一、ST_1肠毒素融合蛋白的纯化及部分特性分析（论文文献综述）
刘兴汉,王莉林,张绍杰,初晓白[1]（1998）在《ST1肠毒素融合蛋白的纯化及部分特性分析》文中研究说明用ＳｅｐｈａｄｅｘＧ１５０凝胶和ＤＥ３２离子交换层析，从重组菌ＰＧＥＭＳＴ２株内分离、纯化ＳＴ１肠毒素融合蛋白，回收的ＳＴ１肠毒素融合蛋白占细菌总蛋白量的３１５％。ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳条件呈一条蛋白带。ＳＴ１肠毒素融合蛋白不溶于甲醇、乳鼠试验阴性。对小鼠皮下注射使用安全，对Ｋ９９强毒菌攻击贩保护率达６０％。ＰＧＥＭＳＴ２菌株可以做为预防仔猪腹泻疫苗的候备菌株
卫广森[2]（2004）在《新生仔猪大肠杆菌性腹泻K88ac-ST1-LTB三价基因工程灭活疫苗的研究与应用》文中指出新生仔猪大肠杆菌性腹泻（Colibacillus diarrhea of newborn piglet）是由产肠毒素性大肠埃希氏菌（Enterotoxigenic E. coli, ETEC）引起的以1～7日龄新生仔猪下痢为特征的一种急性致死性多发性传染病。本病在世界范围内广泛流行，是影响仔猪成活率的主要因素之一。随着疫苗的研发与应用，我国新生仔猪大肠杆菌性腹泻得到了一定程度的控制，但疫苗在免疫原性、安全性等方面仍不理想。因此，研制高效、安全的新型多价基因工程疫苗迫在眉睫。 本研究利用分子生物学技术将ST1基因与K88ac和LTB基因融合在一起，研制大肠杆菌三价基因工程灭活疫苗，以期达到增加疫苗的安全性，提高疫苗免疫效果的目的，解决新生仔猪大肠杆菌性腹泻免疫预防这一难题。 （1） 根据已发表的K88ac、ST1和LTB基因序列，分别设计并合成一对K88ac引物、三对ST1引物和一对LTB引物，利用PCR技术，从大肠杆菌C83902质粒中扩增出K88ac基因、ST1突变基因和LTB基因。将质粒DNA和扩增的DNA片段进行分离、纯化、限制性内切酶酶切、T4 DNA连接酶连接，获得重组质粒pXK88acS73LT5并转化BL21（DE3）宿主菌，构建了含K88ac-ST1-LTB融合基因表达载体的重组菌株BL21（DE3）（pXK88acST3LT5）。经酶切鉴定和DNA序列分析证实，构建的重组质粒pXK88acST3LT5中含有K88ac-ST1-LTB融合基因，且基因序列和阅读框架均正确。将重组菌株BL21（DE3）（pXK88acST3LT5）按1％的量接种到含有Kan(50μg·mL-1)的LB液体培养基中，37℃振荡培养2h，然后用1mmol·L-1IPTG诱导4h，融合蛋白K88ac-ST1-LTB获得高效表达。经ELISA检测，重组菌株表达的K88ac-ST1-LTB融合蛋白能够被ST1单抗、LTB和K88ac抗体识别。将重组菌株BL21（DE3）（pXK88acST3LT5）培养物上清及菌体裂解物，分别进行了乳鼠灌胃试验，结果均为阴性（C／C≤0.083），这表明该融合蛋白K88ac-ST1-LTB已丧失天然ST1肠毒素的活性。用该工程菌株制备的包涵体粗提物和工程菌灭活疫苗免疫小鼠，再用C83902大肠杆菌强毒菌株攻毒均获得了较好的保护，试新生仔猪大肠杆菌性腹泻际ac一STI一LTI，二价基因「程灭活疫苗的研究与应用 里理里旦巴月里巴里里里里里里里里验结果表明，肠ac一sT一LT。融合蛋白能够诱发小鼠产生抗体，该抗体具有中和天然ST:肠毒素毒性的作用，证实了构建的重组菌株可以作为预防新生仔猪大肠杆菌性腹泻基因工程疫苗的候选菌株。 （2）对构建的表达K::aC一ST!一LT。融合蛋白的重组菌株BL21（DE3）（pXK88aeST3LTS）进行了染色特性、培养特性、生化特性、质粒稳定性、免疫原性、保存条件等实验室试验。结果1一10代菌种染色特性、培养特性、生化特性均符合大肠杆菌特性的要求;在无选择压力（Kan一）T BL21（DE3）（pXK88aeST3LTS）菌株连续培养20代，统计质粒丢失率，其重组质粒保留率为1 00%，表明重组质粒pXK88aeST3LTS在受体菌BL21（DE3）中能较稳定传代:重组菌株BL21（DE3）（pXK88aeST3LTS）经诱导后的培养物，用SDS-聚丙烯酞胺凝胶电泳和薄层凝胶扫描分析，结果表明融合蛋白占菌体总蛋白的相对含量能稳定在73%以上;分另，J用BL21（DE3）（pXK88aeST3LTS）菌株第1代和第10代基础种子的培养物制备的疫苗免疫小鼠后，用1 MLD（5/10吕CFU）强毒菌液攻击，其保护率为90.6，表明1一10代基础种子均可作为疫苗生产用菌株，其免疫原性稳定。因此，基础种子代次暂定为1一10代;菌种保存试验确定，甘油保存菌种在一20℃保存期为2年，冻干保存菌种在一20℃保存期暂定为3年;最小免疫剂量测定结果表明小鼠的最小免疫剂量每只为0.lmL，妊振母猪的最小免疫剂量每头为2.smL;制备的5批实验室产品均安全有效;试验中本疫苗保存18个月，仍具有良好的效力，保护率达8既以上，为了保证疫苗质量，并考虑疫苗在保存和应用中的各种不确定因素，将本疫苗的保存期暂定为12个月。为了进一步验证疫苗的安全性和有效性，在不同地区进行T田间试验，免疫妊娠母猪6 50头，产仔7 1 56头，平均保护率为98.2406，试验证明本疚苗安全性良好，新生仔猪通过吮吸母乳获得被动免疫可有效地预防新生仔猪大肠性腹泻的发生。 （3）以实验室工艺为基础，进行了工业化生产工艺的研究。用发酵罐培养，改良LB培养基培养的菌数与普通肉汤培养基的菌数基本一致，明显高于LB培养基的菌数，根据BL21（DE3）（pXK88aeST3LTS）菌株培养的稳定性和降低生产成本的要求，故改良LB培养基为该菌株的最佳培养基;经诱导剂筛选试验分析，100 mmol·L一，乳糖组诱导效果略低于1 mmol·L一，IpTG组，但优于10 mmol·L一，乳糖组，1 mmol·L一，乳糖组诱导效果最差，在工业化生产上为了降低生产成本，故选择乳糖作为诱导剂;摘要aL21（nE3）（pxK88acsT3LTS）菌株添加终浓度为100 mm。l·L一，乳糖进行诱导后，目的蛋白于Zh呈现表达，随着诱导时间的延长，总菌数和目的蛋白表达总数均相应增加，5一6h趋于稳定，确定了乳糖诱导的浓度为10Omm。l·L一，，诱导时间不低于6h;通气培养条件试验表明，BLzl（。Es）（pxKssacST3LTs）菌株以2、10，mL发酵罐通气培养，在500L·min一?
赵姝静[3]（2013）在《大肠杆菌肠毒素卵黄抗体的制备及其抗毒素特性研究》文中研究说明产肠毒素性大肠杆菌（Enterotoxigenic E.coli简称ETEC）是引起仔猪腹泻的主要病原之一。在家畜中，尤以初生幼畜特别易感，并引起生长发育迟缓，生产能力低下，甚至造成死亡，给畜牧业造成很大损失。仔猪腹泻的发生与大肠杆菌的肠毒素LT和ST有密切的关系。目前，对该病的防治主要采用大肠杆菌多价疫苗免疫和药物防治，但防治效果均不理想。卵黄抗体作为一类高效特异性生物制剂在防治仔猪腹泻中显示出明显的效果，为该病的防治开辟了新的途径。本研究扩增了不耐热肠毒素（LT）B亚基基因ltB及含有18个氨基酸的耐热肠毒素（ST1a）st1a的核苷酸序列，用linker连接后分别插入pET-28a-sumo、pET-32a、PHUE、pCold I、PGEX-6P-1等五种表达载体。构建带有HA标签的重组表达载体：将ltB基因与HA标签基因相连后插入pET-28a-sumo。经表达条件优化，获得重组蛋白LTB-ST1a和重组蛋白LTB-HA。将表达的LTB-ST1a蛋白作为免疫原对8只8月龄海兰褐蛋鸡进行免疫。共进行3次免疫，每次间隔2周。一免时，免疫剂量为0.4mg/ml，每只鸡注射1ml。二免时，免疫剂量为0.6mg/ml，每只鸡注射1ml。三免时，免疫剂量为0.8mg/ml，每只鸡注射1ml。二免后3d收蛋，用氯仿抽提法提取卵黄抗体，间接ELISA法检测抗体效价。以重组蛋白LTB-HA为包被抗原检测卵黄抗体中抗LTB的效价。用实验室构建菌株表达的4ST1a蛋白为包被抗原检测卵黄抗体中的ST1a的效价。结果显示，抗LTB的多抗的ELISA效价最高值为1:9192，抗ST1a的多抗的ELISA效价最高值为1:512。两种抗体的效价消长趋势相同，均在二免前后达到了最高峰，三免时降低，三免后效价逐步上升。用3只家兔进行的LT毒素中和实验（肠袢结扎实验）结果显示，卵黄抗体浓缩液与LT毒素1：1混合时，可以中和LT毒素的毒性作用，2倍稀释的卵黄抗体浓缩液不能完全中和毒素，4倍稀释的卵黄抗体浓缩液不能中和毒素。3组浓度卵黄抗体与毒素的混合物使肠段积液量呈递增趋势。ST毒素中和实验（乳鼠灌胃实验）结果显示，卵黄抗体能够中和ST1a毒素，避免了肠积液的产生，实验组小鼠健活，肠重比为0.075，阳性对照组小鼠全部死亡，肠重比为0.112。研究结果表明，用重组蛋白LTB-ST1a免疫产蛋鸡制备的卵黄抗体，具有对LT、ST1a毒素的中和作用，该研究为仔猪大肠杆菌性腹泻的防治提供了有效的特异性防治制剂，同时为肠毒素的深入研究提供了检测抗体。
王卓[4]（2007）在《仔猪大肠杆菌病基因工程菌株GE-3的构建与免疫原性研究》文中提出新生仔猪大肠杆菌性腹泻（Diarrhea in Neonatal Swine Caused by E.coli）俗称仔猪黄痢,是由特定血清型产肠毒素性大肠埃希氏菌（Enterotoxigenetic E.coli,ETEC）感染所引起的初生仔猪的一种急性、致死性传染病。主要发生于一周龄以内的仔猪,尤以1-3日龄最为多见,临床以腹泻、排黄色稀便为主要特征,发病率和死亡率均很高。在仔猪腹泻病病原中,约有40%的病例由ETEC引起,而在我国则约为35%。ETEC的毒力因子主要包括黏附素（adhesin）和肠毒素（enterotoxin,Ent）。许多学者先后证实,多数ETEC菌株带有K88、K99、987P和F41等黏附素,并产生ST/LT或ST和LT。具有K88菌毛的菌株通常产生ST和LT,而具有K99、987P、F41等菌毛和不具有菌毛的菌株通常只产生ST。本研究应用分子生物学技术,针对新生仔猪大肠杆菌性腹泻病原的主要致病因子K88ac、ST1、LTB克隆和连接,并于原核载体中得以表达。表达的K88ac-ST1-LTB融合蛋白能被K88ac抗体、ST1和LTB单克隆抗体识别,并使免疫小鼠和仔猪抵抗强毒C83902株的攻击。用重组PCR技术对ETEC C83902株ST1基因的抗原编码区进行了定点突变,然后将突变后的三个ST1突变基因进行了连接,并克隆至中间载体质粒pUC19中,构建成重组质粒pXST3。用重组PCR技术对ETEC C83902株K88ac基因和LTB基因的抗原编码区分别克隆至中间载体质粒pBluescriptII和表达载体pET-28b中,构建成重组质粒pXK88和pXLT。在构建了上述三个中间质粒之后,经酶切、连接、克隆,构建了重组表达质粒pXK88acST3LT5。将其转化至工程菌株BL21（DE3）构建了重组菌株GE-3,其表达的融合蛋白经检测能够被K88ac抗体、ST1和LTB单克隆抗体识别。用乳糖替代IPTG对重组菌株GE-3进行诱导对比试验和诱导条件试验,证明乳糖可以替代IPTG诱导该重组菌株表达。用重组菌株GE-3乳糖诱导表达的菌液制备疫苗2批,分别用小鼠和猪进行了安全性试验和免疫攻毒试验,结果,2批疫苗均安全、有效。
许崇波,卫广森[5]（2002）在《表达大肠杆菌K88ac-ST1-LTB融合蛋白基因工程菌株的构建》文中研究说明利用PCR技术 ,从大肠杆菌C8390 2质粒中扩增出K88ac基因、ST1 突变基因和LTB 基因 ,通过分离、纯化、内切酶酶切、连接和转化 ,构建了含K88ac ST1 LTB 融合基因表达载体的重组菌株BL2 1（DE3） （pXKST3LT5 ）。经酶切鉴定和DNA序列分析证实 ,构建的重组质粒pXKST3LT5中含有K88ac ST1 LTB 融合基因 ,且基因序列和阅读框架均正确。经ELISA检测 ,重组菌株表达的K88ac ST1 LTB 融合蛋白能够被ST1 单抗、LTB 和K88ac抗体识别。经乳鼠灌胃试验证实 ,表达的融合蛋白已丧失天然ST1 肠毒素的活性。免疫实验结果表明 ,K88ac ST1 LTB 融合蛋白能够诱发小白鼠产生抗体 ,该抗体具有中和天然ST1 肠毒素的毒性作用 ,表明构建的重组菌株可以作为预防仔猪黄、白痢基因工程菌苗的候选菌株
卫广森,陆承平,陈溥言[6]（2003）在《大肠埃希氏菌耐热性肠毒素的研究进展》文中提出
卫广森,陆承平,陈溥言[7]（2003）在《大肠杆菌K88ac-ST1-LTB三价基因工程菌株的构建》文中认为利用 PCR技术 ,从大肠杆菌 C8390 2质粒中扩增出 K88ac基因、ST1 突变基因和 L TB基因 ,通过分离、纯化、内切酶酶切、连接和转化 ,构建了含 K88ac- ST1 - L TB融合基因表达载体的重组菌株 BL 2 1 （DE3） （p XKST3L T5 ）。经酶切鉴定和 DNA序列分析证实 ,构建的重组质粒 p XKST3L T5中含有 K88ac- ST1 - L TB融合基因 ,且基因序列和阅读框架均正确。免疫试验结果表明 ,K88ac- ST1 - L TB融合蛋白能够诱发机体产生抗体 ,该抗体具有中和天然 ST1 肠毒素毒性的作用。用从 IPTG诱导的工程菌中提取的包涵体或经甲醛灭活的工程菌制成抗原免疫小鼠 ,结果免疫小鼠至少能抵抗2 ML D的大肠杆菌强毒株 C8390 2 （K88ac,ST+ ,L T+ ）的攻击。由此表明 ,构建的工程菌株 BL 2 1 （DE3） （p XKST3L T5 ）可以作为预防幼畜大肠杆菌性腹泻的基因工程菌苗的候选株
高小攀[8]（2009）在《新生仔猪源大肠杆菌主要毒力因子的分子流行病学及其免疫防制》文中进行了进一步梳理新生仔猪腹泻是危害养猪业的重要疾病;尽管导致仔猪腹泻的原因非常复杂,但大肠杆菌作为其主要病原已经明确。该研究根据GeneBank发表的大肠杆菌肠毒素ST1、ST2、LT1以及耶尔森氏菌强毒力岛（high pathogenicity island,HPI）的基因序列分别设计特异性引物,建立了检测相应毒力因子的PCR方法。通过对已知毒力型参考菌株的扩增,证明了所建立的PCR方法能够特异鉴定产肠毒素大肠杆菌（Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC）和HPI+大肠杆菌。采集临床151例仔猪腹泻病例的肛拭子样品,接种LB肉汤于37℃增菌培养46h后,用所建立的PCR方法进行检测,结果表明有95例（62%）为HPI+大肠杆菌感染,14例（9.27%）为HPI+大肠杆菌感染与ETEC混合感染,24例（15.8%）为ETEC感染。此外,通过对健康新生仔猪54份样品的检测,发现28例（51.8%）样品携带HPI+大肠杆菌,6例（11%）携带ETEC（主要为ST2+）,未发现所检测的其它毒力因子,这表明HPI+大肠杆菌很可能是条件性致病菌。为了揭示仔猪源大肠杆菌的O抗原型和主要毒力因子的相关性以及筛选具有优势血清型和优势毒力因子的疫苗侯选株,经快速检测为毒力因子阳性的粪便样品进行了广泛的细菌分离。经生化试验以及毒力因子的PCR鉴定,共分离鉴定到89株大肠杆菌。通过对这89株分离株的O血清型与致病性大肠杆菌类型进行相关性分析,结果显示,除20株未定型,69株大肠杆菌分属6种不同的血清型,最流行的血清型为O138,共39株（44%）,其次为O65 11株（12%）;其中ETEC的主要血清型为O138（13%）、O65（2%）、O21（2%）;HPI+大肠杆菌的主要血清型为O138（21%）、O65（8%）、O21（6%）、O141（3%）、O9（2%）、O159（2%）;ETEC且携带HPI+大肠杆菌的主要血清型为O138（9%）、O65（2%）、O9（2%）、O139（1%）、O55（1%）;进一步分析显示,HPI与ETEC高度相关,36株ETEC中,携带HPI+有14株（39%）;菌毛检测发现,K88、987P是主要的黏附因子。运用黏附素单抗对黏附素阳性菌株进行检测筛选,结果只有部分K88阳性菌株体外表达菌毛。结合PCR检测,血清型鉴定,体外黏附素表达检测,菌株O138:HPI:K88:LT1可作为用于预防仔猪腹泻的疫苗候选株。在致仔猪腹泻大肠杆菌主要毒力因子分子流行病学和血清流行病学调查的基础上,筛选了用于预防仔猪腹泻的多价灭活疫苗,经成品检验合格后免疫怀孕母猪,同时以商品化的三价苗为对照,通过定期采集母猪分娩后的乳汁,分离乳清进行乳清中K88、987P、FyuA特异性抗体效价的测定。结果表明,在母猪分娩后不同时段,各免疫组别乳清中K88菌毛抗体的抗体效价具有显着性差异（P<0.01或P<0.05）。各免疫组别乳清中987P菌毛抗体的抗体效价也具有显着性差异（P<0.01或P<0.05）。其中本研究的多价苗与对照组差异极显着（P<0.01）。而各免疫组别乳清中FyuA抗体的抗体效价仅在分娩后第一天差异显着（P<0.01或P<0.05）。从抗体效价的动态变化规律来看,通过两针免疫母猪,其初乳中抗体的效价在分娩后一天为最高,以后逐渐下降,其中K88菌毛抗体在分娩后一周几乎检测不到抗体效价,而987P菌毛的抗体效价可以维持产后14天,而FyuA抗体的效价在分娩后波动不大。利用抗大肠杆菌K88和987P多价乳清抗体对K88和987P菌毛与小肠上皮细胞的黏附特性进行了研究,结果表明免疫组和对照组母猪分娩后一天抗大肠杆菌K88和987P多价乳清抗体均能抑制K88+和987P+大肠杆菌与小肠上皮细胞的黏附,进一步研究表明,免疫组和对照组母猪分娩后七天抗大肠杆菌K88多价乳清抗体不能抑制K88+大肠杆菌与小肠上皮细胞的黏附,而免疫组母猪分娩后七天抗大肠杆菌987P多价乳清抗体能明显抑制987P+大肠杆菌与小肠上皮细胞的黏附。
卫广森,许崇波,王文成,李尚波,王卓,苗玉和[9]（2005）在《新生仔猪大肠杆菌性腹泻K88ac-ST1-LTB三价基因工程灭活疫苗候选菌株的构建》文中提出利用PCR和基因定点突变技术,从大肠杆菌C83902的质粒中扩增出K88ac基因、ST1突变基因和LTB基因,通过分离、纯化、限制性核酸内切酶酶切、连接和转化,构建了含K88ac-ST1-LTB融合基因表达载体的重组菌株BL21（DE3）（pXK88acST3LT5）。经酶切鉴定和DNA序列分析证实,构建的重组质粒pXK88acST3LT5中含有K88ac-ST1-LTB融合基因,且基因序列和阅读框架均正确。经ELISA检测,重组菌株表达的K88ac-ST1-LTB融合蛋白能够被ST1单抗、LTB和K88ac抗体识别。经乳鼠灌胃试验证实,表达的融合蛋白已丧失天然ST1肠毒素的毒性。免疫实验结果表明,K88ac-ST1-LTB融合蛋白能够诱发家兔产生血清抗体,该抗体具有中和天然ST1肠毒素毒性的作用,表明构建的重组菌株可以作为预防新生仔猪大肠杆菌性腹泻基因工程疫苗的候选菌株。
李丹丹[10]（2013）在《大肠杆菌LTB-Stx2B融合蛋白的表达及其诱导小鼠体液免疫的研究》文中研究说明犊牛大肠杆菌性腹泻是牛场常发且危害严重的一种细菌性传染病，主要表现为肠炎或败血症，是新生犊牛死亡的主要病因之一，给养牛业带来巨大的经济损失。目前尚无有效预防该病的商品化疫苗，因此，研制有效的针对该病的疫苗对预防该病的发生具有重要意义。引起犊牛腹泻的大肠杆菌主要毒力因子有肠毒素（包括LT、ST）、志贺毒素和粘附素。LT和LTB具有很强的免疫原性并且具有免疫佐剂的功效，是近些年来疫苗研究的热点。志贺毒素引起的犊牛腹泻的死亡率最高，它有两个型，1型和2型，2型志贺毒素的毒性强于1型，是产志贺毒素大肠杆菌的重要毒力因子，其B亚基无毒且具有免疫原性。ST单独不具有免疫原性，而粘附素的抗原类型又过多，因此，将大肠杆菌不耐热肠毒素和志贺毒素作为疫苗抗原是研制犊牛大肠杆菌疫苗的主要策略。本研究旨在探索ltb和stx2b融合编码基因的构建，在原核系统中表达，以及表达蛋白诱导小鼠体液免疫的情况，为犊牛大肠杆菌疫苗的研究奠定技术基础和提供实验依据。本研究将PCR扩增出的ltb和stx2b基因用一段柔性linker序列连接后插入pMD18T simple载体中，经序列分析鉴定后，再通过酶切，连接，转化宿主菌Rossetta，分别构建了Rossetta/pET-30a-LTB-Stx2B和Rossetta/pCold I-LTB-Stx2B融合基因原核表达系统。经表达条件优化和对表达产物分析，最终选择表达系统Rossetta/pCold I-LTB-Stx2B进行后续研究。SDS-PAGE分析和Western blot鉴定结果显示，表达系统Rossetta/pCold I-LTB-Stx2B所表达的重组蛋白量约占菌体蛋白的1/5。同时还构建了表达stx2b基因的原核表达系统Rossetta/pColdI-Stx2B。SDS-PAGE分析和Western blot鉴定结果显示，该重组蛋白同样获得了高效表达。随机将昆明鼠分为5组（A、B、C、D、E组），每组正常鼠、妊娠鼠各5只，E组为对照组。将重组蛋白LTB-Stx2B、重组蛋白Stx2B、重组大肠杆菌Rossetta/pCold I-LTB-Stx2B灭活菌、重组大肠杆菌Rossetta/pCold I-LTB-Stx2B灭活菌超声波裂解液与矿物油佐剂1:1混合，经腹腔免疫AD组正常鼠及妊娠鼠，免疫2次，间隔2周，对正常鼠、母鼠及仔鼠采血检测血清抗体。ELISA检测结果显示，重组蛋白LTB-Stx2B能够诱导免疫小鼠产生抗LTB和抗Stx2B的特异性抗体，二免疫后10d两种抗体滴度均达到1:10000以上，高于重组蛋白Stx2B免疫组及其他免疫组，并且产生的特异性抗体能够传递给子代小鼠。二免后10d分别对各组小鼠腹腔注射5LD50的LT和5LD50的Stx2进行体内中和试验，结果显示，AD组小鼠均获得了不同程度的针对LT或Stx2的保护作用，其中，以重组蛋白LTB-Stx2B免疫组小鼠获得的保护率最高（5/5健活）。用二免后各组高效价小鼠血清系列稀释后进行Stx2对Vero细胞的毒性的体外中和试验，结果显示，A组小鼠血清的中和效价为1:52，B组为1:11，C组为1:7，D组为1:9。本研究利用基因工程技术表达了重组蛋白LTB-Stx2B，实验证明该蛋白对实验动物具有良好的免原性和免疫保护性，为犊牛大肠杆菌性腹泻疫苗研究奠定了基础。
二、ST_1肠毒素融合蛋白的纯化及部分特性分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、ST_1肠毒素融合蛋白的纯化及部分特性分析（论文提纲范文）
（2）新生仔猪大肠杆菌性腹泻K88ac-ST1-LTB三价基因工程灭活疫苗的研究与应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号及缩略语的说明 |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.新生仔猪大肠杆菌性腹泻的国际流行情况及我国流行现状 |
| 2.新生仔猪大肠杆菌性腹泻病原(ETEC)致病因子研究进展 |
| 3.产肠毒素性大肠杆菌基因工程疫苗研究现状 |
| 第二章 新生仔猪大肠杆菌性腹泻K_(88)ac-ST_1-LT_B三价基因工程灭活疫苗候选菌株的构建 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 参考文献 |
| 第三章 新生仔猪大肠杆菌性腹泻K_(88)ac-ST_1-LT_B三价基因工程灭活疫苗实验室生产工艺研究 |
| Ⅰ．基因工程菌株BL21(DE3)(pXK88acST3LT5)菌种的限定代次及保存条件试验 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| Ⅱ．安全性试验和最小免疫剂量的测定 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| Ⅲ 实验室生产与检验 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| Ⅳ 保存期试验和田间试验 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 参考文献 |
| 第四章 新生仔猪大肠杆菌性腹泻K_(88)ac-ST_1-LT_B三价基因工程灭活疫苗工业化生产工艺的研究 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 参考文献 |
| 第五章 新生仔猪大肠杆菌性腹泻K_(88)ac-ST_1-LT_B三价基因工程灭活疫苗的现场应用及效益分析 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 参考文献 |
| 第六章 结论 |
| 致谢 |
| 本研究发表论文 |
| 个人简介(中文) |
| 个人简介(英文) |
（3）大肠杆菌肠毒素卵黄抗体的制备及其抗毒素特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 致病性大肠杆菌概述 |
| 1.1.1 产肠毒素性大肠杆菌（ETEC） |
| 1.1.2 肠侵袭性大肠杆菌（EIEC） |
| 1.1.3 肠出血性大肠杆菌（EHEC） |
| 1.1.4 肠致病性大肠杆菌（EPEC） |
| 1.2 产肠毒素性大肠杆菌 |
| 1.2.1 培养特性 |
| 1.2.2 毒力因子 |
| 1.2.3 流行特点 |
| 1.2.4 致病机理 |
| 1.3 仔猪大肠杆菌性腹泻概述 |
| 1.3.1 症状及病理变化 |
| 1.3.2 仔猪腹泻的防治 |
| 1.4 卵黄抗体研究进展 |
| 1.4.1 卵黄抗体的形成 |
| 1.4.2 卵黄抗体的结构 |
| 1.4.3 卵黄抗体的特点 |
| 1.4.4 IgY 的提取、分离和纯化 |
| 1.4.5 卵黄抗体的应用 |
| 1.5 研究的目的与意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株、质粒及实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 PCR 扩增引物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 基因克隆与鉴定 |
| 2.2.2 重组表达载体的构建与鉴定 |
| 2.2.3 重组蛋白表达与鉴定 |
| 2.2.4 卵黄抗体的制备 |
| 2.2.5 卵黄抗体抗毒素作用评价 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 基因克隆与鉴定 |
| 3.1.1 LTB-ST1a 基因克隆与鉴定 |
| 3.1.2 LTB-HA 基因克隆与鉴定 |
| 3.2 重组表达载体构建与鉴定 |
| 3.2.1 LTB-ST1a 表达载体构建与鉴定 |
| 3.2.2 LTB-HA 表达载体构建与鉴定 |
| 3.2.3 重组大肠杆菌的构建与鉴定 |
| 3.3 重组蛋白表达与鉴定 |
| 3.3.1 重组蛋白 LTB-ST1a 的表达 |
| 3.3.2 重组蛋白 LTB-HA 的表达 |
| 3.3.3 重组蛋白 4ST1a 的表达 |
| 3.3.4 重组蛋白的 Western blot 分析 |
| 3.4 卵黄抗体的制备 |
| 3.4.1 间接 ELISA 检测方法的建立 |
| 3.4.2 卵黄抗体的效价检测 |
| 3.5 卵黄抗体抗毒素作用评价 |
| 3.5.1 兔肠袢结扎实验 |
| 3.5.2 乳鼠灌胃实验 |
| 4 讨论 |
| 4.1 免疫原的选择 |
| 4.2 提高 ST 免疫原性的策略 |
| 4.3 卵黄抗体的抗毒素作用 |
| 4.4 预防仔猪腹泻病的卵黄抗体的应用前景 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（4）仔猪大肠杆菌病基因工程菌株GE-3的构建与免疫原性研究（论文提纲范文）
| 内容提要 |
| 英文缩写词表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 新生仔猪大肠杆菌性腹泻病原（ETEC）致病因子研究进展 |
| 1 菌毛(黏附素) |
| 2 肠毒素 |
| 3 小结 |
| 第二篇 研究内容 仔猪大肠杆菌病基因工程菌株GE-3 的构建与免疫原性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 致谢 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 硕士期间发表论文情况 |
| CURRICULUM VITAE |
（5）表达大肠杆菌K88ac-ST1-LTB融合蛋白基因工程菌株的构建（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 菌株与质粒 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 PCR引物设计与合成 |
| 1.4 DNA的操作 |
| 1.5 质粒的稳定性试验 |
| 1.6 表达产物SDS-PAGE分析和ELISA检测 |
| 1.7 重组菌株的毒性测定 |
| 1.8 免疫原性试验 |
| 1.9 乳鼠灌胃中和试验 |
| 2 结 果 |
| 2.1 重组菌株BL21 (DE3) (pXKST3LT5) 的构建 |
| 2.2 重组质粒的稳定性 |
| 2.3 K88ac-ST1-LTB融合蛋白的SDS-PAGE分析和ELISA检测 |
| 2.4 重组菌株BL21 (DE3) (pXKST3LT5) 的毒性测定 |
| 2.5 免疫原性试验 |
| 2.6 乳鼠灌胃中和试验 |
| 3 讨 论 |
（6）大肠埃希氏菌耐热性肠毒素的研究进展（论文提纲范文）
| 1 ST1的理化性质 |
| 2 ST1的分子结构与功能 |
| 3 ST1的作用机制 |
| 4 ST1的检测方法 |
| 4.1 乳鼠灌胃试验 |
| 4.2 ELISA |
| 4.3 基因探针 |
| 4.4 PCR技术 |
| 5 ST1的免疫原性 |
| 5.1 ST1和LT的化学偶联 |
| 5.2 ST1和LT的基因融合 |
（7）大肠杆菌K88ac-ST1-LTB三价基因工程菌株的构建（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株与质粒 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 动物 |
| 1.4 PCR引物设计与合成 |
| 1.5 DNA的操作 |
| 1.6 表达产物SDS-PAGE分析和ELISA检测 |
| 1.7 重组菌株的毒性测定 |
| 1.8 抗原制备 |
| 1.9 动物接种 |
| 1.10 攻毒试验 |
| 1.11 乳鼠灌胃中和试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组菌株BL21 (DE3) (pXKST3LT5) 的构建 |
| 2.2 K88ac-ST1-LTB融合蛋白的SDA-PAGE分析和ELISA检测 |
| 2.3 重组菌株BL21 (DE3) (pXKST3LT5) 的毒性测定 |
| 2.4 免疫攻毒保护试验 |
| 2.5 乳鼠灌胃中和试验 |
| 3 讨论 |
（8）新生仔猪源大肠杆菌主要毒力因子的分子流行病学及其免疫防制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 1 仔猪腹泻的流行病学 |
| 2 大肠杆菌引起的新生仔猪腹泻 |
| 3 大肠杆菌的分类 |
| 4 大肠杆菌的毒力因子 |
| 5 仔猪大肠杆菌性腹泻的免疫防制 |
| 研究一 仔猪腹泻源大肠杆菌的PCR 快速检测 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 研究二 仔猪腹泻源大肠杆菌的分离与鉴定 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 研究三 仔猪大肠杆菌性腹泻的免疫防制 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 研究四 黏膜抗体在预防细菌感染中的作用 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士期间发表论文 |
| 致谢 |
（10）大肠杆菌LTB-Stx2B融合蛋白的表达及其诱导小鼠体液免疫的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 犊牛腹泻概述 |
| 1.1.1 病毒性腹泻 |
| 1.1.2 细菌性腹泻 |
| 1.1.3 寄生虫性腹泻 |
| 1.2 犊牛大肠杆菌性腹泻 |
| 1.2.1 病原学 |
| 1.2.2 流行特点 |
| 1.2.3 临床症状及病理变化 |
| 1.2.4 防治 |
| 1.3 大肠杆菌毒力因子 |
| 1.3.1 粘附素 |
| 1.3.2 肠毒素 |
| 1.3.3 志贺毒素 |
| 1.4 大肠杆菌疫苗的研究进展 |
| 1.4.1 灭活苗 |
| 1.4.2 亚单位疫苗 |
| 1.4.3 核酸疫苗 |
| 1.4.4 活载体疫苗 |
| 1.5 研究目的与意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株、质粒、实验动物及细胞系 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 ltb 与 stx2b 融合基因的构建 |
| 2.2.2 重组蛋白 LTB-Stx2B 的表达与鉴定 |
| 2.2.3 重组蛋白 Stx2B 的表达与鉴定 |
| 2.2.4 重组蛋白纯化 |
| 2.2.5 实验动物分组及免疫 |
| 2.2.6 免疫抗体检测 |
| 2.2.7 体内中和试验 |
| 2.2.8 体外中和试验 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 ltb-stx2b 融合基因的构建 |
| 3.1.1 ltb 基因的扩增 |
| 3.1.2 stx2b 基因的扩增 |
| 3.1.3 ltb-stx2b 基因扩增 |
| 3.1.4 ltb-stx2b 重组基因序列的测定 |
| 3.2 重组蛋白 LTB-Stx2B 的表达 |
| 3.2.1 重组 E.coli Rossetta/pET-30a-LTB-Stx2B 的表达 |
| 3.2.2 重组 E.coli Rossetta/pCold I-LTB-Stx2B 的表达 |
| 3.3 重组蛋白 Stx2B 的表达与鉴定 |
| 3.3.1 stx2b 基因的扩增 |
| 3.3.2 stx2b 重组基因序列的测定 |
| 3.3.3 重组表达质粒 pCold I-Stx2B 的鉴定 |
| 3.3.4 重组 E.coli Rosetta/pCold-I-Stx2B 的表达与鉴定 |
| 3.4 免疫原的制备 |
| 3.5 免疫抗体的检测 |
| 3.6 体内中和试验 |
| 3.6.1 LT 和 Stx2 对小鼠的 LD50 的测定 |
| 3.6.2 LT 的小鼠体内中和试验 |
| 3.6.3 Stx2 的体内中和试验 |
| 3.7 体外中和试验 |
| 3.7.1 Stx2 对 Vero 细胞的毒性作用 |
| 3.7.2 Stx2 对 Vero 细胞 CD50 测定 |
| 3.7.3 Stx2 的中和效价 |
| 4 讨论 |
| 4.1 融合 PCR 技术 |
| 4.2 不同免疫原的免疫效力评价 |
| 4.3 初乳对新生犊牛的重要性 |
| 4.4 亚单位疫苗在牛病上的应用研究 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
四、ST_1肠毒素融合蛋白的纯化及部分特性分析（论文参考文献）
- [1]ST1肠毒素融合蛋白的纯化及部分特性分析[J]. 刘兴汉,王莉林,张绍杰,初晓白. 中国畜禽传染病, 1998(01)
- [2]新生仔猪大肠杆菌性腹泻K88ac-ST1-LTB三价基因工程灭活疫苗的研究与应用[D]. 卫广森. 南京农业大学, 2004(02)
- [3]大肠杆菌肠毒素卵黄抗体的制备及其抗毒素特性研究[D]. 赵姝静. 东北农业大学, 2013(10)
- [4]仔猪大肠杆菌病基因工程菌株GE-3的构建与免疫原性研究[D]. 王卓. 吉林大学, 2007(02)
- [5]表达大肠杆菌K88ac-ST1-LTB融合蛋白基因工程菌株的构建[J]. 许崇波,卫广森. 生物工程学报, 2002(02)
- [6]大肠埃希氏菌耐热性肠毒素的研究进展[J]. 卫广森,陆承平,陈溥言. 中国兽医科技, 2003(01)
- [7]大肠杆菌K88ac-ST1-LTB三价基因工程菌株的构建[J]. 卫广森,陆承平,陈溥言. 中国兽医学报, 2003(03)
- [8]新生仔猪源大肠杆菌主要毒力因子的分子流行病学及其免疫防制[D]. 高小攀. 扬州大学, 2009(12)
- [9]新生仔猪大肠杆菌性腹泻K88ac-ST1-LTB三价基因工程灭活疫苗候选菌株的构建[A]. 卫广森,许崇波,王文成,李尚波,王卓,苗玉和. 中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第六届全国会员代表大会暨第11次学术研讨会论文集, 2005
- [10]大肠杆菌LTB-Stx2B融合蛋白的表达及其诱导小鼠体液免疫的研究[D]. 李丹丹. 东北农业大学, 2013(S1)