |
| 3.3.4 接种量OD600对重组单宁酶分泌表达的影响 |
| 3.3.5 诱导温度对重组单宁酶分泌表达的影响 |
| 3.3.6 发酵时间对重组单宁酶分泌表达的影响 |
| 3.3.7 重组单宁酶的分离纯化 |
| 3.3.8 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 蛋白质标准曲线的绘制 |
| 3.4.2 甲醇浓度对重组P.pastoris GS115 分泌表达单宁酶的影响 |
| 3.4.3 不同p H磷酸钾缓冲液对重组P.pastoris GS115 分泌表达单宁酶的影响 |
| 3.4.4 接种量OD600 对重组P.pastoris GS115 分泌表达单宁酶的影响 |
| 3.4.5 诱导温度对重组P.pastoris GS115 分泌表达单宁酶的影响 |
| 3.4.6 发酵时间对重组P.pastoris GS115 分泌表达单宁酶的影响 |
| 3.4.7 重组单宁酶的分离纯化 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 重组单宁酶的酶学性质和构象分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验主要试剂 |
| 4.2.2 主要仪器设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 重组单宁酶的酶学性质分析 |
| 4.3.2 重组单宁酶的构象分析 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 pH值对重组单宁酶活性的影响 |
| 4.4.2 温度对重组单宁酶活性的影响 |
| 4.4.3 金属离子对重组单宁酶活性的影响 |
| 4.4.4 表面活性剂和抑制剂对重组单宁酶活性的影响 |
| 4.4.5 有机试剂对重组单宁酶活性的影响 |
| 4.4.6 重组单宁酶的动力学参数 |
| 4.4.7 重组单宁酶的圆二色谱 |
| 4.4.8 重组单宁酶的傅里叶红外光谱 |
| 4.4.9 重组单宁酶的荧光光谱 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A 米曲霉单宁酶基因比对结果 |
| 附录B 单宁酶基因密码子优化统计分析 |
| 附录C 密码子优化相似性比较 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
（10）猪链球菌噬菌体裂解酶Ply5218功能域解析及体内抗菌活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 猪链球菌研究概况 |
| 1.1.1 猪链球菌2型研究概况 |
| 1.1.2 猪链球菌的耐药性现状 |
| 1.2 猪链球菌噬菌体研究概况 |
| 1.2.1 噬菌体概述 |
| 1.2.2 噬菌体的分类 |
| 1.2.3 噬菌体浸染细菌机制 |
| 1.2.4 猪链球菌噬菌体研究进展 |
| 1.3 噬菌体裂解酶研究概况 |
| 1.3.1 噬菌体裂解酶概况 |
| 1.3.2 猪链球菌裂解酶研究概况 |
| 1.3.3 裂解酶的独特优势及应用发展 |
| 1.4 表达系统研究概况 |
| 1.4.1 重组蛋白表达系统比较 |
| 1.4.2 酵母表达系统 |
| 1.4.3 巴斯德毕赤酵母表达系统的优点 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 第二章 裂解酶PLY5218治疗仔猪猪链球菌2型感染研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株和质粒 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 重组质粒转化到表达菌BL21 |
| 2.2.2 Ply5218蛋白的表达及纯化 |
| 2.2.3 裂解酶的安全性评估 |
| 2.2.4 仔猪感染链球菌HA801治疗方案 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 重组质粒转化到表达菌BL21 |
| 2.3.2 Ply5218蛋白的表达及纯化 |
| 2.3.3 裂解酶的安全性评估 |
| 2.3.4 仔猪感染链球菌HA801治疗方案 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 裂解酶PLY5218的真核表达及活性研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 菌株及载体 |
| 3.1.2 主要试剂和酶 |
| 3.1.3 实验动物 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 Ply5218密码子优化 |
| 3.2.2 酵母感受态细胞的制作 |
| 3.2.3 Ply5218表达菌株的构建 |
| 3.2.4 裂解酶Ply5218真核表达及活性初筛 |
| 3.2.5 诱导条件的优化 |
| 3.2.6 蛋白的纯化 |
| 3.2.7 酶活性的测定 |
| 3.2.8 确定HA9801攻毒量 |
| 3.2.9 ICR小鼠治疗实验 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 Ply5218密码子优化 |
| 3.3.2 酵母感受态细胞的制作 |
| 3.3.3 Ply5218表达菌株的构建 |
| 3.3.4 裂解酶Ply5218真核表达及活性初筛 |
| 3.3.5 诱导条件的优化 |
| 3.3.6 蛋白的纯化 |
| 3.3.7 酶活性的测定 |
| 3.3.8 确定HA9801攻毒量 |
| 3.3.9 ICR小鼠治疗实验 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 PLY5218活性域及关键氨基酸位点的鉴定 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 目的基因的分段截短及表达菌株的构建 |
| 4.2.2 截短片段的表达及活性检测 |
| 4.2.3 关键氨基酸位点的选择与突变 |
| 4.2.4 突变体表达质粒的构建、表达及活性检测 |
| 4.2.5 裂解酶Ply5218与突变蛋白的活性比较 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 目的基因的分段截短及表达菌株的构建 |
| 4.3.2 截短片段的表达及活性检测 |
| 4.3.3 关键氨基酸位点的选择与突变 |
| 4.3.4 突变株表达质粒的构建,表达及活性检测 |
| 4.3.5 裂解酶Ply5218与突变蛋白的活性比较 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 试剂配制 |
| 致谢 |
| 本研究受以下项目资助 |
| 攻读硕士学位期间已发表或录用的论文 |
四、巴斯德毕赤酵母表达系统（论文参考文献）
- [1]不同碳源对毕赤酵母生长代谢与自噬的影响[D]. 陆文怡. 江南大学, 2020(01)
- [2]基于理性设计和基因剂量效应提高米根霉脂肪酶基因ROL的表达水平[D]. 张奕昀. 武汉轻工大学, 2020(06)
- [3]反刍动物胃溶菌酶的重组表达、发酵参数优化、纯化及抗菌机制研究[D]. 刘毓均. 西南民族大学, 2020(03)
- [4]非常规酵母的分子遗传学及合成生物学研究进展[J]. 赵禹,赵雅坤,刘士琦,李建,李圣龙,肖冬光,于爱群. 微生物学报, 2020(08)
- [5]α-factor信号肽及其N-糖基化修饰对毕赤酵母外源蛋白分泌的影响[D]. 吴静雯. 福建师范大学, 2019(12)
- [6]毕赤酵母工程菌产植酸酶的发酵优化及放大[D]. 王旺. 华南理工大学, 2019(06)
- [7]球孢白僵菌Endothiapepsin-like蛋白的毕赤酵母表达及酶活性的检测[D]. 张宝玲. 西南大学, 2019(01)
- [8]甘油抑制巴斯德毕赤酵母PAOX1机制研究[D]. 战春君. 江南大学, 2018(04)
- [9]密码子优化对毕赤酵母表达单宁酶酶学性质和构象影响研究[D]. 王少曼. 南昌大学, 2018(02)
- [10]猪链球菌噬菌体裂解酶Ply5218功能域解析及体内抗菌活性研究[D]. 刘洋. 上海交通大学, 2018(01)