一、丙型肝炎病毒核壳蛋白抗原的化学合成及其在血清学诊断中的应用（论文文献综述）
丁耀忠[1]（2021）在《QH-08PRRS分离株Caspase-8介导的凋亡途径及实时定量PCR方法的建立》文中研究说明猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）是猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）的病原,猪是其唯一宿主。PRRSV属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属,不分节段的一种有囊膜的单股正链RNA病毒,根据抗原特性和基因组特征分为两个基因型:欧洲型（European,Eu）,即1型PRRSV;北美型（North American,NA）,即2型PRRSV。该病毒的基因组长度约为15 kb,具有九个或十个重叠的开放阅读框（ORF）:ORF 1a-1b,ORF 2-7（病毒结构蛋白GP2,E,GP3,GP4,ORF5a,ORF5,M和N）。与马动脉炎病毒（equine arteritis virus,EAV）,乳酸脱氢酶升高病毒（lactate dehydrogenase-elevating virus,LDV）和猴出血热病毒（simian hemorrhagic fever virus）为同一属病毒。我们分离了一株高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus,HP-PRRSV）,将其命名为QH-08（Gen Bank:KU201579）。对其进行溯源后发现,其与HUN4和JXA1的进化变异几乎没有差异,全序列同源性分别为97.2%和97%,同时与HP/Thailand19500LL/2010（泰国,KF735060）、PRRSV/MZ/IND/1A/18（印度,MK287894）和BH58/10（老挝,JN626287）的全序列同源性为95.7%、93.8%和95.9%;遗传进化表明,这5株2型PRRSV分离株处在同一个进化分支上,而且QH-08分离株在进化谱系上与HUN4分离株具有更高的亲源性;同时在分子水平上比较34株分离株的同源性后得到了一种假想,即PRRSV-2型ORF1α1b的同源性差异是导致PRRS疫苗对于同源毒株攻毒保护力差异的重要原因,从而为疫苗选择和实时real-time RT-PCR的建立提供分子理论基础。对于天然抗病毒通路,如TLR 3凋亡途径,能否被有关刺激因子激活从而抑制PRRSV的感染能力;另外,选择一种可以防控QH-08 PRRSV的感染的疫苗对于将来促进PRRSV的防控可以提供一种参考依据;同时,由于PRRSV-2存在大量重组现象,建立能够覆盖经典毒株和变异毒株的、特异性检测PRRSV-2型的实时定量PCR技术,对于PRRSV-2型的防控具有积极意义。因此,在基于对不同的PRRSV-2型分子分析的基础上,进行了一些系列的研究。首先,通过病毒噬斑、qPCR和IFA等检测方法评估了刺激因子—盐酸吗啉胍对QH-08在Marc-145细胞上的复制有一定的抑制作用,其抑制机理是盐酸吗啉胍诱导在细胞水平上诱导TLR 3依赖的凋亡途径,进一步激活了caspas-8和caspas-3凋亡途径进而抑制了PRRSV复制,而且,这种抑制作用与caspase-3激活后Mcl-1表达量下调有关。这种通过激活caspase-8和caspase-3天然抗病毒信号通路或负调控Mcl-1表达来发挥其抗PRRSV的复制的机制,能够为天然抗病毒途径的研发提供启发作用。其次,选用了四种疫苗,分别为Ingelvac PRRS MLV、CH-1a、JXA1和JXA1-RMLV疫苗,其疫苗毒株的特性为ORF1α1b序列同源性为25.3-96.3%,而ORF2-ORF7同源性为85.8-99.6%。其中,第1组和第4组（n=5）的仔猪分别使用上述四种疫苗按照一一对应的方式分别进行免疫,第5组和第6组（n=3）仅仅注射PBS作为阳性和阴性对照。免疫28 d后,除阴性对照组外,第1组-第5组分别使用等量QH-08 PRRSV进行攻毒;与攻毒后14 d,将所有仔猪处死后进行尸检。研究表明,与第5组猪（阳性对照）相比,接种疫苗的猪的体温、肺损伤程度、血清和肺组织中的病毒含量水平显着降低（p<0.05）;在攻毒期内,JXA1和JXA1-R MLV疫苗对QH-08 PRRSV攻击提供了100%的保护,保护率显着的高于Ingelvac PRRS MLV和CH-1a疫苗的保护率。最后,基于QH-08分离株与其余毒株序列特性建立了一种检测2型PRRSV的实时定量PCR技术,研究表明,其检测最低核酸检测限为10拷贝/μL,敏感性是多重RT-PCR的10倍;特异性良好,不与1型PRRSV、PCV2、PRV和CSF发生交叉反应性。对临床样品的阳性检出率和阴性检出率均为100%;研制的3批试剂盒在一定保存期内,其重复性、特异性和敏感性良好,可以满足2型PRRSV的临床检测和防控的需求。
杨航[2]（2020）在《牛结核病诊断技术的建立与初步应用》文中提出牛结核是由牛分枝杆菌引起的人类和动物的人畜共患传染病,OIE将牛结核病分为B类人畜共患疾病在中国为II类人畜共患疾病。牛结核病每年给畜牧业带来的经济损失不可估量,不仅如此,牛结核病给人类的安全带来重大的隐患,因此对于牛结核病的防控至关重要,本研究希望通过探寻作为快速诊断的靶基因以及抗原蛋白,以免疫酶联吸附试验（ELISA）和实时荧光定量PCR技术为基础,建立针对牛结核病的诊断方法,为结核病的防控提供新的技术手段进行以下研究:（1）通过生物信息学分析的手段,对本试验室前期研究的16种结核特异性蛋白进行分析,通过理化特性、不稳定性指数、亲水性、蛋白质二级结构、跨膜域以及B细胞表位的分布预测为后续试验提供理论数据支持;将16株表达菌经表达纯化,经蛋白免疫印迹试验（Western-Blotting）验证均能与牛结核病阳性的牛血清进行反应,具有良好的反应源性;最终用爱德士牛结核病抗体检测试剂盒对本试验涉及的所有蛋白进行初步筛选,结果显示MPT70和MPT83在牛结核病的间接ELISA检测中具备优秀的诊断效能,可以作为诊断抗原进一步研究。（2）以MPT70蛋白、MPT83蛋白、MPT70-83融合蛋白、MPT70预测的抗原表位肽（M1）、MPT83预测的抗原表位肽（M2）分别为包被抗原建立间接ELISA检测方法,通过方阵滴定,确定其最佳包被浓度、血清稀释度、酶标二抗稀释度以及血清、二抗和显色的最佳反应时间,在各种最佳反应条件下对牛结核阳性的血清和牛结核阴性的血清进行检测,确定其阳性符合率以及阴性符合率。结果显示M1和MPT70的阴阳性符合率以及M2和MPT83的阴阳性符合率相当,可以以抗原多肽代替全蛋白作为诊断抗原。（3）建立一种基于Mpt83基因的实时荧光定量pcr的结核分枝杆菌核酸检测的方法,根据Mpt83基因设计一对特异性引物,以培养的H37RV标准株为模版扩增目的基因并连接T载体,构建标准重组质粒以检测所建方法的有效性。经反应条件的优化建立SYBR Green I实时荧光定量检测方法,结果显示所建立的方法线性关系良好,融解曲线波峰单一,具有很强的特异性与常见致病菌无交叉反应,最低检出下限为10copies/reaction,是常规PCR的100倍,对牛乳模拟标本的检测可达到10 CFU/10m L,可用于病菌的检测及定量分析。本试验通过生物信息学分析以及酶联免疫吸附试验对16种结核特异性蛋白进行初步的筛选,筛选出MPT70、MPT83两种对于牛结核病血清学诊断最具价值的抗原蛋白;分别以MPT70和MPT83两种蛋白和MPT70预测的抗原表位肽（M1）、MPT83预测的抗原表位肽（M2）以及MPT70-83融合蛋白建立间接ELISA检测方法,通过临床样本检测的结果显示两种蛋白的优势抗原表位段均能代替两种蛋白的全蛋白作为诊断抗原;以M PT83为靶基因的建立荧光定量PCR的检测方法,经检测所建立的方法具有良好的特异性,其检出下限可达10copies/reaction,对牛乳模拟标本的检测可达到10 CFU/10m L,可用于定量分析。为牛结核病的快速诊断提供一种新的技术方法。
鲁友铭[3]（2020）在《基于氧化石墨烯特种光纤光栅生物传感器的肝癌患者血清sPD-L1、AFP快速检测方法研究》文中认为肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）约占原发性肝癌的90%以上,是最常见类型的原发性肝癌（primary hepatic carcinoma）,HCC是全球范围内第五大癌症,且为全球致死率第三大癌症。肝癌的预后较差,而且有很高的复发风险,对HCC早期诊断显得尤为重要。甲胎蛋白（alpha-fetoprotein,AFP）作为HCC早期诊断的标记物已被普遍使用多年,但AFP诊断肝癌的敏感性仅为60%70%,它的临床诊断价值极其有限。近年来诸多研究表明可溶性程序性死亡因子配体1（sPD-L1）在肝细胞癌患者的血清中较健康人血清呈现显着性差异,预示着sPD-L1可以作为HCC临床诊断的辅助性血清标志物。大量研究证实肝癌标志物联合检测可显着提高敏感性和诊断的准确性。目前血清标志物检测方法主要包括酶联免疫吸附技术（ELISA）、免疫胶体金技术、蛋白质芯片法、化学发光免疫分析法等。其中ELISA法实验步骤繁琐,耗时耗力,结果易受外部因素影响。免疫胶体金技术检测灵敏度不高,只能定性,不能定量,蛋白质芯片法对实验室设备要求较高,且仪器设备价格昂贵。化学发光免疫分析法消耗样本少、操作简便、且检测结果较为准确,但需要患者承担高昂的检测费用。因此探索高效、特异、准确、低成本的检测技术对于肝癌的快速诊断具有十分重要的意义。目前肝癌标志物的血清学检测主要依赖于抗原抗体反应,但国内的肝癌血清标志物抗体产品质量参差不齐,进口产品价格较昂贵。制备高效价、特异性强、低成本的肝癌血清标志物抗体可为肝癌的早期快速诊断提供有效的试剂。极大角度光纤光栅（excessively tilted fiber grating,Ex-TFG）生物传感器具有检测灵敏度高、特异性好、无需标记、成本低、可实现实时检测的优点。前期本实验室已成功将Ex-TFG生物传感器运用于心力衰竭生物标记物N末端脑钠肽前体（NT-proBNP）、猪圆环病毒2型（PCV2）、新城疫病毒（NDV）、禽流感病毒（AIV）和降钙素原（PCT）的检测,将抗原抗体反应的特异性与光纤光栅传感器检测的敏感性结合,在检测的灵敏度上取得了突破,并发表了高水平研究论文。本文通过对前期研制的Ex-TFG生物传感器进一步进行改进,以提高其检测灵敏度、稳定性和特异性。本文通过原核表达系统制备血清标志物蛋白AFP、sPD-L1,将sPD-L1采用长程免疫法免疫BALB/c小鼠,利用聚乙二醇（PEG）细胞融合技术制备抗sPD-L1单克隆抗体,为HCC的早期快速诊断提供有效试剂。对Ex-TFG进行羟基化、硅烷化修饰后,在光栅表面涂覆金纳米壳（AuNS）与氧化石墨烯（GO）。并活化GO表面的羧基（-COOH）。使其与抗体通过-NH-CO-共价键结合。利用脱脂奶粉对光栅表面空余位点进行封闭,进行不同浓度抗原的检测,并对传感器的重复性,特异性,临床样本检测等进行验证。从而初步建立起一种基于Ex-TFG生物传感器的血清标志物快速检测技术,为肝癌的快速诊断提供新的检测手段。本文的研究内容如下:（1）根据GenBank发布的人源PD-L1基因序列（GenBank登录号:AY254342.1）,AFP基因序列（GenBank登录号:NM001134.2）分别对序列分析后进行大肠杆菌密码子偏好性优化,使其适合于大肠杆菌表达系统。化学合成法分别合成全长目的基因sPD-L1、AFP。并将其分别连接至质粒载体pET28a（+）。从而构建重组质粒sPD-L1-pET28a（+）、AFP-pET28a（+）。将重组质粒分别转化至大肠杆菌感受态细胞BL21（DE3）进行诱导表达,并对诱导表达条件进行优化。利用镍柱对目的蛋白进行亲和层析,利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、二喹啉甲酸（BCA）法、蛋白免疫印迹（Western blot）对纯化所得的重组蛋白sPD-L1、AFP进行纯度、浓度、特异性鉴定。（2）将上述制备所得的重组蛋白sPD-L1与佐剂进行乳化,作为免疫原对BALB/c小鼠进行长程免疫。取4次免疫后的小鼠脾脏制成脾细胞悬液,与SP/20细胞混合,采用PEG法进行细胞融合。采用间接ELISA法,对融合细胞及亚克隆后的细胞进行两轮以上筛选。将筛选得到的单克隆阳性细胞株进行扩大培养,注射入BALB/c小鼠腹腔从而制备腹水型单克隆抗体。对单克隆细胞株进行抗体亚型鉴定,利用Protein A柱对腹水型单抗进行纯化,利用SDS-PAGE、二喹啉甲酸（BCA）法、蛋白免疫印迹（Western blot）和酶联免疫吸附测定（ELISA）对纯化所得的腹水型单抗进行鉴定。（3）利用5%的HNO3、无水乙醇、离子水（RO）对光栅进行洁净化处理,取浓度为0.2M的NaOH溶液对光栅表面进行浸泡,使其表面富含大量的羟基（-OH）,从而实现羟基化。将羟基化的栅区表面浸没于适量的1%3-巯丙基三甲氧基（MPTMS）溶液使光栅表面带上巯基（-SH）从而实现硅烷化。将离心处理后的金纳米壳（AuNS）涂覆光栅表面过夜。金纳米壳氨基化后取200uL氧化石墨烯（GO）分散液浸泡栅区隔夜。利用1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）活化GO表面的羧基（-COOH）。分别修饰sPD-L1单克隆抗体以及AFP单克隆抗体,利用5%脱脂奶粉对光栅进行封闭处理,分别检测不同浓度的sPD-L1、AFP抗原,并对生物传感器的灵敏度、特异性、重复性等进行评价,再对临床血清样本进行测试分析。结果:（1）重组质粒pET28a（+）-sPD-L1、pET28a（+）-AFP经过酶切鉴定后,分别在668bp、1875bp处有明显的特异性条带出现,且测序结果与已知对应序列一致,说明重组质粒构建成功。重组菌株pET28a（+）-sPD-L1/BL21（DE3）在37℃,0.5mmol/L IPTG,9h的诱导条件下,目的蛋白sPD-L1的表达量最高;经过SDS-PAGE鉴定显示,重组蛋白sPD-L1、AFP的沉淀表达量均高于上清表达量。经过镍柱亲和层析后的目的蛋白sPD-L1、AFP纯度均能达到90%以上且浓度分别能够达到945.7ug/mL以及191.1ug/mL,经过Western blot鉴定显示,目的蛋白sPD-L1、AFP能够分别与相应的市售单克隆抗体发生良好的结合,且于28KD以及75KD左右有特异性条带出现。（2）细胞融合实验显示,细胞融合率为86.7%,阳性率为80.4%,经过两轮亚克隆筛选共获得4株单克隆细胞株,分别命名为1-3H,2-2G,2-9G,1-10C。单抗亚型鉴定结果表明1-10C、2-2G为IgG2b型、2-9G为IgG2a型。SDS-PAGE鉴定显示纯化后的腹水型单抗于50KD、25KD位置出现条带,与IgG型抗体重链、轻链条带相符。经过BCA法浓度测定,纯化后的腹水单抗浓度较高,达到2.064mg/mL。ELISA鉴定结果显示2-2G、2-9G腹水单抗效价均能够达到1:2048000以上。4株杂交瘤细胞株经反复冻存、复苏及多次传代,均能分泌高效价抗体,经Western blot鉴定后证实所获得单抗是特异性针对sPD-L1抗原。（3）极大角度光纤光栅经过光纤表面羟基化、硅烷化、涂覆金纳米壳、氨基化、涂覆氧化石墨烯、活化羧基、修饰sPD-L1抗体、封闭后进行测试分析,结果显示其各步骤的波长红移量为:0.235nm、0.255nm、0.866nm、0.006nm、0.64nm、0.076nm、0.3nm、0.04nm。表明各步骤修饰均较为理想。该生物传感器对sPD-L1抗原的检测下限为1pg/mL。检测范围为1pg/mL10ng/mL。对极大角度光纤光栅表面经过上述羟基化至活化羧基修饰过程最后修饰AFP抗体、封闭后进行测试分析,结果显示其各步骤的波长红移量为0.225nm、0.047nm、0.832nm、0.736nm、1.152nm、1.168nm、1.408nm、1.68nm,修饰结果较为理想,检测范围为5 pg/mL10ng/mL。经过特异性实验显示,其与不同浓度的布鲁氏菌病血清学标志物BP26蛋白均不发生特异性反应,表明此传感器特异性良好。利用研制的免疫传感器分别对肝癌患者和健康人血清中的AFP、sPD-L1进行检测,结果显示肝癌患者血清和健康人血清的谐振波长偏移量在两种标志物的检测中均存在显着性差异,并在同一患者中AFP和sPD-L1检测结果呈现一定的正相关性,表明该传感器对AFP、sPD-L1检测具有高度的特异性,可满足临床检测要求。结论:本研究构建了sPD-L1、AFP基因工程菌,并成功实现了在原核表达系统中高效表达sPD-L1、AFP蛋白。通过长程免疫法进行抗原免疫、PEG法细胞融合、有限稀释法亚克隆筛选后得到了4株能稳定分泌抗sPD-L1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,利用制备的抗原、抗体,初步建立了基于极大角度光纤光栅生物传感器的AFP、sPD-L1快速检测方法,并对传感器的灵敏度、重复性,特异性以及临床应用等进行了测试,该方法具有较高的灵敏度、特异性强、可重复性较好等优点,可用于血清样品中的AFP、sPD-L1检测,为肝癌的诊断提供了新的检测技术和手段。
王羽[4]（2019）在《细胞因子辅助免疫的抗体制备与应用及基于亲和力的免疫检测灵敏度研究》文中进行了进一步梳理抗体作为免疫检测技术开发的关键原料,其质量直接决定了相应免疫检测方法的性能。对于一些免疫原性低,甚至不具备免疫原性的目标检测物,传统的免疫方式较难以获得高质量的目标抗体。同时在免疫检测过程中,抗原与抗体间的亲和力对所建立的检测方法灵敏度的影响也是不可忽视的。因此,开发高质量检测抗体及明确抗原与抗体间的亲和力对免疫检测方法灵敏度的影响十分有意义。本研究通过应用细胞因子作为分子佐剂辅助免疫制备单克隆抗体,在DNA免疫和皮下免疫两种免疫策略中证实了细胞因子作为分子佐剂对制备单克隆抗体的积极效果。进一步分析了高亲和力抗体所识别的具体抗原表位信息,以及抗原表位氨基酸对抗原-抗体免疫反应亲和力的影响,明确了亲和力在抗原与抗体结合与解离反应过程中的重要作用。通过分析系列与检测抗体具有不同亲和力的竞争抗原对竞争法免疫检测灵敏度的影响,明确了竞争抗原与检测抗体的亲和力和样本中待检抗原与检测抗体的亲和力差异对竞争法免疫检测灵敏度的影响。最后,应用制备得到的高亲和力单克隆抗体开发了抗缪勒氏管激素（Anti-mullerian hormone,AMH）及和肽素（Copeptin,CPP）全自动化学发光检测试剂（Chemiluminescence immuneassay,CLIA）,试剂具有优异的使用性能,并可用于临床样本的检测。主要研究结果如下:（1）通过将合成得到的mFlt3L、mGM-CSF、mCCL20基因片段连接到载体pCAGGS上,成功构建重组载体pCAGGS-mFlt3L,pCAGGS-mGM-CSF及pCAGGS-mCCL20。并验证了其可在293F细胞中有效表达目标蛋白,表明可作为分子佐剂进一步实验。（2）利用分子佐剂（mFlt3L、mGM-CSF、mCCL20）辅助DNA免疫的策略成功制备了针对AMH的高亲和力抗体,使用KD值小于4 nM的两株高亲和力单克隆抗体成功构建了AMH化学发光检测方法。该分析方法对AMH检测表现出高度敏感性和特异性。检测范围为0.12520 ng mL-1,检出限为0.099 ng mL-1。孵育时间仅需30 min,而商品ELISA试剂盒需3 h。用于临床血清标本中AMH的检测,结果与标准AMH检测ELISA试剂盒具有高度一致性。（3）通过分子佐剂（mFlt3L、mGM-CSF、mCCL20）辅助皮下免疫后,杂交瘤的阳性率明显提高,且经过一次杂交瘤制备、亚克隆筛选便得到8株稳定分泌抗体的细胞株,对比皮下普免两次杂交瘤制备得到4株的得率,此策略明显提高抗体的开发效率。经过纯度和效价检测,所制备的抗体纯度均可达到90%,效价均大于1:105;经过细胞免疫化学实验确认,所制备的抗体可与天然的和肽素发生特异性反应,具备免疫检测试剂开发的要求。通过亲和力表征对比,发现分子佐剂辅助免疫制备的抗体亲和力远高于皮下普免制备的抗体,最高亲和力抗体的KD值可达10-1010 M。（4）经过生物信息学软件分析及肽扫描,最终确定了4株高亲和抗体的表位序列,均位于152161（APEPFEPAQP）。经过丙氨酸突变扫描和分子动力学分析,发现4株抗体的表位关键氨基酸主要为脯氨酸（P）、苯丙氨酸（F）和谷氨酰胺（Q）。最终明确抗原氨基酸序列中含疏水氨基酸较多的位置容易形成抗原表位。（5）通过在免疫层析和间接竞争ELISA检测体系同时研究竞争抗原与检测抗体间的亲和力变化对检测体系灵敏度的影响,发现适度下调竞争抗原与抗体的亲和力后,检测限（Limit of detection,LOD）显着下降,在免疫层析体系中最高下降至原LOD的9.5%,在间接竞争ELISA体系中最高下降至原LOD的12.1%,最佳灵敏度改善效果LOD低至0.09 nmol L-1。表明适度的降低竞争抗原与检测抗体之间的亲和力可以改善竞争免疫检测方法学的灵敏度。（6）选用抗CPP高亲和力抗体作为捕获抗体,磁珠作为固相载体,成功构建了可用于CPP检测的全自动CLIA,检测范围1.21250 pmol L-1,且最低检出限LOD仅为6.25 pmol L-1,完全满足临床应用需求(<18.9 pmol L-1)。再者,全自动CLIA的样本孵育时间仅为30 min,而对照ELISA则需要2 h以上。用于临床血清标本中的CPP检测,与市售CPP检测ELISA试剂盒相比,结果具有显着一致性。因此,所构建的全自动CLIA分析方法可以成功用于CPP的临床快速检测。
纪伟[5]（2019）在《HCV和HBV的特异性T细胞免疫反应和分子机制研究》文中提出丙型肝炎是由丙型肝炎病毒（hepatitis Cvirus,HCV）引起的一种主要经血液传播的传染病,呈世界性流行。根据世界卫生组织报告,全球丙型肝炎的流行率平均为3%,估计有1.7亿人感染丙型肝炎病毒,每年新增感染者300万-400万例,死亡25万例,占所有传染病死因的第10位。丙型肝炎已经成为困扰全球公共卫生的一个重要问题。目前,由于HCV基因的多样性以及缺乏理想的动物和细胞感染模型,HCV疫苗研究仍面临很多难题。T细胞免疫在急性HCV感染中病毒是否能自发清除起到关键作用。研究表明,在自限性HCV感染的患者或黑猩猩中发生了强烈的HCV特异性CD8+T细胞应答,但在慢性感染的宿主中观察到较弱CD8+T细胞应答。为了探究T细胞在HCV感染自然进程中的特征,及T细胞免疫与疾病进程的相关性,我们招募河北省某村因献血感染HCV的聚集性人群为研究对象,其中的HCV感染者是1970-1990年左右因献血感染,没有接受过任何治疗。我们用NS3蛋白overlapping多肽库体外刺激PBMC,通过流式分析T细胞细胞因子分泌、记忆细胞分型及抑制性分子表达等,探究T细胞免疫在HCV病毒清除组和慢性感染组的特征及差异。结果表明,病毒清除组的CD8+T和CD4+T细胞因子分泌能力显着高于慢性感染组和健康对照组。两组HCV特异性CD8+T细胞主要以效应性记忆T细胞（TEM）和效应性T细胞为主（TEMRA）,而HCV特异性CD4+T细胞主要以效应性记忆T细胞（TEM）和中心记忆T细胞（TCM）为主。在抑制性分子的表达分析中,慢性感染者病毒特异性CD8+T细胞抑制受体的表达以PD-1高、TIM-3高表达为主要特征,其与以AST或ALT水平异常和形态病理学变化为特征的肝损伤相关。有趣的是,LAG-3在慢性感染者CD8+T细胞上的表达较低,与ALT或AST呈负相关。我们对长时期的HCV感染者的病毒特异性T细胞免疫的特征进行了研究,并有助于阐明免疫应答在相关临床过程中的作用。同时,我们也对慢性感染者感染的HCV病毒进行了分子水平的研究工作。我们对其感染的HCV病毒通过分子生物学实验进行基因分型,并利用一代测序和二代测序手段获得26条全基因组序列。根据基因分型结果,这些感染者感染的是HCV1b（17）、HCV2a（9）两种基因型。对于一代测序的全基因序列,我们根据MEGA7.0的进化距离分析发现,HCV1b间及HCV2a间的序列都有很高的同源性。通过与国内外序列进行系统发育进化树分析,HCV2a的序列相对聚集,聚集在一个独立的分支上,与国外测得的NDM228等株亲缘关系相对较近。HCV1b的17条序列相对分散。对各蛋白编码区也进行了系统进化分析,结果同全基因序列的分析基本一致。通过二代测序,我们获得的信息有原始reads、拼接序列、每条序列每个位点的测序深度、entropy、mutrate等。26条序列的拼接工作已经完成,数据分析还在进行中。我们在病毒“准种”、重要的T细胞表位和中和抗体表位的免疫逃逸突变等角度进行分析,结合临床数据,探究其与肝脏损伤程度的相关性。另外,MHC分子结构在T细胞免疫研究中起了很重要的作用。MHC分子可以限制TCR对多肽的识别,而且多肽与MHC之间的构象协调作用对于TCR的识别至关重要。如果将构像改变的关键氨基酸突变,就会导致pMHC复合物与TCR的结合变弱。同一 MHC-多肽可以被不同TCR识别,MHC-多肽复合物的柔性变化也是TCR可以交叉识别的原因之一。可以看出,MHC-多肽的结合能力以及它们的构象变化影响了TCR识别。我们通过对H-2Kd-HBV peptide复合物分子结构的分析,并结合HLA-B*4001的结构解析及分析,发现两个复合物结构中都有在一个带正电的氨基酸R和负电氨基酸E构成的两种不同形式的盐桥参与MHC与多肽的结合。我们对两个氨基酸进行了单突变和双突变,通过refolding、CD检测MHC与多肽结合的稳定性,以及H-2Kdtetramer对HBV特异性CD8+T的识别,结果证明了盐桥氨基酸的突变影响了多肽与MHC分子的结合能力及多肽-MHC复合物对TCR的识别。综上所述,本研究探究了 T细胞免疫在HCV感染自然进程中的特征和T细胞免疫与肝脏损伤程度的相关性,并对感染者感染的HCV病毒全序列进行了分析。另外,我们基于H-2Kd-HBV peptide HBc87-95和 HLA-B*4001-SARS N216-225复合物结构发现了盐桥在MHC与多肽结合及MHC-多肽复合物对TCR识别的重要性。该研究工作对HCV和HBV的预防和治疗具有一定的提示性和指导性。
柳亚茹[6]（2019）在《猪圆环病毒2型抗原抗体荧光微球免疫层析快速检测方法的建立与应用》文中研究指明猪圆环病毒病是由猪圆环病毒2型（Porcine Cirovirus Type 2,PCV2）感染所致,临床症状表现为断奶仔猪的多系统衰竭综合征、皮炎肾病综合征及母猪的繁殖障碍等,是严重危害养猪业健康发展的重要疾病之一,给世界各国养猪产业造成了巨大经济损失。该病快速诊断与检测技术的研究一直是各国学者研究的热点课题。虽然目前已经建立了聚合酶链式反应（PCR）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、直接免疫荧光、病毒分离鉴定等诊断与检测技术,但缺少可快速读取检测数值的技术方法。因此,开展PCV2抗原抗体快速读取检测数值技术的研究对于该病的成功防控十分必要。本论文基于原核表达纯化的Cap蛋白,建立了PCV2抗体荧光微球免疫层析快速检测技术,基于可配对的PCV2单克隆抗体,建立了PCV2抗原荧光微球免疫层析快速检测技术,丰富了PCV2抗原抗体的快速检测技术。本研究成功扩增出702 bp的Cap基因,构建了pET30a（+）-Cap的原核表达载体,表达了分子量约为36 Ku的含有His标签Cap融合蛋白;通过条件优化,确定了最佳蛋白诱导表达条件,转速180 rpm,IPTG诱导终浓度为0.5 mM,诱导时间5 h,诱导温度为37℃;通过亲和层析的方式成功纯化出Cap融合蛋白,纯化后的蛋白浓度为1.5mg/mL。免疫印迹分析试验表明,纯化的蛋白可与PCV2特异性多抗发生反应,具有良好的反应原性。以表达纯化的含His标签Cap融合蛋白标记荧光微球,实验室已有的无标签的Cap蛋白、兔源PCV2高免血清IgG分别包被在硝酸纤维素膜的检测线（T）和质控线（C）上,点膜仪参数设置为Speed 30 mm/sec,1.0μL/cm,建立了猪圆环病毒2型抗体荧光微球免疫层析快速检测方法。荧光微球标记蛋白抗原的终浓度为50μg/mL,最佳反应条件为待检测血清样品进行20倍稀释,在100μL样品中加入3μL偶联抗原的荧光微球,混合均匀后孵育5 min,加入加样孔,待样液完全浸润NC膜时开始计时,反应15min,用干式免疫荧光分析仪读取T/C比值,判定结果。经对8个不同地区的340份血清样品的检测,同时同商品化猪圆环病毒ELISA抗体检测试剂盒比较,特异性符合率为94.2%,敏感性符合率为99.63%,总体符合率为98.53%;试验结果表明,建立的PCV2抗体荧光微球免疫层析快速检测方法具有快速、简便、敏感、特异等特点,可用于生产临床上猪圆环病毒2型抗体的快速检测。以2株PCV2特异性单抗5C、4E11,基于双抗夹心的方法建立PCV2抗原荧光微球免疫层析检测方法。以5C单抗标记荧光微球,1 mg/mL的4E11单抗、1 mg/mL羊抗小鼠IgG分别包被在检测线（T）和质控线线（C）上,点膜仪参数设置,为Speed 40mm/sec,1.0μL/cm,抗体荧光微球偶联的终浓度为150μg/mL。检测最佳条件:含PCV2的样本稀释20倍,每100μL样品中加入单抗偶联的荧光微球7μL,加入稀释板内混合均匀,室温孵育5 min,加入加样孔,待样液完全浸润NC膜时开始计时,反应12 min,最后用干式免疫荧光分析仪读取T/C比值,判定结果的。对临床收集和制备的120份样品进行了检测,同时同商品化PCV2 PCR检测试剂盒比较,特异性符合率为97.22%,敏感性符合率为100%,总体符合率为99.17%;结果表明,研制的PCV2抗原荧光微球免疫层析快速检测方法具有快速、简便、敏感、特异等特点,可用于PCV2的临床样本快速检测和PCV2疫苗生产中的半成品快速检测与质量控制。
马秀园[7]（2016）在《猪瘟病毒NS2-3蛋白抗原集中区基因的真核表达》文中进行了进一步梳理猪瘟（CSF）是由猪瘟病毒（CSFV）引起一种高度接触性和高致死性传染病,给世界各国的养猪业带来了严重危害。近年来,随着CSFV研究的深入,新型疫苗的研制和先进诊断方法的出现,对控制CSF方面发挥了巨大作用。NS2-3蛋白是CSFV的非结构蛋白,具有很好的免疫优势。本研究从携带猪瘟兔化弱毒（Hog Cholera Lapinized Virus,HCLV）全长基因组c DNA质粒中扩增NS2-3基因的抗原表位集中区基因,扩增长度为789bp,将其命名为NS2-32。将目的片段和表达载体p PICZαC分别经Eco R I和Xba I限制性内切酶双酶切,然后连接转化至大肠杆菌,得到重组表达质粒p PICZαC-NS2-32。经PCR和双酶切鉴定后进行测序鉴定,重组表达质粒p PICZαC-NS2-32经Sac I限制性内切酶单酶切线性化之后,电击转化至P.pastoris工程菌感受态X-33。筛选出高抗性阳性菌株,通过改变温度、培养基p H值、甲醇流加量,摸索诱导表达条件,诱导条件包括:（1）诱导温度为:22℃、24℃、26℃、28℃;（2）诱导p H值为:4.0、5.0、6.0、7.0;（3）甲醇浓度为:0.4%、0.7%。对表达产物进行SDS-PAGE分析,没有出现特异性条带。进一步分析目的蛋白无法表达的可能原因和影响因素,包括密码子的偏嗜性、A+T含量、过度糖基化、甲醇浓度、目的蛋白的降解和蛋白信号肽的影响等,排除了影响目的蛋白表达的条件因素,推测影响目的蛋白表达的关键因素可能是基因自身的特点,即稀有密码子比率高和糖基化位点多,这需要进一步的研究验证。本研究为进一步获得高表达、良好抗原性的蛋白,构建以NS2-3抗原集中区为基础的CSFV检测方法和研制新型疫苗奠定基础。
李图帅[8]（2016）在《O型口蹄疫病毒VP1蛋白GH loop表位表面展示策略与免疫原性研究》文中进行了进一步梳理口蹄疫（Foot-and-mouth disease,FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus,FMDV）引起的一种急性、热性、高度接触性传染病。该病毒主要感染牛、羊等偶蹄动物并可造成严重的经济损失。目前,我国国产的FMDV疫苗均是由灭活口蹄疫病毒,配用油佐剂制备而成,临床副反应大,免疫保护还有待进一步提高,同时在疫苗生产过程中存在灭活不完全而造成强毒逃逸的风险。因此,选择有效表面展示系统,利用基因工程技术展示FMDV抗原表位,进而制备FMDV亚单位疫苗,对于提升国产疫苗质量及安全性,具有很大的实际应用价值。VP1蛋白是FMDV主要的抗原,它含有的GH环第141-160位氨基酸为线性B细胞抗原表位,也是诱导机体产生中和抗体的免疫表位,可以诱导产生保护性免疫应答,因此是研究口蹄疫疫苗的理想抗原,基于口蹄疫VP1蛋白GH loop表位的合成肽疫苗目前在国内已成功上市。PCV2 Cap蛋白病毒样颗粒表面展示系统是国内外近年发展起来的一种外源抗原表位展示系统。该技术是利用外源肽段取代Cap蛋白内部的loop环,表达重组Cap蛋白,然后60个重组Cap蛋白可在体外自我组装为病毒样颗粒完成对外源抗原表位的展示。霍乱毒素B亚单位展示系统是利用外源抗原表位采取同源重组技术替换霍乱毒素B亚单位中KNG氨基酸基因片段,表达重组CTB蛋白,然后5个重组CTB蛋白可在体外聚集为五聚体结构进而完成对外源抗原表位的展示。本研究选择了 PCV2 Cap蛋白病毒样颗粒及霍乱毒素B亚单位作为展示FMDV抗原表位的载体系统,成功展示FMDV VP1的GH loop抗原表位,并以此为基础制备了 FMDV-PCV2二联亚单位疫苗及FMDV亚单位疫苗,初步评价其免疫保护效力,为研制高效FMDV疫苗奠定了良好的基础。本文主要研究内容如下:1.基因替换构建以PCV2 Cap为骨架展示FMDV GHloop的嵌合VLPs本试验以O型FMDV VP1主要B细胞表位GH loop为外源基因,在PCV2 Cap蛋白内部鉴定获得4个位置,以基因替换方式构建嵌合基因,构建成功的嵌合基因与PQZ表达载体相连后在大肠杆菌中成功诱导表达,SDS-PAGE鉴定表明,获得的重组蛋白大小分别为27 kDa左右,均为可溶性蛋白;Western-bloting分析显示,6种重组蛋白均能与PCV2 阳性血清及O型FMDV 阳性血清反应;透射电镜观察表明,重组Cap蛋白体外形成大量直径在20 nm左右的病毒样颗粒。50 μg/只纯化后重组蛋白自制疫苗免疫小鼠证实能够引发机体产生特异性细胞免疫和体液免疫应答,其中以Cap-loop4免疫效果最好。2.基因插入构建以PCV2 Cap为骨架展示FMDV GH loop的嵌合VLPs在前期研究基础上依次将FMDV GH loop基因片段插入PCV2 Cap蛋白内部鉴定获得4个位置处,以基因替换方式构建嵌合基因,构建成功的嵌合基因与PQZ表达载体相连后在大肠杆菌中成功诱导表达。SDS-PAGE鉴定表明,获得的重组蛋白大小分别为35 kDa左右,均为可溶性蛋白;Western-bloting分析显示,4种重组蛋白均能与PCV2阳性血清及O型FMDV血清呈阳性反应;透射电镜观察表明,重组Cap蛋白体外形成大量直径在20 nm左右的病毒样颗粒。50 μg/只纯化后重组蛋白自制疫苗免疫小鼠证实能够引发机体产生特异性细胞免疫和体液免疫应答,其中以Cap-iloop1免疫效果最好。3.以CTB为载体展示FMDV GH loop抗原表位方法的研究探讨以霍乱毒素B亚单位为载体制备猪O型口蹄疫亚单位疫苗的可行性。将FMDV GH loop基因片段取代CTB氨基酸的KNG肽段基因序列,基因替换方式构建嵌合基因,构建成功的嵌合基因与PQZ表达载体相连后在大肠杆菌中诱导表达。SDS-PAGE结果表明重组蛋白获得高效表达且具有良好可溶性;Western-blot分析结果显示重组蛋白能够与FMDV 阳性血清发生反应;神经节苷脂GM1抗原包被板鉴定表明,重组CTB蛋白能够形成五聚体结构;200 μg/头份重组蛋白制备疫苗免疫试验猪能够产生较高的抗体水平与细胞免疫反应。以上结果表明重组蛋白具有针对FMDV良好的免疫原性,为研究口蹄疫亚单位疫苗提供了新思路。
杨闽楠[9]（2014）在《RNAi靶向PRRSV N基因及GP5基因ADE表达缺失重组腺病毒免疫原性研究》文中认为猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是一种以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道疾病为特征的传染病。中国自1996年爆发PRRS以来，已遍及全国各地，成为对养猪业危害最为严重的疫病之一。PRRS的病原体为猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV），是一种有囊膜的单股正链RNA病毒，其基因组大小约为15.5kb，包含10个开放阅读框，属于套式病毒目、动脉炎病毒科、动脉炎病毒属成员。PRRSV具有抗原变异性、嗜巨噬细胞性、持续感染性以及抗体依赖性增加作用等特征。临床上常与其它病原混合感染。现在用于预防PRRS的灭活疫苗效果不稳定，常导致免疫失败；而弱毒疫苗有毒力返强的危险，可能会导致疫苗毒的传播。PRRSV N蛋白是由ORF7编码的核衣壳蛋白，占整个病毒粒子蛋白总量的20-40%，是病毒装配和拆分的主要结构蛋白，在PRRSV感染细胞中，表达量最高，抗原性最强，直接参与病毒基因组的复制。同时，N基因在PRRSV RNA的识别、亚细胞定位、与其他病毒和细胞蛋白的互作中起到重要作用。一旦N基因发生变异或受到抑制，往往会导致整个病毒基因组功能的丧失。GP5蛋白是由ORF5编码的糖基化囊膜蛋白，具有较好的免疫原性，能够诱导机体产生中和抗体，在PRRSV的致病性、诊断、预防与控制方面具有重要意义，是研制基因工程疫苗的最佳候选基因。但是，在GP5蛋白的外结构域中有一个高度保守的线性中和表位B（Aa37-45）和一个高度变异性的免疫优势非中和表位A（Aa27-31）。A表位的核心位于B表位的七个氨基酸之前，这一特点使A表位成为一个“诱骗”表位，当AB表位同时存在时，B表位的中和作用会被A表位完全覆盖，降低中和反应。这一现象称为抗体依赖性增强作用，即ADE效应。本课题结合N蛋白及GP5蛋白的特点，利用RNAi技术靶向N基因，筛选出3个高效靶位（71-91，144-164，218-238），构建shRNA干扰质粒，分别命名为p2.1-N71、p2.1-N144及p2.1-N218，在MARC-145细胞上通过细胞CPE观察，病毒滴度测定，间接免疫荧光检测，以及实时荧光定量PCR技术验证RNAi靶向N基因抑制PRRSV的复制效果。结果表明，构建的三个shRNA干扰质粒均能有效的抑制PRRSV的复制，它们可以阻止MARC-145细胞CPE的形成，能够降低病毒滴度874-倍、151-倍、和592-倍，并且，实时荧光定量PCR结果显示，三个shRNA干扰质粒能够分别使PRRSV在MARC-145细胞中的复制减少93.2%，83.6%，89.2%。在这三个shRNA干扰质粒中，相比于p2.1-N144和p2.1-N218干扰质粒，p2.1-N71表现出更好的抑制效果。另外，我们在线BLAST分析N基因的同源性，发现至少有32株PRRSV与JL07SW株N基因同源性为100%，并且这32株PRRSV均属于美洲型，因此我们推测，N71是高效抑制美洲型PRRSV复制的RNAi靶点。另外，我们应用生物信息学软件DNAStar中Protein模块，对GP5蛋白的二级结构进行预测，预测结果显示，GP5蛋白属于β折叠为主的蛋白，并对其亲水性、两性区、柔韧性以及表面可及性进行分析，选择抗原指数高，亲水性强，表面可及性为正值，并且除去α-螺旋、β-折叠、信号肽和跨膜区的区域，最终筛选出GP5蛋白潜在的优势中和表位区可能是30-41位、49-57位、130-142位、146-156位、159-175位、以及191-199位氨基酸，与理论结果相符。根据预测结果并结合文献报道，我们将GP5基因上27-31位氨基酸缺失，并在缺失位点连入37-45位氨基酸，通过重叠PCR方法扩增缺失A表位及缺失A表位后串联B表位的重组GP5基因（△aGP5及bGP5）。并将改造后的GP5基因连入重组腺病毒穿梭载体pShuttle中，构建重组pShuttle穿梭质粒，分别命名为pShuttle-△aGP5，pShuttle-bGP5，以及pShuttle-GP5，同时构建未带外源基因的空穿梭质粒，作为阴性对照，命名为pShuttle-K。将四种pShuttle穿梭质粒和腺病毒骨架质粒pacAd5，用限制性内切酶PacⅠ线性化后，共转染HEK293AD细胞，在HEK293AD细胞中正确包装出四种重组腺病毒，分别为AD-△aGP5，AD-GP5，AD-bGP5以及AD-K。通过对重组腺病毒稳定性，Western blot免疫印迹及间接免疫荧光检测。结果显示，正确包装出了重组腺病毒，F6代时重组腺病毒的稳定性仍然较好，表达的蛋白大小约为25KD，与预期结果相符。将靶向N基因抑制PRRSV复制效果好的p2.1-N71干扰质粒及包装的重组腺病毒AD-△aGP5，AD-GP5，AD-bGP5，以及AD-K分别免疫15日龄仔猪，一免两周后加强免疫一次，二免一周后鼻内接种PRRSV JL07SW株（TCID50为106.2ml-1）1mL/头，进行动物免疫试验，检测其诱导产生的体液免疫和细胞免疫水平，并与商品化弱毒疫苗JXA1-R所产生的免疫效果相比较，初步研究将N基因及GP5基因作为免疫原性基因构建病毒活载体疫苗的免疫效果，研究缺失ADE表位后GP5基因的免疫抑制情况。对免疫后0、7、14、21、28、35、42和56d的疫苗接种组和对照组免疫的仔猪血清进行无菌采集。分别应用间接ELISA方法进行特异性抗体检测，应用固定病毒稀释血清法检测特异性中和抗体，并提取病毒总RNA作为模板进行实时荧光定量PCR，检测仔猪血清中病毒滴度。结果均显示，除阴性对照组外，在各个试验组中，干扰质粒p2.1-N71组所产生的抗体水平低于其他修饰型重组腺病毒试验组，但能够在攻毒后7d抑制PRRSV的复制。各试验组与野生型重组腺病毒AD-K组比较，整个试验过程中，仔猪体内所诱导的抗体水平显着高于野生型重组腺病毒AD-K对照组，差异极显着（P<0.01）。而免疫PRRSV弱毒活疫苗JXA1-R组所产生的抗体明显高于修饰型重组腺病毒组，差异显着（P<0.05），攻毒7d后，病毒明显受到抑制，并持续至21d。三个修饰型重组腺病毒免疫组相比较，AD-bGP5免疫组诱导产生的抗体水平略高于其他免疫组，但差异不显着（P＞0.05）。T淋巴细胞亚群数量检测结果表明，各修饰型重组腺病毒试验组能够明显提高T淋巴细胞亚类数量，增强细胞免疫反应。综上所述，N基因和GP5基因在仔猪体内能够产生特异性抗体，诱导机体产生良好的体液免疫和细胞免疫反应，有效抑制PRRSV的感染，可能是引起ADE效应的结构基因。本研究为防控PRRSV感染和PRRS疫苗研制提供了理论基础和实验数据。
刘泉[10]（2011）在《日本脑炎病毒多表位基因与法氏囊活性肽的串联表达及其免疫特性研究》文中研究表明日本脑炎（Japanese Encephalitis, JE）,又称流行性乙型脑炎（Epidemic Encephalitis B）,是由日本脑炎病毒（Japanese Encephalitis Virus, JEV）引起的以中枢神经系统损害为主的急性传染病。猪作为日本脑炎传播的中间扩增宿主,带毒蚊子通过叮咬将感染性病毒传播给人。该病在我国流行面积较大,对养猪业的危害巨大,近年来经济损失较为严重,因此预防猪感染本病是防止人患乙脑的重要措施。目前对乙型脑炎的治疗仍然没有行之有效的方法,而且对待本病主要还是以免疫接种疫苗的方式进行预防。寻求稳定、安全的猪用乙脑疫苗,已经成为近年JEV感染防治的主要研究方向。目前关于表位疫苗的设计策略取得了较大的研究进展,作为理想的免疫原,抗原分子中应同时包含目的抗原B细胞表位和自身或外源T细胞表位,才能诱导出高特异性的细胞及体液免疫应答,从细胞免疫和体液免疫水平起到预防或治疗作用,赋予较广泛的保护性。因此表位疫苗成为近年来病毒新型疫苗研究的热点。法氏囊（bursa of Fabricus, BF）是禽类独有的中枢免疫器官,其功能与哺乳动物中的骨髓类似。三肽囊素作为BF组织中分离的活性分子,无种属特异性,不仅对禽类具有免疫调节功能,而且对哺乳动物及人类淋巴细胞也具有明显的免疫学及生理学活性。法氏囊五肽为BF组织中分离的又一活性分子,对禽类具有明显的免疫调节功能。本研究利用基因重组技术,把日本脑炎病毒E蛋白上的多表位基因（MEP）、囊素样肽基因和法氏囊五肽基因分别串联起来,构建三种原核表达载体,在大肠杆菌表达系统中表达。表达的融合蛋白纯化后免疫小鼠,研究三者的免疫原性及保护效力,希望为研制具有高免疫原性的改良的乙脑表位疫苗提供依据。具体的研究内容如下：1串联表达JEV E蛋白多表位基因、囊素样肽及法氏囊五肽利用PCR扩增出含日本脑炎病毒（JEV）E蛋白6个B细胞表位（氨基酸残基分别位于75-92,149-163,258-285,356-362,373-399,397-403）,2个T细胞表位的基因（氨基酸残基分别位于60-68和436-445）,即JEV E蛋白多表位基因（MEP）,用EcoRl和Xhol双酶切将其连接到pET-28a（+）载体中,构建含MEP基因的重组原核表达载体。由于囊素样肽（Bur sin-like peptide, BSA）能增强乙脑亚单位疫苗的免疫反应,在本研究中还构建了一个在大肠杆菌中表达的重组载体,将JEV E蛋白多表位基因（MEP）按正确的读码框与囊素样肽基因串联,构建含MEP-BSA基因的重组原核表达载体。此外,法氏囊五肽（Bursopentine, BP5）为本组从鸡法氏囊中新分离的一种活性肽,为了弄清其免疫佐剂效应,本研究将JEV E蛋白多表位基因（MEP）、囊素样肽基因按正确的读码框与法氏囊五肽基因串联,构建另一个融合表达载体pET-MEP-BSA-BP5。将三种重组表达载体在大肠杆菌BL21中诱导表达,以His-Bind螯合层析柱纯化三种融合蛋白（rMEP、rMEP-BSA、rMEP-BSA-BP5）,然后运用SDS-PAGE进行可溶性分析,利用Western Blotting对该融合蛋白进行了鉴定。结果表明：三种融合蛋白均以包涵体的形式获得了高效表达。通过His-Bind螯合层析柱纯化后的三种融合蛋白,通过Western Blotting鉴定其具有良好的抗原性。2重组蛋白rMEP、rMEP-BSA、rMEP-BSA-BP5对小鼠特异性免疫的影响4-6周龄雌性BALB/c小鼠随机分成5组,每组10只。将50μg的rMEP、 rMEP-BSA、rMEP-BSA-BP5三种融合蛋白（用100μl PBS稀释）分别以肌肉注射接种的方式给小鼠进行3次免疫,同时设两组对照组小鼠,分别是PBS和JEV弱毒疫苗（SA-14-14-2病毒株）。通过检测中和抗体、抗体亚型（IgG1和IgG2a）、淋巴细胞增殖、INF-y和IL-4细胞因子的表达水平、T细胞亚型、攻毒实验发现,使用rMEP、 rMEP-BSA、rMEP-BSA-BP5三种融合蛋白都能明显的提高小鼠的特异性免疫反应。IgG1和细胞因子IL-4水平表明rMEP蛋白主要刺激Th2型免疫反应。而rMEP-BSA和rMEP-BSA-BP5蛋白既能刺激Th2型免疫反应,也能刺激Thl型免疫反应。然而,Thl型免疫反应明显低于JEV弱毒疫苗但高于rMep蛋白,rMEP-BSA和rMEP-BSA-BP5两个蛋白产生的免疫反应很相似。攻毒实验结果表明]MEP、 rMEP-BSA、rMEP-BSA-BP5与弱毒苗一样都能保护小鼠免受致死量的乙脑病毒的感染,且保护率均为100%,证明rMEP、rMEP-BSA、rMEP-BSA-BP5三种融合蛋白具有较好的免疫原性,这为下一步猪体免疫试验奠定了基础。由此也可以看出囊素样肽联合多表位抗原可以提高小鼠的免疫反应,而法氏囊五肽的增强作用不是很明显。因此rMEP、rMEP-BSA可以作为候选的基因工程亚单位疫苗。
二、丙型肝炎病毒核壳蛋白抗原的化学合成及其在血清学诊断中的应用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、丙型肝炎病毒核壳蛋白抗原的化学合成及其在血清学诊断中的应用（论文提纲范文）
（1）QH-08PRRS分离株Caspase-8介导的凋亡途径及实时定量PCR方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| summary |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 PRRS病原特征及防控技术研究 |
| 1 PRRSV非结构蛋白及结构蛋白的基本功能 |
| 1.1 PRRSV非结构蛋白的基本功能 |
| 1.1.1 PRRSV 的 5' UTR 和 3' UTR 的分子特性 |
| 1.1.2 PRRSV ORF1a 和 ORF1b 的特征 |
| 1.2 PRRSV结构蛋白的基本特征 |
| 2 PRRSV致病过程中的天然免疫通路 |
| 2.1 细胞凋亡 |
| 2.2 NF-κB通路 |
| 2.3 干扰素反应 |
| 2.4 Toll样受体信号通路 |
| 3 PRRSV在中国的流行趋势 |
| 3.1 PRRSV-1 型在中国的流行趋势 |
| 3.2 PRRSV-2 型在国内的流行趋势 |
| 4 PRRSV的防控 |
| 4.1 PRRS的检测技术 |
| 4.1.1 PRRS病毒分离 |
| 4.1.2 PRRSV血清学检测方法 |
| 4.1.2.1 间接荧光抗体试验 |
| 4.1.2.2 免疫过氧化物酶单层试验 |
| 4.1.2.3 酶联免疫吸附测定 |
| 4.1.3 PRRSV核酸检测方法 |
| 4.2 PRRS 的疫苗 |
| 4.2.1 现有疫苗 |
| 4.2.2 新型疫苗研发 |
| 4.2.2.1 DNA疫苗 |
| 4.2.2.2 植物疫苗 |
| 4.2.2.3 病毒样颗粒的疫苗 |
| 4.3 疫苗佐剂 |
| 5 抗病毒因子 |
| 5.1 二氧化氯抑制PRRSV的复制 |
| 5.2 化学抗病毒因子对 PRRSV 的抑制作用 |
| 5.3 蛋白质因子对 PRRSV 的抑制作用 |
| 6 本课题研究目标和任务 |
| 第二章 QH-08 PRRSV分离株全序列特征 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 样品 |
| 1.3 序列比对及分析 |
| 1.4 ORF2-ORF7 序列的变异分析 |
| 1.5 ORF2-ORF7 序列二级结构 |
| 2 结果 |
| 2.1 QH-08 的基因组基本特征 |
| 2.2 34株PRRSV-2型的ORF2-7序列的进化变异 |
| 2.2.1 ORF 2 进化和变异 |
| 2.2.2 ORF3 分子进化和变异 |
| 2.2.3 ORF4 分子进化和变异 |
| 2.2.4 ORF5 分子进化和变异 |
| 2.2.5 ORF6 分子进化和变异 |
| 2.2.6 ORF7 分子进化和变异 |
| 2.3 ORF1α1b分子进化和变异 |
| 2.4 二级结构分析 |
| 3 讨论 |
| 第三章 盐酸吗啉胍激活caspase-8 凋亡途径抑制QH-08PRRSV的复制 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细胞、病毒和试剂 |
| 1.2 Quantitative real-time RT-PCR(q PCR)检测 |
| 1.3 病毒感染试验 |
| 1.4 Annexin V和 PI双重染色检测细胞死亡 |
| 1.5 siRNA实验 |
| 1.6 Westernblot检测 |
| 1.7 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 盐酸吗啉胍对 PRRSV 复制和细胞死亡的抑制作用 |
| 2.2 盐酸吗啉胍诱导TLR3 凋亡信号通路 |
| 2.3 盐酸吗啉胍激活 caspase-8 和 caspase-3 途径 |
| 2.4 Mcl-1 蛋白是抑制 PRRSV 复制的主要因子 |
| 3 讨论 |
| 第四章 不同PRRSV疫苗对QH-08 毒株的保护性研究 |
| 1 病毒和疫苗 |
| 2 方法 |
| 2.1 动物实验 |
| 2.2 临床检查 |
| 2.3 血清学检测 |
| 2.4 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 临床观察 |
| 3.2 病毒 RNA 的检测 |
| 3.3 检测 PRRSV 的抗体 |
| 4 讨论 |
| 第五章 基于QH-08 分离株的一步法real-time RT-PCR检测方法的建立 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株与质粒 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 试剂盒 |
| 1.4 仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 real-time RT-PCR方法 |
| 2.1.1 引物 |
| 2.1.2 反应体系 |
| 2.2 多重RT-PCR检测方法 |
| 2.2.1 多重RT-PCR检测方法反应所用引物 |
| 2.2.2 RT-PCR反应体系和反应流程 |
| 2.3 检测结果判定 |
| 2.4 敏感性试验 |
| 2.5 特异性试验 |
| 2.6 临床样品 |
| 2.7 保存期试验 |
| 2.7.1 试剂盒性状检测 |
| 2.7.2 重复性试验 |
| 2.7.3 敏感性试验 |
| 2.7.4 特异性性试验 |
| 3 结果 |
| 3.1 方法建立及标准曲线 |
| 3.2 敏感性试验 |
| 3.3 特异性试验 |
| 3.4 临床样品检测 |
| 3.5 保存期试验 |
| 3.5.1 重复性试验 |
| 3.5.2 试剂盒性状试验 |
| 3.5.3 敏感性试验 |
| 3.5.4 保存期特异性检测 |
| 4 讨论 |
| 第六章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
| 导师简介 |
（2）牛结核病诊断技术的建立与初步应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文词缩略表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 牛结核病简介 |
| 2 牛结核病流行病学 |
| 2.1 自然及生态因素的影响 |
| 2.2 牛结核病分子流行病学研究 |
| 3 牛结核病防控措施 |
| 4 结核病的诊断方法 |
| 4.1 结核特异性抗原蛋白研究进展 |
| 4.2 细菌学诊断方法 |
| 4.2.1 改良抗酸染色法 |
| 4.2.2 噬菌体生物扩增技术 |
| 4.2.3 分枝杆菌生长指标管 |
| 4.3 分子生物学诊断方法 |
| 4.3.1 PCR检测方法 |
| 4.3.2 DNA探针检测 |
| 4.4 免疫学诊断方法 |
| 4.4.1 纯化的结核菌素皮内过敏试验 |
| 4.4.2 皮内比较过敏试验 |
| 4.4.3 IFN-测定 |
| 4.4.4 ELISA诊断方法 |
| 第二章 试验部分 |
| 试验一 牛结核病血清学特异性诊断抗原的筛选 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 主要试剂 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 结核特异性蛋白基因在致病性分枝杆菌中的同源性分布 |
| 1.2.2 结核特异性蛋白理化分析 |
| 1.2.3 结核特异性蛋白二级结构分析 |
| 1.2.4 结核特异性蛋白跨膜结构域的预测 |
| 1.2.5 结核特异性蛋白B细胞表位预测 |
| 1.2.6 结核特异性蛋白表达菌株的复苏 |
| 1.2.7 结核特异性蛋白的表达及纯化 |
| 1.2.8 结核特异性蛋白浓度的测定 |
| 1.2.9 结核特异性蛋白Western Blot验证 |
| 1.2.10 结核特异性蛋白酶联免疫吸附试验初步筛选 |
| 2 结果 |
| 2.1 结核特异性基因在致病性分枝杆菌中的同源性分布 |
| 2.2 结核特异性蛋白理化分析 |
| 2.3 结核特异性蛋白二级结构分析 |
| 2.4 结核特异性蛋白跨膜结构域的预测 |
| 2.5 结核特异性蛋白B细胞表位分析 |
| 2.6 结核特异性蛋白的表达以及纯化 |
| 2.7 结核特异性蛋白浓度的测定 |
| 2.8 结核特异蛋白Western Blot验证 |
| 2.9 结核特异性蛋白酶联免疫吸附试验初步筛选 |
| 3 讨论 |
| 试验二 牛结核病间接ELISA方法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.1.3 血清来源 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 引物的设计合成 |
| 1.2.2 目的基因的扩增 |
| 1.2.3 PCR产物的鉴定和纯化回收 |
| 1.2.4 目的基因与T载体的连接 |
| 1.2.5 阳性克隆菌落的PCR鉴定 |
| 1.2.6 质粒提取、T载体双酶切与片段回收 |
| 1.2.7 重组原核表达载体的构建 |
| 1.2.8 表达载体阳性克隆的菌液PCR鉴定与测序 |
| 1.2.9 重组蛋白的表达及最佳诱导时间的确定 |
| 1.2.10 蛋白的可溶性鉴定及纯化 |
| 1.2.11 纯化蛋白的浓度测定以及Western Blot验证 |
| 1.2.12 间接ELISA最佳反应条件的筛选 |
| 1.2.13 间接ELISA特异性和敏感性试验 |
| 1.2.14 间接 ELISA 检测临床血清样本检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 结核分枝杆菌基因的扩增 |
| 2.2 pMD-19T载体重组质粒构建 |
| 2.3 目的基因与原核表达载体重组构建 |
| 2.4 目的蛋白的表达及纯化 |
| 2.5 蛋白Western Blot分析 |
| 2.6 间接ELISA检测结核病抗体方法的建立 |
| 2.7 间接 ELISA 特异性试验 |
| 2.8 间接 ELISA 敏感性试验 |
| 2.9 间接 ELISA 检测牛结核病血清的阴阳性符合率 |
| 3 讨论 |
| 试验三 结核分枝杆菌实时荧光定量检测方法的初步建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株 |
| 1.1.2 仪器与试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 引物的设计与合成 |
| 1.2.2 菌株培养和DNA模版的制备 |
| 1.2.3 标准阳性模版的制备 |
| 1.2.4 建立SYBR Green I法实时荧光定量PCR标准曲线 |
| 1.2.5 特异性检测 |
| 1.2.6 灵敏性检测 |
| 1.2.7 模拟标本的检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 引物的设计 |
| 2.2 目的基因的扩增以及重组质粒的构建 |
| 2.3 标准曲线的建立以及融解曲线的分析 |
| 2.4 荧光定量PCR的敏感性 |
| 2.5 荧光定量PCR的特异性检测 |
| 2.6 模拟样本的检测 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 论文创新点 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
| 参考文献 |
| 附件 |
（3）基于氧化石墨烯特种光纤光栅生物传感器的肝癌患者血清sPD-L1、AFP快速检测方法研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写索引 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 肝细胞癌概述 |
| 1.1.1 肝细胞癌简介 |
| 1.1.2 肝细胞癌发病机理 |
| 1.1.3 肝细胞癌的诊断方法 |
| 1.1.3.1 影像学方法 |
| 1.1.3.2 蛋白免疫方法 |
| 1.1.3.3 病理学方法 |
| 1.1.3.4 基因诊断方法 |
| 1.1.3.5 细胞学方法 |
| 1.1.4 癌症标志物sPD-L1、AFP简介 |
| 1.1.4.1 可溶性程序性死亡因子配体 |
| 1.1.4.2 甲胎蛋白 |
| 1.1.5 血清标志物检测方法进展 |
| 1.1.5.1 酶联免疫吸附技术进展 |
| 1.1.5.2 免疫胶体金技术进展 |
| 1.1.5.3 蛋白质芯片技术进展 |
| 1.1.5.4 化学发光免疫分析法进展 |
| 1.2 光纤光栅生物传感器 |
| 1.2.1 光纤布拉格光栅(fiber Bragg grating,FBG) |
| 1.2.2 长周期光纤光栅(Long-period fiber grating,LPG) |
| 81°)倾斜光纤光栅(ETFGs)'>1.2.3 极大角度(>81°)倾斜光纤光栅(ETFGs) |
| 第2章 sPD-L1、AFP原核表达及鉴定 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株与质粒 |
| 2.1.2 仪器设备 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 序列分析与合成 |
| 2.2.2 重组质粒的酶切鉴定 |
| 2.2.3 重组质粒的转化 |
| 2.2.4 重组质粒的表达与鉴定 |
| 2.2.5 重组质粒诱导表达条件筛选 |
| 2.2.6 重组蛋白的大量表达及包涵体处理 |
| 2.2.7 重组蛋白的纯化 |
| 2.2.8 重组蛋白SDS-PAGE鉴定 |
| 2.2.9 纯化样品BCA法浓度测定 |
| 2.2.10 重组蛋白Western blot鉴定 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 重组蛋白sPD-L1 原核表达、纯化及鉴定结果 |
| 2.3.1.1 酶切鉴定结果 |
| 2.3.1.2 重组蛋白s PD-L1 的诱导表达鉴定 |
| 2.3.1.3 重组蛋白s PD-L1 的最佳诱导条件的筛选 |
| 2.3.1.4 重组蛋白s PD-L1 的纯化以及SDS-PAGE鉴定 |
| 2.3.1.5 重组蛋白s PD-L1 浓度测定 |
| 2.3.1.6 重组蛋白s PD-L1的Western blot鉴定 |
| 2.3.2 重组蛋白AFP原核表达、纯化及鉴定结果 |
| 2.3.2.1 重组质粒pET28a(+)-AFP酶切鉴定 |
| 2.3.2.2 重组蛋白AFP的纯化以及SDS-PAGE鉴定 |
| 2.3.2.3 重组蛋白AFP法浓度测定 |
| 2.3.2.4 重组蛋白AFP的 Western blot鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 抗sPD-L1 单克隆抗体的制备 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物及细胞 |
| 3.1.2 主要仪器设备 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 主要试剂配方 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 BALB/c小鼠免疫 |
| 3.2.2 抗原最佳包被浓度以及小鼠血清效价测定 |
| 3.2.2.1 抗原最佳包被浓度测定 |
| 3.2.2.2 小鼠血清效价测定 |
| 3.2.3 小鼠腹腔巨噬细胞制备 |
| 3.2.4 SP2/0 细胞的制备 |
| 3.2.5 小鼠脾脏细胞悬液制备 |
| 3.2.6 细胞融合 |
| 3.2.7 阳性杂交瘤细胞筛选 |
| 3.2.8 阳性杂交瘤细胞亚克隆 |
| 3.2.9 小鼠腹水型单抗的制备 |
| 3.2.10 腹水型单抗的纯化 |
| 3.2.11 sPD-L1 单克隆抗体鉴定 |
| 3.2.11.1 单抗纯度鉴定 |
| 3.2.11.2 单抗浓度测定 |
| 3.2.11.3 单抗亚类鉴定 |
| 3.2.11.4 单抗效价测定 |
| 3.2.11.5 单抗特异性鉴定 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 最佳包被浓度以及最佳阴阳性血清稀释度的确定 |
| 3.3.2 融合前小鼠血清效价ELISA测定 |
| 3.3.3 细胞融合结果 |
| 3.3.4 杂交瘤细胞筛选以及亚克隆筛选结果 |
| 3.3.5 sPD-L1 单克隆抗体亚型鉴定 |
| 3.3.6 单抗的纯化 |
| 3.3.7 单抗纯度鉴定 |
| 3.3.8 单抗浓度测定 |
| 3.3.9 效价测定 |
| 3.3.10 2-2G单抗Western blot鉴定 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 基于氧化石墨烯Ex-TFG生物传感器的血清标志物快速检测方法的初步研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 样本 |
| 4.1.2 主要仪器设备 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 溶液配制 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 检测平台的搭建 |
| 4.2.2 Ex-TFG生物传感器表面预处理 |
| 4.2.3 Ex-TFG生物传感器表面修饰 |
| 4.2.3.1 Ex-TFG生物传感器表面生物功能化修饰的研究方案 |
| 4.2.3.2 Ex-TFG生物传感器表面修饰实验步骤 |
| 4.2.3.2.1 表面羟基化 |
| 4.2.3.2.2 表面硅烷化 |
| 4.2.3.2.3 涂覆金纳米壳 |
| 4.2.3.2.4 金纳米壳氨基化 |
| 4.2.3.2.5 涂覆氧化石墨烯 |
| 4.2.3.2.6 活化GO上的-COOH |
| 4.2.3.2.7 修饰s PD-L1 单克隆抗体、AFP单克隆抗体 |
| 4.2.3.2.8 封闭 |
| 4.2.4 Ex-TFG生物传感器灵敏度检测实验 |
| 4.2.5 Ex-TFG生物传感器重复性实验 |
| 4.2.6 Ex-TFG生物传感器特异性实验 |
| 4.2.7 Ex-TFG生物传感器临床性实验 |
| 4.2.7.1 血清标志物s PD-L1 检测 |
| 4.2.7.2 血清标志物AFP检测 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 传感器表面修饰过程光谱演变 |
| 4.3.2 Ex-TFG表面修饰AuNS-GO |
| 4.3.3 Ex-TFG生物传感器灵敏度检测实验 |
| 4.3.4 Ex-TFG生物传感器重复性实验 |
| 4.3.5 Ex-TFG生物传感器特异性实验 |
| 4.3.6 Ex-TFG生物传感器临床性实验 |
| 4.3.6.1 血清标志物s PD-L1 检测 |
| 4.3.6.2 血清标志物AFP检测 |
| 4.3.6.3 sPD-L1、AFP临床实验结果相关性比较 |
| 4.4 分析与讨论 |
| 第5章 总结与展望 |
| 5.1 全文总结 |
| 5.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文及取得的研究成果 |
（4）细胞因子辅助免疫的抗体制备与应用及基于亲和力的免疫检测灵敏度研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 免疫检测技术相关研究 |
| 1.2.1 免疫荧光分析技术 |
| 1.2.2 免疫层析技术 |
| 1.2.3 酶联免疫吸附 |
| 1.2.4 电化学免疫分析 |
| 1.2.5 化学发光免疫分析技术 |
| 1.2.6 数字化单分子免疫分析技术 |
| 1.3 单克隆抗体制备技术 |
| 1.3.1 鼠单克隆抗体 |
| 1.3.2 嵌合抗体 |
| 1.3.3 噬菌体展示技术 |
| 1.3.4 基因工程小鼠制备完全人源化抗体技术 |
| 1.4 DNA免疫制备单克隆抗体技术 |
| 1.4.1 DNA免疫技术诱导宿主免疫反应的机制 |
| 1.4.2 DNA免疫制备单克隆抗体的优点 |
| 1.4.3 DNA免疫制备单克隆抗体的技术要点 |
| 1.5 免疫佐剂研究进展 |
| 1.5.1 免疫佐剂的作用机理 |
| 1.5.2 传统免疫佐剂 |
| 1.5.3 细胞因子免疫佐剂 |
| 1.6 抗原表位分析技术进展 |
| 1.6.1 生物信息学软件预测 |
| 1.6.2 肽扫描技术 |
| 1.6.3 氨基酸定点突变技术 |
| 1.6.4 噬菌体展示技术 |
| 1.7 和肽素临床研究 |
| 1.7.1 和肽素与心血管疾病 |
| 1.7.2 和肽素与糖尿病、肾病 |
| 1.7.3 和肽素与脓毒血症 |
| 1.7.4 和肽素与其他疾病 |
| 1.8 抗缪勒氏管激素临床研究 |
| 1.8.1 AMH与卵巢储备功能 |
| 1.8.2 AMH在预测卵巢反应性中的作用 |
| 1.8.3 AMH和妊娠结局 |
| 1.9 研究的目的、意义和内容 |
| 1.9.1 本研究的目的及意义 |
| 1.9.2 研究的内容 |
| 1.9.3 技术路线 |
| 第二章 细胞因子表达载体的构建及鉴定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与仪器 |
| 2.2.1 细胞株与载体质粒 |
| 2.2.2 仪器与设备 |
| 2.2.3 主要试剂 |
| 2.2.4 主要溶液配制 |
| 2.3 细胞因子重组质粒的构建 |
| 2.3.1 目的基因的合成与鉴定 |
| 2.3.2 重组质粒的构建及鉴定 |
| 2.3.3 重组质粒真核表达鉴定 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 酶切鉴定及测序 |
| 2.4.2 真核表达鉴定 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 细胞因子辅助DNA免疫制备抗缪勒氏管激素单克隆抗体及应用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与仪器 |
| 3.2.1 实验试剂 |
| 3.2.2 主要仪器设备 |
| 3.2.3 动物、抗原、细胞及血清样本 |
| 3.2.4 主要溶液配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 免疫策略 |
| 3.3.2 间接ELISA评价免疫效果 |
| 3.3.3 细胞融合 |
| 3.3.4 筛选及亚克隆 |
| 3.3.5 腹水制备及抗体亚类分析 |
| 3.3.6 腹水的效价检测及纯化 |
| 3.3.7 抗体的纯度和效价的测定 |
| 3.3.8 抗体亲和力测定 |
| 3.3.9 mAb-MPs及 AP-mAbs的制备 |
| 3.3.10 最佳抗体配对的筛选 |
| 3.3.11 全自动化学发光检测方法的建立 |
| 3.3.12 方法学优化和评价 |
| 3.3.13 统计分析 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 免疫效果评价 |
| 3.4.2 腹水中抗体亚型分析 |
| 3.4.3 腹水效价检测 |
| 3.4.4 纯化抗体SDS-PAGE分析 |
| 3.4.5 纯化抗体效价检测 |
| 3.4.6 纯化抗体亲和力表征 |
| 3.4.7 全自动化学发光分析方法的构建 |
| 3.4.8 全自动化学发光分析方法的评价 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 细胞因子辅助皮下免疫制备高亲和力抗和肽素单克隆抗体及表征 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与仪器 |
| 4.2.1 实验试剂 |
| 4.2.2 主要仪器设备 |
| 4.2.3 动物、抗原及细胞 |
| 4.2.4 主要溶液配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 免疫策略 |
| 4.3.2 免疫效果评价 |
| 4.3.3 细胞融合、筛选及亚克隆 |
| 4.3.4 融合阳性率及稳定株数计算 |
| 4.3.5 腹水制备及抗体亚类分析 |
| 4.3.6 腹水抗体效价评价 |
| 4.3.7 腹水的纯化 |
| 4.3.8 抗体的纯度和效价的测定 |
| 4.3.9 免疫细胞化学鉴定 |
| 4.3.10 抗体亲和力表征及比较 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 免疫效果评价 |
| 4.4.2 腹水抗体亚型分析 |
| 4.4.3 腹水效价检测 |
| 4.4.4 纯化效果鉴定 |
| 4.4.5 抗体效价 |
| 4.4.6 特异性识别天然抗原鉴定 |
| 4.4.7 抗体亲和力检测及比较 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 抗原表位氨基酸对免疫反应亲和力的影响 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与仪器 |
| 5.2.1 实验试剂 |
| 5.2.2 主要仪器设备 |
| 5.2.3 主要溶液配制 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 抗原表位生物信息学分析 |
| 5.3.2 间接ELISA初步表位定位 |
| 5.3.3 肽扫描精确定位抗原表位 |
| 5.3.4 间接ELISA分析表位氨基酸 |
| 5.3.5 动力学方法分析表位氨基酸 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 IEDB分析CPP表位结果 |
| 5.4.2 DNAStar分析CPP抗原表位结果 |
| 5.4.3 抗原表位初步定位结果 |
| 5.4.4 抗原表位精确扫描结果 |
| 5.4.5 肽突变体间接ELISA结果与分析 |
| 5.4.6 肽突变体与抗体反应动力学分析 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 竞争法免疫检测中竞争抗原与抗体的亲和力对检测灵敏度的影响 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验材料与仪器 |
| 6.2.1 主要试剂 |
| 6.2.2 主要仪器设备 |
| 6.2.3 主要溶液配液方法 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 改造竞争抗原亲和力分析 |
| 6.3.2 免疫荧光微球的制备及表征 |
| 6.3.3 CPP竞争免疫荧光层析检测体系的构建 |
| 6.3.4 CPP间接竞争ELISA检测体系的构建 |
| 6.3.5 竞争抗原亲和力变化对灵敏度的影响分析 |
| 6.4 结果与分析 |
| 6.4.1 改造竞争抗原亲和力表征结果 |
| 6.4.2 免疫荧光微球的表征 |
| 6.4.3 荧光免疫层析检测卡的优化 |
| 6.4.4 免疫层析检测体系灵敏度改善效果评价 |
| 6.4.5 间接竞争ELISA检测体系的优化结果 |
| 6.4.6 间接ELISA检测体系灵敏度改善效果 |
| 6.5 小结 |
| 第七章 高灵敏全自动和肽素化学发光免疫检测法的构建 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 实验材料与仪器 |
| 7.2.1 实验试剂 |
| 7.2.2 主要仪器设备 |
| 7.2.3 样本的采集与保存 |
| 7.3 实验方法 |
| 7.3.1 免疫磁珠及酶标抗体的制备 |
| 7.3.2 全自动化学发光检测方法的建立 |
| 7.3.3 分析方法学优化 |
| 7.3.4 统计分析 |
| 7.4 结果与分析 |
| 7.4.1 最佳抗体配对的优化 |
| 7.4.2 AP-mAbs和 mAb-MPs优化 |
| 7.4.3 基质缓冲液溶液的pH和孵育时间优化 |
| 7.4.4 标准校正曲线建立 |
| 7.4.5 精密度、准确性、稳定性分析 |
| 7.4.6 特异性分析 |
| 7.4.7 与商品ELISA试剂盒对比分析 |
| 7.5 小结 |
| 结论与展望 |
| 一、结论 |
| 二、创新点 |
| 三、展望与不足 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ测序结果 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（5）HCV和HBV的特异性T细胞免疫反应和分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 研究内容 |
| 第一章 聚集性献血导致的HCV感染的T细胞免疫研究 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 实验材料 |
| 1.2.1 主要实验仪器 |
| 1.2.2 主要实验试剂 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 研究对象 |
| 1.3.2 血样的采集与处理 |
| 1.3.3 抗HCV抗体的定性检测 |
| 1.3.4 临床信息的获得 |
| 1.3.5 HCV基因分型 |
| 1.3.6 HCV RNA足量 |
| 1.3.7 HCV多肽库的设计与合成 |
| 1.3.8 HCV特异性T细胞的刺激及流式分析 |
| 1.3.9 统计分析 |
| 1.4 实验结果 |
| 1.4.1 研究对象的人口学特征 |
| 1.4.2 研究对象的临床特征 |
| 1.4.3 HCV慢性感染者的病毒特征 |
| 1.4.4 HCV病毒清除组与HCV慢性感染组有持续的CD8~+T细胞及CD4~+T细胞应答 |
| 1.4.5 多因子分泌 |
| 1.4.6 HCV特异性T细胞的表型特征 |
| 1.4.7 免疫抑制分子的表达特点 |
| 1.4.8 T细胞免疫与肝功能 |
| 1.5 小结与讨论 |
| 第二章 聚集性献血感染HCV的分子生物学研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 主要实验仪器 |
| 2.2.2 主要的试剂及耗材 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 HCV RNA提取 |
| 2.3.2 RNA反转录 |
| 2.3.3 全序列引物设计及测序 |
| 2.3.4 序列组装及分析 |
| 2.3.5 二代测序 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 HCV病毒基因组的各片段反转录PCR结果 |
| 2.4.2 HCV病毒5'/3' RACE扩增结果 |
| 2.4.3 全基因序列拼接 |
| 2.4.4 序列同源性分析及进化分析 |
| 2.4.5 二代测序 |
| 2.5 小结与讨论 |
| 第三章 盐桥在HBV特异性多肽呈递和T细胞识别中的作用机制研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验主要仪器 |
| 3.2.2 主要实验耗材及商品试剂 |
| 3.2.3 实验试剂及其配方 |
| 3.2.4 实验动物、菌株、载体 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 实验所用的多肽合成和载体构建 |
| 3.3.2 H-2K~d-HBV多肽免疫小鼠及脾细胞的获得 |
| 3.3.3 ELISPOT实验 |
| 3.3.4 H-2K~d和HLA-B~*4001分子的表达与纯化 |
| 3.3.5 HLA-B*4001-peptide(GETALALLLL)的结晶条件的筛选 |
| 3.3.6 HLA-B*4001 Χ-射线衍射及结构解析 |
| 3.3.7 圆二色谱实验检测H-2K~d-HBVpeptide的热稳定性 |
| 3.3.8 H-2K~d-HBV peptide四聚体的制备及流式染色 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 H-2K~d分子和HLA-B~*4001-分子的蛋白纯化 |
| 3.4.2 探究H-2K~d/HLA-B~*4001野生型/突变体与多肽的结合能力 |
| 3.4.3 探究H-2-K~d野生型及突变体结合多肽识别TCR |
| 3.4.4 H-2K~d和HLA-B~*4001形成的两种不同的盐桥 |
| 3.4.5 盐桥对MHCI和结合肽的结构构象的影响 |
| 3.4.6 潜在盐桥广泛存在不同脊椎动物中 |
| 3.5 讨论 |
| 第二部分 文献综述 |
| 第四章 HCV病毒及细胞免疫概述 |
| 4.1 HCV病毒的流行病学及临床 |
| 4.1.1 HCV的流行 |
| 4.1.2 HCV的临床表现 |
| 4.1.3 HCV病毒的检测和实验室诊断 |
| 4.1.4 HCV的防控及治疗 |
| 4.2 HCV病毒的基本特征 |
| 4.2.1 HCV病毒的形态特征 |
| 4.2.2 HCV病毒的基因组成及全基因组测序 |
| 4.2.3 HCV病毒的生活周期 |
| 4.2.4 HCV病毒的传播及变异 |
| 4.3 HCV病毒感染的免疫反应特征 |
| 4.3.1 血清学反应 |
| 4.3.2 T细胞免疫 |
| 第五章 MHC分子结构免疫学概述 |
| 5.1 MHC的概念 |
| 5.2 MHC的抗原呈递及T细胞识别 |
| 5.2.1 MHCⅠ类途径 |
| 5.2.2 MHCⅡ类途径 |
| 5.2.3 外源抗原的MHCⅠ类途径交叉呈递 |
| 5.3 MHC及相关分子的结构特征 |
| 5.3.1 MHCⅠ类分子的结构特征 |
| 5.3.2 MHCⅡ类分子的结构 |
| 5.3.3 非经典的MHCⅠ类分子结构 |
| 5.4 MHC分子结构在T细胞免疫研究中的应用 |
| 5.4.1 MHC结构研究对于MHC分子分类的影响-HLA超级型及其意义 |
| 5.4.2 MHC分子对TCR识别的限制性 |
| 5.4.3 MHC交叉呈递和TCR交叉识别的结构基础 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录1 缩略表 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（6）猪圆环病毒2型抗原抗体荧光微球免疫层析快速检测方法的建立与应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 猪圆环病毒病的概述 |
| 1.1.1 病原 |
| 1.1.2 猪圆环病毒病的流行病学 |
| 1.1.3 发病机理 |
| 1.1.4 症状 |
| 1.1.5 猪圆环病毒病的诊断方法 |
| 1.2 猪圆环病毒cap蛋白研究进展 |
| 1.2.1 圆环cap蛋白的简介 |
| 1.2.2 圆环cap蛋白的检测方法、疫苗研究 |
| 1.3 荧光微球为标记物的免疫层析试纸条 |
| 1.3.1 免疫层析试纸条 |
| 1.3.2 荧光微球 |
| 1.3.3 荧光微球在免疫层析技术中的应用 |
| 1.3.4 胶体金免疫层析方法比较 |
| 1.3.5 检测原理及结果判断 |
| 1.4 研究的意义及目的 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 重组菌种 |
| 2.1.2 荧光微球免疫层析材料等试验材料 |
| 2.1.3 仪器 |
| 2.1.4 试剂制备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 猪圆环Cap基因克隆及原核表达方法 |
| 2.2.2 猪圆环病毒2 型抗体荧光微球免疫层析快速检测方法的建立与应用 |
| 2.2.3 猪圆环病毒2 型抗原荧光微球免疫层析快速检测方法的建立与应用 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 Cap基因克隆及重组表达质粒构建 |
| 3.2 Cap重组蛋白的表达及鉴定 |
| 3.3 蛋白表达条件的优化 |
| 3.4 PCV2 抗体荧光微球免疫层析快速检测方法的建立与应用 |
| 3.5 PCV2 抗原荧光微球免疫层析快速检测方法的建立与应用 |
| 4 讨论 |
| 4.1 猪圆环cap蛋白表达 |
| 4.2 PCV2 抗体荧光微球免疫层析快速检测试纸条的建立与应用 |
| 4.3 PCV2 抗原荧光微球免疫层析快速检测试纸条的建立与应用 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（7）猪瘟病毒NS2-3蛋白抗原集中区基因的真核表达（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 CSFV的结构和特性 |
| 2 CSFV的侵入机制 |
| 3 CSFV的基因组和编码蛋白 |
| 3.1 C蛋白 |
| 3.2 E~(rns)蛋白 |
| 3.3 E1蛋白 |
| 3.4 E2蛋白 |
| 3.5 Npro蛋白 |
| 3.6 p7蛋白 |
| 3.7 NS2-3 蛋白 |
| 3.8 NS4A、NS4B、NS5A、NS5B蛋白 |
| 4 CSF的实验室诊断 |
| 4.1 动物实验 |
| 4.2 病毒分离 |
| 4.3 血清学诊断 |
| 4.4 分子生物学诊断 |
| 4.5 细胞检查法 |
| 5 CSFV新型疫苗研究进展 |
| 5.1 合成肽疫苗 |
| 5.2 亚单位疫苗 |
| 5.3 嵌合CSFV疫苗 |
| 5.4 基因缺失型弱毒疫苗 |
| 5.5 DNA疫苗 |
| 6 P.pastoris表达系统的一般特征 |
| 6.1 外源基因的内在特性的影响 |
| 6.2 宿主菌的选择 |
| 6.3 表达载体 |
| 6.4 发酵条件对表达的影响 |
| 第二章 CSFV NS2-3 蛋白抗原表位集中区的真核表达与鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 质粒和宿主菌 |
| 1.2 主要试剂和酶类 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 1.4 主要试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 CSFV NS2-3_2 基因的PCR扩增、克隆和鉴定 |
| 2.2 重组克隆载体的构建 |
| 2.3 重组表达质粒p PICZαC-NS2-3_2 的构建 |
| 2.4 携带目的基因的重组酵母的构建 |
| 2.5 高抗性重组子的初步诱导表达 |
| 2.6 诱导条件的摸索 |
| 2.7 表达产物的SDS-PAGE鉴定 |
| 2.8 目的蛋白的Western blotting鉴定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 目的基因的PCR扩增 |
| 3.2 重组克隆质粒的转化 |
| 3.3 重组克隆质粒的菌液PCR鉴定 |
| 3.4 重组克隆质粒的双酶切鉴定 |
| 3.5 CSFV NS2-3_2 和表达载体的连接 |
| 3.6 重组表达质粒p PICZαC-NS2-3_2 的PCR鉴定和双酶切鉴定 |
| 3.7 高抗性重组酵母菌的筛选 |
| 3.8 高抗性重组酵母菌菌液PCR鉴定 |
| 3.9 表达产物的SDS-PAGE分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 密码子偏嗜性 |
| 4.2 A+T含量 |
| 4.3 过度糖基化 |
| 4.4 目的蛋白的降解 |
| 4.5 甲醇的影响 |
| 4.6 信号肽的影响 |
| 5 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的成绩 |
| 附录 |
| 致谢 |
（8）O型口蹄疫病毒VP1蛋白GH loop表位表面展示策略与免疫原性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 上篇 第一章文献综述 |
| 1 口蹄疫病毒疫苗研究进展 |
| 1.1 FMD病原学及分子生物学研究 |
| 1.2 FMDV疫苗研究现状 |
| 1.3 FMDV疫苗存在的问题 |
| 1.4 展望 |
| 2 抗原表位表面展示系统研究进展 |
| 2.1 VLPs表面展示系统研究进展 |
| 2.2 CTB表面展示系统研究进展 |
| 2.3 其他几种常见的表面展示系统 |
| 3 猪圆环病毒2型疫苗研究进展 |
| 3.1 PCV2病原学及分子生物学研究 |
| 3.2 PCV2 Cap蛋白结构研究进展 |
| 3.3 PCV2疫苗研究现状 |
| 3.4 展望 |
| 参考文献 |
| 下篇 试验研究 |
| 第二章 基因替换构建PCV2 Cap为骨架展示FMDV GH loop的嵌合VLPs |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组质粒PQZ-Cap-GH loop重组表达质粒的鉴定 |
| 2.2 重组蛋白Cap-loops的表达和可溶性鉴定 |
| 2.3 重组蛋白Cap-GH loop免疫原性的鉴定 |
| 2.4 病毒样颗粒的组装 |
| 2.5 重组蛋白浓缩纯化的鉴定 |
| 2.6 动物实验结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 基因插入构建PCV2 Cap为骨架展示FMDVGH loop的嵌合VLPs |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组表达质粒pQZ-Cap-iGH loop的鉴定 |
| 2.2 重组蛋白Cap-iGH loop的表达和可溶性鉴定 |
| 2.3 重组蛋白Cap-iGH loop免疫原性的鉴定 |
| 2.4 嵌合病毒样颗粒组装 |
| 2.5 重组蛋白浓缩纯化的鉴定 |
| 2.6 动物实验结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 以CTB为载体展示FMDVGH loop抗原表位方法的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组表达质粒的鉴定 |
| 2.2 重组蛋白的表达和可溶性鉴定 |
| 2.3 重组菌表达产物的Western-blot分析 |
| 2.4 重组蛋白五聚体形成鉴定 |
| 2.5 重组蛋白免疫动物体液免疫反应 |
| 2.6 淋巴细胞增殖检测结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 攻读硕士学位期间研究成果 |
| 致谢 |
（9）RNAi靶向PRRSV N基因及GP5基因ADE表达缺失重组腺病毒免疫原性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 PRRSV 的研究进展 |
| 1.1 PRRS 的流行病学及临床症状 |
| 1.2 PRRSV 的基因组结构特征及表达产物功能 |
| 1.3 PRRSV 感染后的免疫应答反应 |
| 第2章 RNA 干扰机制研究进展 |
| 2.1 RNAi 技术的分子作用机制 |
| 2.2 RNAi 技术的特征 |
| 2.3 RNAi 技术的应用 |
| 2.4 RNAi 技术在抗病毒领域的研究进展 |
| 第3章 ADE 效应研究进展 |
| 3.1 感染时存在 ADE 作用的病毒 |
| 3.2 ADE 的分类 |
| 3.3 ADE 的作用机制 |
| 3.4 PRRSV 的 ADE 作用 |
| 3.5 ADE 效应的生物学意义 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 PRRSV N 基因 RNAi 靶位的筛选及干扰质粒的构建 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 shRNA 干扰质粒在 MARC-145 细胞中抑制 PRRSV 增殖的效果研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 GP5 基因抗原表位的筛选及去除 ADE 表位的 aGP5 基因的扩增 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 去除 ADE 表位的 aGP5 基因的重组腺病毒载体的制备75 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 去除 ADE 表位的 aGP5 基因的重组腺病毒免疫原性研究 |
| 5.1 材料 |
| 5.2 方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 攻读博士学位期间发表的论文及其成果 |
| 致谢 |
（10）日本脑炎病毒多表位基因与法氏囊活性肽的串联表达及其免疫特性研究（论文提纲范文）
| 目录 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写及名称 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 流行性乙型脑炎的研究进展 |
| 1 流行性乙型脑炎病毒的分子生物学特性 |
| 1.1 流行性乙型脑炎病毒的病原学特性 |
| 1.2 流行性乙型脑炎病毒基因组的结构特征 |
| 2 流行性乙型脑炎的流行 |
| 3 流行性乙型脑炎病毒的分类和分型 |
| 4 流行性乙型脑炎病毒的毒力和致病机理 |
| 5 流行性乙型脑炎病毒的检测方法 |
| 5.1 流行性乙型脑炎病毒的培养鉴定 |
| 5.2 流行性乙型脑炎病毒的血清学检测 |
| 5.3 流行性乙型脑炎病毒的分子生物学检测 |
| 6 流行性乙型脑炎病毒疫苗的研究概况 |
| 6.1 传统的鼠源灭活疫苗 |
| 6.2 减毒活疫苗 |
| 6.3 基因工程亚单位疫苗 |
| 6.4 合成肽疫苗 |
| 6.5 核酸疫苗 |
| 6.6 基因工程重组活载体疫苗 |
| 参考文献 |
| 第二章 法氏囊活性小肽的研究进展 |
| 1 法氏囊及其生物学功能 |
| 2 法氏囊免疫活性物质研究 |
| 3 法氏囊活性肽的研究进展 |
| 3.1 囊素三肽的研究进展 |
| 3.2 法氏囊五肽的研究进展 |
| 3.3 法氏囊七肽的研究进展 |
| 3.4 其它法氏囊活性肽的研究 |
| 4 法氏囊活性肽的应用前景 |
| 参考文献 |
| 第三章 多表位病毒疫苗的研究进展及应用 |
| 1 病毒抗原表位的确定方法 |
| 1.1 单克隆抗体技术 |
| 1.2 噬菌体展示技术 |
| 1.3 多肽合成技术 |
| 1.4 SDS-PAGE和Western blotting技术 |
| 1.5 人工预测技术 |
| 2 多表位病毒疫苗 |
| 2.1 B细胞多表位疫苗 |
| 2.2 Th细胞多表位疫苗 |
| 2.3 细胞毒性T淋巴细胞(CTL)多表位疫苗 |
| 3 多表位病毒疫苗在疫苗研究、开发领域中的应用 |
| 4 展望 |
| 参考文献 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第四章 串联表达JEV E蛋白多表位基因、囊素样肽及法氏囊五肽 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 目的基因的扩增 |
| 2.2 重组表达载体的构建及双酶切鉴定 |
| 2.3 重组蛋白(rMEP、rMEP-BSA、rMEP-BSA-BP5)的表达 |
| 2.4 表达产物的纯化 |
| 2.5 重组蛋白的可溶性分析及Westem—blot分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 第五章 重组蛋rMEP、rMEP-BSA、rMEP-BSA-BP5对小鼠特异性免疫的影响 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料及试验动物 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 JEV病毒抗体和抗体亚型检测 |
| 2.2 血清中IL-4和IFN-γ的测定 |
| 2.3 JEV中和抗体的产生及对致死量JEV的保护力 |
| 2.4 MTT分析 |
| 2.5 脾T细胞亚群分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 全文总结 |
| 致谢 |
四、丙型肝炎病毒核壳蛋白抗原的化学合成及其在血清学诊断中的应用（论文参考文献）
- [1]QH-08PRRS分离株Caspase-8介导的凋亡途径及实时定量PCR方法的建立[D]. 丁耀忠. 甘肃农业大学, 2021(01)
- [2]牛结核病诊断技术的建立与初步应用[D]. 杨航. 石河子大学, 2020(01)
- [3]基于氧化石墨烯特种光纤光栅生物传感器的肝癌患者血清sPD-L1、AFP快速检测方法研究[D]. 鲁友铭. 重庆理工大学, 2020(08)
- [4]细胞因子辅助免疫的抗体制备与应用及基于亲和力的免疫检测灵敏度研究[D]. 王羽. 华南理工大学, 2019(06)
- [5]HCV和HBV的特异性T细胞免疫反应和分子机制研究[D]. 纪伟. 中国疾病预防控制中心, 2019(12)
- [6]猪圆环病毒2型抗原抗体荧光微球免疫层析快速检测方法的建立与应用[D]. 柳亚茹. 山东农业大学, 2019(01)
- [7]猪瘟病毒NS2-3蛋白抗原集中区基因的真核表达[D]. 马秀园. 河南科技学院, 2016(08)
- [8]O型口蹄疫病毒VP1蛋白GH loop表位表面展示策略与免疫原性研究[D]. 李图帅. 南京农业大学, 2016(05)
- [9]RNAi靶向PRRSV N基因及GP5基因ADE表达缺失重组腺病毒免疫原性研究[D]. 杨闽楠. 吉林大学, 2014(01)
- [10]日本脑炎病毒多表位基因与法氏囊活性肽的串联表达及其免疫特性研究[D]. 刘泉. 南京农业大学, 2011(01)