细胞毒淋巴细胞浸润与鼻咽癌细胞凋亡关系的研究

细胞毒淋巴细胞浸润与鼻咽癌细胞凋亡关系的研究

一、细胞毒淋巴细胞浸润与鼻咽癌细胞凋亡关系的探讨(论文文献综述)

赵爽[1](2021)在《基于转录组测序分析的鼻咽癌相关EB病毒变异亚型及预后模型的研究》文中指出背景:EB病毒(Epstein-Barrvirus,EBV)广泛感染人类,引发多种疾病包括恶性肿瘤,其中与鼻咽癌发病密切相关——在约98%的鼻咽癌患者的肿瘤组织中,可以检测到EBV的核酸。目前,已有多种EBV毒株的基因序列发表,不同肿瘤来源的EBV毒株携带不同的基因变异。EBV的变异可能在其致瘤过程中发挥作用,从而影响特定类型肿瘤的生物学行为。然而,对与鼻咽癌相关的EBV基因变异尚缺乏系统性研究。鼻咽癌是一种具有高度侵袭性和转移性的恶性肿瘤,目前,TNM分期系统是鼻咽癌治疗决策和预后评估的主要依据。然而,该系统对于评估鼻咽癌预后的价值有限,已经不能完全满足临床需求。目的:这一博士学位课题的研究工作基于转录组测序数据分析,目的有二,①发现、鉴定与鼻咽癌相关的EBV基因变异,解析不同EBV亚型与鼻咽癌临床特征的关系,初步揭示鼻咽癌相关EBV基因变异的生物学功能。②筛选、构建鼻咽癌预后分子模型。方法:本项研究共纳入两组鼻咽癌患者;第一组67个病例,主要参加转录组测序及相关分析;第二组32个病例,主要参加EBV基因变异的验证分析。此两组鼻咽癌病例互为独立样本。针对第一组67例鼻咽癌患者的肿瘤和癌旁组织进行转录组测序。对测序数据进行生物信息学分析,从中发现鼻咽癌相关EBV的基因变异。采用RNA原位杂交技术BaseScope联合免疫组化共染色的方法,在第二组32例鼻咽癌组织样本中对测序发现的EBV基因变异进行验证。将上述在鼻咽癌中发现、鉴定的EBV变异位点,与公共数据中非鼻咽癌来源的EBV序列进行聚类分析;从中找出鼻咽癌相关的EBV亚型,并分析不同病毒亚型与鼻咽癌患者临床特征及预后的关系。另外,采用常规细胞分子生物学方法,建立稳定表达上述EBV变异基因的鼻咽癌细胞株,通过体外实验探索鼻咽癌相关EBV变异基因的基本生物学功能。构建鼻咽癌预后分子模型的工作,从第一组参加转录组测序的67例鼻咽癌患者之中选择随访信息完善的60例入组,分为“复发转移组”和“非复发转移组”两组。通过对测序数据的分析,采用随机森林和极限梯度提升的机器学习方法,筛选出宿主的与鼻咽癌预后相关的特征基因。基于这一组特征基因,进一步采用Cox 比例风险回归模型构建鼻咽癌预后模型。继而采用GSEA和相关性分析,评价该模型的医学生物学功能。结果:①转录组测序结果显示,入组的鼻咽癌组织中存在EBV基因变异。其中,EBER2和LMP2基因具有最高的变异频率,分别在65/66和64/66例鼻咽癌组织中被检测到。②采用BaseScope和免疫组化共染技术,在独立样本32个鼻咽癌病例中以单细胞原位的方式验证了测序检出的EBER2的变异;并且证明携带病毒变异的细胞为肿瘤(上皮)细胞,而不是肿瘤组织中的浸润免疫细胞,由此明确了 EBV变异活跃转录的组织细胞来源。③根据EBER2的变异位点,将测序获得的EBV序列与已发表的EBV序列进行聚类分析,可将EBV分为两种亚型:EB-1和EB-2。其中,根据EBER2 7123位点,可进一步将EB-2细分为A>T和A>G两种亚型。EB-1基因型EBV显着富集于鼻咽癌(卡方检验,p<0.0001);而EB-2亚型富集于中国北方鼻咽癌患者,且与肿瘤T分期相关(卡方检验,p<0.05)。生存分析显示,相较于EB-1亚型和EB-2-A>G,感染EB-2-A>T亚型EBV的患者预后最差(Log-rank,p=0.026)。④结合宿主mRNA表达谱数据进行差异表达基因分析和富集分析发现,EB-1和EB-2亚型参与影响宿主细胞不同的生物学过程。其中,EB-1亚型主要激活“Epithelial mesenchymal transition”,而 EB-2 亚型则主要激活“MYC targets v1”等。⑤针对另一个发生高频率变异的病毒基因LMP2变异的体外实验分析发现,相较于对照组,变异的LMP2B有显着促进鼻咽癌细胞增殖、迁移,抑制凋亡的作用。构建鼻咽癌预后分子模型的工作,对于转录组测序数据重点关注宿主的基因表达。⑥采用机器学习方法筛选出“复发转移组”和“非复发转移组”之间的特征基因,共 13 个:CES4A、GIMAP1.GIMAP5、GLB1L、LGR5、LOC730098、MLF1、MTHFD1L、MYLPF、NUP160、SIRPB1、TCN2、TMEM265、U2AF1L5。⑦基于这些特征基因构建Cox风险比例模型,得到一个4-mRNA signature,包括U2AF1L5、TMEM265、GLB1L和MLF1基因。根据这一模型计算每个患者的风险评分,并将患者分为高风险组和低风险组。⑧Kapan-Meier生存曲线和ROC曲线分析显示,这一预后模型能较好地评估鼻咽癌患者的预后,高风险组患者预后显着差于低风险组(Log-Rank,总生存:p=0.00126,无病生存:p=0.000059)。这一 4-mRNA signature在评估患者总生存以及无病生存的效果(AUC分别为0.893和0.86,)优于T分期(AUC为0.619和0.538)及N分期(AUC:0.582和0.622)。⑨多因素Cox分析结果显示,风险评分是鼻咽癌的独立预后因素(总生存,HR=14.501,p=0.012,无病生存:HR=13.752,p<0.001)。⑩GSEA 富集分析发现 4-mRNA signature 与细胞增殖和宿主免疫应答密切相关。结论:鼻咽癌组织中存在EBV基因变异。其中EBER2和LMP2基因具有最高的变异频率。鼻咽癌组织内发生基因变异的EBV存在于肿瘤细胞而非浸润免疫细胞中。根据EBER2的变异模式,可将EBV分为两种亚型:EB-1和EB-2;它们与鼻咽癌患者的临床特征、预后相关,并可能与宿主发生不同的相互作用。通过对转录组数据的分析挖掘,构建了包含4个基因的4-mRNA signature模型,可用于鼻咽癌预后评估。

蔡曌[2](2021)在《1、DNA拷贝数异常改变作为膀胱癌预后判断相关分子标志物的研究 2、EB病毒相关上皮性恶性肿瘤中病毒miRNA与宿主相互作用的分子机制及其意义》文中研究表明这一博士学位课题由相对独立的两部分研究工作构成。第一章DNA拷贝数异常改变作为膀胱癌预后判断相关分子标志物的研究膀胱癌的高复发率为患者带来了长期的身体和经济负担。目前对于膀胱癌的诊断已有多种基于不同技术平台的生物标志物,然而,对于患者复发风险的评估和预测还较少有相关标志物的报道。尽管在膀胱癌肿瘤的发生发展过程中存在大量基因组序列的改变,但目前对于膀胱癌肿瘤预后风险评估还尚未有获得广泛认可的生物标志物可供临床使用。本项研究旨在膀胱癌组织和尿液中探索与膀胱癌患者预后相关的分子标志物,评估其在患者预后评估中的临床应用价值。本实验室前期工作中对65例膀胱癌肿瘤组织DNA进行了基于芯片的比较基因组杂交实验,发现并通过real-time PCR验证了在膀胱癌组织中高频出现的5个高频拷贝数变异的基因CEP63、FOSL2、GHR、PAQR6、ZFAND3。本项研究对候选的5个拷贝数高频变异的基因在219例于中国医学科学院肿瘤医院初治的膀胱癌患者手术切除的新鲜肿瘤组织样本和123例初治膀胱癌患者术前尿沉渣脱落细胞样本中的拷贝数变异与患者临床特征的相关性进行了进一步分析。为分析候选拷贝数变异与患者预后的相关性,研究中对所有入组患者均开展了术后随访,获得其无瘤生存期。研究应用Kaplan-Meier生存曲线、Cox风险比例回归、Logestic线性回归分析候选拷贝数变异与患者肿瘤复发风险的关系,并分别对非肌层浸润性和肌层浸润性膀胱癌构建了预后预测模型。为提高在尿液中检测拷贝数变异的准确性,研究中采用了高灵敏的3D数字PCR技术,并运用受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC 曲线)比较了 real-time PCR 与 3D 数字PCR在尿沉渣脱落细胞中对拷贝数变异基因的检测效能,建立了尿样本中膀胱癌的诊断模型。在5个候选拷贝数变异的基因中,CEP63(p<0.01)、FOSL2(p<0.01)、PAQR6(p<0.01)在219例肿瘤组织中相比于健康人外周血白细胞中的基因拷贝数显着增加。CEP63(p<0.01)和FOSL2(p<0.01)的拷贝数在肌层浸润性膀胱癌肿瘤组织中显着高于非肌层浸润性膀胱癌肿瘤组织。CEP63(p<0.01)和FOSL2(p=0.047)的拷贝数在高级别肿瘤中显着高于低级别肿瘤。在发生淋巴结转移患者的肿瘤组织中CEP63的拷贝数显着增加(p<0.01)。研究中对所有病例进行了随访,随访时间为3个月至188个月,中位随访时间为61个月。所有入组患者的5年无瘤生存率为48.3%;10年无瘤生存率为22.7%。基于219例肿瘤组织中CEP63、FOSL2、PAQR6的拷贝数变异,分别对非肌层浸润性膀胱癌患者和肌层浸润性膀胱癌患者进行生存分析,发现CEP63和FOSL2的拷贝数增加是非肌层浸润性膀胱癌的独立预后因素(p<0.05)。FOSL2和PAQR6的拷贝数增加是肌层浸润性膀胱癌的独立预后因素(p<0.05)。基于CEP63、FOSL2的拷贝数变异构建非肌层浸润性膀胱癌的肿瘤复发预测模型计算预后指数(Prognostic Index,PI),预测模型为PI=1.5095×CEP63+1.47123×FOSL2,结果显示,预后指数高的非肌层浸润性膀胱癌患者肿瘤复发风险是预后指数低的患者的3.434倍(p=0.0003)。基于FOSL2和PAQR6拷贝数变异,构建肌层浸润性膀胱癌的肿瘤复发预测模型计算预后指数,预测模型为PI=2.0440×FOSL2+2.2079×PAQR6,结果显示预后指数高的肌层浸润性膀胱癌患者发生肿瘤复发的风险是预后指数低的患者的5.443倍(p=0.0001)。对于基于传统危险分层中的高风险非肌层浸润性膀胱癌患者,生存分析结果显示,预后指数高的患者无瘤生存期更短(p=0.00056)。在膀胱癌患者尿沉渣脱落细胞中CEP63(p=0.036)与FOSL2(p<0.01)的拷贝数相比于正常对照尿沉渣脱落细胞样本显着增加。应用3D数字PCR检测,发现肌层浸润性膀胱癌尿沉渣脱落细胞样本中CEP63(p<0.01)与FOSL2(p=0.046)的拷贝数显着高于非肌层浸润性膀胱癌样本,CEP63的拷贝数在发生淋巴结转移的膀胱癌患者中显着增加(p=0.042)。生存分析结果显示非肌层浸润性膀胱癌患者尿沉渣脱落细胞中CEP63的拷贝数增加(p<0.01)或FOSL2的拷贝数增加(p=0.018)预示着更大的肿瘤复发风险。基于尿样本中CEP63、FOSL2的拷贝数变异在训练集(n=41)中构建非肌层浸润性膀胱癌12个月内发生肿瘤复发的预测模型并在验证集(n=41)中进行验证,预测模型为PIL=-2.679+2.083×CEP63+1.827×FOSL2,结果显示,预后指数高的非肌层浸润性膀胱癌患者12个月内发生肿瘤复发的风险是预后指数低的患者的6.612倍(p=0.002)。ROC曲线分析结果显示3D数字PCR检测尿沉渣脱落细胞样本中CEP63和FOSL2拷贝数变异的曲线下面积分别为0.848和0.803,灵敏度分别为0.750和0.650,阴性预测值分别为0.786和0.708。而real-time PCR检测CEP63和FOSL2拷贝数变异的曲线下面积分别为0.601和0.685,灵敏度分别为0.475和0.425,阴性预测值分别为0.644和0.646。进一步基于3D数字PCR联合尿样本中CEP63与 FOSL2 的拷贝数变异构建膀胱癌患者诊断型:L=-1.817+2.267×CEP63+2.695×FOSL2,该模型的 ROC 曲线下面积为 0.858,灵敏度为85.0%,阴性预测值为83.8%。本项研究发现CEP63、FOSL2、PAQR6在膀胱癌中拷贝数增加,前两者与膀胱癌肿瘤的分期和病理分级显着相关。CEP63、FOSL2的拷贝数变异能够对非肌层浸润性膀胱癌患者的肿瘤复发风险进行评估和预测,FOSL2、PAQR6的拷贝数变异可应用于肌层浸润性膀胱癌患者肿瘤复发的预测。在膀胱癌患者尿样本中CEP63、FOSL2的拷贝数显着增加,并与肿瘤分期相关。尿样本中CEP63和FOSL2拷贝数增加的非肌层浸润性膀胱癌患者1年内发生肿瘤复发风险更高。研究中应用的3D数字PCR相比于real-time PCR检测效能更高,基于3D数字PCR的尿样本诊断模型能够较好的区分膀胱癌与正常人,为未来膀胱癌尿液检测提供了新途径。第二章EB病毒相关上皮性恶性肿瘤中病毒miRNA与宿主相互作用的分子机制及其意义EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)属于疱疹病毒科γ亚科,是双链DNA病毒。EB病毒是人类普遍且长期感染的病毒。在世界人口中大约有95%存在终生的无症状感染。EB病毒参与了人类多种恶性肿瘤的形成,包括Burkitt’s淋巴瘤、鼻咽癌、霍奇金氏淋巴瘤、NK/T细胞淋巴瘤、胃癌等。EB病毒的发现距今已有50余年,但病毒的致癌机制目前仍然尚未清楚。miRNA是基因表达转录后调控的重要因子,在多种复杂的细胞生物学进程,例如细胞发育和分化中扮演着十分重要的作用。越来越多的研究发现某些特定miRNA的负调控作用能够引起多种器官的癌变发生。EB病毒是第一个发现的能够编码miRNA的病毒,已有研究发现部分EB病毒编码的miRNA能够调控宿主基因的表达。但对于其他EB病毒编码的miRNA在癌变过程中的作用机制目前还尚未完全了解。本项研究旨在通过miRNA表达谱芯片和转录组测序分析,构建EB病毒相关上皮性恶性肿瘤即EB病毒相关胃癌和鼻咽癌中病毒miRNA的表达谱,分析病毒miRNA在宿主细胞中对宿主基因表达的调控作用,进而探索病毒miRNA对宿主细胞生物学功能的影响,以及在癌变发生和发展过程中所起到的作用。EB病毒相关胃癌在亚洲胃癌患者中约占6%,需要通过EBER原位杂交检测证实肿瘤组织中存在EB病毒的感染,由于EBER原位杂交尚未作为胃癌患者的常规病理检测项目,受到样本收集难度的限制,以及RNA较容易降解的特性,目前国内还尚未有基于EB病毒相关胃癌新鲜组织的转录组测序分析研究。在本项研究中,我们对8例EB病毒相关胃癌新鲜冻存组织、2株EB病毒相关胃癌细胞系SNU719、YCCEL1和2株EB病毒阴性胃癌细胞系AGS、HGC27进行了miRNA表达谱芯片和转录组测序分析宿主基因、宿主miRNA和EB病毒miRNA的表达情况。通过生物信息学分析,联合公共数据库中38例EB病毒相关胃癌的基因表达数据,探索EB病毒miRNA与宿主miRNA以及宿主基因的关系。为验证数据分析结果,进一步对筛选出的病毒miRNA进行体外细胞功能实验,探索其对胃癌细胞增殖能力、细胞周期以及细胞迁移能力的影响。为了解筛选出的在EB病毒相关胃癌中能够显着影响细胞生物学功能的病毒miRNA在另一种EB病毒相关上皮性恶性肿瘤即鼻咽癌中的作用。我们对33例鼻咽癌新鲜冻存组织进行了转录组测序。并通过体外细胞功能实验探索候选病毒miRNA在鼻咽癌细胞中对细胞增殖能力、细胞周期以及细胞迁移能力的调控作用。在本项研究中,我们通过对miRNA表达谱芯片和转录组测序数据分析获得了 EB病毒相关胃癌中病毒miRNA的表达谱,筛选出在肿瘤组织和EB病毒相关胃癌细胞系中均高表达的4个病毒miRNA。对其进行靶基因预测,我们发现在EB病毒相关胃癌中高表达的4个病毒miRNA靶基因主要富集于细胞迁移、细胞周期调控、细胞间信号转导和DNA复制等重要生物学功能上。而对于肿瘤组织和EB病毒相关胃癌细胞系中宿主miRNA的差异表达分析水平的分析发现,4个宿主miRNA在肿瘤组织与细胞系中的表达水平与EB病毒miRNA的表达成正相关关系,相关系数大于等于0.9。进一步分析这4个宿主miRNA与EB病毒miRNA的序列,发现 EB 病毒 miRNA miR-BARTl-3p 与宿主 miRNA hsa-miR-29a-3p 具有相同的5’端种子区序列;而miR-BART7-3p则与宿主miRNA hsa-miR-154-3p具有相同的5’端种子区序列。由此推测上述病毒miRNA与宿主miRNA的调控功能具有一定的相似性。为进一步探索“EB病毒miRNA-宿主miRNA”关系对中的病毒miRNA与宿主miRNA是否协同作用共同参与调控细胞生物学功能。首先联合TCGA(The Cancer Genome Atlas)数据库中转录组数据和 GEO(Gene Expression Omnibus)数据库中表达谱芯片数据,以及本项研究中的转录组测序数据,分析共计46例EB病毒相关胃癌中肿瘤与癌旁组织的差异宿主基因,结合在EB病毒相关胃癌相比于EB病毒阴性胃癌细胞中差异的宿主基因,以此对“EB病毒miRNA-宿主miRNA”关系对中的病毒miRNA与宿主miRNA的交集靶基因进行筛选,结果显示,在EB病毒相关胃癌肿瘤组织中差异表达,并与EB病毒感染相关的宿主靶基因,其信号通路主要富集于涉及细胞生长、迁移、分化等重要功能的2个信号通路。说明候选的病毒miRNA可能与其相关的宿主miRNA共同参与到对细胞生长、迁移等重要功能的调控中。进一步的体外细胞功能实验也表明了miR-BART1-3p和miR-BART7-3p能够抑制胃癌细胞的增殖和迁移,对细胞的生长起负向调控作用。此外,在另一种EB病毒相关上皮性恶性肿瘤,鼻咽癌中,我们也构建了 EB病毒miRNA的表达谱,与EB病毒相关胃癌不同的是,miR-BART1-3p在鼻咽癌中的表达水平较低而miR-BART7-3p在鼻咽癌中的表达水平也仅处于中等。但通过体外细胞功能实验,我们发现miR-BART7-3p在鼻咽癌细胞中,仍具有对细胞增殖和迁移功能的抑制作用。在上述研究中,我们构建了 EB病毒相关胃癌和鼻咽癌中病毒miRNA的表达谱。通过生物信息学分析获得了具有相同种子区序列的病毒和宿主miRNA,两者共同参与了涉及细胞增殖、迁移、分化等重要生物学功能的信号通路调控。体外细胞实验结果表明了病毒miRNA对于胃癌和鼻咽癌细胞在增殖、细胞周期和细胞迁移能力的抑制作用。本项研究对病毒miRNA miR-BART1-3p和miR-BART7-3p在胃癌细胞中的作用及其可能的机制进行探索,发现了miR-BART7-3p在两种EB病毒相关恶性肿瘤中具有相似的生物学功能,研究从新的视角提供了 EB病毒影响肿瘤进展的可能机制,有助于促进对于上皮性恶性肿瘤中EB病毒感染在癌变中作用的理解。

王文平[3](2021)在《重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的毒性评价及重楼皂苷Ⅰ的肝毒性机制探究》文中提出研究目的:药源性肝损伤是一项严重的公共卫生问题,据调查统计,我国药源性肝损伤的发病率逐年升高;重楼是一种临床常用中药,因其抗肿瘤活性日益受到重视。重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ是重楼中3种重要的皂苷类成分,越来越多的研究和报道显示其对多种肿瘤细胞均具有杀伤作用。但重楼在抗肿瘤作用的同时毒副作用研究较少,尤其是其单体类成分。本研究围绕重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的潜在毒性及其作用机制进行深入的探索。以期为中药重楼的临床合理应用以及基于重楼皂苷单体的药物研发提供借鉴和参考。研究方法:(1)从细胞、模式生物-斑马鱼、动物3个层面进行了重楼皂苷单体的毒性评价。首先选择了 9种细胞考察了重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的细胞毒性情况,包括3种肝细胞(HepaRG、HL-7702和WRL-68细胞),3种肾细胞(HK-2、HKC和293T细胞)和3种心脏细胞(H9c2、HUVEC和HCMEC细胞);利用模式生物-斑马鱼模型考察不同浓度重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ对斑马鱼生存率的影响,确定了 LC50、LC10与最大非致死浓度(MNLC);体视荧光显微镜观察重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ给药前后肝脏、肾脏和心脏的形态,统计斑马鱼的肾脏水肿率、心率和心包水肿率。利用Image-Pro Plus 5.1.0软件统计给予重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ前后斑马鱼肝脏面积和荧光强度、肾脏面积和荧光强度、心脏SV-BA距离,评价重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的潜在肝、肾、心毒性;通过HE染色和TUNEL染色观察斑马鱼给药前后肝组织病理情况及肝细胞凋亡情况;通过小鼠的急性毒性实验,得出LC50值。然后进行小鼠血清生化检测和组织病理切片分析。各个层面数据相互支持,补充验证,使研究基础更加全面可靠,结论更加合理。(2)选用HepaRG细胞研究重楼皂苷Ⅰ的肝细胞毒性机制。利用酶标仪、流式细胞仪、倒置荧光显微镜等对HepaRG细胞乳酸脱氢酶(LDH)释放、DAPI染色、活性氧(ROS)、线粒体膜电位(MMP)、细胞凋亡及细胞周期等进行测定,利用Western blot对凋亡相关蛋白进行检测;选用HUVEC细胞研究重楼皂苷Ⅰ的心血管毒性机制。从抑制新血管生成和促进心血管细胞凋亡两个方面评价了重楼皂苷Ⅰ的血管毒性机制。进行了LDH释放、细胞迁移、细胞凋亡、DAPI染色、细胞周期以及体外血管生成等研究,测定了近30个相关蛋白的表达。(3)利用TMT标记定量蛋白质组学技术检测给药组和对照组小鼠肝脏组织中的差异蛋白,对差异蛋白进行GO及Pathway通路富集分析;利用STRING11.0构建蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络;采用IPA软件进一步筛选出与表型相关的潜在生物标志物;利用Q300靶向代谢组学技术研究给药组和对照组小鼠血清样本中内源性代谢物的变化情况。采用PCA、OPLS-DA等分析小鼠内源性代谢物的轮廓变化。比较给药前后小鼠血清样本代谢谱的差异,寻找与重楼皂苷Ⅰ致肝毒性相关的代谢差异物及代谢调控网络。使用Cytoscape对蛋白组学和代谢组学做关联分析。采用PCR和Western blot技术对肝毒性机制中的关键蛋白进行进一步的验证。研究结果:(1)重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ毒性实验结果:重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ均具有明显的细胞毒性,能显着的促进H9c2细胞外其余8种细胞的凋亡,且呈现浓度和时间依赖性。对于H9c2细胞,3种皂苷均呈现出低剂量促进增殖,高剂量抑制增殖的作用;斑马鱼实验结果:重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ对斑马鱼的LC50分别为121、213、570 ng/mL,LC10分别为109、178、456ng/mL,MNLC分别为99、146、357ng/mL;毒性器官评价方面,重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ对斑马鱼具有显着的肝脏毒性,能明显降低斑马鱼肝脏面积和荧光强度;重楼皂苷Ⅰ能显着影响斑马鱼的心率,提示其具有心血管毒性;重楼皂苷Ⅰ和Ⅶ能降低斑马鱼肾脏面积和荧光强度,具有一定的肾毒性,但3种皂苷均未造成肾水肿;斑马鱼病理切片显示重楼皂苷Ⅰ给药组的肝组织出现空泡和严重的肝细胞坏死;TUNEL染色结果显示重楼皂苷Ⅰ给药组出现了肝细胞凋亡;动物实验结果:小鼠体内实验发现,重楼皂苷Ⅰ具有体内毒性,其LC50为24.5 mg/kg;给药组血清中ALT、AST显着升高,SOD降低;给药组病理切片显示出显着的肝细胞损伤和脂肪样变性以及一定的心脏毒性。(2)重楼皂苷Ⅰ肝细胞毒性机制:重楼皂苷Ⅰ显着升高了 HepaRG细胞中ROS水平,引起MMP下降,Cyt c从线粒体向胞浆中释放,早期及晚期凋亡细胞增多,LDH的释放量升高。改变了周期蛋白P21、cyclinA、cyclinE和CDK2的表达,诱导细胞周期阻滞。并且明显激活了凋亡通路蛋白Fas、P53、caspase-3、caspase-8、caspase-9的表达,且呈现剂量依赖关系;重楼皂苷Ⅰ血管毒性机制:重楼皂苷Ⅰ显着促进了心血管细胞LDH的释放,抑制细胞迁移和血管生成,改变周期分布,诱导细胞凋亡。给药后的细胞中VEGFR2、p-VEGFR2、Src、p-Src、PI3K、Src、P38、PLCy 等近 30 种蛋白的表达均发生了改变。(3)蛋白组学结果:共筛选出302个差异蛋白,其中上调蛋白182个,下调蛋白120个。差异蛋白具有氧化还原酶活性、催化活性等分子功能,参与了脂肪酸代谢、有机酸的代谢、药物代谢、氧化还原过程等生物过程。主要分布在细胞质和细胞内膜结合细胞器包括线粒体、内质网等;Pathway结果显示,差异蛋白在细胞色素P450酶对药物的代谢、细胞色素P450对外源物质的代谢、过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPARγ)等途径上富集程度较高;PPI网络分析发现差异蛋白主要聚集在三个功能区域,包括细胞色素P450酶、脂质代谢过程、氧化还原过程;IPA商业数据库筛选出9个与肝毒性相关的差异蛋白作为潜在生物标志物;代谢组学结果:给药组代谢物轮廓明显偏离对照组;通过多维和单维的差异代谢物的交集,筛选并初步鉴定出97种差异代谢物,25条代谢通路。结果归纳显示重楼皂苷Ⅰ造成了体内5个方面的代谢异常,包括氨基酸代谢、脂肪酸代谢、谷胱甘肽代谢、能量代谢、蛋白质合成;其中D-谷氨酰胺与D-谷氨酸代谢,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢,花生四烯酸代谢,氨酰tRNA生物合成等代谢通路影响值相对较高;代表性差异代谢物为花生四烯酸、焦谷氨酸、乙醇酸、酰基肉碱等。对全文中研究的重楼皂苷Ⅰ的肝毒性情况进行了综合分析,总结并推测了重楼皂苷Ⅰ造成肝毒性的机制。采用qPCR及Western blot验证了关键蛋白Bax、CYP1A2、P53、Fas的表达,对推测的肝损伤机制进行了初步验证。研究结论:(1)细胞实验研究发现重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ均具有肝脏、肾脏、心血管细胞毒性;斑马鱼实验研究确定了 3种皂苷中毒性最强的为重楼皂苷Ⅰ,毒性最明确的毒性靶部位是肝脏和心血管;斑马鱼肝脏病理切片、TUNEL染色,小鼠生化指标、病理切片检测进一步验证了重楼皂苷Ⅰ的肝脏和心脏毒性;(2)重楼皂苷Ⅰ肝细胞毒性机制为ROS应激通路和死亡受体通路介导的细胞凋亡;心血管毒性主要作用通路为VEGFR2激活的下游PI3K/AKT/mTOR、Src/eNOS、PLCy/ERK/MEK、P38信号通路,JAK2/STAT3信号传导通路和Bcl-2家族介导的凋亡通路,从诱导心血管细胞凋亡和抑制新生血管两方面产生心血管毒性。(3)蛋白质组学和代谢组学实验结果结合全文数据推测重楼皂苷Ⅰ诱导的肝毒性机制可能为CYP450酶和脂质代谢介导的线粒体功能障碍为主体的肝细胞损伤。药物影响了:①多种CYP450酶。主要包括Ⅰ相代谢酶CYP1A1、CYP1A2和Ⅱ相代谢酶GSTA3和UGT1A1表达紊乱,呈现下调趋势。药物在体内的水解、代谢过程被减慢,随着作用时间的延长,药物毒性反应增加。未被代谢的药物作用可能作用于线粒体,造成线粒体功能障碍;也很有可能是Ⅱ相药物代谢酶下调,产生的毒性代谢中间产物作用于线粒体,进一步产生了肝脏毒性;②脂质代谢。线粒体损伤后β-氧化的功能受到影响,体内的游离脂肪酸不能被氧化而转化成甘油三脂,导致了体内脂质的蓄积。同时ATP合成减少,供能障碍。脂质蓄积还能产生脂毒性进一步影响线粒体功能,产生过量ROS;③线粒体氧化应激。过量的ROS生成诱导线粒体氧化应激,释放Cyt c,升高Bax,降低Bcl-2,进而激活caspase家族导致肝细胞凋亡。Western blot验证结果显示药物代谢酶CYP1A2显着下调以及凋亡关键蛋白Bax表达上调。qPCR结果显示凋亡相关基因P53、Bax以及Fas的表达均显着上调,验证实验佐证了机制推论的合理性。

霍少芬[4](2020)在《EBV-EBNA1通过募集Treg细胞构建鼻咽癌免疫抑制微环境的机制研究》文中研究说明研究背景及研究目的:鼻咽癌是一种起源于鼻咽上皮并好发于广东地区的恶性肿瘤,EBV感染是鼻咽癌发生、发展过程中的重要病原学因素。EBNA1是EBV编码的核抗原,在EBV基因组的维持、复制、有丝分裂后的EBV基因组分离等方面起着关键作用。EBNA1在所有EBV相关性疾病中均表达,为宿主细胞提供生存能力。然而,EBNA1抗原蛋白在鼻咽癌构建免疫抑制微环境中发挥何种作用?Treg细胞是限制抗肿瘤免疫反应的重要因素,然而Treg细胞是如何募集到鼻咽癌微环境中构建抑制性免疫微环境的机制尚不明确,本课题将就此切入点进行深入探讨。研究方法及研究内容:原位杂交(ISH)检测组织EBER以明确EBV感染;二代测序(NGS)及生物信息学分析筛选EBNA1过表达前后的差异表达基因;qRT-PCR、WB、IHC、transwe11、流式细胞术、裸鼠成瘤实验在体内、体外及患者组织水平验证EBV-EBNA1-TGFβ 1-SMAD3-PI3K-AKT-c-JUN-miR-200a-CXCL12-CXCR4 反馈环路调控Treg细胞向鼻咽癌微环境趋向性迁移;共聚焦共定位分析和Co-IP实验验证SMAD3和c-JUN形成蛋白复合体介导TGF β1信号;ChIP实验和双荧光素酶报告实验验证c-JUN作用于miR-200a启动子;双荧光素酶报告实验还用于验证miR-200a靶向CXCL12 3’UTR;肝癌裸鼠成瘤实验及C57BL/6小鼠成瘤实验验证CXCL12-CXCR4-Treg轴构建抑制性免疫微环境的作用在实体瘤中具有普遍适用性。研究结果:1、EBNA1表达水平与鼻咽癌Treg细胞浸润密度呈正相关关系;EBNA1高表达是鼻咽癌构建免疫抑制微环境和预后不良的重要预测指标。2、EBNA1通过激活TGF β 1-SMAD3通路促进Treg细胞向鼻咽癌微环境迁移。3、EBV-EBNA1-TGF β 1-SMAD3轴通过抑制miR-200a来募集Treg细胞构建鼻咽癌免疫抑制微环境。4、miR-200a直接靶向调控CXCL12 3’UTR区域,并与CXCL12形成CXCL12-miR-200a-CXCL12负性反馈调控环路,共同调节Treg细胞趋向性迁移。5、c-JUN直接靶向抑制miR-200a启动子区域并与CXCL12互为正性调控。EBNA1通过 CXCL12-PI3K-AKT-c-JUN-miR-200a-CXCL12反馈调控环路调节 Treg 细胞募集,构建以Treg细胞介导的免疫抑制微环境。6、TGFβ 1通过促进c-JUN表达及增强SMAD3/c-JUN蛋白-蛋白复合体的相互作用程度来抑制miR-200a转录。7、TGF β 1以miR-200a依赖性方式正性调控CXCL12表达及由CXCL12介导的Treg细胞趋向性迁移。8、CXCL12通过上调Treg细胞的CXCR4受体来招募Treg向鼻咽癌微环境富集,且CXCL12-CXCR4-Treg轴在实体瘤免疫抑制微环境的构建中具有普遍适用性。研究结论:EB病毒EBNA1 抗原蛋白通过上调鼻咽癌细胞内部的TGF β1-SMAD3-PI3K-AKT-c-JUN-CXCL12 信号轴及抑制 miR-200a 表达,并诱导 Treg 细胞表面的CXCR4受体表达上调,增强由CXCL12-CXCR4配体受体调控轴介导的趋化作用,从而促进Treg细胞向鼻咽癌微环境迁移,形成了 EBV-EBNA1-TGFβ1-SMAD3-PI3K-AKT-c-JUN-miR-200a-CXCL12-CXCR4-Treg 这种病毒—肿瘤-免疫三位一体的反馈调控机制,构建以Treg细胞介导的免疫抑制微环境,促进鼻咽癌免疫逃逸。本研究创新性:我们发现并证明了 EB病毒如何建立病毒-肿瘤-免疫三位一体的反馈调控机制为鼻咽癌创造免疫抑制微环境,促进鼻咽癌免疫逃逸。

韩艳艳[5](2020)在《PIK3CA基因在鼻咽癌发生发展及放疗抵抗中的作用机制研究》文中提出目的:分析PIK3CA基因在鼻咽癌组织中表达差异及表观遗传学甲基化水平,阐述鼻咽癌组织中PIK3CA表达与鼻咽癌临床恶性表型、预后的关系;探讨PIK3CA表达模式对于鼻咽癌细胞增殖、迁移、侵袭等生物学行为的影响。在此基础上进一步探究PIK3CA上游调控PVT1/mi R-515-5p-PIK3CA轴对鼻咽癌细胞增殖、凋亡和放疗抵抗的作用及其内在调控机制,为揭示鼻咽癌发生发展及放疗抵抗分子机制和个体化治疗靶点的筛选奠定科学基础。方法:第一部分:(1)组织水平,利用免疫组织化学SP染色法检测鼻咽癌及鼻咽正常粘膜组织标本PIK3CA表达水平差异,并分析鼻咽癌组织内PIK3CA表达水平与临床病理参数间的相关性,采用Kaplan-Meier法分析PIK3CA表达水平对鼻咽癌预后的影响;(2)体外细胞水平通过特异性si RNA转染鼻咽癌细胞下调PIK3CA表达,检测PIK3CA表达水平对鼻咽癌细胞增殖、侵袭、迁移等细胞功能的影响;(3)利用焦磷酸盐测序法检测鼻咽癌及正常鼻咽粘膜组织中PIK3CA基因启动子区甲基化水平差异。第二部分:(1)利用star Base生物信息学分析预测PIK3CA和mi R-515-5p之间的潜在靶位点,构建载有mi R-515-5p结合位点PIK3CA 3’UTR的野生型序列插入p GL3载体,采用双荧光素酶报告基因验证mi R-515-5p调控PIK3CA基因表达结合位点,并通过抗Ago2进行RIP检测并分析mi R-515-5p与PIK3CA的相互作用。(2)组织水平利用q RT-PCR法检测鼻咽癌和正常鼻咽粘膜组织中PIK3CA的m RNA表达水平,并在细胞水平采用western blot法分析PIK3CA基因在鼻咽癌细胞系及正常鼻咽粘膜细胞系中蛋白表达差异;并采用western blot法分析mi R-515-5p敲减后的NPC细胞中PIK3CA蛋白表达调控。(3)用CCK8法检测转染PIK3CA+mi R-515-5p的NPC细胞监测细胞增殖趋势。采用细胞克隆形成实验及流式细胞仪分析不同辐照剂量(0、2、4、6、8 Gy)下转染PIK3CA+mi R-515-5p的NPC细胞相较PIK3CA的存活分数及凋亡情况,并通过western blot法检测不同辐照剂量(0和8Gy)下以上两种细胞的细胞周期蛋白D1和Bax的蛋白水平,从而揭示mi R-515-5p调控PIK3CA对鼻咽癌细胞放疗抵抗水平影响。第三部分:(1)组织水平采用q RT-PCR检测NPC和正常组织中PVT1的表达及不同TNM分期的PVT1表达差异,并分析其表达与预后相关性;细胞水平采用q RT-PCR检测正常粘膜细胞系和NPC细胞系中的PVT1水平差异。(2)采用携带sh RNA的慢病毒转染敲减PVT1,通过q RT-PCR验证PVT1的敲减效率;使用CCK8法评估PVT1表达对细胞增殖水平影响。进行细胞克隆形成能力检测、细胞周期蛋白检测、流式细胞仪检测及western blot法,分析鼻咽癌细胞在不同辐照剂量(0,2,4,6,8Gy)下的存活分数、凋亡情况及细胞周期蛋白水平。(3)用star Base预测了PVT1与mi R-515-5p结合位点;采用双荧光素酶报告基因和抗Ago2法进行混合靶点阳性候选基因的单靶点验证。构建慢病毒载体,采用q RT-PCR评估NPC组织和细胞中转染mi R-515-5p和PVT1表达调控关系。(4)采用CCK8法检测转染mi R-515-5p、mi R-515-5p+PVT1的鼻咽癌细胞增殖情况,采用细胞克隆形成实验及流式细胞仪分析不同辐照剂量下(0、2、4、6、8 Gy)转染PVT1+mi R-515-5p的NPC细胞相较PIK3CA的存活分数及凋亡情况,并通过western blot法检测不同辐照剂量下(0和8 Gy),以上两种细胞的细胞周期蛋白D1和Bax的蛋白水平,从而揭示PVI1调控mi R-515-5p对鼻咽癌细胞放疗抵抗水平影响。(5)通过western blot检测转染sh-PVT1、sh-PVT1+Anti-mi R-515-5p的鼻咽癌中PIK3CA、AKT和p-AKT的蛋白质水平,确定PVT1/mi R-515-5p-PIK3CA轴调节关系。(6)为了验证PVT1在体内的功能,通过转染sh-PVT1或sh-Control的C666-1细胞建立异种移植小鼠模型,动态监测瘤体在裸鼠皮下成瘤及生长情况,验证PVT1对鼻咽癌细胞在体内生长的影响。结果:第一部分:(1)PIK3CA蛋白在71例鼻咽癌组织中的表达率为81.69%,高于正常鼻咽粘膜组织31.25%,差异具有统计学意义;PIK3CA在鼻咽癌中的表达与鼻咽癌患者的性别、年龄、病理类型、Ki-67等均无统计学相关性,与肿瘤T分期(P=0.000)、N分期(P=0.008)及临床分期(P=0.002)有相关性,经Kaplan-Meier生存曲线分析发现PIK3CA蛋白强表达的鼻咽癌患者的生存率低于低表达及中等表达的患者(Log Rank检验结果:?2=7.995,P<0.05);(2)敲减PIK3CA的si RNA转染鼻咽癌细胞后,MTT实验显示鼻咽癌细胞的增殖活性受抑制;细胞划痕和transwell小室实验显示,CNE1细胞的迁移和侵袭能力在敲减PIK3CA后受到了的抑制(P<0.05)。(3)焦磷酸盐测序检测PIK3CA基因启动子甲基化水平,在启动子区发现4个甲基化位点,其中3个位点鼻咽癌组甲基化水平高于正常鼻咽粘膜组织组(P<0.05)。第二部分:(1)利用star Base预测mi R-515-5p和PIK3CA之间的潜在靶位点,双荧光素酶报告基因和RIP检测证实了mi R-515-5p是通过该结合位点调控鼻咽癌细胞中PIK3CA基因的表达;使用western blot法分析其调控关系,结果显示转染mi R-515-5p的鼻咽癌细胞较正常鼻咽粘膜细胞中PIK3CA的蛋白水平下调(P<0.05),提示mi R-515-5p在体外负性调控PIK3CA的表达。(2)CCK8法检测结果提示,转染mi R-515-5p后鼻咽癌细胞较PIK3CA组增殖下降(P<0.05),提示mi R-515-5p逆转了PIK3CA对细胞增殖的促进作用。(3)转染mi R-515-5p后,鼻咽癌细胞随辐射量的增加细胞存活分数降低,PIK3CA组较对照组存活分数下降幅度小,差异具有统计学意义(P<0.05),PIK3CA促进鼻咽癌细胞的放疗抵抗,mi R-515-5p的上调逆转了PIK3CA诱导的对放疗抵抗的增强作用。流式细胞仪和western blot检测结果提示,PIK3CA过表达可抑制放疗导致的NPC细胞凋亡(P<0.05),而转染mi R-515-5p后PIK3CA抑制放射线所致的凋亡作用被消除(P<0.05)。综上所述,PIK3CA促进NPC细胞的增殖和放疗抵抗,抑制NPC细胞的凋亡,而mi R-515-5p在调节NPC细胞增殖、凋亡和放疗抵抗中与PIK3CA起着相反的作用。第三部分:(1)组织水平,与配对正常对照组织相比,NPC组织中PVT1上调,晚期(III+IV)的PVT1表达水平高于早期(P<0.05);而细胞水平,鼻咽癌中PVT1较鼻咽上皮细胞中上调,PVT1水平越高,细胞存活率越低(P<0.05),以上结果提示PVT1可能是鼻咽癌的癌基因,其高表达导致了NPC的预后不良。(2)通过sh-PVT1瞬时转染鼻咽癌细胞,细胞增殖CCK8试验提示鼻咽癌细胞中PVT1下调抑制NPC癌细胞的增殖;细胞克隆形成实验显示,细胞随辐照剂量(0,2,4,6,8Gy)的增高sh-PVT1组较sh-Control组存活分数下降(P<0.05),提示敲减PVT1后明显促进NPC细胞的辐射敏感性。流式细胞仪和western blot法检测发现,不同辐照剂量(0和8 Gy)下PVT1敲减后鼻咽癌细胞凋亡率升高,sh-Control组较sh-PVT1组细胞周期蛋白D1的增加、Bax水平的下降(P<0.05),PVT1沉默降低了细胞周期蛋白D1的水平,增加了放疗后Bax在NPC细胞中的表达。综上所述,敲减PVT1在体外抑制NPC细胞的增殖和放疗抵抗,并诱导细胞凋亡。(3)通过star Base发现mi R-515-5p载有PVT1的靶位点,双荧光素酶报告基因和RIP检测证实mi R-515-5p是PVT1的靶点。经q RT-PCR证实mi R-515-5p在体外受到NPC细胞中PVT1的负调控。(4)CCK8法检测结果提示,鼻咽癌细胞转染mi R-515-5p后增殖水平下降(P<0.05),但转染mi R-515-5p+PVT1后的鼻咽癌细胞较mi R-515-5p组增殖增加(P<0.05),PVT1的表达逆转mi R-515-5p对细胞增殖抑制。克隆形成实验及流式细胞仪检测同样提示,PVT1通过反向调控mi R-515-5p的作用,促进NPC细胞的增殖和放疗抵抗,抑制NPC细胞的凋亡。(5)经western blot检测发现,在鼻咽癌细胞水平,sh-PVT1组较对照组PIK3CA和p-AKT的蛋白质表达水平低(P<0.05),PVT1的下调降低了PIK3CA和p-AKT的水平;转染sh-PVT1+Anti-Control组较sh-PVT1+Anti-mi R-515-5p组逆转了这种作用(P<0.05)。结果表明,通过与NPC细胞中mi R-515-5p相互作用,PVT1在体外诱导了AKT通路。(6)裸鼠异种移植瘤模型实验证实,敲减PVT1在体内通过与PIK3CA发生作用,抑制了肿瘤的生长。结论:(1)PIK3CA蛋白在鼻咽癌组织中高表达,并与鼻咽癌的不良预后相关,PIK3CA基因表达下调能抑制鼻咽癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力;鼻咽癌中PIK3CA存在异常甲基化,且其甲基化水平高于鼻咽正常粘膜组织。(2)mi R-515-5p在体外靶向调控PIK3CA,并负性调节PIK3CA的表达。PIK3CA促进NPC细胞的增殖及放疗抵抗,抑制了NPC细胞的凋亡,而Mi R-515-5p逆转了PIK3CA的作用。(3)PVT1在NPC组织中高表达,并与NPC的不良预后相关。mi R-515-5p是PVT1的靶点,并且在体外受到NPC细胞中PVT1的负调控。PVT1通过与mi R-515-5p相互作用,促进NPC细胞的增殖和放疗抵抗,抑制NPC细胞的凋亡。在体外PVT1通过与NPC细胞中mi R-515-5p相互作用,诱导了AKT通路,促进鼻咽癌细胞增殖和放疗抵抗。敲减PVT1在体内通过与PIK3CA发生作用,抑制了肿瘤的生长。PVT1/mi R-515-5p-PIK3CA轴能够促进肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移,并诱导鼻咽癌细胞放疗抵抗,导致鼻咽癌预后不良,本研究为鼻咽癌的发病机制和个体化靶向治疗关键分子筛查提供了新的靶点和思路。

孙乐[6](2020)在《LMP1在鼻咽癌的增殖、转移及放疗敏感性中的机制研究》文中提出前言:鼻咽癌(NPC)是一种来源于鼻咽上皮的恶性肿瘤,按其发病率排在常见癌症的第24位,70%的鼻咽癌新发病例均出现在东亚和东南亚地区,尤其是我国南方,如中国广东、广西、湖南、福建、江西、香港地区为鼻咽癌的高发区,男性的发病率一般是高于女性的2-3倍,40-50岁为高发的年龄段。由于患者鼻咽部的恶性肿瘤位置较隐匿,导致其早期临床症状不典型,约70%的患者在被确诊时己是Ⅲ期或Ⅳ期。此外,鼻咽癌大部分患者属于低分化或未完全分化的鳞状上皮细胞癌,恶性程度较高,容易在鼻咽部以外出现远处肿瘤转移。NCCN指南推荐同步放化疗和辅助放化疗或诱导化疗后同步放化疗作为治疗手段。据统计几乎98%的NPC与EBV密切相关,其中EBV的潜伏膜蛋白1(LMP1)在控制和促进鼻咽癌的发生、发展的细胞分化过程中己经被证实起到了重要的作用。它能通过鼻咽癌细胞内多种信号直接传导细胞通路,如TRAFs&NF-κB、PI3K-A kt/PK B、MAPK、转运蛋白PRA1等,调节和控制鼻咽癌细胞的正常增殖、生长、迁移、分化、免疫与细胞凋亡,从而控制癌变细胞的发生和发展。对于LMP1的鼻咽癌最新的研究结果表明,miR-155在体外能够促进鼻咽癌细胞的增殖、迁移和侵袭,但对于鼻咽癌细胞放疗的影响尚不清楚;而高迁移率族蛋白B1(HMGB1)最近被发现在人鼻咽癌组织中过表达,而且其表达的高低与患者的总生存期和无病生存期有关,且关于促进HMGB1的机制以及促进的HMGB1在NPC中的作用却知之甚少;此外,循环肿瘤细胞(CTC)及EBVDNA和RNA作为鼻咽癌的一个有前途的生物标志物也不断的被重视起来,但这几种标志物与鼻咽癌的转移关系还没有研究。目的:为了进一步深入探讨EBV LMP1及其相关因子miR-155、HMGB1在鼻咽癌发生、发展的分子机制,分析EBV的DNA和RNA、CTC在鼻咽癌转移诊断中的作用,寻找基因治疗和判断鼻咽癌预后的分子靶标。我们首先设计和构建了 LMP1真核表达载体转染的鼻咽癌稳定细胞系,并评估LMP1对鼻咽癌细胞增殖、迁移的影响。通过检测LMP1转染的鼻咽癌细胞中miR-155的表达及miR-55基因抑制对鼻咽癌细胞放疗的敏感性,评估miR-155对鼻咽癌细胞增殖、迁移、侵袭和体外放疗的影响,探讨miR-155与LMP1的相关性。通过检测人鼻咽癌标本及EBV感染的鼻咽癌细胞中HMGB1,评估LMP1对HMGB1的促进作用及HMGB1在体外对鼻咽癌细胞增殖的调控作用。检测鼻咽癌患者血浆中的EBV DNA和RNA(LMP1、LMP2、BART和EBER1)水平,评估患者外周血液循环CTC细胞中EBVDNA、RNA与CTC和肿瘤转移之间的关系。方法:(1)构建重组LMP1表达载体,并对CNE-2细胞进行转染,之后以实时定量PCR法、蛋白印迹观察转染率及LMP1转录和蛋白表达水平的变化;对pEGFP-LMP1转染CNE-2鼻咽癌细胞进行克隆,CCK8检测细胞活性,采用细胞划痕实验检测细胞迁移能力;细胞侵袭实验检测细胞侵袭能力;蛋白印迹法对HMGB1和P65蛋白进行表达定量分析;之后采用qPCR测定LMP1过表达的CNE-2细胞中miR-155的转录水平;用miR-155 mimic转染CNE-2和HONE1细胞,并进行细胞侵袭实验判断miR-155对于鼻咽癌侵袭的影响;使用RNeasy Mini试剂盒从CNE-2细胞中分离并提取细胞总mRNA,使用mirVanaTMmiRNA分离试剂盒提取CNE-2细胞中的miRNA;CCK8检测miR-155模拟转染CNE-2细胞后的增殖情况,及使用miR-155抑制剂后的细胞增殖情况;测定miR-155抑制后的正常CNE-2细胞或CNE-2(LMP1)细胞在放疗下的存活率。(2)遵循知情原则,对84例鼻咽癌患者进行活检,血清学检查52例为EBV阳性,32例为EBV阴性,并记录了这些患者放疗或化疗前完整的临床资料。检测这些标本的HMGB1表达以及其与LMP1 DNA水平的关系。之后评估感染EBV的CNE-2细胞从细胞核向细胞质的转移和释放HMGB1的情况,测定HMGB1对CNE-2细胞的增殖影响,以及RAGE特异性siRNA转染对HMGB1在CNE-2细胞增殖中的作用。(3)遵循知情原则,收集250名鼻咽癌患者资料,其中伴有转移者136例,不伴有转移者114例,治疗前取外周静脉血,进行CTC计数,并采用实时定量PCR方法检测血浆LMP1、LMP2、BART和EBER1水平,评估DNA/RNA和肿瘤转移之间的关系。结果:(1)pEGFP-LMP1质粒转染CNE-2细胞后14天时,重组载体转染的LMP1蛋白表达明显高于对照组,pEGFP-LMP1真核载体构建成功;CCK8检测显示LMP1过表达的CNE-2细胞的增殖活性比对照组高,具有统计学差异;细胞划痕实验中,LMP1过表达的CNE-2细胞在12h、24h时间点均大于对照组,有统计学差异,P<0.01;细胞侵袭实验中,LMP1过表达的CNE-2细胞穿过胶膜的细胞数在12h、24h明显多于对照组,有统计学差异,P<0.01;LMP1过表达CNE-2细胞组HMGB1和P65蛋白表达均高于对照组,单因素方差分析均有统计学差异,分别为P=0.0058;P=0.02;比较miR-155在CNE-2与HONE1之间的转录水平,发现并无明显的统计学差异,P>0.05,但在LMP1过表达CNE-2细胞中miR-155的转录水平是CNE-2的4.5倍,P<0.001。采用miR-155 mimic转染CNE-2和HONE1细胞,miR-155转录水平分别增加11.22和11.63倍。细胞侵袭实验中,miR-155 mimic转染CNE-2和HONE1细胞,24h后染色计数穿越基质膜的细胞数明显高于转染对照组的细胞越膜数量,统计学有显着差异,P<0.001。通过CCK-8检测,miR-155模拟转染可显着促进CNE-2细胞增殖,P<0.05。与miR-Con细胞相比,转染miR-155抑制剂显着降低了 CNE-2细胞中miR-155的水平P<0.05;P<0.01,细胞增殖也显着下降,P<0.05。在0或4.0Gy辐射处理后,转染miR-155抑制剂后,CNE-2(LMP1)细胞与转染miR-Con的细胞相比,形成的菌落更少,P<0.01。在转染了miR-155抑制剂的CNE-2(LMP1))细胞中比在转染了 miR-Con细胞中更显着,P<0.01。无论是否暴露于4.0Gy辐射,miR-155敲低对CNE-2(Con)细胞的集落数量减少不显着,P>0.05。(2)EBV阳性组的HMGB1蛋白水平也显着高于EBV阴性组(P<0.001)。HMGB1 mRNA水平与52个EBV阳性人样本中LMP1 DNA水平显着相关,R2=0.5640,P<0.0001。感染EBV的CNE-2细胞的上清液中的HMGB1在感染后12小时至48小时内也有显着的升高(P<0.05、P<0.01或P<0.001),大于0.5 mg/mL HMGB1的处理促进CNE-2细胞增殖(0.5、1、3 mg/mL HMGB1的P<0.05或P<0.01),且有剂量依赖性(P<0.05)。这种促进细胞增殖的作用也具有时间依赖性(治疗后36或48小时,P<0.05或P<0.01)。在60 nM转染siRNA-RAGE后,HMGB1促进CNE-2细胞的增殖被显着抑制(36 或 48 h 后,P<0.05 或P<0.01)。(3)转移组的平均CTC数值为显着高于非转移组,P<0.0001。转移性鼻咽癌患者血浆EBV DNA和RNA水平明显高于非转移性鼻咽癌患者。CTC、LMP1 DNA、BART或EBER1相对水平与肿瘤分期和结节分期均有显着相关性(R2>0.25,无论是肿瘤期还是淋巴结期,四种生物标志物)。结论:(1)pEGFP-LMP1的重组质粒能够有效地转染CNE-2细胞,并在CNE-2细胞中稳定表达。EBV LMP1在鼻咽癌发生、发展中起重要作用,其促进鼻咽癌增殖、侵袭和迁徙可能通过激活HMGB1/NF-kb信号途径完成。miR-155与EBV阳性鼻咽癌相关,其上调与LMP1相关,而miR-155在在体外可以促进鼻咽癌细胞的增殖、迁移和侵袭,抑制miR-155可以使得鼻咽癌细胞对放疗更加敏感。(2)在体内或体外鼻咽癌组织中HMGB1均显着增高,HMGB1与鼻咽癌的恶性状态相关,EBV感染导致的LMP1高表达通过HMGB1/RAGE信号促进在鼻咽癌细胞体外增殖。(3)转移的鼻咽癌患者血中CTC、EBVDNA和RNA水平均明显升高。LMP1 DNA和EBER1 RNA与鼻咽癌转移具有相关性。

邓睿[7](2020)在《肿瘤相关巨噬细胞与鼻咽癌PD-L1表达的相关性研究与意》文中提出研究背景鼻咽癌是我国南方地区及东南亚常见的恶性肿瘤,具有起病隐匿、易早期转移的特点。目前,调强放疗和化疗的综合治疗显着提高鼻咽癌的局控率,但仍有10%的患者在治疗后出现复发或转移,对于复发或转移鼻咽癌患者常规治疗已达瓶颈期,复发或远处转移是鼻咽癌患者死亡的主要原因。PD-1单抗免疫检查点治疗恢复T细胞抗肿瘤免疫反应,为肿瘤治疗带来突破性进展,也为复发或远处转移的鼻咽癌患者带来治疗的希望。由于肿瘤免疫微环境的抑制性,在鼻咽癌中,PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂的整体有效率不足30%。肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages,TAMs)是肿瘤微环境数量最大的一类淋巴细胞,其主要功能为诱导免疫逃逸,刺激肿瘤血管新生、促进肿瘤细胞侵袭和转移;文献报告,以TAMs为靶点的免疫治疗能够重塑肿瘤免疫微环境,提高PD-1单抗治疗的有效率。课题组前期研究发现在鼻咽癌肿瘤间质中存在大量TAM浸润,其浸润程度与肿瘤的临床分期和不良预后密切相关。但在鼻咽癌中肿瘤PD-L1表达与TAMs的相关性不明,为此,本研究将探讨鼻咽癌PD-L1表达与TAM的相关性,为PD-1/PD-L1抑制剂联合针对TAMs靶点的双靶点免疫治疗复发或转移鼻咽癌,以延长患者生命的研究设想提供理论依据.材料与方法收集2007年7月至2013年12月之间在南方医科大学南方医院治疗的212例鼻咽癌患者的临床资料和石蜡组织标本,根据第七版AJCC鼻咽癌分期标准进行TNM分期,随访至2019年10月31日。利用免疫组织化学染色方法检测组织标本中鼻咽癌细胞 PD-L1 与 CD68(pan-macrophages),CD163(M2-macrophage)的表达情况。以癌细胞PD-L1≥5%为PD-L1阳性表达,以累积光密度表示TAM的浸润程度。通过THP-1细胞构建M2型巨噬细胞后与鼻咽癌细胞株共培养,通过荧光定量qPCR、流式细胞技术、免疫蛋白印迹的方法检测共培养后鼻咽癌细胞PD-L1基因与蛋白水平的表达变化。结果1.鼻咽癌细胞PD-L1的表达与临床分期、N分期呈正相关(p<0.05);2.CD68+TAM和CD163+TAM的浸润密度与临床分期、T分期、N分期呈正相关(p<0.05),CD163+TAM 与 M 分期呈正相关(p<0.05);3.鼻咽癌细胞PD-L1和CD68+TAM对预后无显着影响,CD163+TAM高密度组中患者总体生存期(Overall Survival,OS)和无进展生存期(Progress Free Survival)缩短(p<0.05)。单因素生存分析提示:CD163+TAM是影响鼻咽癌患者无进展生存期和总体生存期的危险因素(P<0.05);4.鼻咽癌PD-L1阳性组中CD68+TAMs、CD163+TAMs的浸润密度显着高于PD-L1阴性组;多因素Logistics回归分析显示鼻咽癌细胞PD-L1的表达与CD68+TAM,CD163+TAM的浸润密度独立相关(p<0.05)。5.THP-1细胞诱导分化为M2型巨噬细胞,与鼻咽癌细胞共培养上调肿瘤PD-L1基因与蛋白水平的表达。结论鼻咽癌细胞PD-L1表达与TAMs的浸润密度呈正相关;M2型TAM调控肿瘤细胞PD-L1表达,提示TAMs与鼻咽癌细胞PD-L1表达密切相关,为开展针对TAMs联合PD-1/PD-L1双靶点治疗的免疫疗法奠定理论基础。

林重华[8](2020)在《阿托伐醌对鼻咽癌细胞放射增敏作用及机制研究》文中研究表明[研究背景及目的]:鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是一种高发于中国南方地区和东南亚而世界其它地区少见的的头颈部恶性肿瘤,湘西自治州也是湖南省鼻咽癌高发地区之一。放疗是临床上鼻咽癌有效且首选的治疗手段,获得性放疗抵抗(irradiation resistance,IR)也是制约提高鼻咽癌疗效的瓶颈。目前暂无A类证据在临床使用的非细胞毒鼻咽癌放疗增敏剂,且少数几种放疗增敏候选药物也仍处于临床前评估阶段。非细胞毒作用的放疗增敏策略与化疗作用机制不同,具有高效低毒和放化疗联用优势,逐渐受到重视且成为头颈部肿瘤放疗增敏剂的研究热点。阿托伐醌(atovaquone,ATQ)是一种的广谱抗原虫药,新近研究证实其对多种肿瘤细胞生长具有抑制作用,可能通过抑制增殖、诱导凋亡、降低氧化磷酸化水平诱导体内外放化疗增敏作用,但阿托伐醌对鼻咽癌的影响及放疗增敏作用仍不清楚。[方法]:X射线多分次亚致死剂量筛选法体外培养并鉴定放疗抵抗鼻咽癌细胞系CNE2-IR和对照组CNE2细胞系;倒置显微镜实时观察阿托伐醌处理对鼻咽癌细胞形态学的影响;噻唑蓝比色法检测阿托伐醌对细胞活力的影响;放射克隆存活实验检测细胞放射敏感性;Hoechst染色荧光显微镜观察阿托伐醌联合同期放疗对鼻咽癌细胞周期分布和凋亡的影响;流式细胞仪检测阿托伐醌对细胞活性氧产物水平的影响;q PCR法检测阿托伐醌对细胞氧化磷酸化及有氧糖酵解关键信号分子m RNA水平的影响;免疫印迹法检测阿托伐醌对鼻咽癌细胞增殖,迁移,凋亡及糖酵解相关信号蛋白水平的影响。[结果]:X射线多分次亚致死剂量暴露法筛选获得鼻咽癌细胞株CNE2-IR和CNE2;CNE2-IR及CNE2克隆存活曲线下面积分别为2.158和1.713,提示成功构建放疗抵抗鼻咽癌细胞株;噻唑蓝比色法显示阿托伐醌对不同放疗反应性鼻咽癌细胞具有类似细胞毒作用且呈浓度依赖性,CNE2及CNE2-IR的半数抑制率值分别为16.4μmol/L和17.0μmol/L;阿托伐醌联合放疗处理鼻咽癌细胞CNE2-IR及CNE2克隆存活曲线下面积差值分别为0.559和0.345,提示2.5μmol/L阿托伐醌可能具有非依赖细胞毒体外放疗增敏作用;Hoechst33258染色荧光显微镜观察结果显示,低剂量阿托伐醌具有特异性诱导放疗抵抗鼻咽癌细胞凋亡以及增加细胞周期再分布;免疫印迹法分析阿托伐醌同期联合放疗处理显着下调鼻咽癌CNE2-IR细胞株Bcl-2/Bax比值,抑制磷酸化AK T和磷酸化ERK水平,下调磷酸化H2AX水平,抑制有氧糖酵解途径关键酶HK2和PKM2蛋白表达水平;流式细胞仪检测显示,阿托伐醌同期联合放疗处理显着增加鼻咽癌CNE2-IR细胞的活性氧产物水平。[结论]:1.阿托伐醌具有非依赖细胞毒的鼻咽癌体外放疗增敏作用;2.阿托伐醌联合放疗增加放疗抵抗鼻咽癌细胞的凋亡和周期再分布;3.阿托伐醌可能通过抑制放疗抵抗鼻咽癌细胞株DNA损伤修复,下调糖酵解途径的能量供给,上调活性氧水平发挥非细胞毒的放射增敏作用。

李满意[9](2019)在《miR-30a-5p通过靶点CD73/NT5E抑制鼻咽癌的增殖、侵袭和迁移》文中研究表明研究背景鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是一种因鼻咽上皮细胞癌变引起的常见肿瘤,其发病率较高,恶性程度高,易发生转移及复发。研究治疗鼻咽癌的药物及其靶点临床意义重大。微小核糖核酸(micro RNA,miRNA)是真核生物内源性短片段RNA,负责体内转录后水平基因调控。部分miRNA为抑制肿瘤mRNA,其中大量研究发现miR-30a-5p家族参与抑制肿瘤发生、促进凋亡和抑制转移等过程。目的探讨miR-30a-5p和CD73在鼻咽癌中差异性表达及其临床意义,并在体外通过基因干扰试验、miRNA转染及拯救试验研究miR-30a-5p通过调控CD73对鼻咽癌细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡的影响及机制,研究miR-30a-5p和CD73的作用靶点及信号通路,为鼻咽癌的诊断和治疗探寻潜在的靶标。方法q-PCR分析及对比了20例鼻咽炎患者及94例鼻咽癌组织中miR-30a-5p和CD73mRNA水平,western blot法、免疫组织化学检测分析了CD73蛋白表达,分析其与鼻咽癌的临床病理特征之间的关系,随访50个月各鼻咽癌患者生存和预后情况,评估了miR-30a-5p及CD73对鼻咽癌作用及其机制。并且通过q-PCR和western blot法,从基因水平和蛋白水平对比了鼻咽正常细胞株及4种不同品系的鼻咽癌细胞,NP69细胞和CNE-2细胞、5-8F细胞、CNE细胞、6-10B细胞中CD73和miR-30a-5p水平。采用q-PCR和western blot法,验证miR-30a-5p过表达载体和CD73干扰载体是否成功构建。通过转染CNE-2细胞获得过表达miR-30a-5p的细胞和CD73表达抑制的细胞,以正常CNE-2细胞为对照,通过CCK-8法对比其细胞增殖水平,通过Transwell实验对比其细胞侵袭能力,通过划痕试验对比其迁移能力,通过Annexin V-FITC/PI双染法对比其细胞凋亡水平。通过qPCR和western blot法,从基因及蛋白水平测定过表达miR-30a-5p的细胞、CD73表达抑制的细胞及正常CNE-2细胞的磷酸化细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)和蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)的表达情况,以研究miR-30a-5p抑癌的细胞信号通路机制。采用生物信息学软件预测了miR-30a-5p和CD73 mRNA结合位点,并通过双荧光酶素靶基因实验验证了以上结合位点的正确性。最后,设计了拯救实验,通过转染miR-30a-5p和CD73过表达载体至CNE-2鼻咽癌细胞,与仅转染了miR-30a-5p过表达载体和空载体的CNE-2细胞对比,进行qPCR、western blot法、CCK-8法、Transwell实验、划痕试验及Annexin V-FITC/PI双染法,进一步证明miR-30a-5p抑制鼻咽癌的靶点及机制。结果1)鼻咽癌组织中miR-30a-5p水平显着低于鼻咽炎患者的鼻咽部组织中miR-30a-5p水平(P<0.05)。2)鼻咽癌组织中CD73的基因水平和蛋白水平均显着高于鼻咽炎患者的鼻咽部组织中CD73水平(P<0.05)。3)不同患者鼻咽癌组织中miR-30a-5p和CD73水平有差异,二者之间呈明显负相关,具有显着统计学差异(R=-0.530,P=0.000)。miR-30a-5p表达水平与TNM分期、远处转移之间具有明显统计学差异(P<0.05),与年龄、性别之间无统计学差异(P>0.05)。按照miR-30a-5p表达水平高低,将94名患者分为高表达组1(n=52)、低表达组1(n=42)。高表达组1在10个月、20个月、30个月、40个月及50个月随访点时,生存时间均显着优于低表达组1(P<0.05)。4)CD73 mRNA表达水平与TNM分期、远处转移之间具有明显统计学差异(P<0.05),与年龄、性别之间无统计学差异(P>0.05)。按照不同患者鼻咽癌组织中CD73mRNA的水平高低,将94名患者分为高表达组2(n=46)、低表达组2(n=48)。低表达组2在20个月、30个月、40个月及50个月随访点时,生存时间均显着高于高表达组2(P<0.05)。5)miR-30a-5p在体外鼻咽癌细胞过表达使CD73表达量显着下调(P<0.05)。6)免疫组化实验鼻咽癌IOD值为391538±42281,鼻咽炎IOD值为150631±23193,鼻咽癌较鼻咽炎组织CD73表达量显着提高(P<0.05)。7)细胞划痕试验发现,CD73表达量下调和miR-30a-5p过表达,划痕愈合速度均为35μm/d,较正常CNE-2细胞的划痕愈合速度110μm/d显着下降(P<0.05),迁移速度下降。CD73表达量下调和miR-30a-5p过表达均能显着抑制CNE-2细胞的迁移能力。8)Transwell实验结果发现,CD73表达量下调后较正常CNE-2细胞侵袭抑制率为64.66%±3.41%,miR-30a-5p过表达后侵袭抑制率为60.82%±3.45%,均能显着抑制CNE-2细胞的侵袭能力(P<0.05)。9)Annexin V-FITC/PI双染法结果发现,通过流式细胞仪测定了转染后细胞及正常CNE-2细胞的凋亡率。通过凋亡实验证明,CD73表达量下调后早期凋亡率为11.8%、晚期凋亡及死细胞率为11.9%、总凋亡率分别为23.7%。miR-30a-5p过表达后早期凋亡率为11.9%、晚期凋亡及死细胞率为16.4%、总凋亡率为28.3%,较正常CNE-2细胞的早期凋亡率1.85%、晚期凋亡及死细胞率1.49%、总凋亡率3.34%,均能显着提高CNE-2细胞的早期凋亡率、晚期凋亡及死细胞率、总凋亡率。10)CCK-8法测定CNE-2细胞的细胞增殖水平的结果显示,在24h和48h时,CD73表达量下调和miR-30a-5p过表达,均能显着降低CNE-2细胞的增殖水平,且培养时间越长,增殖水平抑制越显着。48h CD73表达量下调和miR-30a-5p过表达的增殖抑制率分别为64.66%±3.41%,60.82%±3.45%,说明miR-30a-5p能通过下调CD73水平,抑制鼻咽癌细胞的增殖。11)miR-30a-5p和CD73含量对AKT无显着影响。miR-30a-5p能抑制ERK的表达。12)通过生物信息学软件预测了miR-30a-5p与CD73结合的靶点为CD73 mRNA3’UTR区域的328至355及1442至1449位点的UGUUUACA。13)通过双荧光素酶报告基因发现转染了psi CHECK-CD73-WT质粒和hsa-miR-30a-5p的CNE-2细胞中Firefly luciferase与Renilla luciferase比值较转染mimics NC对照显着下降(P<0.05)。14)通过挽救试验,进一步证明了miR-30a-5p是一种鼻咽癌抑制性因子,能在体外通过负调控CD73水平,抑制鼻咽癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。结论1)鼻咽癌组织中miR-30a-5p水平显着低于鼻咽炎组织中miR-30a-5p水平,鼻咽癌组织中CD73的基因水平和蛋白水平均显着高于鼻咽炎组织中CD73水平。2)miR-30a-5p在鼻咽癌组织及多种鼻咽癌细胞株中低表达;miR-30a-5p高表达利于鼻咽癌患者生存,miR-30a-5p对于鼻咽癌发挥了抑癌基因的作用。3)CD73在临床鼻咽癌组织及多种鼻咽癌细胞株中高表达;CD73的高表达与鼻咽癌临床不良预后呈正相关。4)miR-30a-5p的靶基因之一是CD73 mRNA,CD73参与miR-30a-5p抑制肿瘤细胞的过程,miR-30a-5p通过下调CD73的表达,达到抑瘤作用。5)不同细胞系的miR-30a-5p和CD73水平有差别,其中CNE-2细胞较NP69细胞、5-8F细胞、CNE细胞和6-10B细胞的miR-30a-5p水平更低,CD73水平更高。CNE-2细胞是一种用于研究miR-30a-5p和CD73适宜的鼻咽癌细胞系。6)过表达miR-30a-5p可下调鼻咽癌细胞中CD73 mRNA及蛋白水平,抑制鼻咽癌细胞体外增殖率、促进凋亡、抑制迁移及侵袭。7)干扰CD73表达可抑制鼻咽癌细胞体外增殖率、抑制迁移及侵袭、促进凋亡。8)miR-30a-5p下调CD73 mRNA表达抑制鼻咽癌细胞体外增殖、迁移、侵袭及促进凋亡是通过ERK和PI3K/AKT信号传导通路实现的。9)CD73 mRNA的启动子区域有潜在的miR-30a-5p结合位点,结合的靶点为CD73mRNA 3’UTR区域的328至355及1442至1449位点的UGUUUACA。10)过表达CD73能拯救过表达miR-30a-5p引起的抑制鼻咽癌细胞增殖、迁移、侵袭能力及促进凋亡的作用。

陈泽南[10](2019)在《集落刺激因子-1受体过表达对鼻咽癌裸鼠移植瘤生长的影响及机制研究》文中研究说明目的研究过表达集落刺激因子-1受体(colony stimulating factor-1,CSF-1R)对人鼻咽癌6-10B细胞裸鼠移植瘤生长的影响及可能的机制。方法以课题组前期筛选出的CSF-1R低表达的人鼻咽6-10B细胞为载体,构建CSF-1R过表达慢病毒及空载体阴性对照慢病毒转染至人鼻咽癌6-10B细胞。将过表达CSF-1R的6-10B细胞(实验组transfection)、空载体6-10B细胞(阴性对照组NC)及6-10B细胞(空白对照组mock)种植于裸鼠皮下,观察裸鼠移植瘤生长情况,每3天测量移植瘤长径与短径,计算体积,绘制瘤体的生长曲线,观察过表达CSF-1R对人鼻咽癌6-10B细胞裸鼠移植瘤生长的影响。建模成功后第3周,处死全部裸鼠,剥离肿瘤组织标本,称重并比较移植瘤质量。HE染色观察移植瘤的病理情况,免疫组织化学染色、RT-qPCR、Western blot检测移植瘤中CSF-1R表达的变化情况。采用Western Blot技术检测移植瘤组织中增殖相关因子、侵袭相关因子、凋亡相关因子、自噬相关因子及相关通路蛋白的表达水平,探讨CSF-1R影响肿瘤生长的可能机制。结果成功转染CSF-1R过表达慢病毒至6-10B细胞,并构建三组鼻咽癌裸鼠移植瘤模型,肿瘤生长曲线显示CSF-1R过表达转染实验组(transfection组)移植瘤生长明显快于阴性对照组(NC组)及空白对照组(mock组),差异有统计学意义(P<0.05)。3周后实验结束时,与NC组及mock组移植瘤相比,transfection组裸鼠移植瘤体积与质量均显着增大,差异有统计学意义(P<0.05)。HE染色结果显示,三组移植瘤组织具有明显的癌细胞坏死现象。免疫组化结果显示,CSF-1R在NC组及mock组中表达均呈弱阳性,在transfection组中表达呈强阳性。Westernblot结果显示CSF-1R蛋白在transfection组相对表达量高于NC组及mock组,差异有统计学意义(P<0.001),RT-qPCR结果显示transfection组中CSF-1R mRNA的相对表达量较NC组及mock组高,差异有统计学意义(P<0.001),但在NC组及mock组之间CSF-1R蛋白质及mRNA的表达均没有统计学差异(P>0.05)。Western blot结果表明,与NC组及mock组相比,transfection组移植瘤组织中增殖相关因子cyclin D1、转移相关因子MMP2、抗凋亡因子Bcl-2、自噬相关因子LC3 II、Beclin 1蛋白相对表达量均有所增加,差异有统计学意义(P<0.05),凋亡相关因子Bax、自噬相关因子P62蛋白相对表达量降低,差异有统计学意义(P<0.05),NC组与mock组差异无统计学意义(P>0.05)。检测相关通路蛋白结果显示PI3K、AKT、p-AKT、mTOR蛋白均随着CSF-1R的增加而增加,三组差异有统计学意义(P<0.05)。结论1.过表达CSF-1R可能通过促进细胞增殖,抑制细胞凋亡,增加细胞自噬促进人鼻咽癌裸鼠移植瘤的生长;2.CSF-1R促进鼻咽癌裸鼠移植瘤生长的机制可能与PI3K/AKT/mTOR信号通路有关。

二、细胞毒淋巴细胞浸润与鼻咽癌细胞凋亡关系的探讨(论文开题报告)

(1)论文研究背景及目的

此处内容要求:

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例:

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

(2)本文研究方法

调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、细胞毒淋巴细胞浸润与鼻咽癌细胞凋亡关系的探讨(论文提纲范文)

(1)基于转录组测序分析的鼻咽癌相关EB病毒变异亚型及预后模型的研究(论文提纲范文)

英语缩略词
摘要
Abstract
第一章 与鼻咽癌相关的EBV基因变异及其医学生物学功能
    第一节 导论
        1.EBV概述
        1.1 EBV的基本生物学特征
        1.2 EBV潜伏感染
        1.3 EBV潜伏基因
        2 鼻咽癌概述
        3.鼻咽癌中EBV基因的变异
        4.本项研究的目的和基本策略
    第二节 结果
        1.纳入转录组测序分析的鼻咽癌病例入组及其基本特征
        2.入组样品的转录组测序分析
        3.鼻咽癌组织中EBV基因变异的分析
        3.1 鼻咽癌组织中EBER2和LMP2携带高频变异
        3.2 EBER2变异与鼻咽癌
        4.鼻咽癌中EBER2变异亚型及其临床意义
        4.1 EBER2亚型与鼻咽癌患者临床特征的关系
        4.2 EBER2亚型与鼻咽癌患者预后的关系
        5.EBER变异在鼻咽癌独立样本中的实验验证
        5.1 在EBV阳性细胞中验证EBER的变异
        5.2 在鼻咽癌组织中验证EBER的变异
        5.3 独立样本验证中EBER2亚型分布及与临床表型的关系
        6.EBER2亚型对应宿主基因的表达分析
        7.鼻咽癌组织中LMP2B的变异位点
        8.LMP2B-C666和LMP2B-Raji在鼻咽癌细胞中的生物学功能
        8.1 稳定表达外源性LMP2B-C666和LMP2B-Raji的鼻咽癌细胞的构建
        8.2 LMP2B-C666和LMP2B-Raji对鼻咽癌细胞表型的影响
        8.3 LMP2B-C666的蛋白稳定性
        9.LMP2B变异与EBER2亚型的关联
    第三节 讨论
        1.临床相关研究的质量控制
        2.以转录组测序数据分析EBV基因变异
        3.EBER2的变异与鼻咽癌患者预后的关系
        4.EBER变异的独立样本验证与细胞定位
        5.LMP2B在鼻咽癌中的生物学功能
    本章小结
第二章 鼻咽癌预后评估模型的建立
    第一节 导论
        1.鼻咽癌概述
        2.与鼻咽癌预后相关的分子标志物
        3.免疫微环境与鼻咽癌预后的关系
        3.1 鼻咽癌与免疫治疗
        3.2 浸润免疫细胞与鼻咽癌预后
        4.本项研究的目的和基本策略
    第二节 结果
        1.鼻咽癌“复发转移组”和“非复发转移组”的特征性基因表达谱
        1.1 入组的鼻咽癌病例及其临床信息
        1.2 转录组测序数据的主成分分析(principal component analysis,PCA)
        1.3 机器学习方法筛选两组鼻咽癌病例肿瘤组织的特征基因
        1.4 两组鼻咽癌患者肿瘤组织中的差异表达mRNA
        2.筛选出的13个特征基因与鼻咽癌预后的关系
        2.1 13个特征基因与鼻咽癌患者无进展生存的关系
        2.2 13个特征基因与鼻咽癌患者总生存的关系
        3.鼻咽癌预后模型的建立
        3.1 13个特征基因分别对于鼻咽癌预后的影响
        3.2 多因素Cox比例风险回归模型
        3.3 4-gene signature预后预测能力的评估
        3.4 基于4-gene signature的风险评分与其预后能力的关联
        3.5 基于4-gene signature的风险评分是否为预后的独立因素
        4.4-gene signature的生物学功能
        5.肿瘤免疫浸润和鼻咽癌预后的关系
        5.1 本组鼻咽癌病例肿瘤组织中浸润免疫细胞与鼻咽癌预后的关系
        5.2 GEO数据中浸润免疫细胞与鼻咽癌预后的关系
        6.4-mRNA signature表达水平与肿瘤浸润免疫细胞的关系
    第三节 讨论
        1.筛选与鼻咽癌预后相关的基因
        2.干扰素在鼻咽癌发生发展中的作用
        3.鼻咽癌4-gene signature预后评估模型及其生物学功能
        4.免疫微环境与鼻咽癌预后的关系
    本章小结
第三章 材料与方法
    第一节 研究对象和实验材料
        1.鼻咽癌病例及其组织样品
        2.细胞系
        3.菌株和质粒载体
        4.抗体
        5.主要试剂与耗材
        6.细胞培养的器皿
        7.常用试剂的配制
        8.主要仪器
        9.主要分析软件及网站
    第二节 实验方法
        1.分子生物学实验方法
        2.细胞生物学实验方法
        3.生物学信息分析
        4.统计学方法
参考文献
基金资助
致谢
个人简历

(2)1、DNA拷贝数异常改变作为膀胱癌预后判断相关分子标志物的研究 2、EB病毒相关上皮性恶性肿瘤中病毒miRNA与宿主相互作用的分子机制及其意义(论文提纲范文)

英语缩略词
摘要
Abstract
第一章 DNA拷贝数异常改变作为膀胱癌预后判断相关分子标志物的研究
    导论
        1. 膀胱癌概述
        2. 基因拷贝数变异的生物学意义
        3. 基因拷贝数变异与恶性肿瘤的关系
        4. 膀胱癌中的基因拷贝数异常
        5. 问题与展望
        6. 本项研究的目的和基本策略
    结果
        第一节 本研究入组病例及其临床病理特征
        1. 膀胱癌肿瘤组织病例
        1.1 膀胱癌肿瘤组织病例的临床病理特征
        1.2 膀胱癌肿瘤组织病例随访情况
        2. 膀胱癌尿样本
        2.1 膀胱癌尿样本病例的临床病理特征
        2.2 膀胱癌尿样本病例随访情况
        第二节 膀胱癌组织中DNA拷贝数异常改变辅助膀胱癌预后判断
        1. DNA拷贝数异常与临床病理风险因素的相关性分析
        1.1 膀胱癌肿瘤组织中的DNA拷贝数异常
        1.2 膀胱癌肿瘤组织中DNA拷贝数异常与临床病理风险因素的关系
        2. DNA拷贝数异常与患者预后的相关性分析
        2.1 DNA拷贝数异常与非肌层浸润性膀胱癌预后的相关性
        2.2 DNA拷贝数异常与肌层浸润性膀胱癌预后的相关性
        3. 基于临床病理风险因素与DNA拷贝数异常的预后预测模型
        3.1 Cox风险比例回归分析影响膀胱癌患者无瘤生存期的独立预后因素
        3.2 基于膀胱癌独立预后因素构建预后预测模型
        3.2.1 构建非肌层浸润性膀胱癌患者预后预测模型
        3.2.2 构建肌层浸润性膀胱癌患者预后预测模型
        3.2.3 高风险非肌层浸润性膀胱癌患者预后预测
        第三节 基于Real-time PCR方法检测膀胱癌术前尿脱落细胞中DNA拷贝数异常改变辅助膀胱癌预后判断
        1. 膀胱癌患者尿样本中DNA拷贝数异常与临床病理风险因素的相关性分析
        1.1 膀胱癌患者术前尿样本中的DNA拷贝数异常改变
        1.2 术前尿样本中DNA拷贝数异常与临床病理风险因素的关系
        2. 膀胱癌患者术前尿样本中DNA拷贝数异常与预后的相关性分析
        2.1 术前尿样本中DNA拷贝数异常与预后的关系
        2.2 术前尿样本中DNA拷贝数异常与非肌层浸润性膀胱癌短期肿瘤复发的相关性
        2.3 构建非肌层浸润性膀胱癌短期肿瘤复发预测模型
        第四节 基于3D数字PCR方法检测膀胱癌术前尿脱落细胞中DNA拷贝数异常改变辅助膀胱癌预后判断
        1. 膀胱癌患者术前尿样本中DNA拷贝数异常与临床病理风险因素的相关性分析
        1.1 膀胱癌患者术前尿样本中的DNA拷贝数异常改变
        1.2 术前尿样本中DNA拷贝数异常与临床病理风险因素的关系
        2. 3D数字PCR与real-time PCR对尿液中拷贝数变异分子的检测效能比较
        2.1 受试者工作曲线分析比较两者检测效能
        2.2 构建基于3D数字PCR的术前尿样本诊断模型
        3. 膀胱癌患者术前尿样本中DNA拷贝数异常与预后的相关性分析
        3.1 尿样本中DNA拷贝数异常与非肌层浸润性膀胱癌预后的相关性
        3.2 尿样本中DNA拷贝数异常与肌层浸润性膀胱癌预后的相关性
    讨论
        1. 膀胱癌相关分子标志物研究的策略
        2. 组织中膀胱癌预后相关分子标志物
        3. 尿液中膀胱癌预后相关分子标志物
        4. 3D数字PCR在膀胱癌患者尿液检测中的应用
        5. CEP63、FOSL2及PAQR6的异常改变与肿瘤的关系
        6. 本项研究的局限性
    本章小结
    材料与方法
        一、研究病例和实验材料
        1. 膀胱癌患者及其生物学样品
        2. 生物样品收集、制备和鉴定所需试剂
        3. 实时荧光定量PCR
        4. 3D数字PCR
        5. 引物序列
        6. 主要仪器和设备
        7. 主要分析软件
        二、实验方法
        1. 尿沉渣DNA提取
        2. 实时荧光定量PCR
        3. 扩增产物质量检测
        4. 引物扩增标准曲线
        5. 3D数字PCR
        6. 统计学方法
第二章 EB病毒相关上皮性恶性肿瘤中病毒miRNA与宿主相互作用的分子机制及其意义
    导论
        1. EB病毒概述
        2. EB病毒相关的上皮性恶性肿瘤
        3. EB病毒编码基因及其变异与恶性肿瘤的关系
        4. EB病毒编码的小RNA与恶性肿瘤的关系
        5. 本项研究的目的和策略
    结果
        第一节 EB病毒编码的miRNA在胃癌中的表达及其医学生物学意义
        一、研究入组病例及其临床病理特征
        二、EB病毒相关胃癌中病毒及宿主miRNA的表达
        1. EB病毒相关胃癌中病毒miRNA的表达谱
        1.1 miRNA芯片质量控制
        1.2 EB病毒相关胃癌肿瘤组织中病毒miRNA的表达谱
        1.3 EB病毒相关胃癌细胞系中病毒miRNA的表达谱
        1.4 EB病毒相关胃癌中高表达的病毒miRNA
        1.5 探索EB病毒相关胃癌中高表达病毒miRNA的靶基因及其功能
        2. EB病毒相关胃癌中宿主miRNA的表达
        2.1 EB病毒相关胃癌组织中宿主miRNA的差异表达分析
        2.2 EB病毒相关胃癌细胞系中宿主miRNA的差异表达分析
        2.3 EB病毒相关胃癌中与病毒有关的宿主miRNA
        3. EB病毒编码的miRNA与宿主miRNA的相关性分析
        3.1 探索EB编码的miRNA与宿主细胞miRNA表达的相关性
        3.2 探索与EB病毒miRNA与相关宿主miRNA结构的相关性
        3.3 探索与EB病毒相关的宿主miRNA的靶基因及其功能
        三、EB病毒相关胃癌中病毒miRNA对宿主基因表达的影响
        1. EB病毒相关胃癌中差异表达的宿主基因
        1.1 转录组测序EB病毒相关胃癌组织中宿主基因的差异表达
        1.2 公共数据库中EB病毒相关胃癌组织中宿主基因的差异表达
        1.3 EB病毒相关胃癌与EB病毒阴性胃癌中宿主基因的差异表达
        2. 差异表达的宿主基因与病毒miRNA的相关性
        2.1 从差异表达的宿主基因中筛选病毒与宿主miRNA的共同靶基因
        2.2 病毒与宿主miRNA共同靶基因KEGG信号通路富集
        四、EB病毒相关胃癌中病毒miRNA的功能研究
        1. 瞬时转染后细胞中miR-BART1-3p和miR-BART7-3p的表达变化
        2. EB病毒miRNA对胃癌细胞增殖能力的影响
        2.1 miR-BART1-3p及miR-BART7-3p过表达对细胞增殖能力的影响
        2.2 miR-BART1-3p及miR-BART7-3p敲降对细胞增殖能力的影响
        3. EB病毒miRNA对胃癌细胞周期的影响
        3.1 miR-BART1-3p及miR-BART7-3p过表达对细胞周期的影响
        3.2 miR-BART1-3p及miR-BART7-3p敲降对细胞周期的影响
        4. EB病毒miRNA对胃癌细胞迁移能力的影响
        4.1 miR-BART1-3p及miR-BART7-3p过表达对细胞迁移能力的影响
        4.2 miR-BART1-3p及miR-BART7-3p敲降对细胞迁移能力的影响
        第二节 EB病毒编码的miRNA在鼻咽癌中的表达及其医学生物学意义
        一、研究入组病例及其临床病理特征
        二、鼻咽癌中EB病毒miRNA的表达
        三、鼻咽癌中EB病毒miR-BART7-3p的功能研究
        1. 瞬时转染后细胞中miR-BART7-3p的表达变化
        2. miR-BART7-3p对鼻咽癌细胞增殖能力的影响
        2.1 miR-BART7-3p过表达对鼻咽癌细胞增殖能力的影响
        2.2 miR-BART7-3p敲降对鼻咽癌细胞增殖能力的影响
        3. miR-BART7-3p对鼻咽癌细胞周期的影响
        3.1 miR-BART7-3p过表达对鼻咽癌细胞周期的影响
        3.2 miR-BART7-3p敲降对鼻咽癌细胞周期的影响
        4. miR-BART7-3p对鼻咽癌细胞迁移能力的影响
        4.1 miR-BART7-3p过表达对鼻咽癌细胞迁移能力的影响
        4.2 miR-BART7-3p敲降对鼻咽癌细胞迁移能力的影响
    讨论
        1. 临床相关研究质量控制
        2. EB病毒相关胃癌中病毒miRNA的研究
        3. 本项研究中病毒miRNA在EB病毒相关胃癌中的表达及其意义
        4. 鼻咽癌中病毒miRNA的研究
        5. 本项研究中病毒miRNA在鼻咽癌中的表达及其意义
    本章小结
    材料与方法
        一、实验材料
        1. EB病毒相关胃癌患者及其生物学样品
        2. 鼻咽癌相关患者及其生物学样品
        3. 临床样品收集、制备和鉴定所需试剂
        4. 主要试剂盒
        5. 实时定量荧光PCR试剂
        6. 细胞培养和miRNA转染
        7. 常用试剂配制
        8. 细胞培养用主要器皿
        9. 主要仪器
        10. 主要分析软件
        二、实验方法
        1. 基因表达谱芯片技术
        2. 芯片数据读取
        3. 芯片数据预处理和标准化
        4. 第二代测序
        5. miRNA实时定量荧光PCR
        6. 总RNA样品的提取、制备及质量鉴定
        7. 细胞生物学实验方法
参考文献
基金资助
致谢

(3)重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的毒性评价及重楼皂苷Ⅰ的肝毒性机制探究(论文提纲范文)

摘要
ABSTRACT
符号说明
文献综述
    综述一 重楼的药效成分、药理作用和不良反应研究现状
        1 药效成分
        2 药理作用
        3 不良反应研究现状
        4 总结与讨论
        参考文献
    综述二 中药药源性肝损伤机制研究进展
        1 CYP代谢
        2 线粒体稳态
        3 氧化损伤
        4 细胞凋亡
        5 胆汁淤积
        6 Ca~(2+)浓度平衡破坏
        7 免疫激活介导的炎症因子释放
        8 特异反应
        9 总结与讨论
        参考文献
前言
技术路线图
第一章 重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的体内外毒性评价
    第一节 重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的细胞毒性实验
        1 概述
        2 实验材料
        3 实验方法
        4 实验结果
    第二节 模式生物-斑马鱼评价重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的毒性
        1 概述
        2 实验材料
        3 实验方法
        4 实验结果
    第三节 重楼皂苷Ⅰ的小鼠毒性实验研究
        1 概述
        2 实验材料
        3 实验方法
        4 实验结果
    第四节 小结与讨论
        1 重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的细胞毒性实验
        2 模式生物-斑马鱼评价重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的毒性
        3 重楼皂苷Ⅰ的小鼠毒性实验研究
    本章总结与讨论
第二章 重楼皂苷Ⅰ的细胞毒性机制研究
    第一节 肝细胞毒性机制研究
        1 概述
        2 实验材料
        3 实验方法
        4 实验结果
    第二节 心血管细胞毒性机制研究
        1 概述
        2 实验材料
        3 实验方法
        4 实验结果
    第三节 小结与讨论
        1 肝细胞毒性机制研究
        2 心血管毒性机制研究
    本章总结
第三章 基于蛋白组学和代谢组学探索重楼皂苷Ⅰ的体内肝毒性机制
    第一节 TMT标记定量蛋白质组学
        1 概述
        2 实验材料
        3 实验方法
        4 实验结果
        5 生物信息分析
        6 机制分析
        7 PPI网络
        8 潜在生物标志物
    第二节 Q300靶向代谢组学
        1 概述
        2 实验材料
        3 实验方法
        4 实验结果
        5 通路富集
        6 通路分析
        7 潜在生物标志物
    第三节 小结与讨论
        1 TMT标记定量蛋白质组学
        2 Q300靶向代谢组学
        3 蛋白组学-代谢组学关联分析
    第四节 重楼皂苷Ⅰ肝毒性机制验证
        1 动物组织Western blot验证
        2 斑马鱼qPCR实验验证
        3 小结与讨论
结语
    1 重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的体内外毒性评价
    2 重楼皂苷Ⅰ的细胞毒性机制研究
    3 重楼卓苷Ⅰ的蛋白组学和代谢组学研究
    4 重楼皂苷Ⅰ肝毒性机制推测与分析
    5 不足与展望
    创新点
参考文献
致谢
个人简历

(4)EBV-EBNA1通过募集Treg细胞构建鼻咽癌免疫抑制微环境的机制研究(论文提纲范文)

摘要
ABSTRACT
前言
实验材料与实验方法
    一、实验材料
    二、实验方法
第一章 EBV-EBNA1在鼻咽癌患者中的表达特征、临床病理联系及其与肿瘤浸润性Treg细胞募集的相关性分析
    一、结果
        1、临床组织标本中EBV-EBNA1表达丰度的鉴定及其临床病理特征
        2、临床组织标本中EBV-EBNA1感染状态与肿瘤浸润性Treg细胞募集相关
    二、讨论
第二章 EBV-EBNA1通过激活TGFβ1通路促进Treg细胞向鼻咽癌微环境迁移
    一、结果
        1、TGFβ1在EBNA1阳性的鼻咽癌细胞和EBNA1高表达的鼻咽癌组织中表达上调
        2、磷酸化SMAD3在EBNA1阳性的鼻咽癌细胞和EBNA1高表达的鼻咽癌组织中表达上调
        3 、TGFβ1信号的激活促进Treg细胞在EBV-EBNA1高表达的鼻咽癌微环境中募集
    二、讨论
第三章 EBV-EBNA1-TGFβ1-SMAD3轴通过抑制miR-200a来募集Treg细胞构建鼻咽癌免疫抑制微环境
    一、结果
        1、由EBV-EBNA1诱导的TGFβ1通过自分泌效应抑制miR-200a表达
        2、miR-200a是TGFβ1-SMAD3信号轴的下游因子
        3、动物模型体内验证EBV-EBNA1-TGFβ1-SMAD3轴通过抑制miR-200a来募集Treg细胞构建鼻咽癌免疫抑制微环境
    二、讨论
第四章 miR-200a直接靶向调控CXCL12 3‘UTR区域,并与CXCL12形成负性反馈调控环路,共同调节Treg细胞向鼻咽癌迁移
    一、结果
        1、生物信息学预测CXCL12是miR-200a的靶基因
        2、验证CXCL12是miR-200a的靶基因,miR-200a通过转录后调控机制抑制CXCL12表达及由CXCL12介导的Treg迁移
        3、CXCL12可反向负性调控miR-200a表达
        4、体内验证CXCL12调控Treg细胞向鼻咽癌微环境迁移
        5、临床样本验证CXCL12调控Treg细胞向鼻咽癌微环境募集
    二、讨论
第五章 c-JUN直接靶向调控miR-200a启动子区域并与CXCL12互为正性调控
    一、结果
        1、生物信息学预测c-JUN直接与miR-200a启动子区域结合
        2、CXCL12通过正性调控PI3K/AKT/c-JUN信号通路来反向负性调控miR-200a表达
        3、c-JUN通过直接结合和间接结合miR-200a启动子的方式负性调控miR-200a转录
        4、c-JUN与CXCL12互为正性调控并形成CXCL12-PI3K-AKT-c-JUN-miR-200a-CXCL12反馈调控环路
        5、临床样本验证c-JUN调控Treg细胞向鼻咽癌微环境募集
    二、讨论
第六章 TGFβ1通过促进c-JUN表达及增强SMAD3/c-JUN蛋白-蛋白复合体的相互作用程度来抑制miR-200a转录
    一、结果
        1、TGFβ1通过上调SMAD3-c-JUN轴来抑制下游的miR-200a转录表达,形成TGFβ1-SMAD3-c-JUN-miR-200a调控轴
        2、EBV-EBNA1以TGFβ1依赖性的方式调控SMAD3/c-JUN蛋白-蛋白相互作用复合体的丰度
        3、临床样本验证c-JUN与TGFβ1-SMAD3轴的关系
    二、讨论
第七章 TGFβ1以miR-200a依赖性方式正性调控CXCL12表达及由CXCL12介导的Treg细胞趋向性迁移
    一、结果
        1、TGFβ1可正性调控CXCL12表达
        2、TGFβ1以miR-200a依赖性的方式调控CXCL12表达及由CXCL12介导的Treg细胞趋向性迁移
        3、临床样本验证CXCL12与TGFβ1-SMAD3信号轴的关系
    二、讨论
第八章 CXCL12通过上调Treg细胞的CXCR4受体来招募Treg向鼻咽癌微环境富集,且CXCL12-CXCR4-Treg轴在实体瘤免疫抑制微环境的构建中具有普遍适用性
    一、结果
        1、CXCL12-CXCR4配体受体调控轴调节Treg细胞的趋向性迁移
        2、CXCL12-CXCR4配体受体调控轴在构建以Treg细胞介导的实体瘤免疫抑制微环境中具有普遍适用性
    二、讨论
全文小结
课题创新性
References
附录
    Western Blot原始图片
    中英文缩略词
致谢
博士期间发表论文

(5)PIK3CA基因在鼻咽癌发生发展及放疗抵抗中的作用机制研究(论文提纲范文)

中英文缩略词对照表
摘要
ABSTRACT
前言
第一部分 PIK3CA基因表达模式及其对鼻咽癌发生发展和细胞生物学行为的作用研究
    1 研究内容与方法
        1.1 研究对象
        1.2 实验方法
        1.3 质量控制
        1.4 统计分析
        1.5 技术路线图
    2 结果
    3 讨论
    4 小结
第二部分 miR-515-5p在 PIK3CA诱导的鼻咽癌细胞增殖、凋亡和放疗抵抗中作用研究
    1 研究内容与方法
        1.1 研究对象
        1.2 使用试剂与仪器
        1.3 实验方法
        1.4 统计学分析
        1.5 技术路线图
    2 结果
    3 讨论
    4 小结
第三部分 NPC细胞中PVT1/miR-515-5p-PIK3CA轴调控机制研究
    1 研究内容与方法
        1.1 研究对象
        1.2 试剂与仪器
        1.3 研究方法
        1.4 统计学处理
        1.5 技术路线图
    2 结果
    3 讨论
    4 小结
结论
致谢
参考文献
综述 PIK3CA 基因与头颈部肿瘤发病相关性研究进展
    参考文献
攻读博士学位期间获得的学术成果
个人简历
导师评阅表

(6)LMP1在鼻咽癌的增殖、转移及放疗敏感性中的机制研究(论文提纲范文)

中文摘要
abstract
中英文缩略词对照表
第1章 绪论
    1.1 鼻咽癌的研究进展
        1.1.1 前言
        1.1.2 鼻咽癌的病理
        1.1.3 鼻咽癌的危险因素及病因
        1.1.4 症状和诊断
        1.1.5 治疗
        1.1.6 总结及展望
    1.2 EB病毒LMP1 在肿瘤研究中的进展
        1.2.1 前言
        1.2.2 EB病毒LMP1 简介
        1.2.3 LMP1 的结构特点
        1.2.4 LMP1 在上皮细胞中的作用
        1.2.5 LMP1 在相关肿瘤中的研究进展情况
        1.2.6 针均LMP1 的潜在治疗策略
        1.2.7 结论
第2章 实验研究:LMP1 对鼻咽癌增殖、转移及放疗敏感性的机制研究
    2.1 LMP1 诱导MIR-155 在鼻咽癌中的机制研究
        2.1.1 前言
        2.1.2 实验方法
        2.1.3 结果
        2.1.4 讨论
        2.1.5 小结
    2.2 EBV感染上调高迁移率族蛋白B1(HMGB1)表达促进人鼻咽癌细胞增殖
        2.2.1 前言
        2.2.2 材料和方法
        2.2.3 结果
        2.2.4 讨论
        2.2.5 小结
    2.3 血浆人类疱疹病毒第四型LMP1和EBER1 与循环肿瘤细胞及鼻咽癌转移的关系
        2.3.1 前言
        2.3.2 材料和方法
        2.3.3 结果
        2.3.4 讨论
        2.3.5 总结
第3章 结论
    3.1 结论
    3.2 研究的创新点
参考文献
作者简介及在学期间所取得的科研成果
致谢

(7)肿瘤相关巨噬细胞与鼻咽癌PD-L1表达的相关性研究与意(论文提纲范文)

摘要
ABSTRACT
前言
    参考文献
第一章 鼻咽癌组织中PD-L1表达与TAMs表达特征与预后分析
    1. 材料与方法
    2. 结果
    3. 讨论
    参考文献
第二章 TAMs与鼻咽癌PD-L1表达的相关性研究
    1. 材料与方法
    2. 结果
    3. 讨论
    参考文献
全文小结
英文缩写注解
致谢

(8)阿托伐醌对鼻咽癌细胞放射增敏作用及机制研究(论文提纲范文)

摘要
ABSTRACT
英文对照缩略的词表
第1章 前言
第2章 阿托伐醌增加鼻咽癌细胞的放射敏感性
    2.1 材料
        2.1.1 细胞
        2.1.2 药品
        2.1.3 主要试剂
        2.1.4 主要仪器
        2.1.5 主要溶液的配置
    2.2 方法
        2.2.1 细胞培养、筛选及鉴定
        2.2.2 放射治疗体外模型
        2.2.3 MTT比色法
        2.2.4 划痕愈伤法
        2.2.5 放射克隆存活实验
        2.2.6 在倒置显微镜下细胞形态观察
        2.2.7 统计学处理
    2.3 结果
        2.3.1 放疗抵抗鼻咽癌CNE2-IR细胞株的筛选及鉴定
        2.3.2 阿托伐醌对鼻咽癌细胞株增殖和活力的影响
        2.3.3 阿托伐醌对鼻咽癌细胞形态的影响
        2.3.4 阿托伐醌对鼻咽癌细胞迁移的影响
        2.3.5 阿托伐醌增加鼻咽癌细胞株放射敏感性
    2.4 讨论
第3章 阿托伐醌放射增敏的分子机制
    3.1 材料
        3.1.1 细胞的来源
        3.1.2 药品
        3.1.3 主要试剂
        3.1.4 主要仪器
        3.1.5 主要溶液的配制
    3.2 方法
        3.2.1 细胞培养细胞培养及放射线处理
        3.2.2 Hoechst33258 染色荧光显微镜观察法
        3.2.3 Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞周期
        3.2.4 免疫印迹法
        3.2.5 qPCR法
    3.3 结果
        3.3.1 阿托伐醌联合放疗增加鼻咽癌细胞株CNE2-IR细胞凋亡
        3.3.2 阿托伐醌联合放疗诱导鼻咽癌细胞株CNE2-IR细胞G2-M期阻滞
        3.3.3 阿托伐醌联合放疗对鼻咽癌细胞和生存信号关键蛋白磷酸化水平的影响
        3.3.4 阿托伐醌联合放疗对鼻咽癌细胞Bcl-2与Bax蛋白表达影响
        3.3.5 阿托伐醌联合放疗抑制鼻咽癌细胞DNA损伤修复能力
        3.3.6 阿托伐醌联合放疗对糖酵解途径关键酶mRNA水平的影响
        3.3.7 阿托伐醌联合放疗对PKM2和HK2蛋白水平的影响
        3.3.8 阿托伐醌联合放疗对活性氧产物水平的影响
    3.4 讨论
第4章 结论
致谢
参考文献
作者在学期间取得的学术成果

(9)miR-30a-5p通过靶点CD73/NT5E抑制鼻咽癌的增殖、侵袭和迁移(论文提纲范文)

摘要
abstract
前言
    参考文献
第一章 miR-30a-5p、CD73 在鼻咽癌中的表达及临床意义
    1.实验材料
        1.1 组织来源
        1.2 实验仪器
        1.3 实验试剂
    2.试验方法
        2.1 鼻咽炎症和癌组织标本中miR-30a-5p的基因水平及其临床意义
        2.2 q-PCR法测定鼻咽炎症和癌组织标本中CD73 基因水平及其临床意义
        2.3 Western blot检测鼻咽炎症和癌细胞中CD73 表达水平及其临床意义
        2.4 HE病理组织观察
        2.5 免疫组织化学染色分析
        2.6 计算及统计
    3.结果
        3.1 q-PCR法测定miR-30a-5p基因水平
        3.2 鼻咽癌患者细胞中miR-30a-5p的表达水平与患者总生存时间关系
        3.3 q-PCR法测定CD73 基因水平
        3.4 Western blot检测鼻咽炎症和癌细胞中CD73 蛋白量结果
        3.5 CD73 高、低表达组基线资料对比结果
        3.6 CD73高、低表达组与与患者总生存时间关系
        3.7 miR-30a-5p和 CD73 表达量相关性结果
        3.8 HE染色结果
        3.9 免疫组织化学分析结果
    4.讨论
第二章 miR-30a-5p、CD73 在鼻咽癌细胞中的表达及与其增殖、迁移、侵袭能力的相关性
    1.实验材料
        1.1 实验设备
        1.2 实验试剂
        1.3 细胞株
    2.实验方法
        2.1 鼻咽上皮细胞及各鼻咽癌细胞中CD73 mRNA水平测定
        2.2 鼻咽上皮细胞及各鼻咽癌细胞中CD73蛋白水平测定
        2.3 qPCR法检测鼻咽上皮细胞及不同鼻咽癌细胞中miR-30a-5p mRNA水平
        2.4 miR-30a-5p、CD73mRNA过表达及干扰CNE-2 细胞构建
        2.5 细胞划痕实验
        2.6 Transwell侵袭实验
        2.7 转染对CNE-2细胞的凋亡检测
        2.8 CCK-8法检测细胞增殖水平
        2.9 计算及统计
    3.结果
        3.1 鼻咽上皮细胞及各鼻咽癌细胞中CD73 mRNA水平结果
        3.2 鼻咽上皮细胞及各鼻咽癌细胞中CD73蛋白水平结果
        3.3 鼻咽上皮细胞及各鼻咽癌细胞中miR-30a-5p mRNA水平结果
        3.4 转染效率结果
        3.5 载体转染效率验证结果
        3.6 转染后各组细胞CD73蛋白水平结果
        3.7 细胞划痕试验结果
        3.8 Transwell侵袭实验结果
        3.9 凋亡检测结果
        3.10 CCK-8法细胞增殖水平结果
    4.结论
第三章 miR-30a-5p通过靶点CD73 调控ERK、AKT细胞信号通路影响肿瘤细胞增殖
    1.实验材料
        1.1 实验设备
        1.2 实验试剂
        1.3 细胞株
    2.实验方法
        2.1 q-PCR测定miR-30a-5p、ERK、AKT的表达量
        2.2 各组鼻咽癌细胞中ERK、p-ERK、AKT、p-AKT蛋白水平测定
        2.3 miR-30a-5p与 CD73 mRNA结合位点预测
        2.4 双荧光素酶靶基因验证miR-30a-5p与 CD73 mRNA结合位点
        2.5 计算及统计
    3.结果
        3.1 癌细胞中miR-30a-5p、ERK、AKT mRNA水平结果
        3.2 各组细胞ERK、p-ERK、AKT、p-AKT蛋白水平结果
        3.3 miR-30a-5p与 CD73mRNA预测结果
        3.4 双荧光素酶靶基因验证结合位点结果
    4 讨论
第四章 挽救实验验证miR-30a-5p通过靶点CD73 负调控肿瘤抑制作用
    1.实验材料
        1.1 实验设备
        1.2 实验试剂
        1.3 细胞株
    2.实验方法
        2.1 构建miR-30a-5p过表达质粒和CD73 过表达质粒
        2.2 挽救实验分组
        2.3 细胞转染
        2.4 miR-30a-5p和 CD73 mRNA水平测定
        2.5 细胞CD73蛋白水平测定
        2.6 细胞划痕实验
        2.7 Transwell侵袭实验
        2.8 CNE-2细胞的凋亡检测
        2.9 CCK-8法检测细胞增殖水平
        2.10 计算及统计
    3.结果
        3.1 挽救实验miR-30a-5p mRNA水平结果
        3.2 挽救实验CD73 mRNA水平结果
        3.3 挽救实验CD73蛋白水平结果
        3.4 挽救实验细胞划痕试验结果
        3.5 挽救实验Transwell侵袭实验结果
        3.6 挽救实验凋亡检测结果
        3.7 挽救实验CCK-8法细胞增殖水平结果
    4.结论
问题与展望
结论
参考文献
综述一 miR-30a-5p 与肿瘤研究进展
    参考文献
综述二 CD73、Micro RNAs 与鼻咽癌
    参考文献
中英文对照缩略词表
攻读博士学位期间公开发表的论文、论着
致谢

(10)集落刺激因子-1受体过表达对鼻咽癌裸鼠移植瘤生长的影响及机制研究(论文提纲范文)

中文摘要
Abstract
引言
第一部分 文献研究
    1.CSF-1R抑制剂在临床治疗中的研究进展
    2.PI3K/AKT/mTOR在恶性肿瘤发病机制中的研究进展
    3.建立人源肿瘤异种移植模型的方法
第二部分 实验研究
    1.实验材料
    2.实验方法
    3.结果
第三部分 讨论
第四部分 结论
参考文献
综述
    参考文献
致谢
个人简历
发表论文和参加科研情况说明

四、细胞毒淋巴细胞浸润与鼻咽癌细胞凋亡关系的探讨(论文参考文献)

  • [1]基于转录组测序分析的鼻咽癌相关EB病毒变异亚型及预后模型的研究[D]. 赵爽. 北京协和医学院, 2021
  • [2]1、DNA拷贝数异常改变作为膀胱癌预后判断相关分子标志物的研究 2、EB病毒相关上皮性恶性肿瘤中病毒miRNA与宿主相互作用的分子机制及其意义[D]. 蔡曌. 北京协和医学院, 2021
  • [3]重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的毒性评价及重楼皂苷Ⅰ的肝毒性机制探究[D]. 王文平. 北京中医药大学, 2021(02)
  • [4]EBV-EBNA1通过募集Treg细胞构建鼻咽癌免疫抑制微环境的机制研究[D]. 霍少芬. 南方医科大学, 2020(06)
  • [5]PIK3CA基因在鼻咽癌发生发展及放疗抵抗中的作用机制研究[D]. 韩艳艳. 新疆医科大学, 2020(03)
  • [6]LMP1在鼻咽癌的增殖、转移及放疗敏感性中的机制研究[D]. 孙乐. 吉林大学, 2020(08)
  • [7]肿瘤相关巨噬细胞与鼻咽癌PD-L1表达的相关性研究与意[D]. 邓睿. 南方医科大学, 2020(06)
  • [8]阿托伐醌对鼻咽癌细胞放射增敏作用及机制研究[D]. 林重华. 吉首大学, 2020
  • [9]miR-30a-5p通过靶点CD73/NT5E抑制鼻咽癌的增殖、侵袭和迁移[D]. 李满意. 苏州大学, 2019(06)
  • [10]集落刺激因子-1受体过表达对鼻咽癌裸鼠移植瘤生长的影响及机制研究[D]. 陈泽南. 广西中医药大学, 2019(03)

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细胞毒淋巴细胞浸润与鼻咽癌细胞凋亡关系的研究
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