一、改变乙型肝炎病毒核心抗原基因3′端序列对其在原核细胞中表达的影响（论文文献综述）
李彤亚[1]（2019）在《HIV和HBV病毒蛋白同宿主细胞的相互作用机制研究》文中研究说明由人免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus,HIV）感染引起的获得性免疫缺陷综合症（acquired immunodeficiency syndrome,ADIS）是威胁人类最严重的传染病之一,它能破坏人体的免疫系统降低机体的免疫力,并引发严重的并发症,目前没有特效的治疗药物,HIV致病机制研究及药物靶标寻找的是对于人类健康和社会稳定有重要意义。Nef蛋白是HIV的负调控因子,主要表达于CD4+T细胞。Nef诱导的AIDS样症状主要表现为凋亡细胞的增加,且Nef基因突变或者缺失与长期不发病或病程进展缓慢的AIDS（Long-term Nonprogressors/Slowprogressors,LTNP/LTSP）的发生显着相关。Nef能下调CD4、CD28、CD86、MHC-I、MHC-II等细胞表面受体的表达,干扰免疫细胞的监视和清除,实现HIV-1的免疫逃逸;还能通过与诱凋亡因子及某些激酶直接结合抑制凋亡通路,使被感染细胞的存活期延长,利于病毒复制和感染力增强。我们通过酵母双杂交实验发现了Nef与细胞色素b（cytochrome b,Cyto b）C端（169-380 aa）存在相互作用,并通过免疫共沉淀验证了两者能在体内结合。而且我们发现Cyto b与Fas介导的凋亡有关。目前对于线粒体参与的凋亡通路,研究者的目光大都聚集在Cyto c上,Cyto c是线粒体凋亡通路的核心蛋白,通过与Apaf-1等辅助蛋白形成凋亡体,活化caspase并激发级联反应最终导致细胞的凋亡。而我们的研究结果证明Cyto b介导的凋亡与Apaf-1形成凋亡体无关,独立存在于Cyto c经典凋亡通路之外。我们的研究还发现,Nef可以抑制Apaf-1诱导的细胞凋亡,这说明了Nef是Cyto c凋亡通路的负调控因子。此外,我们用Fas的单抗C11刺激细胞的Fas凋亡通路,证明了Nef能通过直接与Cyto b的结合抑制Fas凋亡信号诱导的细胞凋亡。我们利用B型HIV-1的假病毒HIV-1BA-L感染Jurkat T细胞,证明了HIV-1可以通过与Cyto b的结合抑制Fas凋亡通路。迄今为止,关于Cyto b相关的凋亡通路及其机制的研究较少,我们的研究在这方面做出了初步探索,对于加深Nef诱导免疫逃逸机制的认识具有重要意义,也提供了治疗HIV的潜在靶点,然而深入的机制仍需进一步发现。乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）感染可以引起急、慢性肝炎,还与肝衰竭、肝硬化以及肝癌的发生发展有密切关系。乙型肝炎（Hepatitis B）是全球范围内的重要传染病,有较高的传染性和致死率。目前对于乙肝仍然缺乏有效的治疗药物。乙肝的治疗目标是持续抑制HBV的复制,减少肝细胞损伤,延缓肝炎演变为肝硬化（liver cirrhosis,LC）和肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）的进程。HBV很难在体内完全清除,这与其复杂的免疫逃逸机制有关。干扰素（interferon,IFN）是一种广泛表达的细胞因子,具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等多种生物学活性。IFN的生理作用是通过信号通路调节IFN诱导基因的转录来实现的。病毒感染首先诱发机体的天然免疫,IFN诱导的效应因子的表达是机体抗病毒感染的第一道防线。因而,研究HBV逃避IFN相关的天然免疫的机制的研究有重要的现实意义。干扰素诱导跨膜蛋白家族（interferon-inducible transmembrane protein,IFITM）是IFN的诱导重要的抗病毒、抗肿瘤的效应因子。它们主要由IFNγ通过诱导Jak-stat1信号通路诱导产生,具有广谱的抗病毒效应,如艾滋病毒（HIV）、SARS冠状病毒（SARS-CoV）、甲型流感病毒（IAV）、登革热病毒（DFV）和水泡性口膜炎病毒（VSV）等。但是,IFITM抗HBV的机制鲜见报道。HBV e蛋白有较强的免疫调节作用,与乙肝的发病机制有着密切的关系。我们为了研究HBV免疫逃逸的可能机制,首先利用酵母双杂交实验筛选能与HBe相互作用蛋白,发现ARID2编码的BAF200蛋白与HBe存在直接的相互作用。然而,HBe作为一种分泌蛋白,实际上难以在空间上与定位于核内的BAF200发生相互作用。但是,与HBe的基因序列大部分相同的HBV核心蛋白（HBc）大多位于胞质,于是我们推测HBc也可能与BAF200存在体内的相互作用。为验证此想法,我们进行了免疫共沉淀实验,实验结果表明HBc和BAF200确实存在体内的相互作用。SWI/SNF家族是染色质重构复合物。SWI/SNF家族有BAF复合物和PBAF复合物两种形式,组成它们的亚基大多数是相同的,但BAF250只存在于BAF复合物,而BAF200和BAF180是PBAF的特有的亚基。据报道,只有PBAF复合物能调节细胞内核受体-配体依赖的转录活动。我们通过实验证实了,IFITM1的表达依赖于BAF200而并非BAF180。而且,我们发现IFNα对BAF200的调控并不STAT1的磷酸化,暗示IFNα诱导IFITM1的信号通路并不是JAK-STAT1途径。我们将pHBV1.31质粒转染HepG2细胞,并通过ELISA实验和荧光定量PCR,证明了IFNα的刺激可以显着降低HBeAg、HBsAg含量以及HBV DNA的拷贝数。这说明IFNα对HBV有抗病毒作用。此外,我们在HepG2和HepG2.2.15细胞内,通过干扰IFITM1基因的转录,证实了IFITM1介导了IFNα诱导的抗细胞生长作用。我们的实验还证明了,HBc能通过与BAF200的结合抑制IFNα诱导的IFITM1的表达,这可能是HBV免疫逃逸的机制之一,因而本研究为抗HBV复制和抗乙肝药物的研发提供了新思路。综上,我们探讨了关于HIV Nef蛋白和HBV HBc蛋白对宿主细胞的相互作用有机制,丰富和补充了对两种病毒感染及免疫逃逸机制的认识。
吴玲红[2]（2019）在《乙型肝炎病毒X基因突变与自噬相关蛋白（Beclin-1、LC3B和P62）对肝细胞癌作用的相关性研究》文中研究指明目的:通过分析HBV相关HCC患者的癌及癌旁组织中HBX突变特征,同时检测自噬相关蛋白（Beclin-1、LC3B和P62）表达情况评定HCC组织中自噬活性,并在以上基础上探索HBX突变致HCC的过程中是否与自噬有关,以期为HBX致肝癌作用机制提供实验基础。方法:以HBV相关的HCC患者为研究对象,收集2015年7月1日2016年12月30日广西医科大学附属肿瘤医院肝胆外科因HCC手术切除的HCC患者,取其HCC组织及对应癌旁组织（取自距手术切缘大于2cm）,同时收集患者临床资料。采用巢式PCR方法扩增HBX基因序列,对纯化后产物应用Sanger测序法测定肝癌与癌旁组织中HBX突变类型;免疫组织化学法检测肝癌及癌旁组织中自噬相关蛋白（Beclin-1、LC3B及P62）的表达情况;运用SPSS22.0软件包分析数据。对所有定量数据进行正态性检验,配对t检验分析癌与癌旁组织间蛋白均值差异;自噬蛋白表达与临床病理因素间关系采用独立样本t检验,多组间比较用单因素方差分析,组内两两比较用LSD-t检验;计数资料率与构成比的比较用χ2检验;Pearson相关分析自噬蛋白表达的相关性;Sperman相关分析HBX突变与自噬蛋白表达间的相关关系;P<0.05为差异有统计学意义（双侧）。结果:1.HBX基因羧基端序列缺失情况癌组织中,HBX羧基端序列缺失率为25.0%（15/60）,高于癌旁组织6.7%（4/60）,差异有统计学意义（χ2=7.566,P=0.006）;癌组织HBX羧基端序列缺失长度范围为（631）bp,癌旁组织羧基端缺失长度范围为（925）bp。2.HBX基因插入突变情况插入突变存在于肝癌组织的6条序列和癌旁组织的3条序列中,分布差异无统计学意义（P>0.05）,但特殊的是插入突变序列中均存在AFP>20ng/ml,另外发生插入突变序列中有89%序列的位于HBX羧基端;3.HBX基因点突变情况本研究发现的热点氨基酸点突变,癌与癌旁组织中均存在,并非某一组织所特有;非差异性热点突变中,S78R、P152T突变检出率均在90%左右,是所有突变中检出率较高的热点突变;癌组织第47、118、130、131、130+131、132、143、30+144位氨基酸点突变率分别为53.6%、32.1%、78.6%、78.6%、76.8%、30.4%、28.6%、12.5%,高于癌旁组织的33.9%、14.3%、58.9%、58.9%、55.4%、10.7%、12.5%、1.8%,差异均有统计学意义（P均<0.05）,其余热点突变在癌与癌旁组织中间的检出率的差异无统计学意义（P>0.05）;4.差异性点突变对蛋白结构影响分析本研究提示的6个统计学差异的突变位点均位于HBX羧基端且其中5个位于EnhII（K118T）或BCP（K130M、V131I、F132Y/E、C143R/H）区域;A47T位于重要的TB细胞表位;K118T、K130M、V131I、F132Y/E位于重要的TH细胞表位（aa111-135）;K130M、V131I、F132Y/E突变位点TC细胞表位（aa126-134）之中;5.Beclin-1、LC3B及P62蛋白在癌与癌旁组织中的表达情况Beclin-1、LC3B及P62蛋白主要定位于细胞质中,为黄色、棕黄色染色颗粒,弥漫分布。与癌旁组织相比,癌组织Beclin-1、LC3B蛋白表达量降低,而P62蛋白表达量增加,差异均有统计学意义（P<0.05）;6.Beclin-1、LC3B及P62蛋白表达与临床病理特征的关系Beclin-1蛋白表达水平与肿瘤大小有关联（F=3.474,P=0.030）;LC3B蛋白表达水平与BCLC分期（A/B）有关联（t=5.960,P<0.0001）;P62蛋白表达水平与Edmondson分级,癌栓存在情况有关联（F=4.274,t=2.459,P均<0.05）;与其它临床病理特征差异均无统计学意义（P>0.05）。7.HBX突变与Beclin-1、LC3B及P62蛋白的相关性分析根据上述检测HBX突变体的实验结果,同时结合前期本课题组血清学实验结果及其他课题组研究成果,筛选出几个不同的HBX基因突变体,分别是羧基端缺失情况、V30L、A47T、V88N/D、K118T、K130M、V131I、F132Y/E、C143R/H、S144Y、V30L+S144Y、K130M+V131I、三联突变K130M+V131I+F132Y/E、三联突变K130M+V131I+C143R/H;相关分析结果显示:癌组织中,F132Y/E、V30L+S144Y双突变、K130M+V131I+F132Y/E三联突变与LC3B呈现正相关（rs=0.278、0.279、0.278,P均<0.05）;而在癌旁组织中,A47T与LC3B呈正相关（rs=0.270.270,P=0.045）;K118T氨基酸位点突变与Beclin-1蛋白的表达呈现负相关,分别是（rs=-0.325,P=0.014）,其余HBX突变未见与Beclin-1、LC3B及P62蛋白表达有相关性（P>0.05）。8.Beclin-1、LC3B及P62蛋白在癌与癌旁组织中表达的相关性分析癌旁组织中,Beclin-1和LC3B的表达呈正相关（r=0.416,P=0.001）;Beclin-1和P62的表达呈正相关（r=0.361,P=0.006）;LC3B和P62的表达无明显相关性（P>0.05）。癌组织中,Beclin-1、LC3B及P62的间均无明显相关性（P>0.05）。结论:1.HBX突变具有多态性;2.尽管HBX序列中点突变数量众多,但仅有部分点突变对HCC发生有影响;3.自噬活性降低可能与HCC的发生发展有关;4.HBX F132Y/E、V30L+S144Y双突变、K130M+V131I+F132Y/E三联突变可能与自噬延长过程有影响,这可能与HCC的发生发展进程有关。
王静[3]（2019）在《鸭乙型肝炎病毒环介导等温扩增检测系统的建立及其基因组序列分析》文中研究表明鸭乙型肝炎病毒与人乙肝病毒同属嗜肝DNA病毒科,它们在病毒的结构、病毒的复制过程、感染宿主机制和致病机制等方面比较类似,因而以鸭乙型肝炎病毒为动物感染模型对研究嗜肝病毒的复制周期并抑制病毒复制大有助益,DHBV体外感染原代鸭肝细胞模型和体内感染动物模型还可用来研究病毒基因的作用以及筛选治疗药物。本研究通过建立一种新型的环介导等温扩增检测系统,利用其特异性强、灵敏度高、快速简便的特点,优化构建出一套即能简化操作流程,又能满足快速检测需要的适用于基层单位及实地现场检测的检测系统。并通过不断地优化LAMP体系各组分配比和反应条件,建立一个最佳的能够特异检测鸭乙型肝炎病毒的LAMP反应体系,使鸭乙型肝炎病毒可以在基层环境大规模大批量被检测出来。经过大量的实验,得到了鸭乙型肝炎LAMP检测系统的最优化条件为:1.酚红和甲酚红混合染色液作为显色试剂,阳性结果显示为亮黄色,阴性结果显示为紫红色。颜色差别大,利于观察判定结果;2.通过设置梯度实验选择最佳Mg离子浓度,发现体系中Mg离子浓度为6mM时,扩增效果最好;3.通过调节dNTPs浓度发现,当dNTPs浓度为1.2 mM时,扩增效果最好;4.对LAMP体系进行时间梯度实验时,可观察到反应时间为50 min的电泳图条带最为明亮,扩增效果最好,因此选择反应50 min为最佳反应时间;5.进行LAMP温度梯度实验时,发现反应温度为63℃、64℃、65℃时,电泳胶图泳带都较为明亮,扩增效果较好,最后选择Bst DNA聚合酶的最佳酶活温度65℃作为反应的最优温度。利用优化好的LAPM检测系统批量检测河南南阳、安徽亳州、湖北潜江三地鸭场采集的鸭血清样本,筛选出携带DHBV病毒的阳性样本。结果显示,河南南阳、安徽亳州、湖北潜江三地的鸭乙型肝炎感染率分别为17.6%、13.6%、16.1%,差异统计学不显着（P>0.05）。从三地的DHBV阳性样本中各挑选1份进行DHBV全基因的克隆、测序和序列分析,河南南阳、安徽亳州、湖北潜江3株DHBV分离株基因组全长分别为3024、3027、3024 bp。序列分析数据显示3株DHBV间核苷酸同源性为95.1%97.4%,与选取的25株参考株同源性为90.3%96.2%。遗传进化树和P蛋白氨基酸关键位点分析证明,河南南阳、安徽亳州2株分离株为类中方基因型,湖北潜江分离株不属于中方型和西方型两大分支,属于独立小分支,可能产生了病毒重组。
邓浩辉[4]（2018）在《HIV单一和合并HBV或HCV感染者天然耐药及病毒学研究》文中进行了进一步梳理背景:人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus,HIV）呈世界流行,HIV感染者常合并乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）或丙型肝炎病毒（hepatitis Cvirus,HCV）感染。HIV/HBV、HIV/HCV 合并感染相对于 HBV、HCV 单一感染者明显加速肝病的进展和增加终末期肝病的发生率和死亡率。在HIV/HBV、HIV/HCV合并感染人群中合理使用抗病毒治疗对减少该人群终末期肝病的发生和肝病相关死亡率起至关重要的作用。抗病毒药物耐药变异是引起抗病毒治疗疗效下降和治疗失败的主要原因之一。了解HIV、HBV和HCV天然耐药变异的情况,可为临床合理使用和选择抗病毒药物提供理论依据。HBV和HCV在宿主体内是以准种的形式存在的,HIV感染致HBV或HCV准种的变化仅存在零散的,,小样本的研究,且国内研究较少。另外,HBV变异特别是基本核心启动子（BCP）变异在HIV/HBV合并感染与HBV单一感染者的差异在不同报道中结论并不一致,有必要进行大样本的研究,进一步了解HIV/HBV合并感染与HBV单一感染者BCP和preC变异的差异。目的:1.明确广东地区HIV单一感染、HIV/HBV和HIV/HCV合并感染者HIV、HBV和HCV天然耐药变异发生情况。2.了解HIV感染致HBV或HCV准种多样性及HBV BCP/preC变异位点的影响,进一步阐述HIV感染对HBV或HCV病毒自然史的影响。方法:第一部分共包括4个队列:（1）HBV感染队列（HIV/HBV合并感染和HBV单一感染者）;（2）HCV感染队列（HIV/HCV合并感染和HCV单一感染者）;（3）HIV感染队列（HIV单一感染者、HIV/HBV、HIV/HCV合并感染者）;（4）HIV/HBV/HCV三重感染者。各队列根据测序数据确定相关耐药变异并进行队列内比较。第二部分对HIT/HBV、HIV/HCV合并感染和HBV、HCV单一感染者各准种指标进行比较。第三部分对HIV/HBV合并感染和HBV单一感染者BCP/preC变异位点进行比较,并根据e抗原状态,HBV基因型进行分层分析。第四部分对广东地区HIV/HCV合并感染者构成比较高的HCV3b型进行起源分析。第五部分对本研究发现的一例广东地区HIV/HBV/HCV三重感染者的HIV-1 AIC独特重组亚型进行近全长序列分析。结果:1.HIV/HBV合并感染者HBV天然耐药变异明显高于HBV单一感染者,但HCV和HIV天然耐药变异在合并感染和单一感染者中无明显差异。2.HIV/HBV合并感染者HBV preC/C准种多样性明显低于HBV单一感染者,HIV/HCV合并感染者HCV NS5A准种多样性也明显低于HCV单一感染者。3.在HBV C基因型e抗原（-）组,HBV BCP变异在HBV合并感染者明显低于HBV单一感染者。4.广东地区HIV/HCV合并感染和HCV单一感染的HCV 3b亚型均起源云南,更早的源头可能位于泰国,最近共同祖先株时间为分别为23.7和23.8年前,部分HIV/HCV合并感染HCV毒株来源于广东地区HCV单一感染者。5.通过对该例HIV/HBV/HCV三重感染者HIV近全长序列进行分析,明确该例HIV-1重组亚型为AIC。结论:1.HBV天然耐药变异在HIV/HBV合并感染者高于HBV单一感染者,但HCV和HIV天然耐药变异在合并感染和单一感染者无明显差异。2.HIV感染可下调HBV或HCV准种多样性,也可下调HBV BCP变异毒株的选择。3.广东地区HIV/HCV合并感染患者HCV3b型主要起源于云南地区,部分起源于本地区的HCV单一感染者。4.广东地区HIV感染者存在HIV-1 A1C独特重组亚型。
夏方娜[5]（2016）在《乙型肝炎病毒核心基因内部缺失突变体的筛查及其对非折叠蛋白反应调节作用》文中进行了进一步梳理研究背景:HBV是高变异的DNA病毒,其基因组是长约3.2 kb的部分双链环状DNA分子。HBV基因组上的变异包括点突变、缺失突变和移码突变等。缺失突变可发生在基因组不同编码框架中,HBV核心基因的内部缺失（core internal deletion,CID）突变体也有报道。HBV CID突变体可能改变HBV的生物学及致病性质。因此,调查江西地区慢性乙肝感染者的HBV CID突变体的流行情况,分析其基本生物学性质,对于进一步认识HBV致病性有重要意义。研究目的:初步研究江西地区慢性乙型肝炎患者HBV CID突变体的流行率,阐明HBV CID突变体的分子特征。构建HBV CID突变体的真核表达质粒,将其转染肝癌Hep G2细胞,观察HBV CID突变体表达产物的分泌特征,并初步阐述HBV CID突变体对宿主细胞非折叠蛋白反应的调节作用,进一步认识HBV致病的复杂性。研究方法:1.于2014,10-2015,6,从南昌大学第二附属医院门诊检验科收集189例慢性乙型肝炎患者HBs Ag阳性血清作为研究材料,提取病人血清中的HBV DNA。2.采用PCR技术扩增HBV基因组中长约840 bp的C基因DNA片段,命名为HBV-C,其包含Enh II+BCP+Pre C+C基因,产物电泳,目的条带回收、纯化并进行测序。3.利用Clustal X和Bioedit软件将所获得的HBV C区基因核苷酸和氨基酸序列与参考序列进行比对,分析缺失突变位点,以及HBV CID突变株的流行率。4.选取一例含有CID突变的变异株,PCR大量扩增,产物电泳,收集标准片段和缺失片段,将其克隆至真核表达质粒p Bud CE4.1中,构建真核表达载体p Bud CE4.1-HBV-C和p Bud CE4.1-HBV-CID,双酶切及测序鉴定。5.质粒p Bud CE4.1-HBV-C、p Bud CE4.1-HBV-CID以及p Bud CE4.1空质粒转染Hep G2细胞48 h后,收集细胞培养液以及细胞裂解液,ELISA检测其中HBe Ag的表达。6.提取p Bud CE4.1-HBV-C、p Bud CE4.1-HBV-CID以及p Bud CE4.1DNA转染Hep G2细胞后24 h、48 h和72 h时相点的总RNA,RT-PCR检测与非折叠蛋白反应相关蛋白ATF4、ATF6、XBP1-s和GRP78的m RNA的表达。研究结果:1.189份的HBs Ag阳性感染者的平均年龄为48±6.51岁,男性102人（53.97%）,女性87人（46.03%）。2.HBV C区基因PCR扩增结果显示,7例标本中扩增出含840 bp和700 bp左右大小的二条带,序列比对发现840 bp产物为完整C区基因,即含Enh II-BCP-Pre C-C基因的完整序列,而700 bp产物出现了C区基因内部缺失突变,为HBV CID突变体。3.HBV CID突变体序列与HBV C区基因序列比对结果显示,7例HBV CID突变体的缺失区域分别位于nt2152-2265、nt2132-2239、nt2163-2306、nt2179-2283、nt2131-2247、nt2151-2252、nt2180-2203/nt2255-2332。4.7例HBV CID突变体氨基酸缺失区域分别位于aa84-121、aa78-113、aa89-136、aa94-128、aa78-116、aa84-117、aa94-101/aa119-144,分别导致b1/b2/c2/t3、b1/b2/c2/t3、b1/b2/b3/c2/t3、b2/c2/t3、b1/b2/c2/t3、b1/b2/c2/t3和b3/c2/t3免疫位点的丢失。5.质粒DNA双酶切及DNA测序结果证实,重组质粒p Bud CE4.1-HBV-C和p Bud CE4.1-HBV-CID构建成功,分别携带有840 bp和700 bp大小的目的基因。6.ELISA检测质粒转染的Hep G2细胞中HBe Ag表达结果显示,p Bud CE4.1-HBV-C组的细胞培养液和细胞裂解液中HBe Ag的表达量最高,显着高于p Bud CE4.1空载体组和p Bud CE4.1-HBV-CID转染组（P<0.05）。p Bud CE4.1-HBV-CID转染组的细胞裂解液中可检测到较低水平的HBe Ag表达,在培养液中未检测到HBe Ag表达。7.RT-PCR结果显示,p Bud CE4.1-HBV-CID组的ATF4、ATF6、XBP1-s、GRP78基因m RNA的表达量显着高于p Bud CE4.1对照组和p Bud CE4.1-HBV-C组（P<0.05）。结论:1.江西地区慢性乙肝患者中存在HBV CID突变体的流行,初步调查结果显示流行率为3.7%。2.在本地区发现的HBV CID突变体的缺失为编码框架内缺失,缺失区域主要位于nt2131-2306区域。3.HBV CID突变体（aa78-136）可能会导致某些具有免疫优势的表位缺失,从而造成免疫逃避现象,这可能导致乙型肝炎慢性化和持续化的一个重要机制。4.所发现的HBV CID突变体缺失的氨基酸序列未破坏HBV核心蛋白参与病毒衣壳组装的结构域。5.HBV CID突变体的表达产物空间折叠构像可能不同于HBV C基因表达的HBe Ag,是HBV CID突变体表达产物不能分泌的一种机制。6.HBV CID突变体明显激活UPR反应相关蛋白的表达,说明HBV CID突变体参与细胞UPR反应的调节作用。
魏玉荣[6]（2016）在《新疆非禽类野生动物流感抗体调查与流感病毒样颗粒疫苗研究》文中进行了进一步梳理A型流感病毒是真正人畜共患病原并具有高度传染性。尽管A型流感病毒有着严格的宿主范围,但是跨种传播时有发生。近年来除了人可被禽流感H5N1、H9N2和H7N9病毒感染外,还有多种动物被流感病毒感染的报道,并从猫、果子狸、老虎、狮子和红狐中分离到H5N1禽流感病毒。野生鸟类被看作是A流感病毒的主要携带者,随着其长距离跨境迁徙潜在传播并扩散病毒。新疆位于候鸟东非-西亚迁徙线,境内栖息着大量鸟类和非禽类野生动物。由于野生动物和这些迁徙的鸟类共享栖息地,野生动物存在被流感病毒感染的风险。鉴于动物流感的严重危害性及野生动物携带流感病毒的潜在威胁性,本研究中利用血凝抑制试验（HI）和竞争ELISA（c-ELISA）方法调查了新疆非禽类野生动物中流感H5、H7和H9亚型的暴露现状,为野生动物流感防控提供数据资料。A型流感病毒通过突变、重配和重组不断地适应着新宿主,疫苗是预防其暴发流行的有效手段。病毒样颗粒（virus-like particle,VLP）可通过其结构蛋白自我组装出芽形成病毒粒子,结构模拟病毒自身但是不能自我复制,确保了安全性及免疫原性。同时,因流感VLPs不依赖于鸡胚而被视为流感疫苗候选者。目的:本研究以流感病毒为研究对象,调查新疆部分非禽类野生动物中禽流感血清学数据,并利用家蚕及Bac-to-Bac杆状病毒表达系统构建流感VLPs研究其免疫原性,为流感储备疫苗研究提供数据参考。（1）了解新疆非禽类野生动物禽流感暴露现状;（2）探索以家蚕作为生物反应器生产流感VLPs;（3）探索Bac-to-Bac杆状病毒表达系统制备流感新型储备疫苗;（4）评估流感嵌合病毒样颗粒（cVLPs）免疫原性。方法:（1）采用HI及c-ELISA方法对2009年2013年采集的246份野生动物（盘羊、岩羊、鹅喉羚、牦牛、野猪、马鹿、狼、北山羊及狍子）血清样品进行禽流感病毒H5、H7及H9亚型的血清学调查。（2）构建家蚕重组杆状病毒rBmNPV（HA-M1-NA）,感染家蚕5龄幼虫及蚕蛹,经血凝抑制试验、电镜观察、小鼠免疫试验及攻毒保护评价家蚕杆状病毒表达流感VLPs免疫原性。（3）利用Bac-to-Bac表达系统构建重组杆状病毒AcMNPV（HA-M1-NA）,感染昆虫细胞Sf 9,经western blotting及免疫荧光检测目的蛋白表达、电镜观察流感VLPs、小鼠免疫后检测T细胞增殖及测定细胞因子浓度,评价Bac-to-Bac表达系统构建重组流感VLPs免疫原性。（4）将纤毛蛋白基因fliC通过基因合成嵌合于流感病毒HA基因中构建流感cVLPs,经western blotting及免疫荧光检测目的蛋白表达、电镜观察流感病毒样颗粒、小鼠免疫后检测IgG水平和测定细胞因子浓度及攻毒试验,评价流感病cVLPs免疫原性。结果:（1）新疆部分非禽类野生动物禽流感血清学调查:HI检测结果显示4.47%血清样品流感抗体阳性;狼和盘羊血清样品H7亚型抗体阳性率分别为9.09%和4.55%;鹅喉羚、狼、岩羊和盘羊血清样品H9亚型抗体阳性率分别为2.27%,27.27%,23.08%和4.55%。c-ELISA结果显示4.88%血清样品流感抗体阳性;鹅喉羚、狼、岩羊和盘羊血清阳性率分别为6.82%,36.36%,23.08%和9.09%。马鹿、野猪、北山羊、狍子和牦牛血清样品中禽流感H5、H7及H9亚型抗体均为阴性。（2）家蚕及蚕蛹能正确表达并组装具有血凝活性的流感病VLPs,获得的流感VLPs免疫小鼠之后,可诱导小鼠产生特异性抗体;攻毒保护试验结果表明获得的流感颗粒具有较强的免疫原性;肌注免疫途径效果最佳。（3）利用Bac-to-Bac表达系统成功构建重组杆状病毒AcMNPV（HA-M1-NA）,感染昆虫细胞Sf 9之后,细胞能够正确表达流感病VLPs,该VLPs免疫小鼠能诱导T细胞活化,血清中可检测到高浓度的IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ细胞因子,表明Bac-to-Bac/IC系统表达的流感VLPs可诱导Th1和Th2型免疫反应。（4）重组杆状病毒AcMNPV-HA-fliC-NA-M1,感染昆虫细胞Sf 9之后,细胞能够表达并正确组装流感cVLPs,该cVLPs免疫小鼠可诱导T细胞活化;血清中可检测到高浓度的IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ细胞因子;cVLP免疫小鼠血清中有较高水平IgG抗体,且IgG抗体亚型分布以IgG1和IgG2b为主;攻毒保护试验结果表明获得的流感cVLPs具有异源异型交叉保护性。结论:（1）一定比例新疆非禽类野生动物曾感染过禽流感病毒。鹅喉羚、狼、岩羊和盘羊血清样品H9亚型抗体阳性;狼和盘羊血清样品H7亚型抗体阳性;马鹿、野猪、北山羊、狍子和牦牛血清样品H5、H7及H9亚型抗体均为阴性。（2）家蚕杆状病毒表达系统能够表达并组装有血凝活性的流感VLPs;该VLPs免疫小鼠后可诱导产生特异性抗体;攻毒保护试验表明其具有较强的免疫原性;肌注免疫途径效果最佳。（3）Bac-to-Bac杆状病毒表达系统能表达并正确组装出具有较强免疫原性的流感VLPs,该VLPs可诱导免疫小鼠机体产生Th1和Th2型免疫反应。（4）成功制备流感cVLPs且具有较强的免疫原性,可诱导小鼠T细胞活化,血清中有高浓度的IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ细胞因子及IgG抗体。攻毒保护试验结果表明cVLPs具有异源交叉保护性。
史新昌[7]（2014）在《含真核表达质粒的营养缺陷型大肠杆菌工程菌株作为基因治疗口服递送载体系统的研究》文中进行了进一步梳理背景和目的:利用肠道黏膜免疫系统特点（包括:分泌性免疫为主、口服正常菌群微生物耐受、黏膜记忆应答弱和肠道内正常菌群可向肠黏膜下移位等）和大肠杆菌内移位性质,将含有真核表达质粒且具有破吞噬泡能力的菌壁营养缺陷型大肠杆菌工程菌株补充入肠道,将真核表达质粒传递给肠黏膜下细胞,使这些真核细胞分泌表达目的蛋白产生生物学效应。方法和结果:第一部分:以非病理性大肠杆菌工程菌DH10B为基础,利用pKD46介导的重组系统和kan/kil两次筛选系统,敲除其菌壁肽聚糖层重要成分（DAP）合成关键酶（ASD）基因,获得无抗抗生素基因标记的菌壁营养缺陷型大肠杆菌菌株E.coli DH10BΔasd,并对所得菌株进行性质检测,表型特征为菌壁营养缺陷型,革兰氏阴性杆菌,生化反应为典型大肠杆菌代谢特征;抗性特征为具有原菌株链霉素抗性;对数生长期增值速度为21.1分钟/代;在37℃条件下普通LB培养基中的半数裂解速度约为24小时等。第二部分:构建真核表达质粒（pdvnirbhlycmvgene）,该质粒承载有nirb启动子（原核低氧启动子）控制的hly基因表达盒,并进一步将人促红细胞生成素（epo）基因和增强绿色荧光蛋白（egfp）基因分别构建入该质粒cmv启动子之下,获得真核表达质粒（pdvnirbhlycmvepo和pdvnirbhlycmvegfp）,并对所得质粒进行鉴定,包括目的dna测序,质粒限制性内切酶酶切图谱分析,证实质粒构建正确;通过菌体还原型sds-page、菌体westernblot、挖膜n-末端氨基酸序列实验测定证实llo蛋白表达正确;通过转染质粒pdvnirbhlycmvepo的细胞培养液的免疫斑点、还原型sds-page、挖膜n-末端氨基酸序列实验测定证实epo蛋白表达正确;通过荧光显微镜观察转染pdvnirbhlycmvegfp质粒细胞,证实绿色荧光蛋白（egfp）表达等。第三部分:将获得的上述质粒电转入e.colidh10bΔasd,筛选获得重组菌株e.colidh10bΔasd（pdvnirbhlycmvepo）和重组菌株e.colidh10bΔasd（pdvnirbhlycmvegfp）。检测重组菌株e.colidh10bΔasd（pdvnirbhlycmvepo）表型特征为菌壁营养缺陷型,革兰氏阴性杆菌,生化反应为典型大肠杆菌代谢特征;抗性特征为具有链霉素抗性和卡那霉素抗性;对数生长期增值速度为29.6分钟/代;在37℃条件下普通lb培养基中的半数裂解速度约为24小时等。观察balb/c小鼠对菌株灌胃后的反应,确定安全灌胃剂量,证实灌胃剂量小于2×109cfu/只为安全剂量。重组菌株e.colidh10bΔasd（pdvnirbhlycmvegfp）体外被小鼠腹腔吞噬细胞吞噬过程观察,显示小鼠腹腔吞噬细胞可主动吞噬该细胞株并在荧光显微镜下观察到表达egfp细胞存在。激光扫描共聚焦荧光显微镜结果证实菌体可被吞入或侵袭入细胞。重组菌株e.colidh10bΔasd（pdvnirbhlycmvegfp）体外转染细胞（caco-2细胞、hela细胞、nih/3t3细胞、ana-1细胞、小鼠腹腔吞噬细胞）荧光显微镜下可以观察到表达egfp细胞存在。这些结果证实该重组菌株可将所含有的质粒传递给被侵袭的细胞。流式细胞仪的检测结果显示,被转染后表达egfp细胞比例分别为0.5%、0.2%、0.2%、0.1%和0.2%,与细胞计数法测量结果一致。分别取使用重组菌株e.colidh10bΔasd（pdvnirbhlycmvepo）和重组菌株e.colidh10bΔasd（pdvnirbhlycmvegfp）灌胃后balb/c小鼠肠道组织进行组织切片和免疫组化实验（抗llo抗体）,证实灌胃重组菌株e.colidh10bΔasd（pdvnirbhlycmvepo）的balb/c小鼠肠道组织部分细胞基质内有llo蛋白存在,并且肠黏膜结构完整,细胞结构清晰,说明该重组菌菌体蛋白llo被释放入细胞基质;灌胃重组菌株e.colidh10bΔasd（pdvnirbhlycmvegfp）的balb/c小鼠肠道组织细胞内观察到egfp的表达,说明重组菌在细胞基质内释放了所含真核表达质粒pdvnirbhlycmvegfp,并且所载的egfp基因进行了表达。以上实验证实重组菌株e.colidh10bΔasd（pdvnirbhlycmvgene）作为基因递送系统,具有向细胞基质释放内容物的能力。用重组菌株e.colidh10bΔasd（pdvnirbhlycmvepo）灌胃balb/c小鼠,检测小鼠网织红细胞比例变化,实验组与空对照组比较,经t检验统计分析,p<0.05,数据组间差别显着,实验组的平均值为空对照组平均值的2.13倍。间隔21天后的再次灌胃后,实验组与空对照组比较,经t检验统计分析,p<0.05,仍然差别显着,实验组的平均值为空对照组平均值的约1.53倍。以上实验证实递送epo基因表达了epo蛋白,所表达epo蛋白发挥了生理作用。组织活菌培养检测重组菌株e.colidh10bΔasd（pdvnirbhlycmvepo）在balb/c小鼠体内的分布,显示在最初的1小时内肝脏中可检测到活菌,肠系膜淋巴结（含部分肠系膜）可在检测时间点检测到活菌,在其他位置未能检测到活菌。用rtq-pcr法检测重组菌株e.colidh10bΔasd（pdvnirbhlycmvepo）所携带的质粒,结果显示质粒向小鼠其他位置分布。以上两实验证实灌胃重组菌株后,在吞噬细胞携带重组菌株通过门静脉和肠道淋巴两条途径,向小鼠全身分布。多器官免疫组化实验检测质粒pdvnirbhlycmvegfp表达位置,证实pdvnirbhlycmvegfp主要在肝脏和脾脏内表达,其他器官偶有表达。结论:综上所述,本研究用同源重组技术和kan/kil反筛选系统获得无引入筛选抗性基因的细菌壁营养缺陷型菌株e.colidh10bΔasd;构建真核表达质粒pDVnirbhlycmvgene;筛选后获得重组菌株E.coli DH10BΔasd（pDVnirbhlycmvgene）,经本研究证实该重组菌可将所载目的基因传递给机体细胞,并生成治疗用活性蛋白,达到一定的生物效应;同时也证实了通过灌胃含质粒活菌制剂,经肠道黏膜进行基因治疗方案可行,如对载体菌进行进一步的改造,将具有较好的应用前景。与传统基因治疗向机体注射载体不同,本研究是向机体胃肠道内补充含质粒活菌制剂,利用自然界原有的细菌移位途径,将目的基因传递给机体细胞,产生生物效应。本系统的优点为避免注射,同时还可以降低生产成本,方便储存运输。目前本研究的局限性为,目的基因表达量仍然有待进一步提高。此外,提出一个肠道黏膜免疫屏障强度自动控制假说,即在肠道黏膜免疫屏障完整的情况下,PP结可看作“肠道内生物威胁强度的感受器”,以与肠道内微生物等“接触”的方式进行评估,激发效应链,维持肠道黏膜屏障强度,削弱来自肠道内生物威胁强度,将来自肠道内的生物威胁强度限制在可控范围内,借以适应环境变化,特别是肠道微环境的变化。
邱玲[8]（2014）在《乙肝表面抗原在酿酒酵母中的异源表达及优化》文中研究指明乙肝表面抗原（HBsAg）是乙肝疫苗的主要有效成分。利用酿酒酵母表达重组乙肝表面抗原已成为制备基因工程乙肝疫苗的主要途径。本论文利用基因工程技术，将优化的乙肝表面抗原基因在酿酒酵母中进行异源表达，分别从转录水平、翻译水平以及翻译后水平进行优化，显着提高HBsAg的表达活性；并通过摇瓶发酵优化进一步提高HBsAg在重组酿酒酵母中的表达水平。本论文主要研究内容如下：在酿酒酵母中利用TEF1启动子实现HBsAg的异源表达。将HBsAg基因序列按照酿酒酵母密码子偏好性进行优化并合成，构建重组表达载体及相应重组菌。发酵后检测HBsAg活性。结果显示，HBsAg活性为9.82IU g-1干重，表明在酿酒酵母中利用组成型强启动子TEF1成功实现HBsAg的异源表达，且产物具有免疫活性。为了简化产物的纯化，比较了在N端和C端分别添加6×His纯化标签时HBsAg的表达，发现在C端添加His标签对HBsAg表达的影响较小（HBsAg活性降至8.87IU g-1干重）。通过筛选启动子、优化kozak序列、筛选信号肽及共表达PDI分别从转录、翻译和翻译后水平进行优化，使HBsAg活性从初始的8.87IU g-1干重提高至186.11IU g-1干重，提高了20倍。（1）分别利用酿酒酵母组成型的TEF1、TDH3、HXT7、ADH1及诱导型的GAL1五种启动子表达HBsAg，发现GAL1最适合表达HBsAg （46.45IU g-1干重），较启动子TEF1提高了3.87倍。（2）将GCCACC、TACACA和AAAAAA三种kozak序列分别用于HBsAg的表达，发现序列TACACA最有利于HBsAg的表达（63.67IU g-1干重），使活性提高37%。（3）尝试利用应用广泛的酿酒酵母α-factor信号肽、专利报道分泌效率很高的酿酒酵母ybr187w信号肽及南极假丝酵母脂肪酶B的信号肽nsB分别引导HBsAg实现分泌时，均未能成功分泌HBsAg，但发现添加nsB信号肽能促进HBsAg的表达（83.56IU g-1干重），使活性提高31.24%。（4）将蛋白质二硫键异构酶PDI与HBsAg进行共表达，使HBsAg活性进一步提高了1.23倍，为186.11IU g-1干重。对最优重组菌进行摇瓶发酵优化，使HBsAg活性提高了75.2%。为了进一步提高HBsAg的表达水平，在摇瓶水平上，分别对培养条件、培养基组成、添加剂进行优化，优化后的发酵条件为温度30℃、初始pH5.0、装液20mL （250mL摇瓶）、初始OD600为0.5、发酵72h；优化的培养基组成为（g L-1）：半乳糖15、葡萄糖25、胰蛋白胨20、酵母粉10；添加甘油4g L-1和蔗糖6g L-1；经过发酵优化，HBsAg活性提高了75.2%，从185.93IU g-1干重提高至325.75IU g-1干重，实现了HBsAg在酿酒酵母中的较高水平表达。
李继东[9]（2014）在《小反刍兽疫及口蹄疫病毒抗原基因重组山羊痘病毒活载体疫苗的研究》文中进行了进一步梳理口蹄疫（foot and mouth disease，FMD）、小反刍兽疫（peste des petits ruminants，PPR）和羊痘（capripox，CP）是危害山羊、绵羊等小型反刍动物的3种重大疫病，均为世界动物卫生组织（OIE）发布的A类烈性传染病。3种疫病的病原分别是口蹄疫病毒（foot and mouth disease virus，FMDV）、小反刍兽疫病毒（peste des petits ruminants virus，PPRV）和羊痘病毒（capripoxvirus，CPV）。目前这3类疫病的防控主要依靠灭活苗或弱毒苗，在实际应用中存在着免疫持续期短、热稳定性差、病毒毒力有返强风险等诸多缺陷。因此，需要研制更为安全高效的新型疫苗。病毒载体是现代生物科学研究的热点之一，诸多病毒载体已成功构建，并成为研制新型疫苗的候选工具。羊痘病毒活载体就是其中之一。在上述3种感染羊的病毒中，PPRV的H蛋白和F蛋白是刺激机体产生中和抗体的主要抗原；而FMDV的P1-2A在3C的作用下可以形成病毒的核衣壳，是中和抗体产生的主要诱导物，其中P1蛋白中的VP1片段是抗原决定簇最集中的区域，因此，PPRV的H和F基因、FMDV的VP1基因和P12A3C片段是研制亚单位疫苗和重组疫苗的主要候选基因。本研究利用DNA重组技术，构建用于羊痘病毒重组的基因工程转移载体，通过转移载体和病毒之间的同源重组，将PPRV和FMDV的抗原基因分别插入到羊痘病毒基因组中，形成重组羊痘病毒，作为转运外源蛋白的活载体，旨在研制一种能有效预防PPR、羊FMD、羊痘的高效疫苗。获得结果如下：1.构建了重组转移质粒ptkpp，并通过延长重组同源臂、插入报告基因GFP和压力筛选基因gpt、引入多克隆位点，优化了其功能，最后形成了可重复使用的转移质粒pftkpgigp和pftkpgigpi；验证了重组转移质粒启动子p7.5和p11的功能，为此系列质粒的正常使用奠定了基础。2.将PPRV和O型FMDV的抗原基因分别插入转移质粒pftkpgigp和pftkpgigpi的多克隆位点中，构建了6个重组质粒：pftkpgigp-H、pftkpgigp-F、pftkpgigp-VP1、pftkpgigp-P12A3C、pftkpgigp-H-i-P12A3C、pftkpgigp-F-i-P12A3C，以用于和羊痘病毒的同源重组。3.用脂质体转染法将6个重组转移质粒分别导入预先感染羊痘病毒的羔羊睾丸细胞中，经同源重组获得了6株重组羊痘病毒第一代混悬液。然后用选择培养液反复培养筛选纯化，通过GFP的表达、细胞病变效应以及PCR法检测，初步鉴定形成了4株重组GPV，分别命名为rGPV/FMDV-VP1（携带FMDV VP1基因）、rGPV/PPRV-F（携带PPRV F基因）、rGPV/PPRV-H（携带PPRV H基因）、rGPV/PPRVF-FMDVP12A3C（携带PPRV F基因和FMDV的P12A3C片段）。4.4株rGPV分别感染LT细胞，经RT-PCR检测mRNA的转录状况，后用间接免疫荧光技术检测外源基因的表达。结果显示，所有插入的外源基因得到了正常转录，其表达产物与特异性抗体之间产生了良好的免疫反应。5.4株rGPV按105TCID50剂量经皮内接种山羊，分别诱导产生了较高水平的抗GPV、FMDV和PPRV抗体；产生的抗GPV抗体效价和GPV疫苗差异不显着，抗FMDV抗体效价和疫苗组差异显着，抗PPRV效价在加强免疫后和疫苗组差异不显着。
曹永生[10]（2013）在《Asia1型FMDV复合表位免疫原的研制及免疫效果研究》文中研究表明口蹄疫（Foot-and-mouth Disease，FMD）作为一种全球范围内的重大动物疫病，已成为当前动物及其产品国际贸易的主要障碍。O、A、Asia1型FMD是我国一直以来的防治重点，灭活疫苗在预防和控制FMD的过程中发挥着重要作用。机体抵抗口蹄疫病毒（Foot-and-mouth Disease Virus，FMDV）感染过程中，依赖于中和抗体的体液免疫反应是最主要的。虽然灭活疫苗免疫能够产生高水平的中和抗体，但高水平的中和抗体并不是总能为机体提供完全的保护，同时CD4+T细胞在诱导机体体液抗体水平方面发挥着重要的作用，提示同时提高机体的体液免疫和细胞免疫对于FMD的预防更有意义。复合表位疫苗减少了疫苗中与免疫无关的成分，同时可对T、B细胞抗原表位进行不同组合，是实现口蹄疫体液免疫应答和细胞免疫应答的理想选择。FMDV主要是依靠接触和空气进行传播，黏膜免疫应答能够在黏膜部位产生大量的分泌性的sIgA，分泌性的sIgA不仅可以在第一时间中和病毒，而且可通过黏膜的方式进一步激活系统免疫反应，进而阻止病毒的侵入。所以有效的诱导黏膜部位产生sIgA是口蹄疫疫苗发展的新方向。本研究人工设计了复合表位肽，并分别以乙型肝炎病毒核心抗原（HBcAg）和牛IgG2a Fc片段为载体，利用原核表达系统和毕赤酵母表达系统，制备三种复合表位免疫原pET28a-HBc-EB、pET22b-EB-BIg和rGS115-pPICZA-HBc-EB，通过腹腔注射、口服和滴鼻三种途径分别对小鼠进行免疫，从体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫水平对复合表位疫苗的免疫效果进行综合评价。（1）Asia1型FMDV复合表位免疫原的设计及合成选取VP1上第140160位、第200211位两个B细胞表位和VP1上第2040位、3A上第2135两个T细胞表位为候选表位，并在其间引入合适的linker序列，构成了Asia1型FMDV的复合表位。该复合表位肽通过linker序列GSGSG融合于HBcAg的第7879位氨基酸（刺突位置），软件分析表明，Linker序列在表位之间形成柔性区域和转角，特别是序列（G4S）3的引入保证了两个B细胞表位的独立作用，而复合表位肽所在的HBc刺突位置具有较高的抗原性且大部分存在于表位部分，并有出现在分子表面的可能性，将融合有复合表位的HBcAg序列优化后合成。（2）复合表位免疫原在原核表达系统中的制备及腹腔免疫效果评价1)复合表位免疫原在原核表达系统中的制备以合成的质粒pUC57-simple-HBc-EB为模板，PCR扩增出目的基因，产物酶切后与pET28a连接，得到重组表达质粒pET28a-HBc-EB。以合成的含有牛IgG2a Fc片段基因的pUC57-simple-BIg质粒为模板，扩增出牛IgG2a Fc片段基因，并利用融合PCR方法与复合表位基因连接，酶切后与pET22b连接，得到重组表达质粒pET22b-EB-BIg。复性后的重组pET28a-HBc-EB在电镜下可观察到病毒样粒子的存在，而重组蛋白pET22b-EB-BIg也形成了类似免疫球蛋白单体的形式，能够与兔抗牛抗体直接结合。Western blot鉴定结果表明两免疫原均具备良好的抗原性，更为重要的是Dot ELISA结果显示复性后的复合表位免疫原能够与Asia1型FMDV VP1构象表位抗体很好的结合，间接说明复合后的表位免疫原能够一定程度上折叠为类似于Asia1型VP1蛋白构象型表位的抗原结构。2)复合表位免疫原腹腔免疫效果评价免疫后28d的检测结果表明，pET28a-HBc-EB组和pET22b-EB-BIg组小鼠抗体水平显着高于疫苗免疫组（P＜0.01或P＜0.05），pET28a-HBc-EB组的抗体水平显着高于pET22b-EB-BIg组（P＜0.05）；pET28a-HBc-EB组液相阻断抗体效价高于疫苗免疫组，为1:2561:512；而pET22b-EB-BIg组液相阻断抗体效价为1:1281:256，与灭活疫苗组相当；pET28a-HBc-EB组和pET22b-EB-BIg组的淋巴细胞刺激指数显着高于灭活疫苗免疫组（P＜0.01）。pET28a-HBc-EB组和pET22b-EB-BIg组的CD4+/CD8+比值显着高于灭活疫苗组（P＜0.01，P＜0.05）。pET28a-HBc-EB组和pET22b-EB-BIg组小鼠脾细胞刺激后产生的IL-2和IFN-γ显着高于灭活疫苗组（P＜0.01），pET28a-HBc-EB组IL-4和IL-10产生水平显着高于灭活疫苗组（P＜0.05），而pET22b-EB-BIg组与灭活疫苗组无显着差异。表明Asia1型FMDV多表位免疫原具有良好的免疫效果，既可刺激机体产生高水平的体液免疫，又可以刺激机体发生细胞免疫，其中以pET28a-HBc-EB组免疫效果最佳。复合表位免疫原腹腔免疫较为理想的效果证实了复合表位免疫原的有效性，为口服免疫和滴鼻免疫提供了保证。（3）复合表位免疫原在毕赤酵母表达系统中的制备及口服免疫效果评价1)复合表位免疫原在毕赤酵母表达系统中的制备本研究鉴于毕赤酵母具备真核细胞表达系统的修饰功能的特点，以期获得具有天然结构的复合表位免疫原。酶切重组质粒pET28a-HBc-EB，获得复合表位多肽基因，与pPICZA胞内表达载体连接，获得重组质粒pPICZA-HBc-EB；以本实验保存的含有Asia1型FMDV全基因的质粒为模板，分别扩增病毒衣壳蛋白编码基因，并分别克隆于毕赤酵母表达载体pPICZA中，然后通过PCR方法在含有各表达盒两端引入酶切位点，各表达盒经酶切后依次将连入pPICZA载体中，最终构建酵母表达质粒pPICZA-vp031；Western blot和Dot ELISA鉴定结果表明表达产物具有良好的抗原性。2)重组毕赤酵母以5×108CFU剂量口服免疫小鼠，免疫后28d检测结果表明，pPICZA-HBc-EB组和pPICZA-vp031组抗体水平显着低于灭活疫苗免疫组（P＜0.01）；液相阻断抗体效价为1:81:16；毕赤酵母免疫组小鼠黏膜冲洗液sIgA和特异性sIgA总量显着高于疫苗组（P＜0.01）；pPICZA-HBc-EB组和pPICZA-vp031组的黏膜特异性sIgA显着高于灭活疫苗组（P＜0.01）；pPICZA-HBc-EB组和pPICZA-vp031组淋巴细胞增殖指数均显着高于灭活疫苗免疫组（P＜0.01），而pPICZA-HBc-EB组显着高于pPICZA-vp031组（P＜0.05）；灭活疫苗组CD4+/CD8+比值显着高于pPICZA-HBc-EB组和pPICZA-vp031组（P＜0.01）；pPICZA-HBc-EB组小鼠脾细胞刺激后产生的IL-2和IFN-γ显着高于灭活疫苗组（P＜0.01），而pPICZA-vp031组则与灭活疫苗组无显着差异（P＞0.05），pPICZA-HBc-EB组和pPICZA-vp031组IL-4和IL-10水平与灭活疫苗组无显着差异（P＞0.05）。说明口服重组酵母菌不仅可刺激机体产生体液免疫和细胞免疫，而且还能显着地诱导机体黏膜免疫。证实了复合表位免疫原通过口服免疫激发黏膜免疫的可行性。（4）复合表位免疫原滴鼻免疫效果的评价利用原核系统制备的复合表位疫苗对小鼠进行滴鼻免疫，免疫后28d pET22b-EB-BIg组抗体水平显着高于pET28a-HBc-EB组（P＜0.01），显着低于灭活疫苗免疫组（P＜0.01），且抗体上升趋势较为缓慢；液相阻断抗体效价低于1:8；pET22b-EB-BIg滴鼻免疫组黏膜冲洗液总sIgA水平、黏膜特异性sIgA抗体水平显着高于灭活疫苗组、pET28a-HBc-EB滴鼻免疫组（P＜0.01）；pET22b-EB-BIg滴鼻免疫组的刺激指数显着高于其他各组（P＜0.05）；pET22b-EB-BIg滴鼻免疫组CD4+/CD8+比值显着低于灭活疫苗免疫组（P＜0.01）。上述结果说明pET22b-EB-BIg免疫后小鼠上支气管和肺部冲洗液、肠冲洗液和生殖道冲洗液中均有特异性sIgA的分泌，同时机体产生一定的体液免疫和细胞免疫，而pET28a-HBc-EB则无此效应，首次实践了靶向FcRn激发黏膜免疫的可行性，为FMD黏膜疫苗的制备提供一种新的思路。
二、改变乙型肝炎病毒核心抗原基因3′端序列对其在原核细胞中表达的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、改变乙型肝炎病毒核心抗原基因3′端序列对其在原核细胞中表达的影响（论文提纲范文）
（1）HIV和HBV病毒蛋白同宿主细胞的相互作用机制研究（论文提纲范文）
| 本研究的创新点 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 人类免疫缺陷病毒Nef蛋白调控Fas凋亡通路的分子机制 |
| 1 研究背景 |
| 1.1 HIV及调控蛋白Nef |
| 1.1.1 HIV基因组 |
| 1.1.2 Nef的特点 |
| 1.1.3 Nef对表面受体的调控 |
| 1.1.4 Nef对信号通路的调控 |
| 1.2 细胞凋亡的信号途径 |
| 1.2.1 死亡受体介导的凋亡信号通路 |
| 1.2.2 内质网介导的凋亡信号通路 |
| 1.2.3 线粒体介导的凋亡信号通路 |
| 1.3 细胞色素B与细胞凋亡 |
| 2 试剂与材料 |
| 2.1 菌株、质粒与细胞 |
| 2.2.1 菌株、细胞与动物 |
| 2.2.2 质粒 |
| 2.2 文库、试剂及抗体 |
| 2.2.1 试剂 |
| 2.2.2 培养基、诱导剂及文库 |
| 2.2.3 抗体 |
| 2.3 溶液的配制 |
| 3 研究方法 |
| 3.1 酵母双杂交筛选 |
| 3.1.1 测定文库的滴度 |
| 3.1.2 扩增酵母文库 |
| 3.1.3 酵母菌的活化 |
| 3.1.4 小量转化诱饵蛋白质粒 |
| 3.1.5 文库质粒的转化 |
| 3.1.6 诱饵蛋白自身激活检测 |
| 3.1.8 酵母质粒的提取 |
| 3.1.9 DH5α感受态制备及质粒转化 |
| 3.2 重组质粒的构建 |
| 3.2.1 质粒的小量提取 |
| 3.2.2 限制性酶消化 |
| 3.3.3 用试剂盒回收DNA |
| 3.3.4 DNA片段和载体的连接 |
| 3.3 细胞培养和转染 |
| 3.3.1 细胞传代 |
| 3.3.2 细胞的转染 |
| 3.4 凋亡检测 |
| 3.5 多克隆抗体的制备 |
| 3.5.1 Cyto b免疫抗原的表达纯化 |
| 3.5.2 多克隆抗体的制备 |
| 3.6 线粒体的纯化 |
| 3.7 HIV-1BA-L假病毒的制备 |
| 3.8 免疫共沉淀实验 |
| 3.9 Western Blot实验 |
| 4 研究结果 |
| 4.1 Nef能直接与Cyto b结合 |
| 4.1.1 酵母双杂交结果 |
| 4.1.2 Cyto b与 Nef能产生体内的相互作用 |
| 4.2 胞质中的Cyto b参与了Fas凋亡通路 |
| 4.2.1 Cyto b免疫抗原的制备 |
| 4.2.2 Fas刺激后引起Cyto b的切割和C端从线粒体的释放 |
| 4.3 Nef抑制了Fas介导的细胞凋亡 |
| 4.4 Fas凋亡信号诱导Nef与 Cyto b的结合 |
| 4.5 Nef抑制了Cyto b介导的Fas凋亡途径 |
| 4.6 Nef是 Cyto b介导的Fas凋亡通路的抑制子 |
| 4.7 Nef也参与抑制了Cyto c介导的Fas凋亡途径 |
| 4.8 HIV感染细胞后,FasL诱生Cyto b的释放有所增强 |
| 5 结果讨论 |
| 第二章 乙型肝炎病毒核心抗原HBc抑制干扰素α诱导IFITM1 表达的分子机制 |
| 1 研究背景 |
| 1.1 HBV及核心蛋白HBc |
| 1.1.1 HBV基因组 |
| 1.1.2 HBV与肝癌 |
| 1.1.3 HBc及其功能 |
| 1.2 IFN及其诱导的信号通路 |
| 1.2.1 干扰素的分类 |
| 1.2.2 干扰素的生物学作用 |
| 1.2.3 IFN诱导的信号通路 |
| 1.3 SWI/SNF家族 |
| 1.3.1 SWI/SNF的功能 |
| 1.3.2 BAF200 |
| 1.4 IFITM家族 |
| 1.4.1 IFITM家族的特点 |
| 1.4.2 IFITM1 及其功能 |
| 2 试剂与材料 |
| 2.1 菌株、质粒与细胞 |
| 2.1.1 菌株与细胞 |
| 2.1.2 质粒 |
| 2.2 文库、试剂及抗体 |
| 2.2.1 试剂 |
| 2.2.2 培养基、诱导剂及文库 |
| 2.2.3 抗体 |
| 3 研究方法 |
| 3.1 RNA干扰试验 |
| 3.2 RT-PCR |
| 3.2.1 RNA提取所用器具的处理 |
| 3.2.2 细胞总m RNA的提取 |
| 3.2.3 RNA电泳检测 |
| 3.2.4 RNA的反转录 |
| 3.3 细胞活力检测 |
| 3.4 ELISA 实验 |
| 3.5 荧光定量PCR |
| 4 研究结果 |
| 4.1 HBc与 BAF200 的相互作用 |
| 4.1.1 酵母双杂交结果 |
| 4.1.2 HBc与 BAF200 存在体内的相互作用 |
| 4.2 BAF200 调控IFNα诱导的IFITM1 的表达 |
| 4.3 HBc通过与BAF200 相互作用抑制IFITM1 的转录 |
| 4.4 HBc与 BAF180 竞争性结合BAF200,破坏PBAF复合体的形成,进而削弱了BAF200对IFITM1 的表达调控 |
| 4.5 IFNα的诱导不影响STAT1 的磷酸化水平 |
| 4.6 HBc削弱BAF200 对细胞活性的影响 |
| 4.6.1 BAF200 通过IFITM1 对细胞活力进行影响 |
| 4.6.2 HBc可以削弱BAF200 对细胞活力的影响 |
| 4.7 IFNα诱导下BAF200和HBc对 HBV复制水平的影响 |
| 5 结果讨论 |
| 参考文献 |
| 攻博期间发表的与学位论文相关的科研成果 |
| 致谢 |
（2）乙型肝炎病毒X基因突变与自噬相关蛋白（Beclin-1、LC3B和P62）对肝细胞癌作用的相关性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 研究对象 |
| 1.1.2 研究标本处理 |
| 1.2 伦理学说明 |
| 1.3 本课题技术路线图 |
| 1.4 实验仪器与试剂 |
| 1.4.1 主要实验仪器 |
| 1.4.2 主要实验试剂 |
| 1.5 实验方法 |
| 1.5.1 组织中HBV DNA的提取：实验操作严格按照实验说明书进行 |
| 1.5.2 组织HBV DNA纯度测定 |
| 1.5.3 巢式PCR扩增HBX基因 |
| 1.5.4 琼脂糖凝胶电泳 |
| 1.5.5 巢式PCR产物测序与结果分析 |
| 1.5.6 石蜡包埋切片 |
| 1.5.7 免疫组织化学法操作步骤 |
| 1.5.8 免疫组化结果判定 |
| 1.6 统计学方法 |
| 2.结果 |
| 2.1 研究对象的临床特征 |
| 2.2 HBX基因扩增分析 |
| 2.3 HBX基因测序峰图 |
| 2.4 HBX基因突变分析 |
| 2.4.1 HBX序列多重对比情况 |
| 2.4.2 HBX基因羧基端序列缺失情况 |
| 2.4.3 HBX基因插入突变情况 |
| 2.4.4 HBX基因点突变情况 |
| 2.4.5 差异性点突变对蛋白结构的影响分析 |
| 2.5 Beclin-1、LC3B及P62蛋白在癌与癌旁组织中的表达情况 |
| 2.6 Beclin-1、LC3B和P62蛋白表达与临床病理特征的关系 |
| 2.7 HBX突变与Beclin-1、LC3B及P62蛋白的相关性分析 |
| 2.8 Beclin-1、LC3B及P62蛋白在癌与癌旁组织中表达的相关性分析 |
| 3.讨论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 附录1 中英文缩略词一览表 |
| 综述 乙型肝炎病毒X蛋白与自噬在肝癌发生发展中作用 的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文 |
（3）鸭乙型肝炎病毒环介导等温扩增检测系统的建立及其基因组序列分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 鸭乙型肝炎病毒的研究进展 |
| 1 鸭乙型肝炎病毒的结构 |
| 1.1 鸭乙型肝炎病毒的基因结构 |
| 1.2 鸭乙型肝炎病毒编码的蛋白及功能 |
| 2 鸭乙型肝炎病毒的临床病原学研究 |
| 2.1 DHBV的基因组的克隆和序列分析 |
| 2.2 鸭乙型肝炎病毒的检测 |
| 2.3 鸭乙型肝炎病毒的DNA疫苗研究 |
| 3 鸭乙型肝炎病毒动物模型 |
| 4 本研究的目的与意义 |
| 第二章 鸭乙型肝炎病毒的环介导等温扩增检测系统的建立 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验病料 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 引物设计 |
| 2.2 血清中DNA的提取 |
| 2.3 DHBV标准质粒的构建 |
| 2.4 DHBVS基因保守区的LAMP扩增 |
| 2.5 LAMP检测系统优化 |
| 2.6 LAMP反应的特异性试验 |
| 2.7 LAMP反应的灵敏性试验 |
| 2.8 LAMP反应的重复性试验 |
| 2.9 LAMP实际应用与PCR方法的符合度 |
| 3 实验结果及分析 |
| 3.1 DHBV S保守区的PCR扩增 |
| 3.2 DHBV的 LAMP检测 |
| 3.3 DHBV的 LAMP反应系统优化 |
| 3.4 LAMP反应的特异性试验 |
| 3.5 LAMP反应的灵敏性试验 |
| 3.6 LAMP反应的批内重复性试验 |
| 3.7 LAMP实际应用的符合性试验 |
| 第三章 鸭乙型肝炎病毒全基因组克隆与序列分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 样本采集 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 引物 |
| 2 方法 |
| 2.1 血清中DNA的提取 |
| 2.2 DHBV阳性样本鉴定 |
| 2.3 DHBV全基因扩增及克隆 |
| 2.4 DHBV同源性比较 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 DHBV血清阳性样本的鉴定 |
| 3.2 DHBV全基因组的扩增、克隆及测序 |
| 3.3 3株DHBV分离株基因组结构分析 |
| 3.4 3株DHBV分离株核苷酸同源性分析 |
| 3.5 3株DHBV分离株核苷酸同源性分析 |
| 3.6 3株DHBV分离株遗传进化分析 |
| 第四章 讨论与结论 |
| 1 鸭乙型肝炎病毒的LAMP检测方法的建立 |
| 1.1 讨论 |
| 1.2 结论 |
| 2 鸭乙型肝炎的病毒的全基因组克隆与序列分析 |
| 2.1 讨论 |
| 2.2 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（4）HIV单一和合并HBV或HCV感染者天然耐药及病毒学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 研究背景 |
| 1.1 HIV、HBV和HCV的病毒感染概述 |
| 1.2 HIV、HBV和HCV抗病毒治疗方案和天然耐药概述 |
| 1.3 HIV合并HBV或HCV感染准种研究概述及准种常用指标 |
| 1.4 HIV/HBV合并感染者BCP变异和HBV单一感染者差异的争议 |
| 1.5 HBV或HCV病毒变异和准种的研究方法 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 第二章 HIV单一和合并HBV或HCV感染者天然耐药变异研究 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 实验材料与检测方法 |
| 2.3 数据分析 |
| 2.4 结果 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 HIV/HBV、HIV/HCV合并感染和HBV、HCV单一感染者准种差异比较 |
| 3.1研宄对象 |
| 3.2 研究内容 |
| 3.3 研究方法 |
| 3.4 结果 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 HIV/HBV合并感染和HBV单一感染者BCP/preC变异位点比较 |
| 4.1 研究对象 |
| 4.2 研究内容 |
| 4.3 实验与检测方法 |
| 4.4 结果 |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 广东地区HIV/HCV合并感染者HCV 3b基因型起源分析 |
| 5.1 研究目的 |
| 5.2 研究对象和内容 |
| 5.3 研究方法 |
| 5.4 研究结果 |
| 5.5 讨论 |
| 第六章 广东地区HIV-1 A1C独特重组亚型近全长序列及分子进化分析 |
| 6.1 研究目的 |
| 6.2 研究对象和内容 |
| 6.3 实验和检测方法 |
| 6.4 结果 |
| 6.5 讨论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 中英文缩略词对照 |
| 致谢 |
| 附录 |
（5）乙型肝炎病毒核心基因内部缺失突变体的筛查及其对非折叠蛋白反应调节作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词表 |
| 第1章 引言 |
| 1.1 乙型肝炎病毒 |
| 1.2 HBV基因结构 |
| 1.3 HBV核心基因特征及其功能 |
| 1.4 HBV C基因突变特征及其意义 |
| 1.5 HBV C基因内部缺失突变体与非折叠蛋白质反应 |
| 1.6 本论文的研究内容 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞株和质粒 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要设备 |
| 2.1.4 应用软件 |
| 2.1.5 主要的溶剂成分和试剂的配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 样本采集及保存 |
| 2.2.2 引物设计与合成 |
| 2.2.3 病毒DNA提取 |
| 2.2.4 HBV C基因片段的扩增 |
| 2.2.5 HBV基因及氨基酸序列的比对 |
| 2.2.6 真核质粒pBud CE4.1-HBV-C和pBud CE4.1-HBV-CID的构建 |
| 2.2.7 Lipo Fiter进行质粒转染 |
| 2.2.8 ELASA检测HBe Ag表达量 |
| 2.2.9 RT-PCR |
| 2.2.10 图像分析及统计学检验方法 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 研究对象一般特征 |
| 3.2 HBV-CID基因片段PCR扩增结果 |
| 3.3 HBV C基因内部缺失序列分析 |
| 3.3.1 HBV-CID突变体核苷酸缺失序列分析 |
| 3.3.2 HBV-CID氨基酸缺失序列分析 |
| 3.3.3 HBV CID突变体及其免疫表位缺失的分析 |
| 3.4 表达HBV核心基因及核心基因突变体的真核质粒的构建 |
| 3.5 转染的Hep G2细胞培养液与细胞裂解液HBe Ag表达分析 |
| 3.6 pBudCE4.1-HBV-CID对转染HepG2细胞中UPR相关蛋白基因表达 的影响 |
| 3.6.1 总RNA的质量 |
| 3.6.2 转染细胞中ATF4、ATF6、GRP78和XBP1基因m RNA表达水平 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 HBV基因组C基因分子生物学的研究进展 |
| 参考文献 |
（6）新疆非禽类野生动物流感抗体调查与流感病毒样颗粒疫苗研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 野生动物中流感病毒流行现状及流感疫苗研究进展 |
| 1 流感病毒的生物学特点 |
| 2 流感病毒的宿主 |
| 2.1 流感病毒在野生水禽中的流行现状 |
| 2.2 流感病毒在野猪中的流行现状 |
| 2.3 流感病毒在海洋哺乳动物中的流行现状 |
| 3 流感病毒疫苗研究现状 |
| 3.1 传统流感疫苗 |
| 3.2 流感通用或重组疫苗 |
| 3.3 流感病毒样颗粒疫苗 |
| 第二章 杆状病毒/杆状病毒表达系统研究进展 |
| 1 杆状病毒生物学特点 |
| 2 家蚕杆状病毒表达系统的研究进展 |
| 3 Bac-to-Bac杆状病毒表达系统研究进展 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第一章 新疆部分非禽类野生动物流感血清学调查 |
| 1 材料 |
| 1.1 流感HI诊断试剂 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 样品采集 |
| 1.4 血清样品处理 |
| 1.5 HI抗体检测方法 |
| 1.6 竞争ELISA |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 家蚕杆状病毒系统制备流感病毒样颗粒及免疫原性研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 酶与试剂 |
| 1.3 生化试剂 |
| 1.4 实验仪器 |
| 1.5 培养基及溶液 |
| 1.6 实验动物及实验场所 |
| 1.7 引物及基因合成及测序 |
| 2 方法 |
| 2.1 BmNPV表达含流感病毒HA、NA及M1蛋白的流感病毒样颗粒的构建 |
| 2.2 rBmNPV（HA-M1-NA）在家蚕蛹和蚕体中高效表达 |
| 2.3 流感病毒样颗粒的电镜观察 |
| 2.4 家蚕及蚕蛹表达HA-M1-NA病毒颗粒的血凝实验检测 |
| 2.5 流感病毒样颗粒的小鼠免疫试验及病毒攻毒保护试验 |
| 3 结果 |
| 3.1 流感病毒蛋白HA、NA、M1基因及IRES基因的扩增结果 |
| 3.2 含IRES序列片段的pFastBac Dual载体改造鉴定 |
| 3.3 流感病毒HA、NA及M1基因重组转移质粒的鉴定 |
| 3.4 重组病毒rBmNPV（HA-M1-NA）的鉴定 |
| 3.5 重组病毒rBmNPV（HA-M1-NA）感染昆虫细胞、家蚕和蚕蛹 |
| 3.6 流感病毒样颗粒的电镜观察 |
| 3.7 蚕蛹表达rBmNPV（HA-M1-NA）病毒颗粒的血凝试验结果 |
| 3.8 rBmNPV（HA-M1-NA）病毒颗粒免疫小鼠后抗体检测结果 |
| 3.9 rBmNPV（HA-M1-NA）病毒颗粒免疫小鼠的攻毒保护结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 Bac-to-Bac表达系统制备流感病毒样颗粒及免疫原性研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 质粒、菌种和细胞 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 培养基及溶液 |
| 1.4 设备和仪器 |
| 1.5 实验动物 |
| 1.6 引物、基因合成及测序 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 流感病毒蛋白NA和M1基因的扩增结果 |
| 3.2 含流感病毒HA、NA及M1基因重组转移质粒的鉴定 |
| 3.3 重组杆状病毒基因组的构建与鉴定 |
| 3.4 病毒样颗粒的鉴定 |
| 3.5 流感病毒样颗粒的免疫原性研究 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 流感嵌合病毒样颗粒的构建及免疫原性研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞、细菌、质粒与实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 昆虫细胞培养基 |
| 1.4 设备和仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 重组质粒的构建与鉴定 |
| 2.2 重组杆状病毒基因组的构建与鉴定 |
| 2.3 细胞转染与重组杆状病毒的获得 |
| 2.4 病毒样颗粒的表达与鉴定 |
| 2.5 病毒样颗粒的免疫原性 |
| 3 结果 |
| 3.1 流感病毒蛋白NA和M1基因的扩增结果 |
| 3.2 pfastBacDual-HA-fliC-NA及pfastBacDual-M1重组转移质粒的鉴定 |
| 3.3 重组杆状病毒基因组的构建与鉴定 |
| 3.4 病毒样颗粒的鉴定 |
| 3.5 病毒样颗粒的免疫原性 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 创新与特色 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 石河子大学博士研究生学位论文导师评阅表 |
（7）含真核表达质粒的营养缺陷型大肠杆菌工程菌株作为基因治疗口服递送载体系统的研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 1 载体菌选择 |
| 2 肠道黏膜免疫系统组成 |
| 3 肠道黏膜免疫应答过程 |
| 4 肠道黏膜系统免疫应答特点 |
| 5 肠道菌群与肠道黏膜免疫屏障的关系 |
| 6 肠道黏膜屏障强度自动控制假说 |
| 7 载体菌的改造技术 |
| 8 破吞噬体分子的选择 |
| 9 目的基因的选择 |
| 第一部分E.coli DH10B改造 |
| 引言 |
| 1 实验材料和仪器 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 第二部分 真核表达质粒pDV_nirb_hly_cmv_(epo/egfp)构建 |
| 引言 |
| 1 实验材料和仪器 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 第三部分 基因治疗.服递送载体系统 |
| 引言 |
| 1 实验材料和仪器 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（8）乙肝表面抗原在酿酒酵母中的异源表达及优化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 乙型肝炎 |
| 1.2 乙型肝炎病毒 |
| 1.2.1 乙肝病毒的结构 |
| 1.2.2 乙肝病毒的分子生物学特征 |
| 1.3 乙肝表面抗原 |
| 1.3.1 乙肝表面抗原的特征 |
| 1.3.2 乙肝表面抗原的作用 |
| 1.3.3 乙肝疫苗的制备 |
| 1.4 基因工程 HBsAg 的制备 |
| 1.4.1 大肠杆菌表达系统 |
| 1.4.2 酵母表达系统 |
| 1.4.3 哺乳动物细胞表达系统 |
| 1.4.4 病毒表达载体系统 |
| 1.4.5 植物表达系统 |
| 1.5 酿酒酵母表达系统 |
| 1.5.1 酿酒酵母表达系统的优势缺点 |
| 1.5.2 重组酵母乙肝疫苗的安全性 |
| 1.5.3 酿酒酵母生产 HBsAg 的国内外研究现状 |
| 1.5.4 外源蛋白在酿酒酵母中的高效表达 |
| 1.6 立题依据及意义 |
| 1.7 本论文主要研究内容 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 菌株与质粒 |
| 2.2 试剂与仪器 |
| 2.2.1 主要试剂 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.3 培养基 |
| 2.4 培养方法 |
| 2.5 分子生物学操作 |
| 2.5.1 DNA 操作方法 |
| 2.5.2 密码子优化及 HBsAg 基因片段的获取 |
| 2.5.3 含启动子 TEF1 的重组质粒的构建 |
| 2.5.4 含不同启动子重组质粒的构建 |
| 2.5.5 含不同 kozak 序列重组质粒的构建 |
| 2.5.6 含不同信号肽重组质粒的构建 |
| 2.5.7 二硫键异构酶 PDI 共表达重组载体的构建 |
| 2.6 酵母转化及重组菌发酵 |
| 2.7 测定与分析方法 |
| 2.7.1 细胞干重的测定 |
| 2.7.2 HBsAg 活性的测定及 HBsAg 的纯化 |
| 2.7.3 SDS-PAGE 检测 |
| 2.7.4 蛋白浓度的测定 |
| 第三章 结果与讨论 |
| 3.1 乙肝表面抗原 S 基因在酿酒酵母中的表达 |
| 3.1.1 密码子优化及重组表达载体的构建 |
| 3.1.2 酿酒酵母工程菌株的构建 |
| 3.1.3 重组酵母表达 HBsAg 及活性分析 |
| 3.1.4 添加 His 纯化标签对 HBsAg 表达的影响 |
| 3.1.5 讨论 |
| 3.2 酿酒酵母表达 HBsAg 的优化 |
| 3.2.1 筛选启动子的增强 HBsAg 的表达 |
| 3.2.2 优化 Kozak 序列提高 HBsAg 的表达 |
| 3.2.3 不同信号肽对 HBsAg 表达的影响 |
| 3.2.4 共表达 PDI 促进 HBsAg 表达 |
| 3.2.5 讨论 |
| 3.3 发酵优化提高 HBsAg 在酿酒酵母中的表达 |
| 3.3.1 培养条件的优化 |
| 3.3.2 培养基组分的优化 |
| 3.3.3 添加剂的优化 |
| 3.3.4 优化后 HBsAg 的表达 |
| 3.3.5 讨论 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文 |
（9）小反刍兽疫及口蹄疫病毒抗原基因重组山羊痘病毒活载体疫苗的研究（论文提纲范文）
| 博士学位论文评阅人、答辩委员会签名表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 小反刍兽疫疫苗研究进展 |
| 1.1.1 PPR 简介 |
| 1.1.2 PPR 弱毒疫苗 |
| 1.1.3 重组标记疫苗 |
| 1.1.4 小结与展望 |
| 1.2 口蹄疫疫苗研究进展 |
| 1.2.1 口蹄疫简介 |
| 1.2.2 灭活抗原疫苗 |
| 1.2.3 新型分子疫苗 |
| 1.2.4 基础研究在合理设计 FMD 疫苗中的作用 |
| 1.3 羊痘病毒研究进展 |
| 1.3.1 羊痘简介 |
| 1.3.2 羊痘病毒基因组研究进展 |
| 1.3.3 羊痘疫苗研究进展 |
| 1.3.4 羊痘病毒活载体研究进展 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 第二章 重组转移载体的设计、构建与功能验证 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料与试剂 |
| 2.1.2 重组质粒的设计 |
| 2.1.3 重组质粒的构建 |
| 2.1.4 启动子 p11 和 p7.5 功能的验证 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 目的片段 PCR 结果 |
| 2.2.2 重组质粒酶切鉴定结果 |
| 2.2.3 重组质粒测序结果 |
| 2.2.4 转染 LT 细胞结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 同源臂的设计 |
| 2.3.2 载体设计与构建策略 |
| 2.3.3 启动子功能的验证 |
| 第三章 重组山羊痘病毒的产生与纯化 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料与试剂 |
| 3.1.2 重组质粒的制备 |
| 3.1.3 GPV 基因组 DNA 的提取 |
| 3.1.4 重组质粒与 GPV 共转染 LT 细胞 |
| 3.1.5 重组 GPV（rGPV）的筛选与纯化 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 重组质粒转染 LT 细胞的结果 |
| 3.2.2 重组 GPV 的筛选结果 |
| 3.2.3 重组 GPV 的纯化结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 同源重组的基本过程 |
| 3.3.2 痘病毒基因组 DNA 的复制 |
| 3.3.3 提高同源重组的效率 |
| 3.3.4 重组 GPV 的筛选策略 |
| 3.3.5 重组 GPV 的纯化 |
| 第四章 重组山羊痘病毒外源基因的鉴定 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料与试剂 |
| 4.1.2 RT-PCR 检测 rGPV 外源基因的转录 |
| 4.1.3 rGPV 中外源基因表达产物的检测 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 rGPV 中外源基因 RT-PCR 结果 |
| 4.2.2 rGPV 中外源基因的表达结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 病毒基因转录的特点 |
| 4.3.2 痘病毒基因转录的主要元件和转录后加工 |
| 4.3.3 病毒蛋白的翻译及其翻译后加工 |
| 4.3.4 rGPV 中外源基因的转录和翻译 |
| 第五章 rGPV 的免疫效果测定 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试剂及疫苗制备 |
| 5.1.2 动物分组及免疫程序 |
| 5.1.3 抗体水平及效价测定 |
| 5.1.4 数据统计及分析 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 rGPV 病毒滴度 |
| 5.2.2 抗体水平与效价 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 痘病毒感染的免疫反应 |
| 5.3.2 抗体水平的变化 |
| 第六章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（10）Asia1型FMDV复合表位免疫原的研制及免疫效果研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 口蹄疫概述 |
| 1.1.1 病原特性 |
| 1.1.2 口蹄疫病毒主要抗原位点 |
| 1.1.3 传播途径 |
| 1.1.4 流行现状 |
| 1.2 黏膜免疫研究进展 |
| 1.2.1 黏膜免疫系统 |
| 1.2.2 黏膜免疫佐剂 |
| 1.2.3 靶向性黏膜免疫投递载体 |
| 1.3 口蹄疫新型基因工程疫苗研究现状 |
| 1.3.1 亚单位疫苗 |
| 1.3.2 合成肽疫苗 |
| 1.3.3 新型减毒疫苗和分子标记疫苗 |
| 1.3.4 核酸疫苗 |
| 1.3.5 转基因植物可饲疫苗 |
| 1.3.6 活载体疫苗 |
| 1.3.7 表位疫苗 |
| 1.3.8 黏膜疫苗 |
| 1.4 研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试验动物 |
| 2.1.2 菌株和质粒 |
| 2.1.3 灭活疫苗、包被抗原和抗体 |
| 2.1.4 引物设计及合成 |
| 2.1.5 主要试剂和试剂盒 |
| 2.1.6 主要仪器 |
| 2.1.7 主要溶液的配制 |
| 2.2 试验一 Asia1 型 FMDV 复合表位免疫原的制备 |
| 2.2.1 以 HBcAg 为载体复合表位免疫原的原核表达 |
| 2.2.2 以牛 IgG2a Fc 片段为载体的复合表位免疫原的制备 |
| 2.2.3 Asia1 型 FMDV 衣壳蛋白在酵母中的共表达 |
| 2.2.4 以 HBcAg 为载体复合表位免疫原在酵母中的表达 |
| 2.3 试验二复合表位免疫原免疫途径与免疫效果的研究 |
| 2.3.1 腹腔免疫及免疫效果评价 |
| 2.3.2 口服免疫及免疫效果评价 |
| 2.3.3 滴鼻免疫及免疫效果评价 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 试验一 Asia1 型 FMDV 复合表位免疫原的制备 |
| 3.1.1 复合表位免疫原的设计 |
| 3.1.2 复合表位免疫原的原核表达 |
| 3.1.3 阳性重组酵母菌的获得 |
| 3.2 试验二复合表位免疫原免疫途径与免疫效果的评价 |
| 3.2.1 腹腔免疫及免疫效果评价 |
| 3.2.2 口服免疫及免疫效果评价 |
| 3.2.3 滴鼻免疫及免疫效果评价 |
| 4 讨论 |
| 4.1 Asia1 型 FMDV 复合表位免疫原的设计 |
| 4.2 复合表位免疫原的制备 |
| 4.2.1 复合表位免疫原在原核表达系统中的制备 |
| 4.2.2 复合表位免疫原在毕赤酵母表达系统中的制备 |
| 4.2.3 Asia1 型 FMDV 衣壳蛋白在酵母中的共表达 |
| 4.3 复合表位免疫原免疫途径与免疫效果的评价 |
| 4.3.1 复合表位免疫原腹腔免疫效果评价 |
| 4.3.2 黏膜免疫在 FMDV 防控中的意义 |
| 4.3.3 以 HBcAg 为载体复合表位免疫原口服免疫效果评价 |
| 4.3.4 复合表位免疫原滴鼻免疫效果的评价 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
四、改变乙型肝炎病毒核心抗原基因3′端序列对其在原核细胞中表达的影响（论文参考文献）
- [1]HIV和HBV病毒蛋白同宿主细胞的相互作用机制研究[D]. 李彤亚. 武汉大学, 2019(06)
- [2]乙型肝炎病毒X基因突变与自噬相关蛋白（Beclin-1、LC3B和P62）对肝细胞癌作用的相关性研究[D]. 吴玲红. 广西医科大学, 2019(08)
- [3]鸭乙型肝炎病毒环介导等温扩增检测系统的建立及其基因组序列分析[D]. 王静. 南阳师范学院, 2019(08)
- [4]HIV单一和合并HBV或HCV感染者天然耐药及病毒学研究[D]. 邓浩辉. 南方医科大学, 2018(01)
- [5]乙型肝炎病毒核心基因内部缺失突变体的筛查及其对非折叠蛋白反应调节作用[D]. 夏方娜. 南昌大学, 2016(05)
- [6]新疆非禽类野生动物流感抗体调查与流感病毒样颗粒疫苗研究[D]. 魏玉荣. 石河子大学, 2016(02)
- [7]含真核表达质粒的营养缺陷型大肠杆菌工程菌株作为基因治疗口服递送载体系统的研究[D]. 史新昌. 第四军医大学, 2014(08)
- [8]乙肝表面抗原在酿酒酵母中的异源表达及优化[D]. 邱玲. 江南大学, 2014(02)
- [9]小反刍兽疫及口蹄疫病毒抗原基因重组山羊痘病毒活载体疫苗的研究[D]. 李继东. 中国农业科学院, 2014(10)
- [10]Asia1型FMDV复合表位免疫原的研制及免疫效果研究[D]. 曹永生. 东北农业大学, 2013(08)