一、HEPES诱导增强细胞病变中和试验在肾综合征出血热病毒株和病人血清分型的应用（论文文献综述）
俞永新,杨立宏,刘文雪,聂子林[1]（1996）在《HEPES诱导增强细胞病变中和试验在肾综合征出血热病毒株和病人血清分型的应用》文中认为依据羟乙基哌嗪乙烷磺酸（HEPES）能诱导增强肾综合征出血热病毒感染的Vero-E6细胞产生细胞融合病变,并可被特异性抗体所中和抑制的特性,建立了微量细胞病变中和试验方法。应用该方法对11株肾综合征出血热病毒分离株进行分型。结果7株可鉴定为HTN型,4株为SEO型。另对7个地区82份出血热病人血清进行分型。结果,西安、四川、沈阳、湖南、浙江的血清鉴定为HTN型;山西、山东、福建的血清定为SEO型。除三例外,其它每份血清抗体滴度两型间均相差4倍以上。各地区血清抗体水平的几何平均滴度（GMT）两型间相差10倍以上。毒株分型和各地区感染病毒型试验结果与作者用空斑减少中和试验（PRNT）分型的结果一致,但本方法具有较PRNT法试验时间短、容易掌握和经济等优点。
宋干[2]（1996）在《肾综合征出血热病原学研究进展》文中进行了进一步梳理肾综合征出血热病原学研究进展中国预防医学科学院病毒学研究所（北京１０００５２）宋干肾结合征出血热（ＨＦＲＳ）是某些鼠类携带传播，由布尼亚病毒科（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ）汉坦病毒属（Ｈａｎｔａｖｉｒｕｓ，ＨＶ）中的几种病毒引起的自然疫源性疾病。１９７...
陈化新,王华,贾克丽,罗成旺,刘国敏,余陶,严玉辰[3]（1995）在《中国肾综合征出血热病人血清型研究》文中研究说明总结中国大部分地区近年应用血凝抑制试验等方法检测肾综合征出血热病人血清型的初步结果，并用量化的方法进行了肾综合征出血热的疫区分型，结果表明中国大部分地区已经演变为混合型肾综合征出血热疫区，同时尚存部分姬鼠型和家鼠型肾综合征出血热疫区。近十年来，抽样监测表明，中国肾综合征出血热病人汉坦病毒Ⅰ型感染５０．０３％～５１．０８％，Ⅱ型占４８．９２％～４９．９７％。指出了血清型研究对指导防制实践，尤其是对当前合理选用疫苗具有重要指导意义。还提出了对人群致病的汉坦病毒属，不同种（型或亚型）的同源性大小，与鼠科和仓鼠科中的汉坦病毒主要宿主动物黑线姬鼠、褐家鼠、欧洲棕背、鹿鼠系统发育的远近，有密切的亲缘关系。
杨占清[4]（2005）在《山东地区肾综合征出血热宿主和流行病学研究》文中认为近20年来肾综合征出血热流行病学和病原学研究有了飞跃的发展。肾综合征出血热（Hemorrhagic fever with renal Syndrome, HFRS）,又名流行性出血热（Epidemic hemorrhagic fever EHF）,是由汉坦病毒（Hantavirus, HV）引起、以鼠类为主要传染源,可通过多种途径传播的一种自然疫源性疾病。临床上以发热、低血压、出血、少尿及多尿等肾功损伤为特征,是十余种病毒性出血热（Viral hemorrhagic fever, VHF）中在世界上分布较广,发病数较多,危害性较大的一种。本病于1931～1932年在黑龙江沿岸的中苏交界地区被发现。1935年起驻扎在我国东北北部的侵华曰军中发生暴发流行,病死率高达30%,曾按发病地区相继称为“二道岗热”、“孙吴热”、“黑河热”和“虎林热”等,1942年确定为一种独立的疾病,20世纪40年代后,在北欧斯堪的纳维亚半岛、朝鲜半岛、巴尔干半岛相继发生此病。我国建国初期病例很少,直到1955年内蒙古大兴安岭地区的图里河和陕西宝鸡秦岭北坡修筑宝成铁路的工人中暴发流行后,才开始认识到它的危害,相继在东北、华中、华东、华南和西北广大农村陆续证实有此病流行,以黑线姬鼠（Apodemus agrarius）为主要传染源。并于1956年将此病定为报告疾病。目前,世界上四大洲（亚洲、欧洲、非洲和美洲）32个国家有疫情报告,病例主要分布在亚洲,占92.68%。在我国汉坦型（HTN）和汉城型（SEO）HFRS每年流行,除青海、新疆未发现病例外,其余各省（区、市）均曾有过HFRS病例报告,病例占世界病例数的90%以上。是仅次
汤重发[5]（2014）在《狂犬病病毒不同毒株的生物学特性和狂犬病暴露后免疫动物模型研究》文中认为狂犬病是由狂犬病病毒引起的人兽共患病，通常由感染了狂犬病病毒的疯动物咬伤或抓伤而感染人，目前尚无有效的治疗方法，死亡率为100%。狂犬病疫苗是控制人和动物狂犬病的关键因素之一。目前世界上用于人用及兽用狂犬病疫苗生产的毒株种类较多。对于各毒株的生物学特性，尤其是其致病性和对细胞的感染性目前缺乏较为系统的研究。本研究选取2株标准攻击毒（CVS、CVS-11）和4株疫苗株（PV、4aG、Flury-LEP、CTN-1）共6株狂犬病病毒固定毒，着重研究这6株固定毒对动物的致病性和对细胞的感染性。实验以小鼠脑内和肌肉途径接种比较不同毒株的致病性；研究并建立HEPES（4-羟乙基哌嗪乙磺酸）诱导的空斑形成技术测定病毒空斑形成单位（Plaque-forming Unit，PFU）和细胞病变感染技术测定病毒感染滴度（CCID50），并用以比较不同毒株的病毒滴度，空斑实验及细胞病变实验同时在Vero及BHK-21细胞上进行，以确定敏感的细胞系；实验同时以常规的直接免疫荧光法（Direct ImmunofluorescentAssay，dFA）测定的FFU作为滴度参考值。结果显示不同固定毒株对10-12g小鼠的脑内致病力普遍很高，但肌肉毒力普遍降低，相差在3.0-5.0lgLD50之间。用二种新的方法（PFU和CCID50）测定不同毒株的病毒滴度与dFA法测定的结果比较除个别株外无明显差别，如CVS-11、4aG、PV株用三种方法测定的滴度均在7.1-7.9lg之间。实验表明用dFA法测定病毒滴度的结果与小鼠脑内测定的结果有可比性，用以替代小鼠脑内法测定疫苗原液内病毒滴度是可行的。二种细胞感染法更适宜采用BHK-21细胞，二种方法测定的病毒滴度操作简便，无需贵重仪器和昂贵试剂，可以更广泛地应用于狂犬病病毒和疫苗发展的研究，也这为狂犬病病毒致病力研究及疫苗的质量控制研究奠定基础。本文对金黄地鼠作为狂犬病暴露后免疫动物模型的可行性进行了研究，比较狂犬病固定毒CVS和CTN-1株对不同日龄地鼠和不同日龄小鼠肌内感染后的致病性，以及CVS株感染金黄地鼠后病毒入脑和和抗体应答动态。结果显示地鼠肌内感染病毒后7天左右出现狂犬病临床症状，其引起死亡的致病力较小鼠高（地鼠：6.4-8.0lgLD50/ml，小鼠：3.4-6.5lgLD50/ml），3周龄和8周龄金黄地鼠的敏感性无差异。病毒肌肉感染后约5-6天病毒进入脑内，用dFA可见脑组织的特异性荧光。感染后6-7天血清内开始出现中和抗体。根据以上特性选用8周龄地鼠作为狂犬病暴露后免疫动物模型进行疫苗的保护效果实验。以金黄地鼠为动物模型，评价人用狂犬病疫苗、疫苗加PIKA佐剂、减毒活疫苗及人狂犬病免疫球蛋白在暴露后免疫中的保护效果；研究体液免疫在暴露后免疫中的作用，及其与保护效果的相关性。将CVS株稀释至4.0MICLD50/ml，感染8周龄的雌性金黄地鼠的左腿腓肠肌，6h后给予首次暴露后免疫，按照设计的免疫程序依次免疫，观察记录动物发病死亡情况。通过心脏穿刺连续采集给予暴露后免疫及感染对照组的血液，分离血清，RFFIT法测定血清抗体。结果表明未免疫的感染对照组的死亡率在90%左右，人用狂犬病疫苗的免疫保护力在70%以上，但疫苗稀释1-5倍后保护效果下降至20%-30%。同时在疫苗与PIKA佐剂相同1:4稀释后保护作用可达50%-90%，在联合使用疫苗及免疫球蛋白的条件下暴露后保护率可达100%。血清中的抗狂犬病病毒特异性中和抗体的检测结果表明暴露后免疫组的血清抗体可在第4天出现阳转，第5天达到100%阳转，以后持续维持较高水平，但未感染的暴露前免疫的动物的抗体水平从第4天开始一直较前者低，但是个体的抗体阳转与最终发病死亡无相关性。本研究的实验表明金黄地鼠适用于作为狂犬病暴露后免疫的动物模型。对疫苗的评价结果显示人用狂犬病疫苗的效价在暴露后免疫中的保护作用关系很大，同时联合使用免疫球蛋白抗体注射至关重要，PIKA佐剂可以明显降低疫苗抗原量的同时提高保护作用，但暴露后免疫4天以后的抗体水平与保护作用无明显相关，其他免疫机制在暴露后免疫中的作用有待进一步深入研究。
马颖欣[6]（2016）在《陕西省汉滩病毒人源分离株全基因组序列分析及血清学特性研究》文中研究指明汉坦病毒（Hantavirus, HV）属于布尼亚病毒科,是分节段的单股负链RNA病毒。其基因组分为大（Large, L）、中（Medium, M）和小（Small, S）三个片段,分别编码核蛋白,糖蛋白（Gn, Gc）和RNA依赖的RNA聚合酶蛋白。人可通过直接或间接接触宿主动物的排泄和分泌物等感染汉坦病毒,引起以肾脏损害为主的肾综合征出血热（Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome, HFRS）和以肺毛细血管通透性增高以及心血管受累为主的汉坦病毒肺综合征（Hantavirus Pulmonary Syndrome, HPS）,全世界有将近30多个国家每年持续有汉坦病毒感染报告病例,我国肾综合征出血热疫情最为严重,近十年以来年均发病人数一万左右。目前,已确定的汉坦病毒血清型达30余种,而引起我国上述传染病的汉坦病毒主要为汉滩型病毒（Hantaan virus, HTNV）和汉城型病毒（Seoul virus, SEOV）。陕西省是我国受汉坦病毒影响十分严重的两型病毒混合疫区,但针对宿主动物和感染人群的血清学研究显示,该地区主要以汉滩型病毒流行为主,当地每年肾综合征出血热的报告病例都居全国前列,发病高峰集中在每年的冬春两季,其中春季的3-5月一般为发病小高峰,而发病大高峰一般集中在冬季,开始于每年的11月份左右,结束于次年的1月份。因此,基于上述流行病学特征,我们选择于2014冬季在西安地区进行肾综合征出血热患者全血采集工作。目前,汉坦病毒的分离难度仍较大,并且现阶段大部分汉坦病毒分离株来源于宿主动物样本,而分离自人外周血的毒株尚较少,近十年来西安地区也仅有从黑线姬鼠鼠肺中分离到汉坦病毒。因此为提高汉坦病毒分离率,本研究尝试从人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell, PBMC）中进行汉坦病毒分离,并通过分析病毒分离株的基因组特征,为进一步研究宿主来源与HFRS病人来源毒株的相关性提供依据。本研究于2014年11月至2015年1月肾综合征出血热高发时间段,在陕西省西安市第八医院采集HFRS患者抗凝血及血清样本,其中共采集急性期HFRS患者抗凝血样本共38份,恢复期病人血清29份。我们对采集的所有抗凝外周血样本进行分离血浆及PBMC处理,并将来自于同一HFRS患者的全血、血浆及外周血单个核细胞分别接种于预先培养好的Vero-E6细胞表面,并盲传三代,每代约21天,期间通过荧光定量PCR、双抗体夹心法ELISA、间接免疫荧光法等检测方法对盲传细胞上清进行抗原检测。经过三代盲传后,上述检测结果均显示有三份样本的汉坦病毒抗原确定为阳性,其中两份阳性样本来源于患者PBMC,而另一份阳性样本来源于患者血浆,且荧光定量PCR检测结果证实为汉滩型病毒。通过提取病毒RNA,并逆转录成cDNA,经PCR方法进行目的片段扩增,经琼脂糖凝胶电泳鉴定后进行全基因组测序。经测序,我们确定新获得三株汉滩型病毒毒株的全基因组序列,将上述三株病毒分别命名为SX26、SX27和SX30,测序结果显示分离株病毒的S、M、L基因片段大小分别约为1700bp、3580bp及6500bp左右。从GenBank网站下载汉坦病毒各型代表毒株,并通过BLAST比对下载同源性较高毒株构建系统发生树,使用生物信息学软件分析分离株病毒与其它汉坦病毒毒株的核苷酸及氨基酸同源性,发现新分离的三株病毒之间核苷酸与氨基酸相似性均较高,另外,S、M、L片段均与西安2010年鼠源分离株XAAa10091712同源性最近,在系统进化树上归属于同一分支。本次研究虽成功从HFRS患者血液样本中分离到汉坦病毒毒株,但毒株分离途径不同,分离自PBMC的SX26和SX27毒株未能从同一患者的全血或血浆样本中分离获得,而分离自血浆的SX30毒株也未能从PBMC中成功分离,我们推测原因可能是汉坦病毒分离难度较大,在病毒分离培养的过程中存在较多不可控因素,根据现阶段研究结果,尚无法确定PBMC方法与传统病毒分离方法相比,在病毒分离率上有明显优势,然而本研究证明了从PBMC中分离汉坦病毒的可行性,为进一步提高汉坦病毒分离率的研究奠定了基础。针对分离获得的汉坦病毒毒株,我们进一步对其进行血清学特性研究,采用微量中和试验方法,分析所收集的HFRS病人恢复期血清和疫苗免疫者血清各50份样本,针对不同汉坦病毒毒株的中和抗体滴度差别。研究确定病人恢复期血清样本全部为HTNV型,且对SX26毒株的中和抗体滴度稍高于疫苗株Z10和西安人源分离株84FLi,提示西安地区汉坦病毒流行株的抗原性已发生部分改变,且与疫苗株抗原性差别较大。而疫苗免疫者血清针对疫苗株的中和抗体阳性率较高,针对SX26和84FLi毒株的阳性率则较低,推测目前西安地区所用汉坦病毒疫苗免疫效果可能有所减弱,但还需进一步研究予以验证。综上所述,本研究成功从急性期HFRS病人血液样本中分离到三株汉滩型病毒株,其中两株来源于PBMC样本,另一株来源于血浆样本,并且全部获得全基因组序列,证明了PBMC方法分离病毒的可行性,为进一步提高汉坦病毒分离率的研究提供了依据。另外,我们选择实验中病毒分离株和其它代表毒株,分别与HFRS病人恢复期血清和疫苗免疫者血清进行微量中和试验,对病毒分离株血清学的特性进行分析,同时也为进一步评价疫苗免疫效果奠定了基础。
戴诗雨[7]（2020）在《病毒样颗粒抗原及克里米亚刚果出血热病毒Gn/Gc宿主相互作用组的研究》文中研究表明病毒样颗粒（Virus-Like Particle,VLP）是由一个或多个病毒结构蛋白组装形成的颗粒状结构,与天然病毒粒子形态、抗原性相似。VLP缺失病毒的遗传物质,没有复制和感染能力。VLP的免疫原性良好,研制快速,制备成本较低并且安全,在应对新发、突发病毒疾病的疫苗研制中具有独特优势。杆状病毒表达系统是常用的真核表达系统之一,广泛应用于蛋白功能研究,抗原及疫苗制备。我们利用杆状病毒表达系统构建了几种危害人类健康的病毒VLPs,并初步探究了其作为候选疫苗的免疫原性。寨卡病毒（Zika virus,ZIKV）是蚊传黄病毒,近年发现其感染与新生儿小头畸形有关,且能引起格林-巴利综合征等神经系统疾病。目前,对于ZIKV引起的疾病,尚无有效的疫苗和特异性治疗药物,ZIKV严重危害人类健康。我们利用杆状病毒表达系统,构建了表达ZIKV pr ME蛋白的重组病毒。经蔗糖密度梯度离心,从感染的昆虫细胞中纯化得到由ZIKV pr M蛋白和E蛋白自组装形成的ZIKV VLPs。以ZIKV pr ME VLPs免疫小鼠能够诱导小鼠产生中和抗体,及ZIKV特异的体液和细胞免疫反应,表现出良好的免疫原性,为以VLP为基础的ZIKV疫苗研发奠定了基础。我们也构建了表达ZIKV囊膜蛋白E的重组病毒,结果显示在昆虫细胞中囊膜蛋白E可以不依赖于pr M蛋白共表达组装成与ZIKV病毒粒子形态类似的VLP,并且释放到胞外。E蛋白保留膜融合活性,可以诱导合胞体形成,这一现象同样适用于包括日本脑炎病毒、登革热病毒和蜱传脑炎病毒在内的黄病毒。基于杆状病毒表达黄病毒囊膜蛋白E诱导合胞体形成的现象,我们还建立了靶向黄病毒E蛋白的抗病毒药物筛选平台。脊髓灰质炎病毒（Poliovirus,PV）是脊髓灰质炎（简称脊灰）的病原体。目前脊灰没有特异治疗方法,只能通过接种疫苗来预防。目前世界上普遍使用的脊灰疫苗有两种,即口服脊髓灰质炎减毒活疫苗（OPV）和灭活脊髓灰质炎疫苗（IPV）。自从1988年世界卫生组织（WHO）发起全球消灭脊灰行动以来,世界各国大力推广OPV的使用,2015年和2019年,WHO先后宣布Ⅱ型和Ⅲ型脊灰野病毒的消灭。在根除脊灰的最后阶段,OPV和IPV都不可避免存在安全性问题,面临着免疫策略调整的挑战,在无PV的环境下生产疫苗更安全可靠。我们利用杆状病毒表达系统共表达PV的P1和3CD蛋白,P1前体可以被3CD蛋白酶成功剪切成衣壳蛋白VP0、VP1和VP3,经过蔗糖密度梯度离心结合氯化铯密度梯度离心可以纯化出PV VLPs,与天然PV病毒颗粒的形态、大小相似。克里米亚刚果出血热病毒（Crimean-Congo Hemorrhagic Fever Virus,CCHFV）是一种高致病性病毒,可以导致克里米亚刚果出血热,一种以出血为典型特征的蜱媒自然疫源性疾病。CCHFV感染能引起人发热、出血以及多器官的功能衰竭,进而导致死亡,致死率高达30%-50%,没有有效的抗CCHFV的药物和疫苗,CCHFV是人类健康的潜在威胁。在我国病毒分类目录中,CCHFV属于第一类危害程度的病毒;在国外,CCHFV是生物安全4级的病毒。CCHFV在体外通过细胞培养进行病毒的分离和扩增较困难,极大限制了CCHFV的研究进展。我们构建重组病毒在昆虫细胞中共表达CCHFV的膜蛋白和核衣壳蛋白,或者单独表达膜蛋白。通过蔗糖密度梯度离心,成功从感染的细胞中制备出CCHFV VLPs。CCHFV病毒粒子表面是膜蛋白Gn和Gc,为了形成感染性病毒粒子,膜蛋白前体在细胞内经过复杂的剪切、加工和定位从而形成结构蛋白Gn和Gc,非结构蛋白GP160,GP85,GP38和NSm。在整个生命周期中CCHFV膜蛋白Gn和Gc在病毒入侵、膜融合、致病性、宿主选择和免疫逃逸等方面有重要作用。对CCHFV膜蛋白Gn和Gc宿主互作蛋白的研究,探索CCHFV与宿主的相互作用有利于了解CCHFV的分子生物学,找到病毒感染的关键宿主因子。为了研究CCHFV膜蛋白Gn/Gc与宿主的相互作用,我们首先制备了CCHFV膜蛋白Gn/Gc的单克隆抗体。以原核表达的Gn/Gc胞外区作为免疫原免疫小鼠,通过有限稀释法,以真核表达的Gn/Gc蛋白作为检测抗原,经ELISA方法初筛融合上清,结合蛋白免疫印迹分析和细胞免疫荧光检测。经过综合评定和比较,筛选出8株Gn单克隆化的杂交瘤细胞和10株Gc单克隆化的杂交瘤细胞。分别以不同截短形式的Gn/Gc原核表达蛋白为抗原,对融合上清的识别区段进行鉴定,最终鉴定出2株Gn单克隆抗体和1株Gc单克隆抗体及其识别的抗原表位。为了探索膜蛋白Gn/Gc的宿主互作蛋白,我们以带有Twin-strep标签的Gn或Gc作为诱饵蛋白,对样品进行细胞亲和纯化-质谱（AP-MS）鉴定。共鉴定出45个Gn或Gc相关宿主蛋白,结合生物信息学深入挖掘和分析,并通过免疫荧光等方法对质谱结果有效性进行验证。综上所述,我们利用杆状病毒表达系统成功构建了ZIKV VLPs,PV VLPs和CCHFV VLPs。对ZIKV VLPs免疫原性的初步探索表明其有良好的免疫原性,有希望成为ZIKV候选疫苗。基于杆状病毒表达的黄病毒E蛋白诱导合胞体的现象,建立了针对黄病毒E蛋白的抗病毒药物筛选平台。筛选出2株CCHFV Gn单克隆抗体和1株Gc单克隆抗体。并通过蛋白质组学和生物信息学鉴定分析了CCHFV膜蛋白Gn/Gc的宿主互作蛋白,可以促进全面地了解膜蛋白Gn/Gc与宿主的关系,对认识CCHFV感染相关过程,后续功能分析及药物靶点设计具有重要指导意义。
陈曦[8]（2017）在《猪繁殖与呼吸综合征病毒上调猪树突细胞CD83的表达及其分子机制》文中指出猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）是危害全球养猪业的一种重要病原,可引起母猪繁殖障碍和猪呼吸道疾病,并导致感染猪体免疫抑制,造成严重经济损失,但其致病机理尚不十分清楚。CD83作为树突细胞（DCs）的重要表面分子,它不仅仅是DCs成熟的标志,还是DCs发挥其激发免疫应答作用不可或缺的功能性分子。CD83一方面活化DCs,另一方面为初始T细胞和记忆性T细胞提供共刺激信号,但可溶形式CD83分子（sCD83）具有强大的抑制混合淋巴细胞反应（MLR）和DCs介导的同种异体T细胞增殖反应作用。PRRSV与CD83的相互关系及其机制尚无报道。本研究主要内容如下:1.PRRSV诱导树突细胞CD83表达及其关键功能蛋白的探寻本研究采集PRRSV阴性猪外周血液淋巴细胞（PBMC）,采用GM-CSF和IL-4刺激,制备获得单核细胞衍生的树突细胞（MoDCs）,采用PRRSV 3个不同毒力毒株(高致病性毒株BB0907、经典毒株S1及致弱毒株NT0801,分别以不同剂量感染MoDCs,收集细胞和细胞培养液,分别通过流式细胞术检测MoDCs细胞膜CD83（mCD83）表达,夹心ELISA方法检测细胞培养液sCD83表达,qRT-PCR检测MoDCs CD83 mRNA水平,发现3种不同病毒株均可上调mCD83及其mRNA水平,并能够强烈诱导sCD83分泌。采用基因步移试剂盒扩增获得850 bp的CD83启动子基因,克隆至pGL3-Basic质粒,成功建立CD83双荧光报告基因检测系统。将PRRSV BB0907毒株编码蛋白基因克隆至pVAX1,构建成功PRRSV编码蛋白基因真核表达质粒。将不同真核表达质粒与CD83启动子报告基因共转染Marc-145和HEK293细胞,发现PRRSVN、nsp1及nsp10蛋白能够显着上调CD83启动子活性,表明PRRSVN、nsp1及nsp10蛋白在促进MoDCs表达sCD83方面发挥重要作用2.PRRSV N蛋白诱导树突细胞CD83表达及其分子机制本研究利用丙氨酸突变技术,构建PRRSV N蛋白基因的8个连续氨基酸（aa）残基突变体的基因重组质粒,转染Marc-145和HEK293细胞,采用CD83双荧光报告基因检测系统检测,结果显示:N蛋白第43和44aa残基能够上调CD83基因启动子活性。利用PRRSVBB0907毒株感染性cDNA克隆（pBB/wt）,通过融合PCR方法构建上述N蛋白基因突变重组质粒,构建感染性cDNA克隆,拯救获得N蛋白第43和44aa突变重组PRRSV[rK43A和rR44A]及其回复重组病毒[rK43A（R）和rR44A（R）]。该4种重组病毒空斑和生长特性与其野生重组病毒rBB/wt相似,但rK43A与rR44A上调CD83启动子活性明显低于rBB/wt（P<0.001）,rK43A（R）与rR44A（R）上调CD83活性与rBB/wt相似。将4种重组病毒及rBB/wt接种MoDCs后测定CD83表达水平,rK43A和rR44A组中的CD83 mRNA水平,mCD83表达水平及sCD83分泌量都明显低于rBB/wt、rK43A（R）和rR44A（R）组。根据CD83启动子基因序列含有的多个Sp1结合位点及NF-κB结合位点,利用Sp1 siRNA及NF-κB抑制剂研究Sp1及NF-κB在PRRSV N蛋白上调CD83中的作用。CD83双荧光报告基因检测系统检测结果显示,Sp1 siRNA及NF-κB抑制剂均能够阻断PRRSV及N蛋白质粒对CD83启动子的激活,但对rK43A和rR44A重组病毒激活CD83启动子活性无明显差异。rK43A和rR44A重组病毒感染MoDCs诱导的Sp1和NF-κB mRNA水平明显低于rBB/wt。上述结果表明,PRRSV N蛋白N端非共价键区域是PRRSV N蛋白上调CD83的关键区域,PRRSVN蛋白通过Sp1及NF-κB信号通路诱导CD83表达,从而丰富了 PRRSV免疫抑制理论基础。3.PRRSV nsp10蛋白诱导树突细胞CD83表达及其分子机制本研究采用截断体和丙氨酸基因突变技术,构建了 8个连读5aa突变体及多个点突变体重组质粒,与pCD83报告基因共转染Marc-145和HEK293细胞,采用CD83双荧光报告基因检测系统检测,结果显示:nsp10的第192至196aa和214-216aa残基,均能够上调CD83启动子活性。利用PRRSV BB0907毒株感染性cDNA克隆（pBB/wt）,通过PCR方法构建了 nsp10位点基因突变体,拯救获得nsp10蛋白第192-196和214-216aa 突变重组PRRSV[rP192-196A,rG214-216]及其回复病毒[rP192-196A（R）和rG214-216（R）]。Nsp10基因突变重组PRRSV空斑和生长特性与其野生重组病毒rBB/wt相似,但rP192-196A和rG214-216对CD83启动子调节活性明显低于rBB/wt、rP192-196A（R）和rG214-216（R）。将重组病毒接种MoDCs后测定CD83蛋白水平,rP192-196A 和 rG214-216 对 CD83 诱导能力也明显低于 rBB/wt、rP192-196A（R）和rG214-216（R）。此外,Sp1 siRNA及NF-κB抑制剂均能够阻断PRRSV及Nsp10重组质粒对CD83启动子的激活,但对rP192-196A和rG214-216激活CD83启动子活性无明显影响。rP192-196A和rG214-216感染MoDCs诱导的Sp1和NF-κB mRNA水平明显低于rBB/wt组。上述结果表明,PRRSV nsp10的P192-196aa及G214-216aa是PRRSV Nsp10上调CD83的关键区域,PRRSV Nsp10也通过Sp1及NF-κB信号通路诱导CD83表达。4.PRRSV通过sCD83介导抑制MoDCs免疫调节作用本研究利用大肠杆菌表达系统和重组蛋白纯化技术,制备sCD83重组蛋白。将sCD83重组蛋白预处理MoDCs并与PBMC分离的T细胞共培养,结果显示,随着sCD83剂量的增加,T细胞增殖明显减低。采用CD83抗体预先封闭MoDCs后,则其丧失对T细胞增殖的抑制能力。Western blot检测结果显示,sCD83蛋白以剂量依赖的方式抑制LPS刺激的MoDCs中TAP1和ERp57蛋白的表达,表明sCD83能够明显抑制T细胞的增殖,降低MoDCs细胞抗原提呈能力。将PRRSV感染的MoDCs与PBMC中T细胞共培养结果显示,PRRSV感染能够抑制MoDCs促进T细胞增殖,采用CD83抗体封闭MoDCs,PRRSV抑制作用明显降低。同时,PPPSV感染明显抑制MoDCs中TAP1和ERp57蛋白表达。上述结果表明,PRRSV通过诱导sCD83抑制MoDCs抗原提呈及MoDCs介导的T淋巴细胞增殖作用,丰富了 PRRSV免疫抑制机制理论基础。5.PRRSV nsp1通过sCD83介导抑制MoDCs免疫调节作用及其关键氨基酸位点本研究构建了 PRRSV BB0907毒株nsp 1、nsp 1 α及nsp 1 β真核表达质粒,发现仅nsp1α具有上调CD83启动子活性功能。根据nsp1α功能域构建nsp1α截断体,同时利用丙氨酸突变技术构建10个半胱氨酸位点突变的重组质粒,发现nsp1α上调CD83的功能区域位于锌指结构域,nsp1α的C8半胱氨酸对上调CD83也有重要作用。针对锌指结构域,构建12个连续4-6个氨基酸突变的重组质粒及多个点突变重组质粒,发现nsp1α调节CD83的功能位点位于第5aa、6aa、45aa、48aa及61-66aa。因此,构建了 PRRSV BB0907 毒株 nsp1α 第 5-2aa、45a/48a 及 61-6aa 单突变重组病毒[rL5-2A、rG45/G48A、rL61-6A]及双突变体病毒rNsp1α-2m和rNsp1α-3m,随后构建了回复病毒[rL5-2A（R）、rG45/G48A（R）、rL61-6A（R）、rNsp1α-2m（R）和 rNsp1α-3m（R）]。除了 rL5-2A和rNsp1α-3m,其他突变重组病毒空斑和生长特性与其野生重组病毒 rBB/wt 相似,rL5-2A、rG45A/G48A、rL61-6A、rNsp1α-2m 和 rNsp1α-3m 重组PRRSV上调CD83启动子活性明显下降,表明PRRSV nsp1α锌指结构域5-2aa、45a、48a及61-66aa与上调CD83作用密切相关。为了进一步检测nsp1α的免疫抑制效应,将nsp1α突变重组PRRSV感染MoDCs,检测MoDCs抗原提呈相关蛋白TAP1和ERp57表达水平及PRRSV感染MoDCs对T细胞增殖能力,结果显示,与野生重组病毒相比,nsp1α 突变重组病毒 rL5-2A、rG45A/G48A、rL61-6A、rNsp1α-2m 和 rNsp1α-3m感染细胞TAP1和ERp57表达水平明显回升,且T细胞增殖能力也显着回升,表明突变体病的的抑制效应不同程度丧失。上述结果表明,PRRSV nsp1通过sCD83介导抑制MoDCs免疫调节作用,其关键氨基酸位点是第5-6aa、45aa、48aa及61-66aa,从而丰富了 PRRSV nsp1α能够引起机体的免疫抑制的理论基础。
李昌[9]（2008）在《新型抗HIV-1蛋白西诺维恩、格瑞弗森及其重组导向制剂构建、表达与活性研究》文中研究表明本研究针对当前AIDS/HIV治疗中面临的病毒变异快、病毒感染细胞贮存池难以清除、病毒感染造成机体免疫功能损伤等关键问题,以构建具特异杀伤和免疫治疗双重功能的基因工程制剂为目标,筛选能够与HIV-1膜蛋白特异结合的抗病毒蛋白西诺维恩（CVN）、格瑞弗森（GRFT）以及免疫诱导因子金黄色葡萄球菌外毒素A（SEA）为研究对象,利用细菌和酵母表达系统,获得了重组抗病毒蛋白CVN、GRFT及其偶联SEA的重组导向制剂CS、GS,对其进行初步活性分析。同时制备了稳定表达中国流行株HIV-1膜蛋白的靶细胞模型,利用该模型,通过免疫印迹（Western blot）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、间接免疫荧光测定（IFA）、细胞毒性T淋巴细胞（CTL）杀伤试验等,对CVN、GRFT及其重组导向制剂CS、GS的体外结合活性、细胞结合活性及细胞杀伤活性进行研究。结果表明,成功获得了抗病毒蛋白和重组导向制剂,并且都具有良好的细胞结合活性。重组导向制剂可非特异性活化PBMCs、特异性介导CTLs杀伤表达HIV-1膜蛋白的靶细胞,为该制剂进一步推向临床奠定了基础。
向梦蓉[10]（2019）在《寨卡病毒感染早期NS1抗原快速诊断方法的建立及宿主免疫状态对诊断的影响》文中提出研究背景黄病毒属是一类通过蚊虫传播的RNA病毒。因我国南部地处热带亚热带地区,全年平均气温高,气候湿热,特别适合于各种虫媒性病原体的繁殖,成为急性虫媒病毒性传染性疾病的自然疫源区和发生地,尤其是广东省,出入境人流量大,因此本地输入和流行的风险极高。ZIKV为黄病毒属家族成员之一,自1947年首次分离出来至2007年以前因其温和性而鲜为人知。后于2007年在太平洋岛首次爆发后,间断有亚热带地区报道ZIKV的流行,随着疫情的爆发,神经系统并发症发生率在增加。在2015年末南美和中美洲的疫情中,巴西报道了几千例疑似新生儿小头症病例。截止至2017年底,共有80多个国家和地区报告了蚊子传播ZIKV感染的证据,而且还存在进一步扩大和跨境的风险。在我国2016年2月报道了第一例输入寨卡病例后,截至2017年5月,共有25例ZIKV感染病例,我国输入省份又以广东省最多为15例,占输入病例总数的60.0%。随着疫情的扩大,以及其侵害神经系统导致长远不良影响的特点,我国作为潜在自然疫情区,应储备好相应的诊治应对手段,尤其是早期快速可区分其他黄病毒的诊断。在早期诊断上,可以参考同为黄病毒属的重要成员之一——登革病毒,因我国南部已存在多个自然疫源地,在诊断方面,DENV诊断手段较ZIKV多且较成熟,除了核酸诊断外,DENV的免疫层析快速诊断在临床已成为初筛手段,其中包括了IgM/IgG以及NS1（non-structural protein 1,NS1）的胶体金免疫层析（GICA）快速检测。尤其是病毒抗原NS1,其作为来自DENV感染细胞的可溶性六聚体分泌,并在感染患者的血流中循环。NS1在病毒血症阶段可同时检测到,并且在病毒血症阶段后仍可检测到,提供比病毒RNA更长的诊断窗口,因此常常作为诊断靶标之一。快速准确的诊断对于疫情爆发时迅速的临床管理至关重要。因此无论在ZIKV还是DENV,联合早期快速检测,多策略进行诊断对疫情的控制无疑是增益的。第一部分寨卡病毒感染早期快速抗原检测方法的建立研究目的建立检测NS1抗原的免疫层析胶体金试纸方法,用于寨卡病毒（ZIKV）感染的早期诊断。研究方法对已获得的5株人源抗ZIKV NS1的单克隆抗体采用生物膜层光学干涉法进行抗体亲和力测定实验和竞争抑制实验,又通过两两随机组合配对方法筛选出最佳捕获抗体及包被抗体,制备成胶体金试纸。分别用重组NS1蛋白、感染ZIKV细胞培养上清液以及感染DENV病人血清/血浆多种检测样品以获得准确的特异性和敏感性。其中病毒定量采用FFA（Focus-Forming Assay,FFA）方法。研究结果1.抗体的配对及NS1抗原胶体金试纸的制备在亲和力测定实验中,5株抗体对ZIKV NS1有着较高的亲和力。通过竞争抑制实验,ZKns3G2、ZKns4B8抗体的抗原结合位点相似归为一类,另外3株抗体ZKns4F10、ZKns14G5、ZKns2E11的抗原结合位点相似归为另一类。通过随机配对原则,最终筛选以ZKns2E11为包被抗体,用胶体金标记的ZKns3G2为检测抗体,并成功构建胶体金试纸。2.胶体金试纸的敏感性与特异性鉴定在试纸敏感性分析中,用31.25ng/ml ZIKV重组NS1蛋白以及用2×104FFU/ml的ZIKV病毒量感染细胞所释放的NS1蛋白进行检测,该试纸条可在有效时间内读出阳性结果。试纸在其特异性上,无论是重组蛋白、感染病毒细胞培养上清液还是临床样本,与DENV均不交叉,表现出良好的特异性。结论1.从感染ZIKV恢复期患者分离获得的5株抗体与ZIKV NS1蛋白均有很强的结合活性;2.抗体根据结合位点可分为两类,一类为ZKns3G2和ZKns4B8,另一类为ZKns4F10、ZKns2E11、ZKns14G5;3.以ZKns2E11为包被抗体,以ZKns3G2标记胶体金作为捕获抗体制备的试纸条,具有较好的敏感性,可检测出31.25ng/mlZIKV重组NS1蛋白,且与DENV均不交叉,表现出良好特异性。可作为临床核酸诊断寨卡病毒病的补充,为DENV流行区ZIKV诊断提供技术储备。第二部分宿主免疫状态对NS1胶体金诊断的影响研究目的分析2018年7、8月临床出现的登革病毒感染的患者,其病毒抗原血症水平、宿主免疫状态及感染病毒株类型对早期诊断的影响。研究方法对2018年7、8月在广州市第八人民医院住院并通过RT-PCR确认的DENV-2感染的15名患者的实验室数据进行简单分析。收集到其中7名患者在住院期间的血清/血浆（其中漏诊病例收集了发病第5、6和32天血清/血浆）,均进行NS1、IgM/IgG ELISA检测,分析患者体内NS1抗原以及抗体分泌水平。并对上述样本进行病毒RNA提取,后扩增及构建质粒,获取E、NS1全长序列。通过氨基酸序列比对以及进化树的绘制,获得可能的基因突变位点以及感染病毒株基因分型,进一步分析其对早期诊断的影响。研究结果1.临床资料的收集及整理收集的15例的实验室数据中,NS1快速检测的12个个体中有11个显示弱阳或阳性,且与其对应的RT-PCR结果一致。至于IgM/IgG快速检测,大多数病例（8/10）在第6天之前均为阴性。2.NS1和IgM/IgG ELISA检测漏诊病例（pt3）的第5、6天血清/血浆样本在NS1 ELISA检测方法中OD值分别为0.21和0.32（临界值=0.16）,在IgM、IgG ELISA检测中均为阴性。仅第32天血浆样本在IgM ELISA检测中为阳性,而IgG检测中,第5、6、32天采集的血清/血浆均为阴性。而其他患者收集的样本中,IgM ELISA检测中5名患者为阳性但在快速检测中仅一个样本呈弱阳性,对于IgG ELISA检测中,有两名患者的血清/血浆样本为阳性,而快速检测为阴性。3.E、NS1基因序列的获得及分析成功从5份样本中扩增获得E基因序列,以及从4份样本中扩增获得的NS1基因序列,上传至Genbank数据库。在E序列及NS1序列的比对中,2018年分离获得的病毒株之间E、NS1蛋白氨基酸序列非常相似,仅仅只有几个氨基酸的不同,其中获得的E、NS1蛋白氨基酸序列中,有与pt3完全一致的。获得株均为DENV-2全球基因型,在基于E基因的分子进化树中获得株可为三个分支,其中从pt3分离的DENV-2病毒株所属的分支,与印度的2013年流行株（MH822956）亲缘性相近,另外两个分支中,分别与肯尼亚共和国2017年流行株（MG779202）及马来西亚2013年流行株（KJ806783）有较近的亲缘关系;在基于NS1基因的分子进化树中,根据获得序列可分为两个分支,其中一个分支（分别从pt3、pt2、pt6分离获得）与印度的2013年流行株（MH822956）亲缘性相近,另一分支（从pt10分离获得）与印度尼西亚2008年流行株（KC762671）亲缘性相似。结论1.宿主的免疫状态可以影响抗原快速检测的敏感性;2.从E蛋白序列分析表明,2018年DENV-2存在2个病毒株流行,均为全球性基因型,且本研究中病例均属于输入性病例,传播来源主要为东南亚地区;3.本研究中DENV-2感染者低NS1抗原血症能与宿主有关,提示对于高度疑似病例应采取多种策略以协助诊断。
二、HEPES诱导增强细胞病变中和试验在肾综合征出血热病毒株和病人血清分型的应用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、HEPES诱导增强细胞病变中和试验在肾综合征出血热病毒株和病人血清分型的应用（论文提纲范文）
（4）山东地区肾综合征出血热宿主和流行病学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第1章 山东地区HFRS野生动物宿主的流行病学调查 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 HFRS家畜宿主的流行病学调查 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 山东地区肾综合征出血热病人血清流行病学研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 应用RT-nested PCR结合RFLP／SSCP对山东肾综合征出血热重疫区病人血清的HV基因分型 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 参考文献 |
| 附录：山东地区流行病调查点分布图 |
| 综述(一) |
| 综述(二) |
| 发表论文和获奖目录(及影印件) |
| 致谢 |
| 原创性声明及版权使用授权说明 |
（5）狂犬病病毒不同毒株的生物学特性和狂犬病暴露后免疫动物模型研究（论文提纲范文）
| 第一部分 狂犬病病毒不同毒株的生物学特性研究 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 1、实验材料 |
| 2、实验方法 |
| 实验结果 |
| 1、直接免疫荧光实验结果 |
| 2、细胞病变实验结果 |
| 3、空斑形成实验结果 |
| 4、小鼠毒力实验结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 金黄地鼠作为狂犬病暴露后免疫动物模型的可行性研究及其初步应用 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 1、实验材料 |
| 2、实验方法 |
| 实验结果 |
| 一、金黄地鼠作为狂犬病暴露后免疫动物模型可行性研究结果 |
| 二、金黄地鼠作为狂犬病暴露后免疫动物模型的初步应用结果 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词 |
| 致谢 |
（6）陕西省汉滩病毒人源分离株全基因组序列分析及血清学特性研究（论文提纲范文）
| 英文缩略语 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 陕西省汉滩病毒分离株全基因组测序及进化分析 |
| 引言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 陕西省汉滩病毒分离株血清学特性研究 |
| 引言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 全文总结 |
| 引用文献 |
| 致谢 |
（7）病毒样颗粒抗原及克里米亚刚果出血热病毒Gn/Gc宿主相互作用组的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 病毒样颗粒疫苗的研究进展 |
| 1.1.1 病毒样颗粒疫苗的简介 |
| 1.1.2 病毒样颗粒疫苗的表达系统 |
| 1.1.3 病毒样颗粒疫苗发展面临的挑战和解决方案 |
| 1.2 寨卡病毒及其疫苗的研究进展 |
| 1.2.1 寨卡病毒的流行病学 |
| 1.2.2 寨卡病毒的分类 |
| 1.2.3 寨卡病毒结构和基因组结构 |
| 1.2.4 寨卡病毒的生命周期 |
| 1.2.5 寨卡病毒E蛋白的结构和功能研究 |
| 1.2.6 寨卡病毒疫苗的研究进展 |
| 1.3 脊髓灰质炎病毒及其疫苗的研究进展 |
| 1.3.1 脊髓灰质炎的流行现状 |
| 1.3.2 脊髓灰质炎病毒的生物学 |
| 1.3.3 脊髓灰质炎疫苗的研究进展 |
| 1.4 克里米亚刚果出血热病毒的研究进展 |
| 1.4.1 CCHFV的生物学 |
| 1.4.2 CCHFV的临床流行病学 |
| 1.4.3 CCHF的预防 |
| 1.4.4 CCHFV疫苗的研究进展 |
| 1.4.5 CCHFV单克隆抗体的研究进展 |
| 1.5 本论文的研究内容和意义 |
| 第2章 寨卡病毒样颗粒的构建和免疫原性研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 细胞、病毒与菌株 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 抗体与抗体制备 |
| 2.1.4 重组杆状病毒v Ac-Zpr ME的构建 |
| 2.1.5 ZIKV病毒蛋白的表达和鉴定 |
| 2.1.6 ZIKV病毒样颗粒和病毒粒子的纯化与检测 |
| 2.1.7 ZIKV VLPs的免疫原性评价 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 重组杆状病毒v Ac-Zpr ME的构建 |
| 2.2.2 ZIKV pr M和 E蛋白形成VLPs |
| 2.2.3 ZIKV VLPs的免疫原性研究 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 基于杆状病毒表达的VLP诱导合胞体现象的抗黄病毒药物筛选方法的建立 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 细胞、病毒、菌株与质粒 |
| 3.1.2 试剂 |
| 3.1.3 抗体与抗体纯化 |
| 3.1.4 重组杆状病毒的构建 |
| 3.1.5 质粒的构建及转染实验 |
| 3.1.6 序列比对和进化分析 |
| 3.1.7 免疫荧光分析 |
| 3.1.8 ZIKV滴度测定(空斑实验) |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 杆状病毒表达的黄病毒E蛋白诱导Sf9细胞形成合胞体 |
| 3.2.2 黄病毒E蛋白在Sf9细胞中的细胞定位研究 |
| 3.2.3 ZIKV prME和E蛋白形成VLPs |
| 3.2.4 基于杆状病毒表达的黄病毒E蛋白诱导合胞体现象的抗病毒筛选 |
| 3.2.5 AMS通过影响病毒入侵抑制黄病毒感染 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 脊髓灰质炎病毒样颗粒的构建 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 细胞与菌株 |
| 4.1.2 试剂 |
| 4.1.3 抗体与抗体制备 |
| 4.1.4 重组杆状病毒的构建 |
| 4.1.5 病毒样颗粒的纯化和鉴定 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 PVⅡP1多克隆抗体的制备和鉴定 |
| 4.2.2 重组杆状病毒的构建 |
| 4.2.3 PVⅡVP0,VP1和VP3 蛋白形成VLPs |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 克里米亚刚果出血热病毒样颗粒的构建 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 细胞、病毒与质粒 |
| 5.1.2 试剂 |
| 5.1.3 抗体 |
| 5.1.4 重组杆状病毒的构建 |
| 5.1.5 病毒样颗粒的纯化和鉴定 |
| 5.2 实验结果 |
| 5.2.1 重组杆状病毒v Ac-Gn Gc NP和 v Ac-Gn Gc的构建 |
| 5.2.2 CCHFV VLPs的纯化和鉴定 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第6章 CCHFV膜蛋白Gn/Gc单克隆抗体的制备及表位鉴定 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 菌株、质粒与细胞系 |
| 6.1.2 试剂 |
| 6.1.3 CCHFV膜蛋白Gn/Gc胞外区的诱导表达 |
| 6.1.4 单克隆抗体制备的流程 |
| 6.1.5 小鼠血清和杂交瘤细胞上清识别能力的检测 |
| 6.1.6 单克隆抗体线性识别位点的鉴定 |
| 6.2 实验结果 |
| 6.2.1 小鼠血清的检测 |
| 6.2.2 CCHFV膜蛋白Gn/Gc单克隆抗体的筛选 |
| 6.2.3 CCHFV膜蛋白Gn/Gc单克隆抗体识别表位的鉴定 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 第7章 CCHFV膜蛋白Gn/Gc宿主相互作用组的研究 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 细胞、病毒、菌株与质粒 |
| 7.1.2 试剂 |
| 7.1.3 抗体 |
| 7.1.4 细胞转染 |
| 7.1.5 免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP) |
| 7.1.6 非标定量质谱分析 |
| 7.1.7 生物信息学分析 |
| 7.1.8 免疫荧光和共聚焦实验 |
| 7.2 实验结果 |
| 7.2.1 诱饵蛋白Gn/Gc及其宿主互作蛋白的SDS-PAGE和 Western blot分析 |
| 7.2.2 膜蛋白Gn/Gc宿主互作蛋白的非标定量质谱分析 |
| 7.2.3 膜蛋白Gn/Gc宿主互作蛋白的GO和 KEGG通路富集分析 |
| 7.2.4 膜蛋白Gn/Gc宿主互作蛋白的相互作用网络分析 |
| 7.2.5 间接免疫荧光验证质谱结果 |
| 7.3 讨论 |
| 7.3.1 线粒体 |
| 7.3.2 内质网 |
| 7.3.3 细胞骨架 |
| 7.3.4 外泌体和囊泡 |
| 7.4 小结 |
| 第8章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（8）猪繁殖与呼吸综合征病毒上调猪树突细胞CD83的表达及其分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 猪繁殖与呼吸综合征病毒基因功能及致病机制研究进展 |
| 1 病毒基因及编码蛋白功能 |
| 1.1 病毒粒子和基因组结构 |
| 1.2 病毒蛋白功能 |
| 2 病毒致病性及免疫特性 |
| 2.1 病毒致病性 |
| 2.2 病毒免疫特性 |
| 3 病毒与宿主免疫应答 |
| 3.1 病毒抑制宿主天然免疫应答 |
| 3.2 病毒影响干扰素的产生 |
| 4 病毒感染引起的炎性反应 |
| 4.1 PRRSV与抗炎因子IL-10 |
| 4.2 PRRSV与促炎因子TNF-α |
| 4.3 PRRSV诱导的炎性反应 |
| 5 CD83分子概述 |
| 5.1 CD83的结构和生物学特性 |
| 5.2 CD83分型及生物学功能 |
| 6 PRRSV先天性免疫相关信号通路 |
| 6.1 PRRSV与NF-κB信号通路 |
| 6.2 Sp1信号通路 |
| 7 树突细胞(Dendritic cells)生物学特性 |
| 8 本研究的研究目的和意义 |
| 参考文献 |
| 第二章 猪繁殖与呼吸综合征病毒诱导树突细胞CD83表达及关键功能蛋白的探寻 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 质粒与病毒 |
| 1.2 仪器与试剂 |
| 1.3 病毒增殖与滴度测定 |
| 1.4 PBMC分离与MoDCs制备 |
| 1.5 流式细胞术检测CD86和CD83 |
| 1.6 实时荧光定量PCR(qRT-PCR) |
| 1.7 夹心ELISA检测sCD83蛋白 |
| 1.8 CD83启动子基因克隆鉴定 |
| 1.9 CD83启动子报告载体的构建 |
| 1.10 去内毒素质粒提取 |
| 1.11 双荧光报告基因Luciferase检测系统验证CD83启动子活性 |
| 1.12 PRRSV对pCD83的作用 |
| 1.13 PRRSV编码蛋白真核表达质粒的构建 |
| 1.14 Western blotting |
| 1.15 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 MoDCs制备与鉴定 |
| 2.2 PRRSV感染对MoDCs分泌CD83蛋白水平的影响 |
| 2.3 PRRSV不同毒力毒株上调CD83的比较 |
| 2.4 PRRSV感染诱导CD83上调具有剂量依赖性 |
| 2.5 PRRSV诱导CD83上调具有时间依赖性 |
| 2.6 猪CD83启动子的克隆和序列分析 |
| 2.7 猪CD83启动子活性的鉴定 |
| 2.8 PRRSV编码蛋白真核表达质粒的构建与鉴定 |
| 2.9 PRRSV及其编码蛋白对猪CD83启动子活性的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白诱导树突细胞CD83表达及其分子机制 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 质粒与试剂 |
| 1.2 N蛋白截断突变表达载体的构建 |
| 1.3 质粒DNA提取 |
| 1.4 Western-blotting |
| 1.5 PRRSV N基因突变毒株感染性cDNA克隆的构建及病毒拯救 |
| 1.6 重组病毒RNA提取 |
| 1.7 cDNA合成 |
| 1.8 实时荧光定量PCR(qRT-PCR) |
| 1.9 PRRSV空斑实验 |
| 1.10 PRRSV生长曲线的测定 |
| 1.11 重组病毒对Marc-145中pCD83的作用 |
| 1.12 重组病毒对MoDCs中CD83的作用 |
| 1.13 Sp1基因干扰RNA干扰试验 |
| 1.14 信号通路抑制剂的干扰试验 |
| 1.15 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 PRRSV N蛋白对CD83启动子活性的上调作用 |
| 2.3 N蛋白突变体的构建及其对CD83启动子的作用 |
| 2.4 PRRSV感染性cDNA克隆突变体构建及重组病毒拯救 |
| 2.5 PRRSV N蛋白基因突变重组病毒对CD83启动子活性的影响 |
| 2.6 PRRSV突变病毒感染MoDCs后对CD83蛋白水平的影响 |
| 2.8 Sp1 siRNA抑制PRRSVN蛋白CD83启动子的上调 |
| 2.9 NF-κB抑制剂抑制PRRSVN蛋白对猪CD83启动子的激活 |
| 2.10 PRRSV能够诱导MoDCs中Sp1和NF-κB上调 |
| 2.12 PRRSV N蛋白突变体对Sp1及NF-κB mRNA水平的影响 |
| 2.14 PRRSVN蛋白突变体通过Sp1及NF-κB调节CD83启动子活性 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp10诱导树突细胞CD83表达及其分子机制 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 质粒与试剂 |
| 1.2 Nsp10蛋白截断突变表达载体的构建 |
| 1.3 质粒的提取 |
| 1.4 Western-blotting |
| 1.5 PRRSV nsp10突变毒株感染性cDNA克隆构建 |
| 1.6 PRRSV nsp10突变毒株的拯救 |
| 1.7 重组病毒RNA的提取 |
| 1.8 RT-PCR扩增各片段 |
| 1.9 病毒空斑试验 |
| 1.10 病毒生长曲线的测定 |
| 1.11 重组病毒对Marc-145细胞中pCD83的作用 |
| 1.12 重组病毒对MoDCs中CD83的作用 |
| 1.13 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 Nsp10对CD83启动子活性的上调作用 |
| 2.2 Nsp10突变体的构建及其对CD83启动子的作用 |
| 2.4 PRRSV nsp10突变毒株感染性cDNA克隆构建与病毒拯救 |
| 2.5 PRRSV nsp10突变病毒对CD83启动子活性的影响 |
| 2.6 PRRSV nsp10突变病毒感染MoDCs对CD83蛋白水平的影响 |
| 2.7 Sp1 siRNA抑制PRRSV nsp10蛋白CD83启动子的上调 |
| 2.8 NF-κB抑制剂抑制PRRSV nsp10蛋白对猪CD83启动子的激活 |
| 2.9 PRRSV nsp10蛋白突变体对Sp1和NF-κB mRNA水平的影响 |
| 2.10 SP1干扰RNA和NF-κB抑制剂抑制Nsp10蛋白突变重组病毒激活CD83基因启动子活性 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 猪繁殖与呼吸综合征病毒通过CD83介导抑制树突细胞免疫调节作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株与质粒 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 原核表达质粒pGEX-6P-1-sCD83的构建 |
| 1.4 刺激细胞(MoDCs)的制备 |
| 1.5 反应细胞的制备 |
| 1.6 混合淋巴细胞反应 |
| 1.7 sCD83蛋白对树突细胞培介导T细胞增殖的抑制实验 |
| 1.8 PRRSV对树突细胞培养介导T细胞增殖的抑制实验 |
| 1.9 western blotting |
| 1.10 RT-PCR |
| 1.11 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 猪sCD83基因克隆、表达和鉴定 |
| 2.2 sCD83融合蛋白的纯化及其含量的测定 |
| 2.3 sCD83蛋白抗原性测定 |
| 2.4 sCD83作用的MoDCs对T细胞增殖的影响 |
| 2.5 sCD83对MoDCs抗原提呈相关蛋白的抑制效应 |
| 2.6 PRRSV对MoDCs介导的T细胞增殖抑制效应 |
| 2.7 PRRSV对MoDCs抗原提呈相关蛋白的抑制效应 |
| 2.8 PRRSV由CD83介导抑制MoDCs抗原提呈相关蛋白 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp1α诱导树突细胞CD83表达及关键氨基酸位点解析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 质粒与试剂 |
| 1.2 Nsp1α蛋白截断突变表达载体的构建 |
| 1.3 质粒的提取 |
| 1.4 Western-blotting |
| 1.5 利用BB0907毒株感染性cDNA克隆构建相应的突变体和回复体 |
| 1.6 病毒拯救 |
| 1.7 重组病毒RNA的提取 |
| 1.8 RT-PCR扩增各片段 |
| 1.9 空斑试验 |
| 1.10 生长曲线的测定 |
| 1.11 重组病毒对Marc-145中pCD83的作用 |
| 1.12 重组病毒对MoDCs中CD83的作用 |
| 1.13 T细胞的制备 |
| 1.14 混合淋巴细胞反应 |
| 1.15 sCD83蛋白对树突细胞培介导T细胞增殖的抑制实验 |
| 1.16 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 Nsp1α激活CD83报告基因活性 |
| 2.2 Nsp1α截断体以及突变体的构建及其对CD83启动子的作用 |
| 2.3 PRRSV nsp1α突变重组病毒的构建与鉴定 |
| 2.4 PRRSVnsp1α突变病毒对CD83启动子活性的影响 |
| 2.5 PRRSV nsp1α突变病毒对树突细胞中CD83表达的影响 |
| 2.6 PRRSVnsp1α突变病毒对MoDCs介导的T细胞增殖的影响 |
| 2.7 PRRSV nsp1α突变病毒对MoDCs抗原提呈相关蛋白的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 主要创新点 |
| 致谢 |
（9）新型抗HIV-1蛋白西诺维恩、格瑞弗森及其重组导向制剂构建、表达与活性研究（论文提纲范文）
| 内容提要 |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 HIV 感染分子机制及其防治研究现状 |
| 1 AIDS/HIV 的流行情况 |
| 2 HIV 病原学 |
| 3 HIV 感染与致病分子机制 |
| 4 HIV 的进化与变异 |
| 5 AIDS/HIV 防治研究现状 |
| 6 问题与展望 |
| 第二章 抗HIV 重组导向制剂与免疫治疗研究进展 |
| 1 AIDS 靶向治疗的历史、原理及研究现状 |
| 2 AIDS 靶向治疗运载工具研究 |
| 3 AIDS 靶向治疗生物弹头研究 |
| 4 AIDS 新的免疫治疗策略研究 |
| 5 问题与展望 |
| 6 研究目的与意义 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 新型抗病毒基因西诺维恩、格瑞弗森的合成构建、原核表达及多克隆抗体制备 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 抗HIV 重组导向制剂CS、GS 的构建及原核表达 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 重组抗病毒蛋白及其导向制剂的纯化与复性 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 HIV-1 感染靶细胞模型的制备 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 西诺维恩、格瑞弗森及其重组导向制剂活性检测 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第六章 西诺维恩、格瑞弗森及其重组导向制剂在酵母中表达探索研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻博期间发表的学术论文及其他成果 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 致谢 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| CURRICULUM VITAE |
（10）寨卡病毒感染早期NS1抗原快速诊断方法的建立及宿主免疫状态对诊断的影响（论文提纲范文）
| 中英文对照表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 寨卡病毒感染早期快速抗原检测方法的建立 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 宿主免疫状态对NS1胶体金诊断的影响 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 研究生期间发表论文 |
| 致谢 |
四、HEPES诱导增强细胞病变中和试验在肾综合征出血热病毒株和病人血清分型的应用（论文参考文献）
- [1]HEPES诱导增强细胞病变中和试验在肾综合征出血热病毒株和病人血清分型的应用[J]. 俞永新,杨立宏,刘文雪,聂子林. 中华实验和临床病毒学杂志, 1996(04)
- [2]肾综合征出血热病原学研究进展[J]. 宋干. 中国公共卫生, 1996(08)
- [3]中国肾综合征出血热病人血清型研究[J]. 陈化新,王华,贾克丽,罗成旺,刘国敏,余陶,严玉辰. 中国公共卫生学报, 1995(05)
- [4]山东地区肾综合征出血热宿主和流行病学研究[D]. 杨占清. 第一军医大学, 2005(04)
- [5]狂犬病病毒不同毒株的生物学特性和狂犬病暴露后免疫动物模型研究[D]. 汤重发. 中国食品药品检定研究院, 2014(03)
- [6]陕西省汉滩病毒人源分离株全基因组序列分析及血清学特性研究[D]. 马颖欣. 中国疾病预防控制中心, 2016(02)
- [7]病毒样颗粒抗原及克里米亚刚果出血热病毒Gn/Gc宿主相互作用组的研究[D]. 戴诗雨. 中国科学院大学(中国科学院武汉病毒研究所), 2020(02)
- [8]猪繁殖与呼吸综合征病毒上调猪树突细胞CD83的表达及其分子机制[D]. 陈曦. 南京农业大学, 2017(07)
- [9]新型抗HIV-1蛋白西诺维恩、格瑞弗森及其重组导向制剂构建、表达与活性研究[D]. 李昌. 吉林大学, 2008(11)
- [10]寨卡病毒感染早期NS1抗原快速诊断方法的建立及宿主免疫状态对诊断的影响[D]. 向梦蓉. 广州医科大学, 2019(01)