一、豚鼠精子在发生及顶体反应过程中细胞内Ca~(2+)的定位研究（论文文献综述）
肖凯[1]（2021）在《水牛精浆外泌体蛋白质组的初步研究》文中提出水牛（Bubalus bubalis）是我国南方亚热带地区一种优良的乳肉兼用型大家畜,具有广泛的产业开发价值,但相比地处中温带的牛属物种,水牛的繁殖率较低,精子活力低下是其中重要影响因素之一,极大的限制了奶水牛业的发展和本地水牛品种改良的步伐。精子是一种高度特化和浓聚的已不能生长和分裂的细胞,基因组的转录和翻译功能几乎处于沉默状态,主要依赖于精浆发育内环境调节其成熟过程。正常的受精不仅取决于精子发育的内在因素,还受到精浆等外部因素的影响,这些因素会影响精子的功能。精浆外泌体是来源于雄性生殖道内众多附属性腺分泌的胞外囊泡,在精子成熟和受精过程中扮演重要角色。蛋白质组学技术是研究哺乳动物精子成熟与发育的重要手段,可以高通量寻找影响精子受精的功能蛋白质,有助于筛选关键基因或生物标志物,目前,精浆外泌体的蛋白质组研究报道较少。本研究通过蛋白质组学技术探索水牛精浆外泌体与精子功能的关系,发现外泌体调节精子功能的关键因子并进行分析,有助于解释水牛活力低下的成因,阐明水牛雄性生殖机制。本文研究的主要内容如下:一、水牛精浆外泌体的分离与鉴定。使用改良后的差速离心+蔗糖垫法分离提取精浆外泌体,通过蛋白质印迹（Western blot）验证外泌体蛋白标志物CD81、TSG101和ALIX,结果均阳性表达。通过纳米颗粒跟踪分析仪（NTA）分析外泌体粒径大小,结果显示粒径集中于119.4 nm附近,占比99.2%;通过透射电子显微镜（TEM）观察外泌体形态,结果显示其具有明显的茶托状结构。二、水牛精子、精浆及精浆外泌体蛋白质表达谱的构建和生物信息学分析。利用液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）蛋白质组学策略在精子、精浆和精浆外泌体中分别鉴定到1894种、1247种和1343种蛋白质。对蛋白质表达谱进行GO分析,结果显示精子、精浆和外泌体蛋白质主要参与氧化还原过程和蛋白质转运过程,具有ATP、GTP结合能力,定位于胞外外泌体、细胞质、线粒体上。KEGG分析显示,精子、精浆和精浆外泌体蛋白质富集最丰富的均为代谢通路;精子在能量代谢相关的通路上参与的蛋白质数量最多;精浆通过补体系统和蛋白酶体通路起到稳定内环境的作用;外泌体中蛋白质参与了蛋白酶体通路,说明蛋白酶体通路可能是外泌体发挥保护功能的主要方式。三、水牛高低活力精浆外泌体的定量蛋白质组学分析。利用i TRAQ结合液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）蛋白质组学策略对高低活力精浆外泌体进行定量分析。以高活力水牛精浆外泌体表达蛋白质作为对照组,筛选到差异表达蛋白质160个（差异倍数>1.2）,包括下调表达蛋白质119个,上调表达蛋白质41个,低活力精浆外泌体中差异蛋白质变化总体呈现下降趋势。对差异蛋白质进行GO分析,结果显示大部分差异蛋白质定位于精子和囊泡,具有水解酶、金属蛋白酶活性,参与精卵识别、受精、单受精、精子与透明带的结合、单生物生殖、细胞识别等过程。KEGG分析结果显示,差异蛋白质主要参与PPAR信号通路、钙信号通路、c AMP信号通路等,其中IZUMO1等10种蛋白质表达量在低活力精浆外泌体显着下调。综上所述,本研究首次分离并鉴定水牛精浆外泌体,构建了水牛精子、精浆和精浆外泌体蛋白质表达谱,获得水牛高低活力精浆外泌体差异蛋白质表达谱,通过比较水牛高低活力精浆外泌体的差异表达蛋白质,筛选出了一批可能与精子功能相关的外泌体蛋白质,分析外泌体与水牛精子活力维持的关系,为水牛雄性生殖机理研究提供新的视角。
方翔永[2]（2021）在《中华绒螯蟹syntaxin-1蛋白多抗制备及其功能分析》文中指出中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）,为我国重要的经济蟹类,可溶性NSF附着蛋白受体（Soluble N-ethyl-maleimide Sensitive Factor Attachment Protein Receptor,SNARE）蛋白作为N-乙基马来酰胺-敏感因子（N-ethyl-maleimide Sensitive Factor,NSF）和可溶性NSF附着蛋白（soluble NSF attachment proteins,SNAP）的膜受体,而syntaxin-1蛋白属于SNARE蛋白的一种。本研究以syntaxin-1蛋白为基础,为探究SNARE蛋白家族在中华绒螯蟹精子发生过程中的表达特征和功能提供基础。获取中华绒螯蟹syntaxin-1基因转录组信息,并进行相关的生物信息学分析,克隆相应的syntaxin-1基因,并将重组后的克隆载体转入DH5α菌株中培养。结果显示,中华绒螯蟹的syntaxin-1蛋白为亲水不稳定蛋白,共有1个跨膜区段,无信号肽存在,是一种成熟蛋白,中华绒螯蟹的syntaxin-1蛋白与美洲螃蟹的syntaxin-1A蛋白具有同源性,可克隆出的syntaxin-1基因大小在250-500bp,与理论值（397bp）相符合。构建相应的表达载体syntaxin-1-p ET-30a,转入到DE3菌株中培养,并通过p ET-30a上的组氨酸标签纯化得到syntaxin-1蛋白。研究发现,纯化的蛋白大小为20-31kd之间,与理论值（21kd）相符合。以纯化后的syntaxin-1蛋白作为免疫原,制备多克隆抗体,并检测多克隆抗体效价。多克隆抗体效价检测结果显示,制备的多克隆抗体效价为1:25600,效价大于1:10000,符合抗体制备的要求。以制备的多克隆抗血清作为一抗,通过免疫荧光及免疫组化的方法,对syntaxin-1蛋白在中华绒螯蟹各种生精细胞中的定位进行分析。免疫荧光接结果表明,syntaxin-1蛋白在精原细胞、初级精母细胞和次级精母细胞中定位于细胞膜上,但在成熟精子细胞中则定位于细胞核上,且syntaxin-1在精原细胞、初级精母细胞和次级精母细胞中的分泌量依次增多,并且制备多抗组染色效果显着优于购买抗体组,同时免疫组化结果也显示该蛋白的定位情况与免疫荧光结果相一致。综上所述,本研究成功克隆了syntaxin-1基因,并通过构建相应的syntaxin-1-p ET-30a表达载体,成功合成和纯化了syntaxin-1蛋白,并以纯化出的syntaxin-1蛋白作为免疫原,制备出效价符合要求的多克隆抗体。通过免疫荧光和免疫组化方法,发现syntaxin-1蛋白在精原细胞、初级精母细胞和次级精母细胞中定位于细胞膜上,而在成熟精子中定位于细胞核上。综合免疫荧光与免疫组化结果,可推测syntaxin-1蛋白主要在精子发生后期发挥作用,其功能主要在于完成精子顶体反应,且在形成成熟精子后SNARE复合体解体,syntaxin-1蛋白转移入核。
陈志英[3]（2021）在《他克林对冻融猪精子的保护作用及机制研究》文中进行了进一步梳理猪精子对温度极其敏感,在冷冻解冻过程中易于应激损伤,导致在生产中使用冷冻精液进行人工授精时产仔率比常规液态保存精液低20～30%。研究发现将0.10 mmol/L他克林加入猪精液冷冻稀释液中可以显着地提高猪精子的冻后质量,其对猪精液常温及低温保存也具有积极作用,说明稀释液中他克林能够延长精子的寿命从而显着地改善猪精子的保存效果。但有关他克林对猪精液保护作用的机制未有相关研究报道。因此,作者在已有研究基础上选取浓度为0.10 mmol/L他克林开展试验,以杜洛克公猪为研究对象,探究他克林对冻融猪精子生物学特性的影响,并评价保护作用的机制,为促进猪精子冷冻保存提供参考资料。具体研究内容及结果下:1.他克林对猪精子冻后表观指标的影响。在猪精子冷冻稀释液中添加浓度0.10 mmol/L的他克林,冷冻后检测精子表观指标（活率、顶体完整率、质膜完整性、畸形率、DNA完整性、线粒体膜电位）。结果提示:与鲜精相比,冻融后精子活率、质膜完整率、顶体完整率、线粒体膜电位、DNA完整性均极显着下降,畸形率极显着升高（P<0.01）。与冷冻组相比,他克林显着提高冻后精子顶体完整率、DNA完整率（P<0.05）,极显着提高精子活率、质膜完整率、线粒体膜电位,极显着降低畸形率（P<0.01）。结论:他克林能够提高猪精子的冻后质量。2.他克林抑制冻融猪精子凋亡的作用评价。试剂盒检测猪精子Ach E活性和Ach含量;Western blot检测各组精子内Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9蛋白表达含量;RT-PCR检测他克林对精子Bcl-2、Caspase-8、Hsp70基因m RNA表达的影响。结果提示:与鲜精组比较,冷冻组Ach E活性、Ach含量极显着增高（P<0.01）,与冷冻组比较,他克林极显着降低冻融猪精子Ach E活性和Ach含量（P<0.01）。与鲜精组相比,冷冻组凋亡基因Caspase-8和凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-9表达量极显着升高,凋亡基因Bcl-2、Hsp70和凋亡蛋白Bcl-2表达量极显着降低（P<0.01）。冷冻试验组较冷冻组Caspase-8基因（P<0.01）和凋亡蛋白Caspase-3（P<0.01）、Caspase-9（P<0.05）表达显着降低,Bcl-2、Hsp70基因（P<0.01）和Bcl-2蛋白（P<0.05）表达量显着升高。结论:冷冻导致精子凋亡,他克林能够抑制冻融过程中猪精子凋亡。3.他克林对冻融猪精子抗氧化能力的影响。RT-PCR检测他克林对冻融精子SOD、CAT、GPX基因m RNA表达的影响,试剂盒检测他克林对冻融精子T-AOC、SOD、MDA、ROS的影响。结果提示:（1）与鲜精组相比,冻融后精子GPx、CAT、SOD基因m RNA表达量均极显着下降（P<0.01）。与冷冻组相比,他克林极显着提高冻后精子GPx、CAT、SOD基因m RNA表达量（P<0.01）;（2）与鲜精组相比,冻融后精子SOD、T-AOC含量均极显着下降,ROS、MDA极显着上升（P<0.01）。与冷冻组相比,他克林极显着提高冻后精子T-AOC,极显着降低MDA和ROS水平（P<0.01）,显着提高SOD活性（P<0.05）。结论:他克林可以显着改善冻融猪精子的抗氧化能力。4.他克林对冻融猪精子糖代谢水平的影响。试剂盒检测他克林对冻融精子TC、HK、PA和乳酸含量的影响,荧光酶标仪检测Ca2+含量,酶联免疫法检测冻融精子中PKA、PKG和AKT活性。结果提示:（1）与鲜精组相比,两个冷冻组中TC、HK、PA、乳酸和Ca2+含量极显着降低（P<0.01）。冷冻试验组比冷冻组TC、PA、乳酸和Ca2+含量极显着增加（P<0.01）,HK含量显着增加（P<0.05）。（2）鲜精组PKA、PKG和AKT活性极显着高于冷冻组（P<0.01）,冷冻试验组中PKA、AKT活性极显着高于冷冻组（P<0.01）,PKG活性与冷冻组无显着差异（P>0.05）。结论:他克林可以增加精子对葡萄糖的利用从而促进其能量代谢。总之,在猪精子冷冻稀释液中添加他克林对猪精子的冻后质量产生积极的影响,其可能机制是他克林可以减少精子的凋亡、提高精子抗氧化能力和对葡萄糖的利用效率。试验为进一步研究他克林对精子的保护机理提供了理论基础。
袁文博[4]（2021）在《低剂量双酚A致男（雄）性生殖损伤及TET1在其中的作用及机制研究》文中认为背景研究发现动物和人类接触BPA对生殖系统都有许多不良影响。课题组前期已经证实BPA暴露可引起小鼠GC-2细胞总甲基化水平升高。TET1作为一种非常重要的去甲基化酶,与多种生物学过程密切相关。结合最新文献报道,我们推测TET1可能通过调控下游关键分子DNA去甲基化/甲基化的动态平衡参与BPA暴露致小鼠生殖损伤,其具体机制有待深入研究。本研究采用小鼠生殖系统相关的三种细胞探索在BPA暴露致雄性生殖细胞损伤过程中TET1介导下游调控通路关键分子的表观遗传调控作用及其具体机制,将为从表观遗传角度寻找雄性生殖损伤更为敏感的分子标志物提供新思路。目的1.基于CTD数据库筛选BPA毒性相关基因,探索可能的作用通路。2.探索TET1在低剂量BPA致男（雄）性生殖损伤中的作用及调控机制。方法1.使用CTD数据库筛选BPA毒性有关的基因,进行富集分析。2.采用终浓度为0μM、20μM、40μM、80μM的BPA处理小鼠GC-2细胞、TM3细胞、TM4细胞72h,采用CCK-8法检测细胞存活率。3.采用激光共聚焦显微镜观察BPA对GC-2细胞内钙离子浓度的影响,采用qRT-PCR和Western blot技术检测染毒后分子的表达水平。4.建立TET1基因过表达/干扰GC-2细胞模型,流式细胞仪检测细胞凋亡、细胞周期以及细胞内钙离子水平的变化。5.采用hMeDIP、MeDIP检测TET1基因过表达/干扰后分子的（羟）甲基化水平。6.运用SPSS25.0对TET1基因表达量与人群精液质量参数进行相关性分析。结果1.GO功能富集分析结果发现富集的基因参与生殖系统发育、生殖结构发育等分子生物过程,这些基因涉及HIF-1、PI3K-AKT等信号通路（P<0.01）。2.BPA染毒GC-2细胞,PI3K和JAK的mRNA表达水平显着下调,P53、BCL2则显着上调,PI3K、BCL2的蛋白水平显着下降,而P53显着上升（P<0.05）;BPA染毒TM3细胞,PI3K、HIF1-αmRNA表达水平显着下调,BCL2、BAX的mRNA表达水平显着上调（P<0.05）;BPA染毒TM4细胞,P53 mRNA表达水平显着下调,HIF1-α、P300/CBP、BAX mRNA表达水平均显着下调（P<0.05）。3.TET1基因及Catsper钙离子信号通路关键分子的表达水平在低剂量BPA致小鼠生殖系统细胞损伤中显着下调:（1）随着染毒剂量增大,三种细胞存活率均明显下降（P<0.001）。（2）GC-2、TM3细胞染毒72h后TET1的表达水平显着下调;而TM4细胞染毒TET1的表达水平上调尤为显着（P<0.05）。（3）随着BPA染毒剂量的增大,GC-2细胞内钙离子水平显着下降（P<0.01）,Catsper1-4的mRNA以及蛋白表达水平均呈现下降趋势。4.TET1通过促进细胞增殖、升高钙离子浓度参与BPA致小鼠生殖损伤过程:（1）TET1基因过表达后,GC-2细胞的增殖速率明显上升（P<0.001）。（2）与对照组相比,TET1过表达组中细胞凋亡受到抑制（P<0.001）。（3）TET1过表达组中,细胞内Ca2+显着上升（P<0.001）,Catsper1-4的表达水平也显着上升（P<0.05）;TET1干扰组中,Ca2+水平显着下调（P<0.001）,Catsper-4的表达水平也显着降低（P<0.05）。5.TET1基因通过羟甲基化修饰参与低剂量BPA致小鼠生殖系统细胞损伤过程:（1）TET1基因过表达后,Catsper1和Catsper3发生羟甲基化变化;TET1基因低表达后,Catsper2和Catsper4的甲基化水平改变（P<0.05）。（2）80μM BPA染毒组中,TET1基因过表达组细胞相对增长速度较对照组高（P<0.05）,TET1基因干扰组细胞相对增长速度较对照组低（P<0.01）。6.TET1基因表达量与人群精液质量参数相关性分析:（1）精子中Catsper1-4表达水平与TET1基因表达水平呈正相关关系（P<0.01）。（2）前向运动比例合格组的精子浓度、快速前向运动比例、精子总活力等精液参数均明显升高（P<0.05）,而静止精子明显下降（P<0.001）。结论1.不同剂量BPA暴露导致GC-2、TM3、TM4细胞出现不同程度的损伤,PI3K-AKT信号通路可能在该过程中发挥重要作用。2.低剂量BPA暴露后可导致GC-2细胞凋亡,细胞内钙离子水平下降,Catsper1-4表达水平显着下调。3.首次发现TET1基因通过其羟基化修饰调控Catsper钙离子信号通路相关分子的表达影响钙离子水平,从而参与低剂量BPA致雄性生殖毒性发生过程。
苑洋洋[5]（2020）在《精子特异性离子通道的生理与毒理作用研究》文中提出离子通道调节胞内钙离子浓度和膜电位,并调控多种细胞的生理功能。精子是一种特殊的细胞,从男性生殖道射出的精子只有经历获能、超活化、顶体反应等生理变化才能具备受精卵子的能力。而男性生殖道和女性生殖道的离子浓度、渗透压、酸碱度存在差异,精子适应上述新环境必须要有离子通道的参与,其中Cat Sper和KSper作为精子特异性的离子通道,在精子成功受精卵子过程中起到至关重要的作用。钙通道Cat Sper的激活介导Ca2+内流,从而细胞胞内Ca2+([Ca2+]i)浓度的增加诱导随后的获能、超活化、顶体反应等利于精子成功受精。已有报道,Cat Sper易于响应外界的刺激,一些内分泌干扰物通过作用Cat Sper扰乱精子的功能,而全氟辛酸（PFOA）作为主要的环境污染物,其对雄性动物生殖有某种程度的损伤作用,但PFOA对人成熟精子的影响及机制还未被报道。另外,通过什么方式预防和缓解PFOA诱导的生殖毒性也还没被报道。众所周知,槲皮素（Que）是一种具有抗炎症、增强免疫、抗氧化等多种生物学效应的天然物质,被选用缓解PFOA毒性的研究。小鼠精子钾通道KSper是由主亚基Slo3介导,Slo3通道响应胞内p H碱化开放,K+外流从而控制膜电位的超级化。已有报道,Slo3-/-小鼠的精子质膜不能进行超级化而是去极化,并且在精卵结合必要的获能条件下,精子运动异常、精子尾部类似于“发卡结构”,未进行顶体反应,更严重的后果是雄性小鼠不育。KSper在成熟精子被研究的很充分,但其是否在精子发生中发挥作用还没被报道。精子发生分为三个阶段:有丝分裂、减数分裂和精子的形成,整个过程生精细胞的种类主要分为:精原细胞、初级精母细胞（细线期、偶线期、粗线期和双线期精母细胞）、精子细胞（圆形精子和长形精子）。如果KSper在生精细胞中发挥作用,又是哪一个时期呢?由KSper异常引起的小鼠精子不育,是否可以由精子发生正常的生精细胞体外培养来弥补。实验目的:（1）离子通道Cat Sper是否是PFOA毒性的靶点和参与机制;（2）天然物质预防和缓解PFOA引起的生殖毒性;（3）KSper在精子发生中有什么作用。实验方法:（1）穿透人工粘性介质和顶体反应检测技术评价PFOA对人精子功能的影响;（2）钙信号的测定技术评价PFOA毒性作用的靶点是否和Cat Sper有关;（3）活性氧产生检测的技术评价是否参与PFOA扰乱人精子的功能;（4）苏木精-伊红染色染色法用于观察小鼠睾丸组织病理学和附睾精子数的变化,评定PFOA对睾丸的毒性及Que的营救作用;（5）实时荧光定量核酸扩增法结合氧化应激产物和抗氧化酶的定量评定氧化应激的程度;（6）免疫印迹法检测细胞凋亡是否参与PFOA的毒性作用;（7）流式细胞仪检测法:分离不同阶段的生精细胞,并用GFP荧光小鼠验证分离的结果。并观察Slo3+/+、Slo3+/-和Slo3-/-小鼠生精细胞的Slo3表达量、精子的膜电位变化以及Slo3表达量高的细胞对胞内碱化的膜电位变化;（8）免疫荧光法用于观察Slo3在生精细胞中的表达及定位;（9）膜片钳实验技术:记录PFOA及PFOA和孕酮（P4）联合灌流下Cat Sper的电流;在p H 6.0和胞内碱化条件下,记录粗线期精原细胞和圆形精子Slo3的电流,并检测p H 8.0两种细胞的Slo3电流。结果:（1）高剂量PFOA（25μg/ml）单独暴露导致人精子穿透人工合成黏液的能力下降,以及其4 h的连续孵育增加活性氧（ROS）的产生;（2）PFOA暴露剂量依赖性激活人精子Cat Sper,介导细胞外的Ca2+内流,从而[Ca2+]i浓度升高。然而,人精子预处理PFOA（2.5-25μg/ml）显着抑制P4诱导的细胞外Ca2+内流;（3）PFOA（0.25-25μg/ml）预处理明显阻碍了P4诱导精子的顶体反应和穿透粘稠介质的能力。与单独PFOA暴露的小鼠相比,Que的补充（4）减少由PFOA诱导的组织学变化,包括:生精上皮细胞排列不规则,管腔中精子数减少,精原细胞的消失和生殖细胞的脱落;改善由PFOA引起的小鼠睾丸绝对重量和附睾精子数;（5）上调睾丸转录因子NRF2及其下游靶点抗氧化基因:超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和血红素加氧酶-1（Ho-1）的表达,同时也增加了抗氧化酶SOD和CAT的活性,降低氧化产物丙二醛（MDA）的生成;（6）增强了抗凋亡蛋白BCL-2的表达,相反降低了促凋亡蛋白p53和BAX的表达;（7）Slo3+/+小鼠中,精原细胞中几乎没有Slo3的表达,初级精母细胞有高水平的Slo3表达,减数第二次分裂（MII）Slo3表达量最高,而随后的精子细胞Slo3的表达量下降;与Slo3+/+生精细胞Slo3的表达相比较,（8）Slo3-/-小鼠生精细胞中几乎无Slo3蛋白的表达,而Slo3+/-生精细胞后期（双线期、MII、和精子细胞）Slo3的表达量会下降;（9）NH4Cl可以使MII细胞胞内碱化,膜电位发生超级化;而NH4Cl使粗线期精母细胞微微碱化,膜电位发生去极化;（10）Slo3蛋白定位到粗线期精母细胞的细胞质和细胞膜上;（11）胞内溶液在p H 6.0下,不能记录到粗线期精母细胞的Slo3电流,并且不响应NH4Cl。在该条件下,能记录到圆形精子微小的Slo3电流,部分可以响应胞内的碱化。而胞内溶液在p H 8.0下,同样不能记录到粗线期精母细胞的Slo3电流,能记录到圆形细胞微小的Slo3电流。结论:（1）Cat Sper是PFOA的作用靶点,PFOA可能通过诱导氧化应激以及扰乱P4诱导的Ca2+信号影响人精子功能,而Que可以通过减轻氧化应激和抑制细胞凋亡,来改善PFOA暴露引起的雄性生殖毒性;（2）KSper在第二次减数分裂后期发挥作用。
李作臣[6]（2020）在《延边黄牛精子蛋白组学鉴定及蛋白通路分析》文中提出精子获能是受精前的一个过程,对于产生高质量的活胚胎至关重要。虽然在理解精子获能过程中的信号通路方面已经取得了很大的进展,但构成这些过程的分子基础仍有待阐明。受精前的许多过程,例如精子获能,是蛋白质依赖性的,通过这种方式,蛋白质的翻译后修饰在获能机制中起着关键作用。同时已经表明,在获能期间,精子可以取代降解的蛋白质或合成新的蛋白质,这对于获能和受精过程都是必不可少的。蛋白质组学已应用于哺乳动物精子获能的研究,其分子机制已从人类和公牛等物种中得到阐明。质谱分析是蛋白质组学中应用的一项综合技术,它可以用来阐明细胞中的蛋白质水平及其组成。因此,本研究通过采取延边黄牛种公牛精液进行体外获能和非获能比较,利用蛋白组学分析两组蛋白的表达差异。本试验从20头中选择3头3-5岁、健康无疾病的延边黄牛,取其精液,编号分别为A、B、C,设置获能和非获能两个处理组。试验主要分为两个部分进行:第一部分主要对延边黄牛获能精子生理生化特征变化进行研究,具体为通过微生物动（静）态图像检测系统（CASA）,检测牛精子的生物学特性;采用考马斯亮蓝染色法和低渗肿胀法检测精子质膜和顶体膜的完整性;提取两个处理组样品的精子蛋白,进行SDS PAGE和Western Blot用于磷酸化分析:通过JC-1染色,检测精子获能前后线粒体膜电位的变化;通过流式细胞仪（BDaccuri C6）,检测精子细胞凋亡和质膜膜脂质紊乱情况;以及观察获能精子与牛卵母细胞的体外受精及发育。第二部分主要是对获能和非获能精子的蛋白质组进行鉴定和蛋白通路的分析。具体为提取获能和非获能处理组的精子蛋白,进行SDS PAGE和Western Blot用于质谱分析,本试验选用的是液相色谱-质谱分析（LC-MS）;通过GO富集、KEGG Pathway富集、蛋白间相互作用（PPI）进行生物信息的分析。试验结果如下:1.经微生物动（静）态图像检测系统（CASA）检测,延边黄牛获能精子的活率、质膜和顶体膜完整性以及线粒体膜电位水平均低于非获能处理组;2.经微生物动（静）态图像检测系统（CASA）和Western Blot检测,延边黄牛获能精子的曲线速度、蛋白酪氨酸磷酸化水平高于非获能精子;3.经流式细胞仪（BDaccuri C6）检测,延边黄牛获能精子的凋亡及膜脂质紊乱程度大于非获能精子;4.延边黄牛精子获能后与卵母细胞进行体外培养,卵裂率可达到46%以上;5.与未获能精子相比,获能精子中89个蛋白表达上调,509个蛋白表达下调;6.经Western Blot分析,获能精子组（H）PSMD1和HSPA5的表达水平明显低于未获能精子组（F）。本试验利用蛋白组学分析了延边黄牛体外获能和非获能精子的蛋白表达差异,发现在精子获能过程中有89种蛋白表达量上调,509种蛋白表达量下调,用Western Blot检测PSMD1蛋白和HSPA5蛋白的表达水平,观察到获能后,PSMD1和HSPA5的表达量均下调。我们发现的精子获能过程中这些关键蛋白的变化,有助于筛选影响精子获能的关键蛋白,增强了我们对延边黄牛精子获能的一些分子过程的理解,对深入了解精子发生调控机制有参考价值,并为进一步研究这一过程提供了框架。
乔燕[7]（2020）在《SPACA3与SPACA1、PDIA3及CRISP2之间的相互作用鉴定》文中提出受精是哺乳动物有性生殖的基本过程,精卵融合是受精过程的关键步骤,它是由多个分子共同参与并协助完成的过程。研究发现,哺乳动物的精卵融合除了必需有精子的IZUMO1与卵子的JUNO相互作用外,还需要PDIA3、CRISP2、SPACA3以及SPACA1等多种其他精子或卵子上的蛋白相互作用。本研究用酵母双杂交和免疫共沉淀技术在分子水平上鉴定了大鼠SPACA1与SPACA3之间的相互作用。并利用间接免疫荧光技术对SPACA1与SPACA3、PDIA3与SPACA3、PDIA3与CRISP2在大鼠和绵羊精子上进行共定位。为全面理解精卵融合的分子机制提供了新的资料。首先,我们克隆了大鼠spaca1和spaca3的cDNA及绵羊pdia3、crisp2和spaca3的cDNA,构建pGBK-spaca1与pGAD-spaca3酵母表达载体和pCMV-C-HA-spaca1与pCMV-C-Flag-spaca3真核表达载体,分别用酵母双杂交和免疫共沉淀的实验方法鉴定发现SPACA1与SPACA3之间存在相互作用。鉴定蛋白的细胞和亚细胞定位需要抗体。为了制备大鼠SPACA1和SPACA3以及绵羊PDIA3、CRISP2和SPACA3的抗体,我们构建了大鼠pET-28a-spaca1、pET-28a-spaca3、绵羊pGEX-pdia3、pGEX-crisp2和pGEX-spaca3原核表达载体,分别转入E.coli BL21（DE3）细胞中诱导表达,得到了SPACA1-HIS、SPACA3-HIS、PDIA3-GST、CRISP2-GST和SPACA3-GST重组融合蛋白。用SPACA3-HIS、PDIA3-GST免疫家兔、SPACA1-HIS、CRISP2-GST、SPACA3-GST免疫小鼠,得到了兔抗大鼠SPACA3、兔抗绵羊PDIA3血清和小鼠抗大鼠SPACA1、小鼠抗绵羊CRISP2、小鼠抗绵羊SPACA3腹水多克隆抗体。然后,以自制兔抗大鼠SPACA3血清和小鼠抗大鼠SPACA1腹水多克隆抗体为一抗,鉴定了SPACA1和SPACA3在大鼠睾丸组织和精子上的定位。结果显示:SPACA1存在于精子细胞和睾丸曲细精管中成熟精子上,在支持细胞和间质细胞中均不表达;SPACA3表达于大鼠睾丸组织的间质细胞、精原细胞和精母细胞中,主要存在于成熟精子中。精子发生顶体反应后,SPACA1与SPACA3能共定位于精子头部赤道段。以自制兔抗绵羊PDIA3血清、小鼠抗绵羊CRISP2和小鼠抗绵羊SPACA3腹水多克隆抗体为一抗,鉴定了PDIA3、CRISP2以及SPACA3在绵羊精子上的共定位。结果显示:Ca2+诱导的精子顶体反应发生后,SPACA3与PDIA3共定位于精子头部的赤道段,而PDIA3与CRISP2不存在共定位。论文结果说明,精子溶酶体相关蛋白SPACA3与SPACA1和PDIA3在精子顶体反应后发生相互作用,共同参与精子与卵子结合或融合过程,而CRISP2与PDIA3可能独立参与精卵结合或融合过程,二者的相互作用不发生在精子上,可能发生在细胞生物学的其他过程中。
王涛[8]（2020）在《人精子特异性阳离子通道CatSper调控机制研究》文中指出早在上个世纪50年代,Austin和Chang就各自发现,生殖道内的迁移过程对哺乳动物成熟精子获得最终使卵子受精的能力至关重要,这种现象也被Austin形象地命名为获能。时至今日,随着对获能过程中精子生理功能调控机制研究的不断深入,胞内自由钙离子（[Ca2+]i）作为细胞内最重要的第二信使之一,被证实在超活化运动、顶体反应、穿透卵子能力等精子关键功能的调节过程中发挥着不可替代的作用。在许多物种中,精子特异性阳离子通道 CatSper（cationchannel of sperm）介导的胞外 Ca2+内流是[Ca2+]i升高的主要途径。哺乳动物CatSper通道复合体由四个成孔亚基（CatSper 1,2,3,4）以及至少六个辅助亚基（CatSper β,γ,δ,ε,ζ,以及Efcab9）共同组成,任一亚基的功能缺陷都将直接导致雄性生育力减低,甚至完全不育。在生理条件下,CatSper本质上主要受细胞内pH（pHi）、细胞膜电位（Em）控制。除此之外,人精子CatSper还可受生殖道内多种类固醇、前列腺素类生理激素共同调节。因此,在获能过程中,人精子CatSper发挥着化学感受器的作用,通过将胞外微环境中复杂的化学信号转化为胞内Ca2+信号,以保障受精过程的顺利实现。然而,目前有关CatSper的具体调控机制在很大程度上仍是个未知数。与CatSper介导的Ca2+信号相辅相成,胞内cAMP是调节精子获能的另一个重要因素。在哺乳动物精子内,胞内cAMP含量主要受其合成酶——可溶性腺苷酸环化酶（sAC）,及其降解酶——磷酸二酯酶（PDEs）共同控制。精子在生殖道内一旦遇到高浓度的HCO3-后,便可迅速激活sAC活性以提高胞内cAMP浓度,从而启动cAMP及其下游蛋白激酶A（PKA）、鸟苷酸转化因子（EPAC）等信号通路。与此同时,PDEs对cAMP的降解作用则可以避免cAMP浓度过度升高,并在合适的时候终止cAMP信号。cAMP信号通路的激活将导致精子重要蛋白发生磷酸化及其他功能改变,这也被视作精子获能与否的重要指标。尽管cAMP信号和CatSper介导的Ca2+信号对精子功能的重要性毋庸置疑,但他们之间的内在联系却饱受争议,尤其是在CatSper是否受胞内cAMP信号控制这一关键问题上。目前,越来越多的证据表明,cAMP透膜性类似物,8-Bromo-cAMP,不仅可以有效模拟精子胞内cAMP功能,还能激活人和小鼠CatSper,从而导致精子[Ca2+]i升高。从表面上来看,这一事实似乎更支持CatSper受cAMP信号控制这一观点。然而,来自不同团队的大量研究结果却显示,无论是利用HCO3-促进cAMP合成还是通过PDEs抑制剂抑制cAMP降解,甚至是在sAC转基因小鼠中利用光遗传手段人为地控制精子cAMP含量,都无法影响CatSper活性和[Ca2+]i。此外,CatSper的激活过程也不伴随胞内cAMP含量的增加。这些证据都暗示着,CatSper并不受cAMP信号控制。但是,争议到此并没有解决,我们仍然注意到有少量研究却指出,HCO3-可以引起人和小鼠精子[Ca2+]i增加。尤其在小鼠精子中,8-Bromo-cAMP和HCO3-诱导的[Ca2+]i可被PKA抑制剂所阻断。根据这些新颖的发现,CatSper受cAMP/PKA信号控制这一曾经看似可信的观点又被重新提出,至少是在小鼠精子中。由此可见,有关CatSper通道与细胞内cAMP信号的功能联系目前仍未有一个清晰的定论。此外,在研究人精子CatSper是否还受其他信号通路调控时,一种由G蛋白耦联受体CCR6介导的信号通路吸引了我们的兴趣。CCR6最初发现于免疫细胞,可通过与免疫因子,如巨噬细胞炎性蛋白3α（MIP-3α/CCL20）以及多种具有抑菌活性的β防御素（DEFB1/2）结合后,启动免疫应答反应。最新研究表明,CCR6同样表达于哺乳动物成熟精子中,而生殖道内也确定存在多种CCR6的配体物质。其中,由生殖道上皮细胞分泌的人β防御素1（DEFB1）,现已被证明可以通过CCR6结合于人精子表面,不仅可以改善精子抗菌活性,而且还能促使精子[Ca2+]i增加,从而在精子运动能力调节过程中发挥重要作用。考虑到CatSper与[Ca2+]i的密切关系,我们猜测DEFB1/CCR6信号通路很有可能是潜在的CatSper调控因素。本研究中,为了深入阐明CatSper与细胞内cAMP信号以及DEFB1/CCR6的关系,我们在健康男性捐献者的精子以及由CATSPER2基因缺失导致的不育患者精子中,主要利用精子全细胞膜片钳技术、离子（Ca2+、H+）敏感荧光测定等技术,系统地研究了 HCO3-、cAMP及其多种透膜性类似物、多种cAMP效应分子（PKA、EPAC）抑制剂对人精子CatSper功能及[Ca2+]i的影响。另一方面,作为合作课题,我们还与香港中文大学陈小章教授团队一起,共同研究了 DEFB1/CCR6复合物对人精子CatSper的潜在激活作用。我们的研究结果显示,人精子CatSper并不受胞内cAMP和（或）PKA信号控制。但cAMP及其透膜性类似物在极高的非生理浓度下,可以通过细胞外环核苷酸结合位点激活CatSper。此外,我们还发现,常用的PKA抑制剂、EPAC抑制剂等药理学工具虽然可以影响CatSper活性,但这些效应的产生并不依赖于胞内信号途径。因此,我们推论,CatSper受cAMP信号控制这一结论,主要是基于干扰cAMP信号药理学工具的非特定效应做出的不准确判断。与此同时,我们还发现,同类固醇、前列腺素等生理激素类似,生殖到内存在的DEFB1也可以激活人精子CatSper。这一激活效应的实现依赖于精子膜表面的趋化因子受体CCR6。总的来说,我们的研究解决了本领域内存在的诸多争议性问题,为将来CatSper生理调控机制的进一步研究做出了重要的铺垫。
张伟伟[9]（2020）在《SLO家族在中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）精子发生过程中的表达及功能》文中研究说明精子是在睾丸曲细精管内完成,属于非常复杂的细胞分裂分化过程,为了使这一过程有条不紊的完成,需要曲细精管的内外信号、膜蛋白等对这一发生过程进行严格有序的调控。目前认为精子形成可能与生殖细胞电位的改变密切相关。精子为了获得受精能力需要完成以下几个步骤:附睾成熟、精子获能、超活化、趋向性,最后是精子的顶体反应。这些生理过程与细胞内外离子浓度变化有关。离子通道在精子形成过程中可以调节其内外的渗透压平衡,可以通过改变膜电位的变化推进精子的各种生理过程;受精过程中,精子外部环境会有很大的改变,离子通道就起了至关重要的作用,因此离子通道蛋白的表达、以及其功能的改变都会影响有性生殖物种雄性配子的发育以及受精能力。中华绒螯蟹（学名:Eriocheir sinensis）的生活史比较复杂,其受精过程有别于其它物种,其个体的生活环境与其它物种也有很大的不同。中华绒螯蟹有一个非常重要的生理现象,即生殖洄游。淡水的离子浓度与海水的离子浓度有很大的不同,因此中华绒螯蟹在生殖迁移过程中经历了很强的离子浓度的变化。由此可见,离子浓度变化对中华绒螯蟹生殖发育起着不可或缺的作用。钾通道为目前为止种类和亚型最多的离子通道。有报道称钾离子通道对精子的形成过程以及受精过程都有调节作用,SLO家族是钾通道一类非常特殊的通道,这类通道不仅具有电压依赖性,还对其它因素如Ca2+、Na+、Cl-、pH等具有敏感性。本文以中华绒螯蟹生精细胞为实验材料,采用Western blot、免疫组化、免疫荧光、PCR、基因克隆等技术对SLO家族蛋白进行组织及细胞定位和序列分析;用全细胞膜片钳技术分析生精细胞SLO通道的电生理特性和表达情况。结果如下:1、通过Western blot确定了SLO1存在于中华绒螯蟹精巢以及其它组织内,但是储精囊内的精子SLO1表达较少。SLO2在精巢的生精细胞和储精囊内的精子均有表达,但表达出现了差异性。2、对编码SLO1蛋白的基因克隆,并将测序的结果进行分析,发现slo1 cDNA序列与其它物种有相似性较高,说明其保守性较强,且与拟穴青蟹的slo1最相近;克隆slo2.2的cDNA序列与其它物种虽有相似性,但是其保守性不是很高,与小鼠和和人类有很大的差异性,且与北黄道蟹（Cancer borealis）的slo2.2最相近,关系最为密切。（3）采用全细胞膜片钳技术记录SLO1介导的钙激活钾通道和SLO2介导的钠激活钾通道:结果表明中华绒螯蟹生精细胞的钾电流包含钙激活钾电流。随后加入不同的阻断剂IbTX、CdCl2观察该电流,发现这些阻断剂均可以将钾电流进行阻断,根据阻断的结果分析SLO1蛋白主要表达于精原细胞和精母细胞,这与前期的SLO1蛋白的免疫定位结果一致;SLO2介导的钠激活钾通道也存在于中华绒螯蟹的生精细胞内,但是生精细胞对钠离子的依赖性不同,精子对钠离子的依赖性较强,而精原细胞、精母细胞、精细胞对钠离子的依赖性较弱,说明SLO2在生精细胞的表达存在差异性。（4）观察SLO家族通道对精子的顶体反应的影响,发现钾通道不仅与精子的形成有关,而且还间接调节精子的顶体反应,SLO1与顶体反应相关,其不同抑制剂对顶体反应有不同的抑制作用;采用含不同浓度的钠离子作用于中华绒螯蟹的精子观察其顶体反应,发现钠离子和顶体反应没有直接的关系,这也间接说明SLO2的作用可能更多在精子能动性以及获能上面。综上所述,中华绒螯蟹生精细胞内既有SLO1介导的钙激活钾电流,也有SLO2介导的钠激活钾电流。前者随着精子的形成分布越来越少;后者表现出精子对钠离子的敏感性与其它生精细胞不同,需要更高钠离子浓度才能激活,这与中华绒螯蟹生殖洄游环境密切相关。通过顶体反应诱导率实验发现,SLO1不仅与精子的形成有关,而且还间接调节精子的顶体反应,SLO1通道的关闭导致顶体反应的降低。SLO2的作用可能更多在精子能动性以及获能上面,需进一步试验进行验证。
袁航[10]（2020）在《中华绒螯蟹精子获能的生理生化特征》文中研究表明中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）属于甲壳纲、十足目、短尾类,俗称河蟹。其精子与哺乳动物精子比较,有很大区别,具有无鞭毛、不运动、非浓缩核等特征。哺乳动物精子在受精前首先需要获能,才能完成受精。那么在中华绒螯蟹精子是否具有获能的过程?中华绒螯蟹精子在完成受精前,精子分别在储精囊精荚中、交配后暂存于纳精囊、排卵时精子附着于卵子上,处于被卵子表面基质包被的状态,之后通过顶体反应完成受精作用。本研究以中华绒螯蟹在完成受精前不同时期的精子为研究对象,对精子的理化性质进行了探究,通过提取的纳精囊分泌物,卵水来刺激储精囊内的成熟精子,探究成熟精子在受精之前的生理生化变化,进而认识其获能特征。首先使用金霉素对不同处理的精子进行荧光染色,结果表明储精囊精子在进入纳精囊后,顶体内膜上的钙离子会在顶体管内膜发生聚集。表明纳精囊仍有生理特征变化;同时还对不同处理的精子细胞内部的pH值的变化做了检测,结果显示:储精囊精子细胞的内环境为中性,经过纳精囊分泌物处理后变为酸性,经过卵水处理后变为碱性。对不同处理的精子进行钙离子载体A23187诱导顶体反应的试验,结果显示,经过纳精囊分泌物处理的精子,其顶体反应能力下降,表明酸性的精子细胞内环境会抑制河蟹精子的顶体反应。胆固醇/磷脂数据的降低会提高膜的流动性,对对精子膜和卵膜的的融合具有促进作用,提高精卵融合效率。对不同处理的精子细胞总胆固醇含量的验证,结果显示,河蟹成熟精子在经过储精囊、纳精囊、卵水的过程中,精子总胆固醇含量逐渐降低。显示出胆固醇从精子流向外环境,使得精子本身的胆固醇含量降低。对不同精子样品的酪氨酸磷酸化蛋白进行了western blot验证,结果表明,成熟精子在经过纳精囊分泌物与卵水处理后其酪氨酸磷酸化的蛋白有不同分子量上的变化,再对样品进行免疫荧光检测,结果显示酪氨酸磷酸化蛋白的聚集位置发生了变化,在成熟精子中仅有顶体囊膜上显示显示酪氨酸磷酸化,处理后则在顶体管处也显示酪氨酸磷酸化。表明酪氨酸磷酸化在获能过程中有重要作用;通过免疫沉淀（IP Co-Immunoprecipitation）对酪氨酸磷酸化蛋白进行了富集,对富集的蛋白进行液相质谱串联（LC-MS/MS）分析,结果鉴定到储精囊精子中有酪氨酸磷酸化蛋白236种,纳精囊精子中204种,纳精囊分泌物处理的储精囊精子有222种。从分子角度确定了在河蟹精子受精前同样具有胆固醇外流的现象。同时对受精前酪氨酸磷酸化蛋白的功能进行了初步的分类。本研究初步认为中华绒螯蟹精子存在获能过程。
二、豚鼠精子在发生及顶体反应过程中细胞内Ca~(2+)的定位研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、豚鼠精子在发生及顶体反应过程中细胞内Ca~(2+)的定位研究（论文提纲范文）
（1）水牛精浆外泌体蛋白质组的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 精子发生与成熟 |
| 1.1.1 精子结构 |
| 1.1.2 精子的发生 |
| 1.1.3 精子的成熟 |
| 1.2 外泌体的研究背景 |
| 1.2.1 外泌体的发现、定义和组成 |
| 1.2.2 外泌体的生物发生 |
| 1.2.3 外泌体的功能 |
| 1.2.4 外泌体的分离与鉴定 |
| 1.3 外泌体与精子活力 |
| 1.3.1 精浆外泌体 |
| 1.3.2 精浆外泌体在精子成熟过程中的作用 |
| 1.4 蛋白质组学概况 |
| 1.4.1 蛋白质组学研究概况 |
| 1.4.2 蛋白质组学在精浆外泌体中的应用 |
| 1.5 本研究的目的、意义及技术路线 |
| 第二章 水牛精浆外泌体的分离鉴定与蛋白质表达谱的构建 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 精液的处理 |
| 2.1.3 精子和精浆总蛋白的提取 |
| 2.1.4 基于超高速差速离心结合蔗糖垫纯化方法对精浆外泌体的分离和提取 |
| 2.1.5 精浆外泌体蛋白的提取 |
| 2.1.6 BCA法测定蛋白质浓度 |
| 2.1.7 蛋白免疫印迹法检测精浆外泌体的蛋白标志物 |
| 2.1.8 透射电子显微镜(TEM)观察精浆外泌体形态 |
| 2.1.9 纳米颗粒跟踪分析仪(NTA)分析外泌体颗粒尺寸 |
| 2.1.10 蛋白质的还原烷基化和酶切 |
| 2.1.11 反相高效液相色谱(RP-HPLC)预分离 |
| 2.1.12 肽段脱盐 |
| 2.1.13 LC-MS/MS分析 |
| 2.1.14 数据检索与生物信息学分析 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 基于超高速差速离心结合蔗糖垫提取水牛精浆外泌体的鉴定 |
| 2.2.2 水牛精子活力的检测 |
| 2.2.3 精子、精浆和精浆外泌体蛋白质的质谱鉴定结果及Venn分析 |
| 2.2.4 蛋白质的理化性质统计 |
| 2.2.5 高丰度蛋白质分析 |
| 2.2.6 精子、精浆和精浆外泌体的基因本体论(GO)分析 |
| 2.2.7 精浆外泌体中生殖相关蛋白质的挖掘 |
| 2.2.8 精子、精浆和精浆外泌体的信号通路分析 |
| 2.2.9 精浆外泌体蛋白质互作网络(PPI) |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 水牛高低活力精浆外泌体的差异蛋白质组学分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 精液的采集及处理 |
| 3.1.3 水牛精浆外泌体的分离和提取 |
| 3.1.4 水牛精浆外泌体蛋白质的提取与浓度测定 |
| 3.1.5 水牛精浆外泌体的鉴定 |
| 3.1.6 蛋白质的还原烷基化和酶切 |
| 3.1.7 iTRAQ标记 |
| 3.1.8 反相高效液相色谱(RP-HPLC)预分离 |
| 3.1.9 肽段脱盐 |
| 3.1.10 LC-MS/MS分析 |
| 3.1.11 数据检索与生物信息学分析 |
| 3.2 实验结果与分析 |
| 3.2.1 高低活力水牛精液的检测 |
| 3.2.2 质谱鉴定结果及质量控制 |
| 3.2.3 差异表达蛋白质(DEPs)分析 |
| 3.2.4 基因本体论分析 |
| 3.2.5 KEGG通路分析 |
| 3.2.6 差异表达蛋白质的互作网络(PPI)分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 全文结论 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
（2）中华绒螯蟹syntaxin-1蛋白多抗制备及其功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 SNARE蛋白简介 |
| 1.1.1 SNARE蛋白结构及分类 |
| 1.1.2 SNARE蛋白功能——介导囊泡运输 |
| 1.2 SNARE蛋白常见功能简介 |
| 1.2.1 SNARE蛋白与生殖细胞 |
| 1.2.2 SNARE蛋白与顶体反应 |
| 1.2.3 SNARE蛋白与神经递质传递 |
| 1.3 中华绒螯蟹 |
| 1.3.1 中华绒螯蟹精子发生 |
| 1.3.2 中华绒螯蟹顶体反应 |
| 1.4 研究目的及意义 |
| 1.5 创新点 |
| 第二章 中华绒螯蟹syntaxin-1 蛋白基因克隆 |
| 2.1 实验材料与仪器 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 主要试剂与配方 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 syntaxin-1 基因生物信息学分析 |
| 2.2.2 精巢总RNA提取 |
| 2.2.3 紫外分光光度法检测总RNA浓度及纯度 |
| 2.2.4 1%琼脂糖凝胶分离总RNA |
| 2.2.5 精巢总c DNA反转录 |
| 2.2.6 RT-PCR合成syntaxin-1 基因 |
| 2.2.7 1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物 |
| 2.2.8 回收PCR产物 |
| 2.2.9 表达syntaxin-1 基因及测序 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 syntaxin-1 基因生物信息分析结果 |
| 2.3.2 精巢总RNA提取结果 |
| 2.3.3 syntaxin-1 PCR扩增结果 |
| 2.3.4 syntaxin-1 阳性克隆菌液PCR鉴定结果 |
| 2.3.5 Syntaxin-1 基因测序结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 syntaxin-1 蛋白的生物信息学分析 |
| 2.4.2 中华绒螯蟹精巢总RNA提取 |
| 2.4.3 syntaxin-1 基因的PCR扩增 |
| 2.4.4 syntaxin-1 阳性克隆菌液PCR |
| 第三章 中华绒螯蟹syntaxin-1 蛋白的原核表达与纯化 |
| 3.1 实验材料与仪器 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验试剂与配方 |
| 3.1.3 实验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 构建表达载体 |
| 3.2.2 syntaxin-1 蛋白原核表达 |
| 3.2.3 syntaxin-1 蛋白纯化 |
| 3.2.4 纯化蛋白的质谱检测 |
| 3.2.5 BCA法测目的蛋白浓度 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 克隆带双酶切位点syntaxin-1 基因 |
| 3.3.2 syntaxin-1 基因酶切后产物 |
| 3.3.3 p ET-30a表达载体双酶切产物 |
| 3.3.4 重组质粒酶切后产物 |
| 3.3.5 原核表达检测结果 |
| 3.3.6 Syntaxin-1-p ET-30a 表达载体测序结果 |
| 3.3.7 蛋白原核表达结果 |
| 3.3.8 蛋白纯化结果 |
| 3.3.9 质谱一级结构 |
| 3.3.10 质谱二级结构 |
| 3.3.11 BCA法测定syntaxin-1 蛋白浓度结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 构建表达载体 |
| 3.4.2 镍柱纯化目的蛋白 |
| 3.4.3 质谱一级结构分析 |
| 3.4.4 质谱二级结构分析 |
| 3.4.5 BCA法描绘回归曲线 |
| 第四章 中华绒螯蟹syntaxin-1 多克隆抗体制备 |
| 4.1 实验材料与试剂 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 主要试剂及配方 |
| 4.1.3 实验仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 免疫小鼠 |
| 4.2.2 测定小鼠抗血清效价 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 小鼠抗血清效价检测结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 小鼠免疫 |
| 4.4.2 小鼠抗血清效价检测 |
| 第五章 中华绒螯蟹syntaxin-1 蛋白在生精细胞的定位特征 |
| 5.1 实验材料与试剂 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 实验试剂与配方 |
| 5.1.3 实验仪器 |
| 5.2 实验步骤 |
| 5.2.1 制备石蜡切片 |
| 5.2.2 免疫荧光 |
| 5.2.3 免疫组化 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 免疫荧光结果 |
| 5.3.2 免疫组化结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 免疫荧光结果分析 |
| 5.4.2 免疫组化结果分析 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（3）他克林对冻融猪精子的保护作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写索引 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 猪精液冷冻保存研究进展 |
| 1.2.1 猪精液冷冻保存技术简介 |
| 1.2.2 国内外研究现状 |
| 1.3 精子质量检测方法 |
| 1.3.1 精子运动能力 |
| 1.3.2 精子质膜完整性 |
| 1.3.3 精子顶体完整性 |
| 1.3.4 线粒体膜电位 |
| 1.3.5 DNA完整性 |
| 1.4 精子冷冻保存的影响因素 |
| 1.4.1 冻融对精子的影响 |
| 1.4.2 ROS对精子的影响 |
| 1.4.3 糖类物质对精子的影响 |
| 1.4.4 离子物质对精子的影响 |
| 1.5 他克林研究进展 |
| 1.5.1 他克林国内外研究现状 |
| 1.5.2 他克林在猪精子保存中的应用现状 |
| 第二章 他克林对冻融猪精子质量的影响 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 样品采集与分组 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 主要药品与试剂 |
| 2.1.4 溶液配置 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 精液的冷冻与解冻 |
| 2.2.2 精子活率检测 |
| 2.2.3 精子质膜完整性检测 |
| 2.2.4 精子顶体完整率及畸形率检测 |
| 2.2.5 精子DNA损伤率检测 |
| 2.2.6 精子MMP检测 |
| 2.2.7 数据处理 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 他克林对冻融猪精子活率的影响 |
| 2.3.2 他克林对冻融猪精子质膜完整性的影响 |
| 2.3.3 他克林对冻融猪精子顶体完整率和畸形率的影响 |
| 2.3.4 他克林对冻融猪精子DNA损伤率的影响 |
| 2.3.5 他克林对冻融猪精子MMP的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 他克林对冻融猪精子凋亡的影响 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 样品采集与分组 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 试剂配制 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 猪精子AchE活性检测 |
| 3.2.2 猪精子Ach含量检测 |
| 3.2.3 猪精子凋亡蛋白表达检测 |
| 3.2.4 猪精子凋亡基因相对表达量检测 |
| 3.2.5 数据处理 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 他克林对冻融猪精子AchE活性的影响 |
| 3.3.2 他克林对冻融猪精子Ach含量的影响 |
| 3.3.3 他克林对冻融猪精子凋亡蛋白的影响 |
| 3.3.4 他克林对冻融猪精子凋亡基因mRNA相对表达量的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 .小结 |
| 第四章 他克林对冻融猪精子抗氧化的影响 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 样品采集与分组 |
| 4.1.2 主要仪器 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 猪精子T-AOC、SOD检测 |
| 4.2.2 猪精子MDA、ROS检测 |
| 4.2.3 猪精子抗氧化基因表达水平检测 |
| 4.2.4 数据处理 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 他克林对冻融猪精子T-AOC和SOD活性的影响 |
| 4.3.2 他克林对冻融猪精子MDA含量和ROS水平的影响 |
| 4.3.3 他克林对冻融猪精子抗氧化基因mRNA表达的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 他克林对冻融猪精子糖代谢的影响 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 样品采集与分组 |
| 5.1.2 主要仪器 |
| 5.1.3 主要试剂 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 猪精子HK活性、TC和PA含量检测 |
| 5.2.2 猪精子乳酸、Ca~(2+)含量检测 |
| 5.2.3 猪精子中PKA、PKG和AKT的活性检测 |
| 5.2.4 数据处理 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 他克林对冻融猪精子HK活性、TC和PA含量的影响 |
| 5.3.2 他克林对冻融猪精子乳酸、Ca~(2+)含量的影响 |
| 5.3.3 他克林对冻融猪精子PKA、PKG和AKT活性的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（4）低剂量双酚A致男（雄）性生殖损伤及TET1在其中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 第二章 基于CTD数据库-BPA毒性相关基因的生信分析与实验验证 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第三章 TET1 基因在BPA致男(雄)生殖损伤中的功能及机制研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 精子发生过程中的表观遗传修饰 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）精子特异性离子通道的生理与毒理作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 哺乳动物精子发生的过程 |
| 1.1.1 精原细胞的大小及特征 |
| 1.1.2 减数分裂前期精母细胞的大小及特征 |
| 1.1.3 减数分裂后精子细胞的大小及特征 |
| 1.1.4 生精细胞的分选 |
| 1.2 附睾中精子的成熟 |
| 1.3 女性生殖道精子的成熟及成功受精的必备事件 |
| 1.3.1 女性生殖道精子的成熟-获能 |
| 1.3.2 超活化 |
| 1.3.3 顶体反应 |
| 1.3.4 趋化反应 |
| 1.3.5 超极化 |
| 1.4 精子特异性的钙通道CatSper |
| 1.4.1 CatSper通道在精子调控中的作用 |
| 1.4.2 环境内分泌干扰物和CatSper的关系 |
| 1.5 精子特异性的钾通道KSper |
| 1.5.1 人精子KSper |
| 1.5.2 小鼠精子KSper-Slo3 |
| 1.5.3 生精细胞与离子通道的联系 |
| 1.6 环境内分泌干扰物对男性生殖的影响 |
| 1.6.1 全氟辛酸的基本性质 |
| 1.6.2 全氟辛酸对男性生殖的危害 |
| 1.7 研究的意义 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 主要实验试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 主要溶液配方 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 人精液标本的收集与处理 |
| 2.2.2 .实验动物建模 |
| 2.2.3 小鼠生殖细胞的收集与处理 |
| 2.2.4 主要实验方法 |
| 2.2.5 数据统计分析及作图 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 体外不同浓度PFOA孵育对精子功能的影响及机制 |
| 3.1.1 PFOA抑制P4诱导的精子穿透人工粘性介质的能力 |
| 3.1.2 PFOA镇压P4诱导的顶体反应 |
| 3.1.3 PFOA诱导人精子胞外Ca~(2+)内流 |
| 3.1.4 PFOA抑制P4引起的胞外钙离子内流 |
| 3.2 Que恢复PFOA诱导的氧化应激和细胞凋亡 |
| 3.2.1 Que恢复PFOA诱导的小鼠睾丸组织学形态损伤 |
| 3.2.2 Que改善PFOA诱导的睾丸绝对重量和附睾精子数的降低 |
| 3.2.3 Que对 PFOA诱导的过氧化指标和抗氧化酶的影响 |
| 3.2.4 Que对 PFOA诱导的抗氧化调节因子NRF2 的恢复 |
| 3.2.5 Que增加PFOA诱导的抗氧化基因的表达 |
| 3.2.6 25μg/ml PFOA孵育4h增加ROS的产生 |
| 3.2.7 Que保护PFOA诱导的细胞凋亡 |
| 3.3 KSper在小鼠生精细胞中的表达、作用及定位 |
| 3.3.1 生精细胞的分离及验证 |
| 3.3.2 生精细胞群Slo3蛋白的表达 |
| 3.3.3 Slo~(3-/-)鼠验证生精细胞Slo3 表达的准确性 |
| 3.3.4 精子中Slo3的表达及作用 |
| 3.3.5 MII和粗线期细胞Slo3 的作用 |
| 3.3.6 生精细胞Slo3蛋白的定位 |
| 3.3.7 pH6.0和8.0下粗线期、圆形细胞Slo3的电流 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 体外不同浓度PFOA孵育对精子功能的影响及机制 |
| 4.2 Que缓解PFOA诱导的氧化应激和细胞凋亡 |
| 4.3 生精细胞中功能性的Slo3的表达 |
| 第5章 结论和展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 进一步工作 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间研究成果 |
（6）延边黄牛精子蛋白组学鉴定及蛋白通路分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 综述部分 |
| 1.1 精子获能 |
| 1.1.1 精子成熟 |
| 1.1.2 精子获能 |
| 1.1.3 精子获能的能量要求 |
| 1.1.4 碳酸氢盐和sAC/cAMP/PKA激活 |
| 1.1.5 碳酸氢盐和膜脂结构 |
| 1.1.6 精子蛋白的酪氨酸磷酸化 |
| 1.1.7 钙在获能过程中的作用 |
| 1.2 精子获能和受精过程中的精子蛋白酶体 |
| 1.2.1 精子蛋白酶体的亚细胞定位 |
| 1.2.2 精子获能和顶体胞吐过程中对蛋白酶体活性的要求 |
| 1.2.3 PSMD1 |
| 1.3 活性氧参与精子获能 |
| 1.3.1 活性氧的性质 |
| 1.3.2 线粒体活性氧生成 |
| 1.3.3 线粒体活性氧与精子凋亡 |
| 1.3.4 氧化应激对精子的影响 |
| 1.3.5 精子活性氧的生理来源 |
| 1.4 热休克蛋白(HSPs) |
| 1.4.1 细胞表面GRP78 |
| 1.4.2 GRP78在增殖内皮细胞的表面上 |
| 1.4.3 GRP78从ER转移到细胞表面的潜在机制 |
| 1.4.4 GRP78在细胞质中 |
| 1.4.5 线粒体的GRP78 |
| 1.5 蛋白组学 |
| 第二章 延边黄牛获能精子生理生化特征变化的研究 |
| 1 前言 |
| 2 试验材料与方法 |
| 2.1 试验样本 |
| 2.2 试验所用仪器及药品 |
| 2.3 药品的配制 |
| 2.4 试验步骤 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 获能和非获能状态下延边黄牛精子生物学参数的变化 |
| 3.2 获能和非获能状态下延边黄牛精子动力学参数的分析 |
| 3.3 获能和非获能状态下延边黄牛精子蛋白酪氨酸磷酸化水平的检测 |
| 3.4 获能和非获能状态下延边黄牛精子线粒体膜电位的变化 |
| 3.5 获能处理对延边黄牛精子细胞凋亡的影响 |
| 3.6 获能处理对延边黄牛精子膜脂质紊乱的影响 |
| 3.7 获能处理对体外受精及发育的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 获能和非获能牛精子蛋白质组鉴定 |
| 1 前言 |
| 2 试验材料与方法 |
| 2.1 试验样本 |
| 2.2 试验所用仪器及药品 |
| 2.3 药品的配制 |
| 2.4 试验步骤 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 实验酶切效率及搜库结果 |
| 3.2 蛋白定性分析 |
| 3.3 蛋白定量分析 |
| 3.4 组间比较差异蛋白 |
| 3.5 蛋白质组概要分析 |
| 3.6 GO富集分析 |
| 3.7 KEGG Pathway富集分析 |
| 3.8 蛋白-蛋白相互作用(PPI)分析 |
| 3.9 蛋白质印迹分析 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录一 中英文对照表 |
| 附录二 攻读学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（7）SPACA3与SPACA1、PDIA3及CRISP2之间的相互作用鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 符号说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 精子的成熟 |
| 1.2 精子获能 |
| 1.3 顶体反应与膜融合 |
| 1.4 精卵融合相关蛋白 |
| 1.4.1 精子顶体相关(Sperm acrosome associated,SPACA)蛋白家族 |
| 1.4.1.1 精子顶体相关蛋白 3(Sperm acrosome associated 3,SPACA3) |
| 1.4.1.2 精子顶体相关蛋白1(Sperm acrosome associated 1,SPACA1) |
| 1.4.2 蛋白二硫异构酶A家族成员PDIA3 |
| 1.4.3 富含半胱氨酸的分泌蛋白家族成员CRISP2 |
| 1.4.4 免疫球蛋白超家族成员IZUMO1 |
| 1.5 与精卵融合相关蛋白(SPACA1/SPACA3/PDIA3/CRISP2/IZUMO1)相互作用的蛋白 |
| 1.6 小结 |
| 第二章 SPACA1和SPACA3 的相互作用鉴定 |
| 引言 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验仪器设备 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验动物及实验菌种 |
| 2.1.4 实验细胞及载体 |
| 2.1.5 实验常用溶液的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 大鼠睾丸组织总RNA的提取 |
| 2.2.2 大鼠睾丸组织cDNA的合成 |
| 2.2.3 大鼠睾丸组织cDNA的检测 |
| 2.2.4 大鼠spaca1和spaca3 CDS区全长的克隆 |
| 2.2.4.1 大鼠spaca1与spaca3 CDS全长克隆引物的设计与合成 |
| 2.2.4.2 大鼠spaca1与spaca3 CDS区全长克隆 |
| 2.2.4.3 大鼠pMD19-T-spaca1与pMD19-T-spaca3 重组载体的构建 |
| 2.2.5 酵母双杂交实验 |
| 2.2.5.1 大鼠spaca1与spaca3 亚克隆(酵母)引物的设计与合成 |
| 2.2.5.2 大鼠spaca1与spaca3 过渡载体的构建 |
| 2.2.5.3 大鼠spaca1与spaca3 酵母表达载体的构建 |
| 2.2.5.4 LiAc法制备酵母感受态 |
| 2.2.5.5 pGAD-spaca3与pGBK-spaca1 重组质粒转化酵母感受态细胞 |
| 2.2.5.6 酵母双杂交 |
| 2.2.6 免疫共沉淀验实验 |
| 2.2.6.1 大鼠spaca1与spaca3 的亚克隆(真核)与真核表达载体的构建 |
| 2.2.6.1.1 大鼠spaca1与spaca3 的亚克隆(真核)引物的设计 |
| 2.2.6.1.2 大鼠spaca1与spaca3 过渡载体的构建 |
| 2.2.6.1.3 大鼠spaca1与spaca3 真核表达载体的构建 |
| 2.2.6.2 293 细胞的培养 |
| 2.2.6.2.1 细胞复苏 |
| 2.2.6.2.2 细胞传代 |
| 2.2.6.2.3 细胞铺板与转染 |
| 2.2.6.3 磁珠法免疫沉淀目标蛋白 |
| 2.2.6.3.1 Western-Blot检测免疫共沉淀结果 |
| 2.2.7 SPACA1与SPACA3 多克隆抗体的制备 |
| 2.2.7.1 大鼠spaca1与spaca3 原核表达载体的构建 |
| 2.2.7.1.1 大鼠p MD19-T-spaca1与pMD19-T-spaca3 过渡载体的构建 |
| 2.2.7.1.2 大鼠pET-28a-spaca1与pET-28a-spaca3 原核表达载体的构建 |
| 2.2.7.2 大鼠SPACA1-HIS与 SPACA3-HIS融合蛋白表达 |
| 2.2.7.3 大鼠SPACA1-HIS和 SPACA3-HIS融合蛋白SDS-PAGE鉴定 |
| 2.2.7.4 大鼠SPACA1-HIS和 SPACA3-HIS蛋白Western-Blot鉴定 |
| 2.2.7.5 大鼠SPACA1-HIS和 SPACA3-HIS融合蛋白切胶纯化 |
| 2.2.7.6 大鼠SPACA1-HIS和 SPACA3-HIS蛋白浓度测定 |
| 2.2.7.7 SPACA3与SPACA1 多克隆抗体的制备及鉴定 |
| 2.2.7.7.1 SPACA1-HIS与 SPACA3-HIS免疫实验动物 |
| 2.2.7.7.2 S180腹水瘤细胞的培养 |
| 2.2.7.7.3 SPACA1与SPACA3 多克隆抗体的特异性识别检测 |
| 2.2.8 SPACA1与SPACA3 在大鼠睾丸组织中的定位 |
| 2.2.9 SPACA1与SPACA3 在大鼠精子顶体反应前后的定位 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 大鼠睾丸组织cDNA检测 |
| 2.3.2 大鼠spaca1与spaca3 酵母表达载体的构建 |
| 2.3.2.1 大鼠spaca1与spaca3 CDS区全长的克隆 |
| 2.3.2.2 pMD19-T-spaca1与p MD19-T-spaca3 的双酶切鉴定 |
| 2.3.2.3 pGBK-spaca1与pGAD-spaca3 酵母表达载体的构建 |
| 2.3.3 酵母双杂交实验 |
| 2.3.3.1 pGBK-spaca1与pGAD-spaca3 转化酵母感受态菌落PCR鉴定 |
| 2.3.3.2 酵母双杂交 |
| 2.3.4 免疫共沉淀实验 |
| 2.3.4.1 大鼠spaca3与spaca1 真核表达载体的构建 |
| 2.3.4.2 免疫共沉淀 |
| 2.3.5 大鼠SPACA3与SPACA1 抗体的制备 |
| 2.3.5.1 大鼠pET-28a-spaca3与pET-28a-spaca1 原核表达载体的构建 |
| 2.3.5.2 大鼠SPACA3-HIS与 SPACA1-HIS原核蛋白的表达以及鉴定 |
| 2.3.5.3 大鼠SPACA3-HIS与 SPACA1-HIS原核蛋白的纯化以及鉴定 |
| 2.3.5.4 大鼠SPACA3-HIS与 SPACA1-HIS融合蛋白的浓度测定 |
| 2.3.5.5 SPACA3与SPACA1 多克隆抗体的制备及检测 |
| 2.3.6 SPACA3与SPACA1 在大鼠睾丸组织中的定位 |
| 2.3.7 SPACA3与SPACA1 在大鼠精子上的共定位 |
| 2.3.8 利用Image J软件分析SPACA3与SPACA1 的共定位结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 SPACA1与SPACA3 在生殖组织和生殖细胞中的定位分析 |
| 2.4.2 SPACA1与SPACA3 相互作用的分析 |
| 2.5 本章小结和创新点 |
| 2.5.1 小结 |
| 2.5.2 创新点 |
| 第三章 PDIA3、CRISP2和SPACA3 在绵羊精子上的共定位 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.2.2.1 绵羊睾丸组织总RNA的提取及c DNA的合成与检测 |
| 3.2.2.2 绵羊pdia3、crisp2和spaca3克隆载体的构建 |
| 3.2.2.2.1 绵羊pdia3、crisp2和spaca3克隆引物的设计 |
| 3.2.2.2.2 绵羊pdia3、crisp2和spaca3 CDS区全长的克隆 |
| 3.2.2.2.3 绵羊p MD19-T-pdia3、pMD19-T-crisp2和p MD19-T-spaca3 克隆载体的构建 |
| 3.2.2.3 绵羊PDIA3、CRISP2和SPACA3 多克隆抗体的制备 |
| 3.2.2.3.1 绵羊pGEX-pdia3、pGEX-crisp2和pGEX-spaca3 原核表达载体的构建 |
| 3.2.2.3.1.1 绵羊pdia3、crisp2和spaca3 过渡载体的构建 |
| 3.2.2.3.1.2 pGEX-pdia3、pGEX-crisp2和pGEX-spaca3 原核表达载体的构建 |
| 3.2.2.3.2 绵羊PDIA3-GST、CRISP2-GST和 SPACA3-GST融合蛋白的表达与鉴定 |
| 3.2.2.3.3 绵羊PDIA3-GST、CRISP2-GST和 SPACA3-GST融合蛋白的鉴定 |
| 3.2.2.3.4 绵羊PDIA3-GST、CRISP2-GST和 SPACA3-GST融合蛋白的纯化及鉴定 |
| 3.2.2.3.5 纯化后的PDIA3-GST、CRISP2-GST和 SPACA3-GST免疫实验动物 |
| 3.2.2.4 PDIA3-GST、CRISP2-GST和 SPACA3-GST多克隆抗体的检测和纯化 |
| 3.2.2.5 PDIA3、CRISP2和SPACA3 在绵羊精子顶体反应前后的共定位 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 绵羊睾丸组织cDNA检测结果 |
| 3.3.2 绵羊pdia3、crisp2和spaca3 克隆载体的构建 |
| 3.3.2.1 绵羊pdia3、crisp2和spaca3 CDS区全长的克隆 |
| 3.3.2.2 绵羊pMD19-T-pdia3、p MD19-T-crisp2和pMD19-T-spaca3 的构建 |
| 3.3.3 绵羊PDIA3、CRISP2和SPACA3 血清及腹水多克隆抗体的制备 |
| 3.3.3.1 绵羊pGEX-pdia3、pGEX-crisp2和pGEX-spaca3 原核表达载体的构建 |
| 3.3.3.2 PDIA3-GST/CRISP2-GST/SPACA3-GST融合蛋白的表达与鉴定 |
| 3.3.3.3 PDIA3-GST/CRISP2-GST/SPACA3-GST融合蛋白的纯化及鉴定 |
| 3.3.3.4 PDIA3-GST/CRISP2-GST/SPACA3-GST多克隆抗体的检测与纯化 |
| 3.3.4 PDIA3、CRISP2以及SPACA3 在绵羊精子顶体反应前后的定位 |
| 3.3.5 利用Image J软件分析PDIA3、CRISP2和SPACA3 在绵羊精子上的共定位结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 PDIA3与CRISP2 共定位分析 |
| 3.4.2 PDIA3与SPACA3 共定位分析 |
| 3.5 本章小结和创新点 |
| 3.5.1 小结 |
| 3.5.2 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间参与的科研项目和发表论文 |
（8）人精子特异性阳离子通道CatSper调控机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 引言 |
| 1.1 人成熟精子形态概述 |
| 1.2 人精子授精过程 |
| 1.2.1 人精子在生殖道内的迁移过程 |
| 1.2.2 精子获能 |
| 1.3 精子获能的分子调控机制 |
| 1.3.1 精子胞内pH及其影响因素 |
| 1.3.1.1 电压门控质子通道Hv1 |
| 1.3.1.2 Na~+/H~+交换体NHE |
| 1.3.1.3 HCO_3-及其转运机制 |
| 1.3.2 精子胞内cAMP及其影响因素 |
| 1.3.2.1 腺苷酸环化酶AC |
| 1.3.2.2 磷酸二酯酶PDEs |
| 1.3.2.3 cAMP效应分子 |
| 1.3.3 Ca~(2+)在精子获能中扮演核心作用 |
| 1.4 CatSper通道是增加精子[Ca~(2+)]_i的主要途径 |
| 1.4.1 CatSper的结果和生理功能 |
| 1.4.2 CatSper的电生理特性及相关生理调节机制 |
| 1.4.2.1 CatSper的主要电生理特性 |
| 1.4.2.2 生理激素等对人精子CatSper的激活作用 |
| 1.4.2.3 cAMP信号途径与CatSper的关系仍存争议 |
| 1.4.2.4 DEFB1/CCR6与CatSper的关系有待确定 |
| 1.5 小结与研究目标 |
| 第2章 实验材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 人精子 |
| 2.1.2 主要试剂及生产厂家 |
| 2.1.3 主要仪器及生产厂家 |
| 2.2 实验方法 |
| 第3章 结果与分析 |
| 3.1 CatSper不受细胞内cAMP信号途径调控 |
| 3.1.1 细胞内cAMP不增加精子[Ca~(2+) |
| 3.1.2 细胞内cAMP不影响CatSper的激活过程 |
| 3.1.3 细胞内cAMP不激活CatSper |
| 3.2 HCO_3~-极易引起CatSper的碱性激活 |
| 3.2.1 HCO_3~-在空气中极易碱化溶液 |
| 3.2.2 HCO_3~-碱化溶液后可引起CatSper碱性激活 |
| 3.3 cAMP透膜性类似物直接激活CatSper |
| 3.3.1 CATSPER2~(-/-)精子有助于CatSper调控机制研究 |
| 3.3.2 8-CPT-cAMP通过CatSper增加人精子[Ca~(2+)]_i |
| 3.3.3 8-CPT-cAMP直接激活CatSper |
| 3.4 cAMP类似物激活CatSper不依赖胞内cAMP信号 |
| 3.4.1 CatSper受多种cAMP透膜性类似物激活 |
| 3.4.2 cAMP和8-CPT-cAMP从胞外激活CatSper |
| 3.5 CatSper活性受胞外环核苷酸结合位点调控 |
| 3.6 PKA抑制剂不通过抑制PKA影响CatSper活性 |
| 3.6.1 PKA抑制剂对人精子[Ca~(2+)]_i的多种影响 |
| 3.6.2 KT 5720、PKI 5-24、Rp-CAMPS不抑制CatSper |
| 3.6.3 H 89和PKI 14-22是CatSper抑制剂 |
| 3.7 EPAC抑制剂对人精子[Ca~(2+)]_i的影响 |
| 3.8 CatSper活性受DEFB1/CCR6调控 |
| 3.8.1 DEFB1激活人精子CatSper |
| 3.8.2 CCR6介导了DEFB1对CatSper的激活效应 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
（9）SLO家族在中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）精子发生过程中的表达及功能（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 精子的形成及受精过程 |
| 1.1.1 精子形成过程 |
| 1.1.2 精子的获能 |
| 1.1.3 精子的顶体反应 |
| 1.1.4 中华绒螯蟹精子的成熟过程 |
| 1.2 离子通道的研究进展 |
| 1.2.1 离子通道的功能及分类 |
| 1.2.2 钾离子通道的分类与特性 |
| 1.2.3 SLO家族钾离子通道 |
| 1.3 离子通道在生殖方面的研究进展 |
| 1.3.1 精子成熟和受精过程中离子通道的研究进展 |
| 1.3.2 离子通道与精子激活 |
| 1.3.3 离子通道与精子的趋化性 |
| 1.3.4 精子离子通道与顶体反应 |
| 1.4 研究目的及意义 |
| 第二章 SLO蛋白在中华绒螯蟹生殖系统的定位 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.3 仪器与试剂 |
| 2.3.1 仪器 |
| 2.3.2 试剂 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 免疫印迹 |
| 2.4.2 免疫组组织化学技术 |
| 2.4.3 免疫荧光技术 |
| 2.5 结果与分析 |
| 2.5.1 SLO1 蛋白在生精细胞内的定位 |
| 2.5.2 SLO2 蛋白在生精细胞的定位 |
| 2.6 讨论 |
| 第三章 中华绒螯蟹SLO基因的生物信息学分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.3 仪器和试剂 |
| 3.3.1 仪器 |
| 3.3.2 试剂 |
| 3.4 实验方法 |
| 3.4.1 RNA提取 |
| 3.4.2 RT-PCR |
| 3.4.3 引物设计 |
| 3.4.4 PCR扩增 |
| 3.4.5 目的片段的连接、转化及测序 |
| 3.4.6 slo基因的生物信息学分析 |
| 3.5 结果与分析 |
| 3.5.1 中华绒螯蟹slo1 扩增结果 |
| 3.5.2 中华绒螯蟹slo1 基因测序结果 |
| 3.5.3 中华绒螯蟹slo2.2 基因测序 |
| 3.6 讨论 |
| 第四章 中华绒螯蟹生精细胞SLO家族钾电流的检测 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.3 仪器和试剂 |
| 4.3.1 仪器 |
| 4.3.2 试剂 |
| 4.4 实验方法 |
| 4.4.1 生精细胞的提取 |
| 4.4.2 全细胞外向钾电流的记录 |
| 4.4.3 数据统计分析 |
| 4.5 结果与分析 |
| 4.5.1 不同物种生精细胞全细胞钾电流鉴定 |
| 4.5.2 SLO1 介导的外向钾电流的鉴定与特性分析 |
| 4.5.3 生精细胞BK电流的分布 |
| 4.5.4 SLO2.2 介导的外向钾电流的鉴定与特性分析 |
| 4.6 讨论 |
| 第五章 SLO家族钾通道对中华绒螯蟹精子顶体反应的影响 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.3 仪器和试剂 |
| 5.3.1 仪器 |
| 5.3.2 试剂 |
| 5.4 实验方法 |
| 5.4.1 中华绒螯蟹精子获取 |
| 5.4.2 精子密度测定 |
| 5.4.3 精子成活率测定 |
| 5.4.4 顶体诱导率的分组设计 |
| 5.4.5 精子在不同试剂下的顶体反应 |
| 5.5 结果与分析 |
| 5.5.1 精子成活率的统计 |
| 5.5.2 不同实验组的顶体诱导率 |
| 5.5.3 各时期占总顶体诱导率的百分比 |
| 5.6 讨论 |
| 5.6.1 SLO家族通道对精子顶体反应的影响 |
| 第六章 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介及攻读学位期间取得的研究成果 |
（10）中华绒螯蟹精子获能的生理生化特征（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 精子获能 |
| 1.2 影响哺乳动物精子获能的因素 |
| 1.3 精子获能的相关信号通路 |
| 1.4 中华绒螯蟹精子形态结构及受精过程 |
| 1.5 中华绒螯蟹受精过程 |
| 1.6 精子获能的鉴定方法 |
| 1.6.1 金霉素(Chlortetracycline,CTC)荧光染色法 |
| 1.6.2 液相质谱串联分析(LC-MS) |
| 1.7 研究目的与意义 |
| 第二章 金霉素初步鉴定中华绒螯蟹精子获能 |
| 2.1 实验材料及试剂 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 主要实验仪器 |
| 2.1.3 主要试剂及配方 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 中华绒螯蟹精子获得 |
| 2.2.2 CTC染色方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 获能过程中酪氨酸磷酸化蛋白的变化 |
| 3.1 实验材料和方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验试剂及溶液配方 |
| 3.1.3 主要实验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 精子细胞全蛋白提取 |
| 3.2.2 免疫印迹实验 |
| 3.2.3 免疫荧光定位 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 Western blot结果 |
| 3.3.2 酪氨酸磷酸化定位特征 |
| 第四章 pH值对精子顶体反应的影响 |
| 4.1 BCECF、BECF/AM简介 |
| 4.2 实验材料及试剂 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 主要实验试剂及配方 |
| 4.2.3 主要实验仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 标准曲线的制作 |
| 4.3.2 精子细胞提取与处理 |
| 4.3.3 胞内pH值测定 |
| 4.3.4 顶体反应率测定 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 pH值标准曲线 |
| 4.4.2 pH值检测激发光处荧光结果 |
| 4.4.3 顶体反应率测定 |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 精子细胞整体的胆固醇变化 |
| 5.1 实验材料和仪器 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 实验试剂及溶液配方 |
| 5.1.3 主要实验仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 酪氨酸磷酸化蛋白的富集与鉴定 |
| 6.1 实验材料与试剂 |
| 6.1.1 实验材料 |
| 6.1.2 主要试剂与配方 |
| 6.1.3 主要实验仪器 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 富集酪氨酸磷酸化蛋白 |
| 6.2.2 质谱分析 |
| 6.3 实验结果 |
| 6.3.1 免疫沉淀(IP Immunoprecipitation)富集结果 |
| 6.3.3 质谱分析结果 |
| 6.4 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
四、豚鼠精子在发生及顶体反应过程中细胞内Ca~(2+)的定位研究（论文参考文献）
- [1]水牛精浆外泌体蛋白质组的初步研究[D]. 肖凯. 广西大学, 2021(12)
- [2]中华绒螯蟹syntaxin-1蛋白多抗制备及其功能分析[D]. 方翔永. 河北大学, 2021(09)
- [3]他克林对冻融猪精子的保护作用及机制研究[D]. 陈志英. 广西大学, 2021(12)
- [4]低剂量双酚A致男（雄）性生殖损伤及TET1在其中的作用及机制研究[D]. 袁文博. 新乡医学院, 2021(01)
- [5]精子特异性离子通道的生理与毒理作用研究[D]. 苑洋洋. 南昌大学, 2020(02)
- [6]延边黄牛精子蛋白组学鉴定及蛋白通路分析[D]. 李作臣. 延边大学, 2020(05)
- [7]SPACA3与SPACA1、PDIA3及CRISP2之间的相互作用鉴定[D]. 乔燕. 内蒙古大学, 2020(01)
- [8]人精子特异性阳离子通道CatSper调控机制研究[D]. 王涛. 南昌大学, 2020(01)
- [9]SLO家族在中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）精子发生过程中的表达及功能[D]. 张伟伟. 河北大学, 2020(08)
- [10]中华绒螯蟹精子获能的生理生化特征[D]. 袁航. 河北大学, 2020(08)