![蛇毒竹叶青竹的研究[Ⅰ]柱层析分离及酶活性和生物活性的测定](https://www.lunwen00.cn/thumb/17f623d79e05af6da6cfbec8.webp)
一、烙铁头(Trimeresurus mucrosquamatus)蛇毒的研究[Ⅰ]柱层析分离及酶活性与生物活性测定（论文文献综述）
吕秋敏,赖仞,张云[1]（2010）在《动物毒素与人类疾病——从单一成分到组学研究,从理化性质到疾病机理,从粗毒利用到理性药物设计》文中指出为了适应环境,很多动物在长期的进化过程中演化出了丰富的毒素及相关分泌物。这些物质中包含了高活性、作用专一的蛋白和多肽。由于它们作用的特异性和专一性,成为蛋白质多肽结构与功能研究的良好模型,也成为研究人类自身生理病理机制的工具和线索,同时也是开发临床诊断试剂和治疗药物的天然宝库。该文综述了中国科学院昆明动物研究所30多年来立足于我国丰富的有毒动物资源,对陆生有毒动物,包括蛇毒、两栖类皮肤分泌物及节肢动物唾液腺分泌物等的主要研究工作,总结了从单一成分到组学研究、从理化性质到人类疾病机理、从粗毒利用到理性药物设计等的发展历程,并对今后的研究提出一些建议。
王婉瑜,杨长久,熊郁良,陈锡兰[2]（1983）在《烙铁头（Trimeresurus mucrosquamatus）蛇毒的研究[Ⅰ]柱层析分离及酶活性与生物活性测定》文中认为本文报导了用二乙氨基乙基葡聚糖凝胶A-50和氯化钠直线梯度洗脱方法,获得14个蛋白峰。测定了11种酶活性,含有精氨酸酯酶,蛋白水解酶,L-氨基酸氧化酶,5′-核苷酸酶,腺三磷酸酶,磷酸单酯酶,磷酸二酯酶,核苷焦磷酸酶,磷脂酶A9种,不含核糖核酸酶,胆碱酯酶。对每个蛋白峰的生物活性测定表明,出血毒主要分布在12峰,其次为10—14峰。致死活性表现在1,12—14峰。1峰具有较强溶解纤维蛋白的活性。8,10—14峰具有明显的凝血酶样作用,酶活性的分布及其对凝血系统的作用接近一致。11—13峰能使血小板聚集。 烙铁头毒蛇在我国分布很广,成都生物所两栖爬行动物研究室1974年作过报导。蛇毒的研究已被许多学者所重视,Suzuki在Anthony.T.Tu.编着的Venoms Chemistry and Moleculor Biology（1977）报导了该蛇毒含磷酸单酯酶,磷酸二酯酶,5′-核苷酸酶及小分子活性多肽,1970年Ouyang报导含透明质酸酶,1963年Murata报导有蛋白水解酶活性。Ouyang等（1976—1978）分离纯化纤溶组分,并研究了该组分的理化性质。但对各组分的酶活性及生物活性测定尚未见报导。为充分利用这一丰富资源,我们对湖南产烙铁头蛇毒进行了柱层析分离和各组分的酶活性和生物活性测定,结果报导于下。
崔昊,孙黔云[3]（2008）在《烙铁头蛇毒的分离及部分生物活性研究》文中认为目的:对烙铁头蛇毒进行分离及部分生物活性的初筛,为发现新的功能蛋白奠定前期工作基础。方法:本文采用阴离子交换凝胶Q Sepharose Fast Flow和氯化钠直线梯度洗脱方法对国产烙铁头蛇（Trimeresurus mucrosquamatus）蛇毒进行柱层析分离,对分离峰进行抗补体活性、水肿活性、出血活性、流血时间、精氨酸酯酶活性和纤维蛋白原水解酶活性的测定。结果:获得6个蛋白峰;其中第1峰具有抗补体活性;16峰均有较强水解纤维蛋白原活性,同时都有精氨酸酯酶活性;16峰均有水肿活性,其中1、3峰活性较强;14峰有出血活性。结论:烙铁头蛇毒中具有抗补体、水解纤维蛋白原及抗凝等活性蛋白,该工作为从烙铁头蛇毒中分离纯化出新的生理活性蛋白奠定了基础。
邓敏[4]（2008）在《白唇竹叶青（Trimeresurus albolabris）蛇毒纤溶组分的分离纯化及性质研究》文中研究表明随着人们生活水平的提高,血栓栓塞性疾病患者逐年增加,血栓性疾病严重危害着人类的生命健康。因而开发出高效、无副作用、价廉的新型溶栓制剂是一项紧迫而重要的工作。蛇毒纤溶酶专一性较好,体内半衰期长且热稳定性较强。目前对蛇毒纤溶酶的开发研究主要集中于蝮亚科蛇蛇毒中,国内外先后对蝮亚科中的五步蛇（Agkistrodom acutus）、蝮蛇（Agkistrodom halys Pallas）、竹叶青（Trimeresurus stejnegeri）、烙铁头（Trimeresurus mucrosquamatus）等多种蛇毒的纤溶活性组分进行过报道,而对白唇竹叶青蛇蛇毒纤溶酶的研究未见报道。因此本研究以我国产白唇竹叶青蛇毒为研究对象,对其性质进行了分析研究,并从中提取出一种无出血作用的纤溶活性组分,初步鉴定该组分为α金属蛋白酶,并对理化性质及部分生物功能进行探讨,主要研究工作包括以下几个方面:1.测定白唇竹叶青蛇蛇毒的多种理化性质和生物活性,结果表明:白唇竹叶青蛇毒对小白鼠的半致死量（LD50）为7mg/kg;Lowry法测得毒液中蛋白质含量达81 %,SDS-PAGE电泳呈现多条蛋白质条带;具有水解酪蛋白的活性,且其活性可被EDTA抑制,提示白唇竹叶青蛇毒中含有金属蛋白酶;通过纤维蛋白平板法检测到毒液具有纤溶活性;具有精氨酸酯酶活性,检测到该蛇毒具有类凝血酶活性;该蛇毒的其他性质,如磷脂酶A2活性、5’核甘酸酶活性、碱性磷酸单酯酶活性、磷酸二酯酶活性。2.用DEAE-SephadexA-25, SephadexG-100和CM-SephadexC-50三步色谱法进行分离纯化,从白唇竹叶青蛇毒中分离纯化出分子量为66.3KDa的金属蛋白酶。SDS-PAGE电泳结果显示在还原性和非还原性条件下均为单一条带,表明白唇竹叶青蛇毒纤溶组分是由单一肽链组成的蛋白分子。以酪蛋白为底物测得其蛋白质水解酶比活力为0.68U/mg。酶的最适作用温度为40℃,最适PH为7;抑制剂EDTA,EGTA,对酶活力有明显的抑制作用,而PMSF（丝氨酸蛋白酶抑制剂）、β-巯基乙醇对酶活力没有影响;Cu2+对酶活力有明显的抑制作用,Zn2+对其活性有一定的增强作用;未检测到精氨酸酯酶活性存在;纤维蛋白原原降解实验显示,该组分与纤维蛋白原于37℃孵育5分钟便能迅速水解纤维蛋白原或纤维蛋白Aα链,随后缓慢水解Bβ链,而对γ链无作用,提示该组分可能为一种α金属蛋白酶;出血活性实验中,小鼠未出现皮下出现斑点,显示其无不含出血毒活性。结论:我们首次从我国产的白唇竹叶青蛇（T. albolabris）毒中分离纯化得到一种新的蛇毒纤溶酶,该酶纤溶活性强能同时水解纤维蛋白原Aα链和Bβ链,且无出血作用。但有关该组分的分子结构、活性中心以及分子溶纤机制尚待进一步探讨,为进一步基因克隆与表达以及临床应用研究提供理论基础,以达到制备具有实际应用价值的蛇毒酶溶栓制剂的目的。
许建强[5]（2008）在《基因重组大连蛇岛蝮蛇类凝血酶的制备与性质表征》文中指出蛇毒类凝血酶属于纤维蛋白原裂解酶，是一种丝氨酸蛋白酶。它们降解纤维蛋白原但不激活凝血因子FactorⅩⅢ，形成的纤维蛋白块能被后继的血液纤溶系统清除。由于它们在血浆中能够降低纤维蛋白原，可以作为抗凝剂使用。从珍稀树栖毒蛇——大连蛇岛蝮蛇（Gloydius shedaoensis）毒液中分离制备的蛇毒类凝血酶制品已经在血栓病临床治疗应用了很多年。可是鉴于国家法律法规禁止捕蛇，天然酶生产面临严峻的挑战，因而基因工程方法是解决这一困境的最佳选择之一。本论文内容主要就获得可溶性、活性重组大连蛇岛蝮蛇类凝血酶的制备，尤其是其纤维蛋白原裂解活性开展研究工作。（一）在大肠杆菌体系中可溶、活性大连蛇岛蝮蛇类凝血酶的克隆与表达使用Wilkinson-Harrison蛋白质可溶性概率模型，对带有不同商业化融合标签的重组大连蛇岛蝮蛇类凝血酶的可溶性趋势进行预测，结果显示在N端融合有NusA、GST和TrxA的重组大连蛇岛蝮蛇类凝血酶具有更高的可溶性。因而选择NusA、GST和TrxA三种标签用于促进大连蛇岛蝮蛇类凝血酶在大肠杆菌中的可溶性表达。相应地，构建了pQYNusA-glo-a、pQYGST-Glo-a和pQYTrxA-Glo-a三种表达质粒，转化获得了相应的大肠杆菌BL21-Gold（DE3）重组菌株。SDS-PAGE分析和Western blotting检测确定pQYNusA-Glo-a的可溶性表达状况最佳。（二）重组蛇毒类凝血酶的分离纯化1、首次使用人工核酸酶R5对重组大连蛇岛蝮蛇类凝血酶样品预处理：在400 nm紫外光激发条件下，1 mM R5可以高效去除重组大连蛇岛蝮蛇类凝血酶样品中的核酸杂质，而对重组大连蛇岛蝮蛇类凝血酶的活力没有造成损伤。由于合成成本低，人工核酸酶R5在蛋白质／酶的生产中具有很好的应用前景。2、采用四步柱层析方法获得高纯度重组大连蛇岛蝮蛇类凝血酶：柱层析依次包括Phenyl Sepharose FF疏水层析、Q Sepharose HP阴离子交换层析、Mono Q高分辨阴离子交换层析和Superdex 200分子排阻层析，最终获得重组蛇岛蝮蛇类凝血酶在SDS-PAGE胶上呈现单一条带，产率为0．1 mg／L。其表观分子量90 kDa，比活力为506 U／mg。（三）重组大连蛇岛蝮蛇类凝血酶的生化性质表征：1、重组大连蛇岛蝮蛇类凝血酶酶学性质：具有纤维蛋白原凝结活性、纤维蛋白原裂解活性以及酰胺水解活性。以酰胺水解活性底物BApNA为模式底物，该酶催化活性最适温度为40℃，最适pH为8．0。重组酶对纤维蛋白原裂解呈现剂量依赖和时间依赖，其裂解方式为：优先裂解Aα-链，然后裂解Bβ-链，但不裂解γ-链。2、抑制剂对酰胺水解酶活力的影响：研究了多种丝氨酸蛋白酶抑制剂、螯合剂、还原剂及凝血酶抑制剂对重组大连蛇岛蝮蛇类凝血酶的影响。丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF（1 mM）和TPCK（1 mM）分别抑制了重组酶100％和77％的酰胺水解活力，表明它属于丝氨酸蛋白酶家族。抑制剂苯脒、3-氨基苯脒、4-氨基苯脒和咪唑只抑制了<15％酶活力。EDTA不影响酰胺水解活力，表明大连蛇岛蝮蛇类凝血酶不是金属依赖型蛋白水解酶。还原剂二硫苏糖醇和β-巯基乙醇对酶活力没有影响，表明重组酶具有高度稳定性。凝血酶天然抑制剂如肝素等，不影响重组酶的酰胺水解活力，表明重组大连蛇岛蝮蛇类凝血酶与凝血酶在结构上存在差异。3、抑制剂对纤维蛋白原裂解酶活力的影响：通过SDS-PAGE的方法，研究了丝氨酸蛋白酶抑制剂、螯合剂、还原剂及凝血酶抑制剂对重组酶纤维蛋白原裂解活性的影响。丝氨酸蛋白酶抑制剂中只有PMSF具有抑制作用，表明Ser182既是酰胺水解活性又是纤维蛋白原裂解活性的关键氨基酸催化残基。同源模建预测表明PMSF与Ser182之间形成共价键阻碍了底物分子的趋近。可是TPCK只影响了酰胺水解活力，却对纤维蛋白原裂解活力没有影响。EDTA阻碍了重组酶的纤维蛋白原裂解活力，提示金属离子尤其是过渡金属离子在纤维蛋白原裂解过程发挥了作用。EDTA的抑制作用可能与EDTA螯合去除痕量金属离子从而引起底物纤维蛋白原的构象改变有关。还原剂二硫苏糖醇和β-巯基乙醇不抑制酰胺水解活力，表明重组大连蛇岛蝮蛇类凝血酶的高稳定性。肝素和水蛭素不影响纤维蛋白原裂解活力，提示重组大连蛇岛蝮蛇类凝血酶可与肝素或水蛭素联合应用于肝素相关血小板减少症和心肺血栓疾病的临床治疗。4、金属离子对酰胺水解活性和纤维蛋白原裂解活性的影响：1)1 mM过渡金属离子对重组大连蛇岛蝮蛇类凝血酶酰胺水解活力产生抑制的强弱顺序为：Fe2+>Cu2+≈Zn2+>Hg2+>>Ni2+，EDTA的引入可以恢复>80％被过渡金属离子抑制的重组大连蛇岛蝮蛇类凝血酶酰胺水解活力：其他金属离子Co2+和Mn2+分别抑制了重组酶酰胺水解活力的38％和25％；2)过渡金属离子抑制重组酶的纤维蛋白原裂解活力的强弱顺序为：Cu2+≈Ni2+>Zn2+>Co2+；其他二价金属离子如Ca2+和Mg2+对两种活力都没有影响。根据Irving-Williams晶体场理论，结合同源模建获得的大连蛇岛蝮蛇类凝血酶模型，抑制效应的产生可能和Zn2+与酶催化中心Ser182侧链上O原子、His43咪唑环上N原子以及两分子H2O中O原子之间形成四对配位键有关。综上，本研究通过在目标蛋白N端融合NusA标签的表达策略，获得了重组蛇岛蝮蛇类凝血酶可溶性、活性表达；人工核酸酶R5可以高效地去除重组大连蛇岛蝮蛇类凝血酶粗样品中的核酸杂质，并对重组酶活力没有损伤，表明人工核酸酶R5在生化工程领域中具有很好的应用潜力；利用四步柱层析纯化获得了高纯度的可溶性重组大连蛇岛蝮蛇类凝血酶，表现出高的酰胺水解活性和纤维蛋白原裂解活性；系统研究了丝氨酸蛋白酶抑制剂、螯合剂、还原剂、凝血酶抑制剂及二价金属离子对重组大连蛇岛蝮蛇类凝血酶活力的影响，结合同源模建手段揭示抑制效应的作用机制。本研究可以为蛇毒类凝血酶的重组制备和临床应用提供依据。
邓疆渝[6]（2011）在《白唇竹叶青（Trimeresurus albolabris）蛇毒磷脂酶A2的分离纯化及性质研究》文中研究说明白唇竹叶青（Trimeresurus albolabris）属于蝮亚科（Crotalinae）竹叶青属（Trimeresurus）,为剧毒蛇,是我国特有的毒蛇,主要分布于重庆、云南、四川、贵州、福建、海南、广东、广西和台湾等地区。蝮亚科毒蛇的蛇毒中含有多种可以影响血液系统的酶类,其中磷脂酶A2受到广泛的关注。磷脂酶A2在哺乳动物胰脏和蛇毒毒液中含量较丰富,它能专一催化3-Sn-甘油磷脂2位酰脂键的水解反应,生成溶血磷脂和脂肪酸,还表现出多种药理性质,例如,出血毒性、溶血活性、肌肉毒性、抗凝和诱导水肿等作用。正是由于其特殊的结构和丰富的生物活性,有些蛇毒的磷脂酶A2已经成为蛋白质结构和功能研究的重要模型。国内外先后对五步蛇（Agkistrodom. acutus）、蝮蛇（Agkistrodom. halys Pallas）、竹叶青（Trimeresurus Stejnegeri）、烙铁头（T. mucrosquamatus）等多种蛇毒的磷脂酶A2进行过报道,而对中国产白唇竹叶青蛇毒磷脂酶A2的研究未见报道。本研究以中国产白唇竹叶青蛇毒为研究对象,从中分离纯化一种磷脂酶A2,并对其性质进行研究,主要研究工作包括以下几个方面:1.利用CM-Sephadex C-50阳离子交换层析,Sephadex G-75凝胶层析和Q-Sepharose FF预装柱三步色谱法进行分离纯化,从白唇竹叶青蛇毒中分离纯化出一种分子量约为17.2 KDa的磷脂酶A2。电泳结果显示该酶在还原性和非还原性条件下均为单一条带,表明磷脂酶A2是仅由单一肽链组成的蛋白分子。2.对分离纯化出来的磷脂酶A2的性质进行了分析研究。测得该酶的比活力为4.625×104U/mg,酶的最适作用温度为50℃左右,最适pH值为8.0左右,热稳定性较好;Ca2+、K+、Na+对其酶活性具有增强作用,而Mg2+、Zn2+、Cu2+、Fe2+则对其酶活性具有明显的抑制作用;EDTA和EGTA对酶活性具有抑制作用,而DTT、PMSF和β-巯基乙醇对酶活性稍有影响,但是影响不大;无蛋白水解活性、精氨酸酯酶活性和类凝血酶活性;有一定的抗胰蛋白酶活性和间接溶血活性;动物实验显示没有水肿活性。
王婉瑜,杨长久,杨上川,熊郁良,武祥福,林南琴,陈远聪[7]（1987）在《烙铁头蛇毒血小板聚集素（TMVA）的生化性质》文中研究表明用DEAE A-50柱层析从湖南烙铁头（Trimeresurus mucrosquamtus）蛇毒中分离出一个能诱导血小板聚集的组分（ⅩⅢ峰）,随后经Sephadex G-75,Bio-gel等柱层析纯化,得到湖南烙铁头蛇毒血小板聚集素,简称TMVA。经聚丙烯酰胺凝胶电泳,等电点,分子量,氨基酸组成,N—末端,含糖量以及几种酶活性测定,表明:TMVA是一个由两种不同分子量亚基组成的糖蛋白聚合体,含有1.8％的中性糖,0.5％的唾液酸及3.75％的己糖胺。其等电点为5.2,由562个氨基酸残基组成,N—末端氨基酸残基为门冬氨酸（Asp）分子量为68,000,两种亚基的分子量分别为13,700和12,000,纯化后的TMVA不具有粗毒中的何任酶活性。
陈思[8]（2010）在《蛇毒的分离、纯化及其抗肿瘤活性研究》文中研究指明蛇类在世界范围内分布广泛,种类繁多,在中国大陆已发现200多种蛇种及54种亚种。因此,对蛇毒中富含的生物活性成份研究与开发一直是基础医学和制药工业关注的重要研究领域。近年来,研究者分离纯化出一些蛇毒中的酶类及神经毒素等活性物质,其生物活性也得到了应用。但蛇毒中的多种蛋白成分及其生物活性功能仍不为人类所了解。与国际研究水平相比,国内至今只对其中少数几种粗毒或部份纯化的蛋白组分进行了抗肿瘤作用研究,绝大部分蛇毒抗肿瘤成分都没有被发掘出来。本论文以我国华南地区广西常见的眼镜蛇毒为分离样品源,进行了蛇毒蛋白的纯化、分离,检测其抗肿瘤活性,对眼镜蛇毒各组分进行跟踪筛选与评价,旨在为发现具有临床应用价值的抗肿瘤作用活性物质打下理论基础。首先,选取眼镜蛇、蝮蛇、金环蛇和蟒蛇为原料,检测四种蛇毒对人肝癌HepG2细胞生长的抑制作用,确定这四种蛇毒的抗癌活性作用依次减弱；利用MTT法检测眼镜蛇毒和蝮蛇毒的半数抑制浓度（IC50）分别为5.12和22.50μg／mL,而蟒蛇毒和金环蛇毒的IC50均大于100μg／mL。选择抗肿瘤活性作用最为明显的眼镜蛇毒做进一步研究。利用FOCUSTM-Mammalian Proteome试剂盒结合真空浓缩离心系统处理,得到蛇毒粗纯蛋白样品。眼镜蛇毒粗纯蛋白对人肝癌HepG2细胞的半数抑制浓度（IC50）为1.07μg／mL。眼镜蛇毒和蛇毒粗纯蛋白对人肝正常HL-7702细胞有一定的细胞毒性,并对比肿瘤细胞的IC50值,确定蛇毒粗纯蛋白选择性更强。为研究蛇毒粗纯蛋白抑制肿瘤细胞增殖的时效和量效关系,本实验绘制蛇毒粗纯蛋白处理后HepG2细胞的生长曲线,结果显示其可浓度和时间依赖性的抑制肿瘤细胞增殖。采用吖啶橙染色进行形态学观察,发现细胞形态呈时间和浓度依赖性变化,低浓度蛇毒粗纯蛋白处理组细胞圆缩、贴壁能力下降,密布黄绿色芽孢状突起；各组细胞核或细胞质内可见致密的黄绿色荧光,甚至可见浓染的黄绿色碎片,呈现细胞凋亡形态学变化；在高浓度处理组有一定的坏死细胞出现,细胞膜破裂,呈弥散状。以Tris-HCl缓冲液（20mM, pH8.0）为洗脱体系,用0-0.5M NaCl的Tris-Hcl溶液进行线性梯度洗脱,洗脱流速为0.5 mL/min,建立眼镜蛇毒粗纯蛋白的离子交换层析分离方法,紫外检测波长280nm,共得到四个吸收峰,其中一、二两个洗脱峰是蛇毒粗纯蛋白的主要成分。进一步采用高效液相比较分析各洗脱峰下所对应馏分的蛋白洗脱模式。各馏分的液相分析选用反相柱（Lichrospher C18,150×4.6 mm,5μm i. d.）,上样量20μL,流动相为A （0.1%v/v TFA,98%v/vACN）,流动相B （0.1%v/v TFA,2%v/v ACN）,按14.7%-88.2% ACN（15-90%流动相A）比例进行梯度洗脱,流速为0.8 mL/min,紫外全波长扫描。第一洗脱峰,馏分9-12,含有多种蛋白成分,其中两类疏水性、紫外吸收特性各异的蛋白混合物含量较高,而另外三个吸收峰分别存在单一蛋白,它们的疏水性及光谱特性均有所不同。以牛血清白蛋白为标准,采用BCA法检测各馏分总蛋白含量,结果与离子交换柱洗脱曲线一致。根据分析结果,选取四大洗脱峰中的代表性馏分,进一步追踪筛选其活性,并通过SDS-PAGE法定性鉴定对应馏分的蛋白分子量大小。结果显示相比眼镜蛇毒粗纯蛋白,各馏分对人肝癌HepG2细胞的半数抑制浓度（IC50）较大。其中第一洗脱峰抗癌活性最强,它对应的是两类疏水性各异的蛋白混合物,在反相色谱平缓洗脱条件下仍然难以分开,蛋白分子量分布于<14-30KDa。本实验应用溶液酶解,2D-LC, QStar Elite MS/MS技术鉴定相应馏分的蛋白成分,结构鉴定、数据处理工作仍在进行当中。
杨大苹[9]（2010）在《蛇毒类凝血酶及叶绿素结合蛋白的高活性表达及功能分析》文中指出功能性蛋白的高效、高活性重组表达在蛋白质医药以及生物化学研究领域中占据十分重要的地位。但是每一个功能性蛋白都具有特异性,没有一个普遍适用的策略来获得高效、高活性表达的重组蛋白,因此有必要开发不同的策略去表达不同的功能性蛋白。本论文选取了两个比较有代表性的难以表达的功能性蛋白,即动物体系来源的蛇毒类凝血酶和植物体系来源的叶绿素结合蛋白来探索功能性蛋白的高效高活性表达策略。蛇毒类凝血酶是临床治疗血栓病的国家基本药物,由于蛇毒资源有限,天然酶生产面临严峻的挑战,所以利用基因工程手段获得重组蛇毒类凝血酶是满足需求的有效途径。但目前表达量和活性都难以满足大规模制备的要求,是该领域的难点。叶绿素结合蛋白Pcb（prochlorophyte chlorophyll a/b binding protein）结合不同的叶绿素能使光合生物在不同的光照及营养环境下利用光能。深海单细胞蓝细菌Acaryochloris marina以Chlorophyll（Chl）d为主要的捕光色素能利用一般光合物质（Chlorophyll a,b,c）不能利用的远红外光（690～750 nm）,从而适应阴暗的生存环境。而几乎所有的有氧生物,从蓝细菌到植物都以Chi a为主要的色素。在蓝细菌Acaryochloris marina中,Chl d几乎完全替代Chi a行使功能。将结合Chl d的捕光蛋白PcbA转入只含Chl a的蓝细菌,不仅能揭示叶绿素的替代机制,而且也将提供一个系统来探讨光合生物中各种不同捕光策略的功能及其进化机制。本论文主要研究蛇毒类凝血酶和叶绿素结合蛋白这两个功能性蛋白的高活性表达。（一）蛇毒类凝血酶的表达及功能鉴定大连蛇岛蝮蛇蛇毒类凝血酶在大肠杆菌表达系统中以非融合及融合形式进行表达时,并未获得高效、高活性的重组表达。相比于大肠杆菌,甲醇酵母表达系统由于具有表达量高、本身遗传稳定、具翻译后加工能力等优势,在基因工程领域中得到日益广泛的应用。但是前期工作表明,以非融合形式在甲醇酵母表达系统中表达大连蛇岛蝮蛇蛇毒类凝血酶时不能获得理想的表达量。本研究工作从融合的表达策略来研究大连蛇岛蝮蛇蛇毒类凝血酶在毕赤酵母中的高效、高活性重组表达。热休克蛋白（Heat Shock Protein70）是分子伴侣,具有帮助蛋白质正确折叠的功能,已在毕赤酵母中获得高活性高水平的表达（120mg／L）。因此通过将热休克蛋白（Hsp70）与蛇毒类凝血酶的N端融合表达来提高类凝血酶的高效、高活性表达水平。1)毕赤酵母表达重组大连蛇岛蝮蛇蛇毒类凝血酶以Hsp70作为融合标签构建了pPIC9K-hsp70/tle表达质粒,转化毕赤酵母GS115菌株。通过SDS-PAGE分析和Western blot（抗蝮蛇血清做为一抗）证实重组蛇毒类凝血酶获得表达。最佳表达条件为pH 6.0,诱导时间为36小时,甲醇诱导表达浓度为1%,培养基为营养丰富的复合培养基。2)重组蛇毒类凝血酶的分离纯化采用Q Sepharose HP阴离子交换层析、Superdex 200凝胶过滤层析2步层析方法,从培养上清中分离纯化获得,产量为44.5 mg／L,较以前报导的在毕赤酵母中以非融合形式表达的重组大连蛇岛蝮蛇类凝血酶的表达量（10 mg／L）提高了近五倍。活力回收率为67.5%。比活力为33.70 U／mg。纯化后的重组蛇岛蝮蛇类凝血酶经SDS-PAGE分析为单一条带,其表观分子量98 kDa。3)重组大连蛇岛蝮蛇类凝血酶的酰胺水解活性①以人工合成三肽Nα-p-tosyl-Gly-Pro-Arg-p-nitroanilide为底物,重组蛇毒类凝血酶的酶活性最适温度为50℃,最适pH为7.5；②抑制剂的影响：丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF（5 mM）和TLCK（10 mM）分别抑制了重组酶93%和36%的酰胺水解活力,表明重组蛇毒类凝血酶属于丝氨酸蛋白酶家族。抑制剂苯脒只抑制了57%酶活力。EDTA不影响酰胺水解活力,表明大连蛇岛蝮蛇类凝血酶不是金属蛋白水解酶。4)重组大连蛇岛蝮蛇类凝血酶对纤维蛋白原的凝结及裂解活性①重组蛇毒类凝血酶纤维蛋白原凝结活性为499.8 U／mg；②重组蛇毒类凝血酶对纤维蛋白原的裂解方式为：优先裂解Aa-链,然后裂解Bp-链,但不裂解γ-链。（二）叶绿素结合蛋白PcbA的表达及生理活性蓝藻Synechocystis sp. PCC 6803是仅含有Chl a,并且利用藻胆体为捕光天线的蓝细菌,也是基因工程方法制备藻类蛋白的常用工程菌。表达载体pWS19K是通过psbAⅢ的上下游序列将目的基因序列同源重组入蓝藻Synechocystis sp. PCC 6803的基因组中。psbAⅢ与psbAⅡ是蓝藻Synechocystis sp. PCC 6803光合系统Ⅱ中D1蛋白的编码基因,替换任何一个编码基因都不会影响蓝藻的生理活性,因此psbAⅢ替换为pcbA（编码蛋白PcbA）的基因序列不会影响Synechocystis sp. PCC 6803中光合系统Ⅱ的光合性质。表达的重组PcbA可以定位于类囊体膜中并与光合系统Ⅱ结合。利用此重组系统不仅可以研究Ch1 a与PcbA的结合机制,而且也可以研究光合作用生物不同捕光策略的调剂机制及进化发展。1)重组叶绿素结合蛋白PcbA的表达将pcbA基因的3’端加入6xHis-tag构建入pWS19K质粒载体中,转化Synechocystis sp.PCC6803。PCR反应证实pcbA基因已经插入到菌株中psbAⅢ基因位点。SDS-PAGE和western blot方法（anti His-tag做为一抗）证实pcbA因获得了表达,分子量38 kDa左右与预测的理论分子量相符。2)重组叶绿素结合蛋白PcbA的生理活性①重组叶绿素结合蛋白PcbA在宿主中的定位及结合性质通过去垢剂n-dodecyl-β-D-maltoside提取转化菌株的类囊体膜进行SDS-PAGE及western blot证实重组PcbA位于类囊体膜。类囊体膜含有光合系统（PS）Ⅰ/Ⅱ, Blue-Native电泳可以将其分离,并分离的PSⅠ/PSⅡ进行western blot（anti His-tag, anti D1分别做为一抗）分析显示重组PcbA与PSⅡ结合,二维电泳及蛋白印迹杂交（anti His-tag, anti D1分别做为一抗）也显示了相同的结合性质。②重组叶绿素结合蛋白PcbA的生理活性野生型及重组菌株进行全波长扫描分析表明,重组菌株中的藻胆体减少大约40%而类胡萝卜素的含量升高20%。野生型菌株中是以藻胆体为捕光系统,重组菌株中藻胆体含量升高说明重组PcbA的转入对重组菌株的捕光策略产生影响。PcbA的稳定存在需要叶绿素及类胡萝卜素的结合,重组菌株合成更多的类胡萝卜素可能是用来满足重组PcbA稳定的需要。野生型及重组菌株进行荧光光谱分析：1,选择在435 nm下激发得到荧光发射波谱,室温下重组菌株与野生型相比存在一个额外的～705 nm处的肩峰。77K下,重组菌株与野生型相比存在一个额外的～720nm的肩峰,说明转化的PcbA与Chl a结合改变了宿主中Chl a的光学环境使其发生红移。2,选择在685 nm与720 nm下发射得到荧光激发波谱。室温及77K下,在重组菌株中几乎观测不到藻胆体的激发峰值。这提供了直接证据,说明重组PcbA的转入已经改变了菌体的捕光策略,即藻胆蛋白下调,而膜结合天线系统上调。综上,通过不同的表达策略,即热休克蛋白做为融合部分在毕赤酵母中表达Gloshedobin及synechocysits sp. PCC6803做为表达宿主表达叶绿素结合蛋白,获得了功能性蛋白的高水平、高活性表达。这也证实基于宿主基因组DNA构建的表达载体来表达功能性蛋白是一个获得功能性蛋白的高水平、高活性表达的比较好的策略。
黄璐[10]（2013）在《皖南蝮蛇毒血小板抑制因子的分离纯化及其抗血小板的机制研究》文中提出目的：从皖南蝮蛇粗毒中分离纯化出血小板抑制因子（platelet inhibitor fromAgkistrodon halys venom，AHV-PI），并探讨AHV-PI对家兔血小板的影响及其可能机制。方法：借助Cellulose DEAE-52，CM-Sephadex C-25离子交换柱及SephadexG-75凝胶柱，以离子交换和凝胶过滤层析方法从皖南蝮蛇（AHV）粗毒中分离纯化出AHV-PI；以家兔体外血小板聚集实验来筛选出蝮蛇毒血小板抑制因子组分，并计算出其对血小板聚集的半数抑制率；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测AHV-PI的纯度和相对分子量。按照随机分配表将36只新西兰家兔随机分成以下6组，假手术组（sham）6只、动脉血栓模型组（model）6只、阳性对照组（positive control，剂量为5mg/kg的奥扎格雷钠注射液）6只、AHV-PI低（0.05mg/kg）、中（0.1mg/kg）、高（0.2mg/kg）三个剂量实验组各6只。家兔颈动脉血栓模型的制备采用70%FeCl3溶液化学损伤的方法。假手术组中的家兔经耳缘静脉注射1ml0.9%NaCl溶液，不用制备家兔颈动脉血栓模型。1h后经股动脉采血，采用双通道凝血仪测定家兔血浆纤维蛋白原（FIB）含量，血栓弹力仪（TEG）描计血栓弹力图，ADP诱导比浊法测定家兔血小板聚集率，酶联免疫吸附法（ELISA）测定各组血浆中血管性血友病因子（vWF）、α-颗粒膜蛋白（GMP-140）、血栓素B2（TXB2）和血小板膜糖蛋白IIb/IIIa（GPIIb/IIIa）水平，光镜和透射电镜分别观察各组家兔动脉血栓形成和血小板形态的改变。结果：从皖南蝮蛇粗毒中经Cellulose DEAE-52阴离子交换层析分离纯化出7个层析峰，分别命名为I～VII峰。经家兔体外血小板聚集实验筛选出抑制血小板聚集作用最显着的为IV峰。再经CM-Sephadex C-25阳离子交换柱及Sephadex G-75凝胶柱层析得到AHV-PI。AHV-PI在体外可以剂量依赖性的抑制由ADP诱导的血小板聚集，其IC50为221μg/ml。再经SDS-PAGE电泳测定AHV-PI为单一峰，其相对分子量约为31.0kDa左右。作用于家兔体内后，与模型组比较，AHV-PI中、高剂量实验组血栓弹力图中凝血时间（R）和血凝块形成时间（K）延长（P<0.01），Alpha角度（A）、最大幅度（MA）和凝血指数（CI）减小（P<0.05和P<0.01）；血小板聚集率的各项指标最大聚集时间（Tmax），最大聚集幅度（Amax），一分钟聚集率（A1），三分钟聚集率（A3）和聚集坡度均明显降低（P<0.05和P<0.01）；血浆中FIB、GMP-140、vWF和TXB2含量均降低（P<0.01），但血浆中GPIIb/IIIa含量并无明显的降低（P>0.05）。除FIB和GPIIb/IIIa外，AHV-PI中、高剂量实验组与假手术组和阳性对照组相比以上各项指标差异无统计学意义（P>0.05）。病理切片显示AHV-PI中、高剂量实验组家兔颈动脉内未形成血栓，内膜相对比较完整。AHV-PI中、高剂量实验组血小板超微结构与模型组比较，血小板的表面比较光滑，形态也基本规则，α-颗粒和致密颗粒明显增加，胞浆空泡化的现象也减轻。结论：从皖南蝮蛇毒粗毒中经一次阴离子交换、一次阳离子交换和一次凝胶过滤法可以分离纯化出蝮蛇毒血小板抑制因子（AHV-PI），为单一峰，其相对分子量为31.0kDa左右，其可能为具有纤溶酶活性的一类蛋白质，未发现其具有血小板摸糖蛋白GPIIb/IIIa拮抗剂的效应。经家兔体内实验证明AHV-PI可以保护血小板的超微结构，通过抑制血小板聚集来防止动脉血栓的形成，其机制可能与之减少血小板的脂质代谢和颗粒内容物的释放有关。
二、烙铁头(Trimeresurus mucrosquamatus)蛇毒的研究[Ⅰ]柱层析分离及酶活性与生物活性测定（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、烙铁头(Trimeresurus mucrosquamatus)蛇毒的研究[Ⅰ]柱层析分离及酶活性与生物活性测定（论文提纲范文）
（3）烙铁头蛇毒的分离及部分生物活性研究（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试剂和实验材料 |
| 1.2 仪器 |
| 1.3 烙铁头蛇毒的分离 |
| 1.4 蛋白浓度测定 |
| 1.5 电泳 |
| 1.6 抗补体活性测定 |
| 1.7 酶活性测定 |
| 1.8 抑制剂对纤维蛋白原水解活性的影响 |
| 1.9 水肿活性测定 |
| 1.10 皮下出血活性及抑制剂的影响 |
| 1.11 流血时间测定 |
| 2 结果 |
| 2.1 柱层析分离 |
| 2.2 SDS-PAGE |
| 2.3 抗补体活性 |
| 2.4 纤维蛋白原水解活性、精氨酸酯酶活性测定 |
| 2.5 蛋白酶抑制剂的作用 |
| 2.6 水肿活性 |
| 2.7 出血活性 |
| 2.8 流血时间测定 |
| 3 讨论 |
（4）白唇竹叶青（Trimeresurus albolabris）蛇毒纤溶组分的分离纯化及性质研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写一览表 |
| 1 引言 |
| 1.1 研究目的和意义 |
| 1.2 本研究的主要内容 |
| 1.3 本研究的技术路线 |
| 2 白唇竹叶青蛇粗毒的性质研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 3 白唇竹叶青蛇毒纤溶组分的分离纯化及性质研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 4 全文小结 |
| 5 文献综述 |
| 参考文献 |
| 作者在攻读硕士学位期间发表的论文目录、科研情况 |
| 致谢 |
（5）基因重组大连蛇岛蝮蛇类凝血酶的制备与性质表征（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 纤维蛋白原与纤维蛋白原裂解酶 |
| 1.1.1 纤维蛋白原 |
| 1.1.2 纤维蛋白原裂解酶 |
| 1.2 蛇毒类凝血酶 |
| 1.2.1 蛇毒类凝血酶概述 |
| 1.2.2 蛇毒类凝血酶的结构特征 |
| 1.2.3 蛇毒类凝血酶的生理生化性质 |
| 1.2.4 蛇毒类凝血酶的医药价值与临床应用 |
| 1.2.5 蛇毒类凝血酶与其他抗血栓药物的比较 |
| 1.3 蛇毒类凝血酶的制备 |
| 1.3.1 天然蛇毒类凝血酶的制备 |
| 1.3.2 蛇毒类凝血酶基因的重组表达 |
| 1.3.3 重组蛇毒类凝血酶可溶性表达策略 |
| 1.3.4 重组蛇毒类凝血酶样品预处理 |
| 1.3.5 蛇毒类凝血酶的分离纯化策略 |
| 1.4 本论文选题依据和研究内容 |
| 1.4.1 选题依据 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 2 大连蛇岛蝮蛇类凝血酶的分子克隆与表达 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与仪器 |
| 2.2.1 基因、质粒和菌株 |
| 2.2.2 工具酶 |
| 2.2.3 试剂 |
| 2.2.4 实验仪器 |
| 2.2.5 溶液配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 蛋白质可溶性预测 |
| 2.3.2 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.3.3 质粒的提取 |
| 2.3.4 样品DNA片段的切胶回收 |
| 2.3.5 样品DNA片段的精制 |
| 2.3.6 聚合酶链式反应(PCR) |
| 2.3.7 限制性酶切反应 |
| 2.3.8 线性DNA末端的去磷酸化 |
| 2.3.9 线性DNA片段末端的平端化和磷酸化 |
| 2.3.10 线性DNA的连接 |
| 2.3.11 质粒DNA的转化 |
| 2.3.12 重组菌株的培养和目的蛋白的诱导表达 |
| 2.3.13 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测(SDS-PAGE) |
| 2.3.14 蛋白质免疫印迹检测(Western blotting) |
| 2.3.15 蛋白浓度定量 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 蛋白可溶性预测 |
| 2.4.2 基因克隆和载体构建的实验流程 |
| 2.4.3 大连蛇岛蝮蛇类凝血酶基因点突变修复 |
| 2.4.4 大连蛇岛蝮蛇类凝血酶基因的亚克隆 |
| 2.4.5 三种重组融合表达载体的构建 |
| 2.4.6 三种融合蛋白对可溶表达的影响 |
| 2.4.7 重组菌株的培养和目的蛋白的诱导表达 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 3 重组大连蛇岛蝮蛇类凝血酶的样品预处理及分离纯化 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与设备 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.2.3 溶液配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 琼脂糖凝胶电泳 |
| 3.3.2 蛋白样品的制备 |
| 3.3.3 蛋白样品预处理 |
| 3.3.4 大肠杆菌基因组DNA的提取 |
| 3.3.5 植物基因组DNA的提取 |
| 3.3.6 核酸酶活性测定 |
| 3.3.7 酰胺水解活力的检测 |
| 3.3.8 纤维蛋白酶原凝结活性 |
| 3.3.9 纤维蛋白原裂解活性 |
| 3.3.10 变性聚丙烯凝胶电泳检测(SDS-PAGE) |
| 3.3.11 蛋白质免疫印迹检测(Western blotting) |
| 3.3.12 蛋白浓度定量 |
| 3.3.13 蛇毒类凝血酶样品的浓缩和脱盐 |
| 3.3.14 重组蛇毒类凝血酶纯化方法 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 人工核酸酶用于重组蛇毒类凝血酶样品预处理 |
| 3.4.2 四步柱层析法分离纯化重组大连蛇岛蝮蛇类凝血酶 |
| 3.4.3 重组大连蛇岛蝮蛇类凝血酶纯化产物鉴定 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 重组大连蛇岛蝮蛇类凝血酶蛋白样品预处理 |
| 3.5.2 重组大连蛇岛蝮蛇类凝血酶的分离纯化 |
| 3.6 小结 |
| 4 重组大连蛇岛蝮蛇类凝血酶的性质表征 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与设备 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.2.3 溶液配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 纤维蛋白酶原凝结活性 |
| 4.3.2 纤维蛋白原裂解活性的测定 |
| 4.3.3 酰胺水解活力测定 |
| 4.3.4 最适温度和最适pH值的测定 |
| 4.3.5 抑制剂、还原剂和螯合剂对酶活力的影响 |
| 4.3.6 金属离子对酶活力的影响 |
| 4.3.7 序列比对和同源模建 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 最适温度和最适pH |
| 4.4.2 重组类凝血酶生理活性 |
| 4.4.3 抑制剂对于重组类凝血酶的纤维蛋白原裂解活力影响 |
| 4.4.4 金属离子对于重组类凝血酶的纤维蛋白原裂解活力影响 |
| 4.4.5 纤维蛋白原裂解活力的对照实验 |
| 4.4.6 抑制剂对于重组类凝血酶酰胺水解活力的影响 |
| 4.4.7 金属离子对于重组类凝血酶酰胺水解活力的影响 |
| 4.4.8 同源模建和抑制模拟 |
| 4.5 讨论 |
| 4.5.1 重组大连蛇岛蝮蛇类凝血酶的基本性质 |
| 4.5.2 丝氨酸蛋白酶抑制剂对重组大连蛇岛蝮蛇类凝血酶的影响 |
| 4.5.3 还原剂对重组大连蛇岛蝮蛇类凝血酶的影响 |
| 4.5.4 凝血酶天然抑制剂对重组大连蛇岛蝮蛇类凝血酶的影响 |
| 4.5.5 金属离子对重组大连蛇岛蝮蛇类凝血酶酰胺水解活力的影响 |
| 4.5.6 金属离子对重组大连蛇岛蝮蛇类凝血酶纤维蛋白原裂解活力的影响 |
| 4.5.7 金属离子螯合剂EDTA对重组大连蛇岛蝮蛇类凝血酶的影响 |
| 4.5.8 过渡金属离子对重组大连蛇岛蝮蛇类凝血酶的抑制机理推测 |
| 4.6 小结 |
| 结论与展望 |
| 结论 |
| 展望 |
| 创新点摘要 |
| 参考文献 |
| 附录A 专有名词缩写 |
| 附录B 质粒图谱 |
| 附录C 常用仪器设备 |
| 附录D 常用溶液配制 |
| 附录E 质粒DNA的提取 |
| 附录F DNA片段的切胶回收 |
| 附录G DNA片断的精制 |
| 附录H 大肠杆菌基因组DNA的提取 |
| 附录I 植物基因组DNA的提取 |
| 附录J 人工核酸酶R5的合成与鉴定 |
| 攻读博士学位期间发表学术论文情况 |
| 攻读博士学位期间专利申请授权情况 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）白唇竹叶青（Trimeresurus albolabris）蛇毒磷脂酶A2的分离纯化及性质研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写一览表 |
| 1 引言 |
| 1.1 研究目的和意义 |
| 1.2 本研究的主要内容 |
| 1.2.1 粗毒的制备 |
| 1.2.2 白唇竹叶青蛇毒磷脂酶A_2 的分离纯化 |
| 1.2.3 白唇竹叶青蛇毒磷脂酶A_2 的性质研究 |
| 1.3 本技术的研究路线 |
| 2 白唇竹叶青蛇毒磷脂酶A_2 的分离纯化 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 主要仪器与设备 |
| 2.1.2 主要材料与试剂 |
| 2.1.3 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 层析结果 |
| 2.2.2 纯度鉴定及分子量测定 |
| 2.3 讨论 |
| 3 白唇竹叶青蛇毒磷脂酶A_2 的性质研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 主要仪器与设备 |
| 3.1.2 主要材料与试剂 |
| 3.1.3 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 蛋白质含量测定 |
| 3.2.2 酶活力测定 |
| 3.2.3 不同温度对酶活力的影响 |
| 3.2.4 pH 对酶活力的影响 |
| 3.2.5 金属离子对酶活力的影响 |
| 3.2.6 抑制剂对酶活力的影响 |
| 3.2.7 热稳定性 |
| 3.2.8 精氨酸酯酶活力的测定 |
| 3.2.9 蛋白水解酶活性的测定 |
| 3.2.10 抗胰蛋白酶作用的测定 |
| 3.2.11 类凝血酶活性测定 |
| 3.2.12 溶血活性测定 |
| 3.2.13 水肿活性测定 |
| 3.3 讨论 |
| 4 全文小结 |
| 5 文献综述 |
| 5.1 磷脂酶A_2 的概述 |
| 5.2 磷脂酶A_2 的分类 |
| 5.3 磷脂酶A_2 的理化性质和结构特征 |
| 5.4 蛇毒磷脂酶A_2 的分类 |
| 5.5 蛇毒磷脂酶A_2 的理化性质 |
| 5.6 蛇毒磷脂酶A_2 的结构特征及催化机理 |
| 5.7 蛇毒磷脂酶A_2 的毒理作用及其机制 |
| 5.7.1 对血液循环系统的作用 |
| 5.7.2 肌毒性作用 |
| 5.7.3 诱导水肿形成作用 |
| 5.7.4 突触前神经毒性作用 |
| 5.7.5 其他作用 |
| 5.8 蛇毒磷脂酶A_2 生物信息学研究 |
| 5.9 蛇毒磷脂酶A_2 基因工程的研究 |
| 5.10 竹叶青属蛇毒中磷脂酶A_2 的研究进展 |
| 5.11 蛇毒磷脂酶A_2 的研究展望 |
| 参考文献 |
| 附：作者在攻读硕士学位期间发表的论文目录、科研情况 |
| 致谢 |
（8）蛇毒的分离、纯化及其抗肿瘤活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 蛇毒简介 |
| 1.2 蛇毒的化学成分 |
| 1.2.1 蛇毒中的酶类 |
| 1.2.2 蛇毒中的毒素及其活性因子 |
| 1.3 蛇毒抗肿瘤作用研究 |
| 1.4 蛇毒蛋白研究进展 |
| 1.4.1 蛋白的分离分析 |
| 1.4.2 高灵敏度分析技术-生物质谱 |
| 1.4.3 生物信息学查询 |
| 1.4.4 蛇毒蛋白研究 |
| 1.5 本课题的选题背景、研究意义及研究内容 |
| 1.5.1 选题背景 |
| 1.5.2 研究意义 |
| 1.5.3 研究内容及思路 |
| 第2章 四种蛇毒抗肿瘤活性的初筛研究 |
| 2.1 材料、试剂及仪器 |
| 2.1.1 试验试剂 |
| 2.1.2 试验仪器 |
| 2.1.3 试验原料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 肿瘤细胞株的培养 |
| 2.2.2 浓度范围的筛选 |
| 2.2.4 药品的配制 |
| 2.2.5 蛇毒初筛 |
| 2.2.6 眼镜蛇毒对肿瘤细胞增殖的抑制率及IC |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 四种蛇毒对HepG_2细胞抗肿瘤作用的筛选 |
| 2.3.2 眼镜蛇毒对HepG_2细胞的抑制作用 |
| 2.3.3 本章小结 |
| 第3章 眼镜蛇毒与粗纯蛋白的比较研究 |
| 3.1 材料、试剂及仪器 |
| 3.1.1 试验试剂 |
| 3.1.2 试验仪器 |
| 3.1.3 试验原料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 肿瘤细胞株的培养 |
| 3.2.2 眼镜蛇毒粗纯蛋白的制备 |
| 3.2.3 SDS-PAGE电泳 |
| 3.2.4 药品的配制 |
| 3.2.5 眼镜蛇毒粗纯蛋白对肿瘤细胞增殖的抑制率及IC_(50) |
| 3.2.6 眼镜蛇毒及粗纯蛋白对正常细胞的毒性研究 |
| 3.2.7 眼镜蛇毒粗纯蛋白对HepG_2细胞生长的影响 |
| 3.2.8 荧光染色形态学观察 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 蛇毒粗纯蛋白的制备与电泳分析 |
| 3.3.2 眼镜蛇毒粗纯蛋白对肿瘤细胞增殖的抑制作用 |
| 3.3.3 眼镜蛇毒及粗纯蛋白对正常细胞的毒性研究 |
| 3.3.4 眼镜蛇毒粗纯蛋白对HepG_2细胞生长的影响 |
| 3.3.5 荧光染色形态学观察 |
| 3.3.6 本章小结 |
| 第4章 眼镜蛇毒粗纯蛋白的分离及各馏分抗肿瘤活性研究 |
| 4.1 材料、试剂及仪器 |
| 4.1.1 试验试剂 |
| 4.1.2 试验仪器 |
| 4.1.3 试验原料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 DEAE-Sephacel离子交换柱层析 |
| 4.2.2 高效液相色谱分析 |
| 4.2.3 眼镜蛇毒粗纯蛋白各馏分的蛋白浓度测定 |
| 4.2.4 眼镜蛇毒粗纯蛋白各馏分抗肿瘤活性研究 |
| 4.2.5 SDS-PAGE电泳 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 离子交换柱层析分离 |
| 4.3.2 液相色谱分析 |
| 4.3.3 眼镜蛇毒粗纯蛋白各馏分的蛋白浓度 |
| 4.3.4 各馏分液相色谱和总蛋白浓度结果的综合比较 |
| 4.3.5 眼镜蛇毒粗纯蛋白各馏分抗肿瘤活性研究 |
| 4.3.6 SDS-PAGE电泳 |
| 4.3.7 后续结构鉴定 |
| 4.3.8 本章小结 |
| 第5章 结论 |
| 5.1 结论 |
| 参考文献 |
| 附录一 常用试剂及配制 |
| 附录二 中英文名词术语对照表 |
| 附录三 研究生期间所发表的论文 |
| 致谢 |
（9）蛇毒类凝血酶及叶绿素结合蛋白的高活性表达及功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 蛇毒类凝血酶性质、功能及研究进展 |
| 1.1.1 丝氨酸蛋白酶概述 |
| 1.1.2 蛇毒类凝血酶概述 |
| 1.1.3 蛇毒类凝血酶的生理生化性质 |
| 1.1.4 蛇毒类凝血酶重组表达的研究进展 |
| 1.1.5 蛇毒类凝血酶的分离纯化技术 |
| 1.2 叶绿素结合蛋白Pcb的性质、功能及研究进展 |
| 1.2.1 光合系统概述 |
| 1.2.2 叶绿素结合蛋白Pcb概述 |
| 1.2.3 叶绿素结合蛋白Pcb的进化 |
| 1.2.4 叶绿素结合蛋白的体外重组表达及其与叶绿素结合性质的研究进展 |
| 1.2.5 细胞器的分离 |
| 1.3 本论文选题依据和研究内容 |
| 1.3.1 选题依据 |
| 1.3.2 研究内容 |
| 2 重组大连蛇岛蝮蛇类凝血酶在毕赤酵母中克隆与表达 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与仪器 |
| 2.2.1 基因、质粒和菌株 |
| 2.2.2 工具酶 |
| 2.2.3 试剂 |
| 2.2.4 实验仪器 |
| 2.2.5 溶液配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 聚合酶链式反应(PCR) |
| 2.3.2 大连蛇岛蝮蛇毒类凝血酶基因在表达载体pPICgK中的克隆 |
| 2.3.3 表达载体转化毕赤酵母细胞GS115 |
| 2.3.4 重组菌株的诱导表达 |
| 2.3.5 酰胺水解活性检测 |
| 2.3.6 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测(SDS-PAGE) |
| 2.3.7 蛋白质免疫印迹检测(Western blot) |
| 2.3.8 蛋白浓度测定 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 大连蛇岛蝮蛇类凝血酶基因的亚克隆 |
| 2.4.2 大连蛇岛蝮蛇类凝血酶基因在毕赤酵母中的克隆 |
| 2.4.3 大连蛇岛蝮蛇类凝血酶基因在毕赤酵母中的表达 |
| 2.4.4 表达条件的优化 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 3 重组大连蛇岛蝮蛇毒类凝血酶基因的分离纯化及活性 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 重组蛋白的表达 |
| 3.3.2 蛋白样品的制备 |
| 3.3.3 蛋白定量的方法 |
| 3.3.4 Q HP阴离子交换层析 |
| 3.3.5 Superdex 200凝胶过滤层析 |
| 3.3.6 酰胺水解活性 |
| 3.3.7 纤维蛋白酶原凝结活性 |
| 3.3.8 纤维蛋白原裂解活性 |
| 3.3.9 变性聚丙烯凝胶电泳检测(SDS-PAGE) |
| 3.3.10 蛋白质免疫印迹检测(Western blot) |
| 3.3.11 抑制剂对酰胺水解活力的影响 |
| 3.3.12 最适温度和最适pH值的测定 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 重组蛇毒类凝血酶的分离纯化 |
| 3.4.2 重组蛇毒类凝血酶活性 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 4 重组叶绿素d结合蛋白PcbA在synechocystis sp.PCC6803中的克隆与表达 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与仪器 |
| 4.2.1 基因、质粒和菌株 |
| 4.2.2 工具酶和化学试剂 |
| 4.2.3 引物 |
| 4.2.4 实验仪器 |
| 4.2.5 溶液配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 琼脂糖凝胶电泳 |
| 4.3.2 质粒的提取 |
| 4.3.3 样品DNA片段的切胶回收 |
| 4.3.4 样品DNA片段的精制 |
| 4.3.5 叶绿素结合蛋白PcbA基因的表达载体构建 |
| 4.3.6 叶绿素结合蛋白PcbA基因在蓝藻中的转化 |
| 4.3.7 提取基因组DNA |
| 4.3.8 RT-PCR |
| 4.3.9 重组菌株的培养 |
| 4.3.10 类囊体膜的提取 |
| 4.3.11 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测(SDS-PAGE) |
| 4.3.12 蛋白质免疫印迹检测(Western blot) |
| 4.3.13 蛋白浓度定量 |
| 4.3.14 叶绿素含量的测定 |
| 4.3.15 金属螯合层析 |
| 4.4 实验结果与分析 |
| 4.4.1 重组PcbA基因的表达载体构建 |
| 4.4.2 重组PcbA基因的表达载体的转化 |
| 4.4.3 RNA水平检测目的基因的转录 |
| 4.4.4 重组PcbA的表达 |
| 4.4.5 重组PcbA的分离纯化 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 5 重组叶绿素d结合蛋白PcbA在宿主中的生理活性 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与设备 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 实验设备 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 类囊体膜增溶 |
| 5.3.2 蓝绿温和胶电泳 |
| 5.3.3 蛋白质免疫印迹检测 |
| 5.3.4 吸收波谱分析 |
| 5.3.5 荧光光谱分析 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 重组PcbA在宿主中的定位 |
| 5.4.2 重组PcbA与类囊体膜光合系统的结合 |
| 5.4.3 重组PcbA与叶绿素的结合 |
| 5.4.4 波谱分析重组pcbA的生理活性 |
| 5.5 讨论 |
| 5.5.1 重组叶绿素结合蛋白PcbA在宿主中的定位及结合性质 |
| 5.5.2 吸收波谱分析重组PcbA在宿主中的生理活性 |
| 5.5.3 荧光波谱分析重组PcbA在宿主中的生理活性 |
| 5.6 小结 |
| 结论与展望 |
| 创新点摘要 |
| 参考文献 |
| 附录A 质粒图谱 |
| 附录B 常用仪器设备 |
| 附录C 常用溶液配制 |
| 附录D 质粒DNA的提取 |
| 附录E DNA片段的切胶回收 |
| 附录F DNA片断的精制 |
| 攻读博士期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（10）皖南蝮蛇毒血小板抑制因子的分离纯化及其抗血小板的机制研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 研究内容与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 AHV-PI 的分离纯化 |
| 2.1.1 AHV-PI 的分离纯化 |
| 2.1.2 血小板抑制因子的筛选 |
| 2.1.3 AHV-PI 分子量的测定 |
| 2.2 动物实验 |
| 2.2.1 实验动物分组 |
| 2.2.2 动物血栓模型的复制 |
| 2.2.3 血栓弹力图的监测 |
| 2.2.4 血小板聚集曲线及其指标检测 |
| 2.2.5 血浆蛋白原的检测 |
| 2.2.6 各 ELISA 试剂盒指标的检测 |
| 2.2.7 动脉组织形态学的观察 |
| 2.2.8 血小板超微结构的观察 |
| 2.3 统计学处理 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 作者简介及读研期间主要科研成果 |
四、烙铁头(Trimeresurus mucrosquamatus)蛇毒的研究[Ⅰ]柱层析分离及酶活性与生物活性测定（论文参考文献）
- [1]动物毒素与人类疾病——从单一成分到组学研究,从理化性质到疾病机理,从粗毒利用到理性药物设计[J]. 吕秋敏,赖仞,张云. 动物学研究, 2010(01)
- [2]烙铁头（Trimeresurus mucrosquamatus）蛇毒的研究[Ⅰ]柱层析分离及酶活性与生物活性测定[J]. 王婉瑜,杨长久,熊郁良,陈锡兰. 动物学研究, 1983(04)
- [3]烙铁头蛇毒的分离及部分生物活性研究[J]. 崔昊,孙黔云. 贵阳中医学院学报, 2008(03)
- [4]白唇竹叶青（Trimeresurus albolabris）蛇毒纤溶组分的分离纯化及性质研究[D]. 邓敏. 重庆师范大学, 2008(01)
- [5]基因重组大连蛇岛蝮蛇类凝血酶的制备与性质表征[D]. 许建强. 大连理工大学, 2008(05)
- [6]白唇竹叶青（Trimeresurus albolabris）蛇毒磷脂酶A2的分离纯化及性质研究[D]. 邓疆渝. 重庆师范大学, 2011(08)
- [7]烙铁头蛇毒血小板聚集素（TMVA）的生化性质[J]. 王婉瑜,杨长久,杨上川,熊郁良,武祥福,林南琴,陈远聪. 动物学研究, 1987(S1)
- [8]蛇毒的分离、纯化及其抗肿瘤活性研究[D]. 陈思. 浙江工商大学, 2010(11)
- [9]蛇毒类凝血酶及叶绿素结合蛋白的高活性表达及功能分析[D]. 杨大苹. 大连理工大学, 2010(09)
- [10]皖南蝮蛇毒血小板抑制因子的分离纯化及其抗血小板的机制研究[D]. 黄璐. 皖南医学院, 2013(11)