一、实验性肝癌前期病变的研究及中药复方861对其的影响（论文文献综述）
李思怡[1]（2021）在《健脾化瘀解毒法调节NF-κB活性抑制胃“炎-癌”转化细胞迁移机制研究》文中研究指明背景:根据Correa假说,胃癌发生的病理演变过程中由“慢性萎缩性胃炎→肠上皮化生→异型增生”,最终进展为胃腺癌,以上三个阶段癌变风险较高,因而被统称为胃癌前病变（Gastric precancerous lesions,GPL）。基于此,阻断或延缓GPL进展至胃癌,成为预防胃癌的有效措施。“慢性胃炎—萎缩性胃炎—异型增生—胃癌”被称为“炎—癌”链,其中非可控性炎症在GPL“炎—癌”转变中发挥着重要作用,因此在GPL中应用抗炎治疗显得尤为重要。目前现代医学针对GPL的靶向药物仍是空白,虽然临床上常用药维酶素、幽门螺旋杆菌根除法、COX抑制剂等,在一定程度上能延缓慢性萎缩性胃炎进展,具有防治GPL恶变的作用,但存在服用时间较长、疗效不稳定等缺点,中医药对GPL的治疗具有独特优势,而其对GPL精准靶向防治却未得到总结。因此,本论文以胃“炎—癌”转变为切入点,通过探索健脾化瘀解毒法调节NF-κB信号通路介导的胃“炎—癌”转化细胞迁移,深入探讨GPL发病机制及健脾化瘀解毒方干预甚至逆转胃“炎—癌”转变的效应和分子机制。目的:1.采用对致癌因子最为敏感的C57近交系小鼠Balb/c,利用N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍（MNNG）溶液自由饮水进行造模。通过观察胃黏膜病理组织结构变化、GPL分子标志物的表达（Ki67、p53）及小鼠体重摄食情况,建立、筛选并鉴定胃“炎—癌”转化小鼠模型;2.以课题组前期大量研究的中药复方健脾化瘀解毒方为代表方,探讨其通过抑制NF-κB信号通路对胃“炎—癌”转化炎症的改善作用及深入机制;3.在前期研究健脾化瘀解毒方调控NF-κB活性改善胃“炎—癌”转化小鼠炎症的基础上,通过体内外观察胃“炎—癌”转化小鼠胃黏膜及细胞发生早期迁移情况,从NF-κB 信号通路下游深入探讨健脾化瘀解毒方干预甚至逆转胃“炎—癌”转变的信号转导调控机制。方法:1.从不同造模时间、浓度等因素探索胃“炎—癌”转化细胞模型造模条件,创新该细胞模型造模方法,同时针对胃“炎—癌”转化上皮间质转化（EMT）机制,构建胃癌细胞EMT模型,探索健脾化瘀解毒方对胃癌阶段EMT的干预作用,主要通过CCK8法检测细胞存活率、qPCR法检测EMT相关基因表达及划痕愈合实验观察细胞迁移,明确健脾化瘀解毒法代表方胃痞消对细胞迁移的干预效应;2.在前期健脾化瘀解毒法代表方胃痞消的基础上,结合GPL“虚毒瘀”病机,优化得出健脾化瘀解毒方,通过高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）分析健脾化瘀解毒方主要活性成分,将化合物标准品的保留持续时间和质谱、参考化合物的保留持续时间和离子色谱图与健脾化瘀解毒方匹配进行比较,以鉴定健脾化瘀解毒方中的主要成分,建立质量控制标准;3.通过化学诱变剂构建胃“炎-癌”转化小鼠模型,使用JPHYJD干预后,观察小鼠胃黏膜组织结构变化、检测癌症标志物、炎症因子产生情况、炎性细胞浸润情况、NF-κB信号通路活化情况;4.通过化学诱变剂MNNG在体内外分别构建胃“炎-癌”转化小鼠模型、细胞模型,使用健脾化瘀解毒方干预后,观察小鼠胃黏膜组织结构变化及细胞存活情况、细胞迁移相关蛋白表达情况。结果:1.MNNG诱导GES-1复制构建胃“炎-癌”转化细胞模型,模型组细胞出现形态学上的改变,形态多为梭形、纺锤形,并伴有伪足形成,同时细胞极性丧失、排列紊乱;在分子生物学层面,模型组细胞出现分子标志物表达变化,如Vimentin表达（上皮、间质表型标志物）、MMP2表达上调。2.通过HPLC-MS/MS分析对JPHYJD中的四种代表性组分进行鉴定并定量,结果显示,其主要成分包括三七总皂苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、黄芪甲苷和腺苷。此外,检测三七总皂苷、黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和腺苷,通过在前体离子的全MS光谱中提取具有最大强度的片段离子来进行定量,发现三七总皂苷和腺苷均为最丰富的化合物。3.H&E染色及免疫组化染色（IHC）结果显示,MNNG可诱导Balb/c小鼠胃黏膜组织出现胃黏膜萎缩、肠上皮化生、炎性细胞浸润和细胞异型增生等胃“炎-癌转化”关键病理改变,胃“炎-癌转化”小鼠模型构建成功,健脾化瘀解毒方可缓解MNNG诱导的包括胃黏膜病理组织结构改变、促炎Th1细胞浸润和胃黏膜上皮组织癌症标志物Ki67、p53 表达。4.Western-blot结果显示健脾化瘀解毒方可逆转MNNG所诱导的NF-κB/IκB-α活化、COX-2、NADPH氧化酶家庭成员NOX2和NOX4蛋白表达的增加,qPCR检测结果显示健脾化瘀解毒方可显着改善MNNG诱导的炎症因子产生（IL-6、TNF-α）,此外,与阳性药维生素B12（VitB12）相比,高剂量的健脾化瘀解毒方具有更强的抗炎活性。5.另外,NF-κB活化诱导产生“炎症因子风暴”,进而诱导胃“炎-癌转化”过程中发生早期细胞迁移的蛋白活化,Western-blot结果MNNG可在体内外诱导早期细胞迁移相关蛋白的活化,如E-cad、N-cad等,而健脾化瘀解毒方预处理可明显抑制这些蛋白的活化。结论:1.GPLCs发生EMT,可能参与胃癌早期转移,健脾化瘀解毒中药WPX可在一定程度上下调EMT相关基因表达,而抑制细胞迁移,但疗效不显着,在此基础上,健脾化瘀解毒中药需进一步进行优化;2.三七总皂苷、黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、腺苷为健脾化瘀解毒方含量较高的四种有效活性成分,其中三七总皂苷和腺苷均为最丰富的化合物,提示以上化合物可视为健脾化瘀解毒方的化学标记物;3.MNNG可在体内外诱导出现胃“炎-癌转化”,本次动物造模选用对致癌因子敏感的Balb/c小鼠进行造模成功,可稳定模拟胃“炎-癌转化”组织病理变化过程;4.健脾化瘀解毒方可以通过在胃黏膜中介导NF-κB引发的“炎症因子风暴”干预胃“炎-癌转化”进程;同时可能通过抑制其级联反应进而抑制细胞迁移,从而发挥控制甚至逆转胃“炎-癌转化”效应的潜能,进而预防胃癌发生。总之,本研究成功构建胃“炎-癌转化”模型小鼠。健脾化瘀解毒方可能通过调控NF-κB信号通路,抑制其活化导致的“炎症因子风暴”级联反应,调控其下游蛋白。从而在干预胃“炎-癌转化”小鼠胃黏膜萎缩、肠上皮化生、异型增生的基础上,干预胃黏膜上皮细胞受MNNG诱导所发生的早期迁移,进而发挥治疗GPL、预防胃癌的作用。
周怡驰[2]（2021）在《柴芪益肝方治疗肝纤维化的临床和实验研究》文中研究说明中国是肝病大国,多种肝病高发,肝纤维化作为肝病研究和治疗的重要领域,越来越受到重视。肝纤维化是肝脏修复肝损伤引起的异常结缔组织增生和细胞外基质过度沉积的病理改变。肝纤维化存在于大多数慢性肝病中,是慢性肝病向肝硬化发展的必经阶段,甚至可持续进展为肝硬化、肝癌,给患者生命健康带来严重威胁。研究肝纤维化的病因及发病机制、寻找有效的治疗靶点,对于阻止肝病的发展、维护患者的生命健康有很大的意义。近年来,肝纤维化的病理分子生物学机制、临床诊疗技术等取得了长足发展。但目前西医对于抗纤维化疗效尚不确切,缺乏有效的治疗手段。中医药治疗肝纤维化具有确切的优势,已有多种注册适应证为肝纤维化的中成药上市。柴芪益肝方由导师胡世平教授所创,是治疗慢性乙型肝炎肝纤维化的经验方,前期临床和实验研究发现对肝纤维化有较好疗效,但其作用机制尚不清楚。胡教授现任北京中医药大学深圳医院党委书记,广东省名中医,全国基层名老中医师承项目指导老师,深圳市地方级领军人才,获评“南粤最美中医”,从事中医药防治慢性肝病的临床与科研工作30多年,擅长中医、中西医结合治疗肝脏疾病,形成了独特的学术思想体系。目的结合临床回顾性研究、网络药理学预测和动物实验探讨柴芪益肝方治疗肝纤维化的疗效与作用机制,为该方的进一步开发应用提供依据,并分析总结导师胡世平教授“推陈致新”的学术思想及其在柴芪益肝方组方思路中的应用。方法1、临床研究:通过回顾性研究方法,收集2018年1月1日至2021年2月3日期间在北京中医药大学深圳医院肝病科门诊及住院部诊断为慢性乙型肝炎患者的病例资料,并筛选出符合本研究标准的慢性乙型肝炎肝纤维化肝郁脾虚型患者。根据患者所服药物分为常规治疗组和CQYG组,收集所有患者治疗12个月前后的指标,包括主要指标:肝脏硬度值（LSM）、纤维化-4指数（FIB-4）、天门冬氨酸氨基转移酶和血小板比率指数（APRI）、乙肝病毒表面抗原（HBsAg）、乙型肝炎病毒（HBV-DNA）定量;次要指标:谷丙转氨酶（ALT）,谷草转氨酶（AST）,总胆红素（TBiL）,谷氨酰转酞酶（GGT）,白蛋白（ALB）,将所有检测指标进行治疗前后的组内与组间比较。2、网络药理学:检索 TCMSP、TCMID、Swiss Target Prediction、OMIM、Gene Cards等数据库,筛选CQYG治疗肝纤维化的活性成分和潜在作用靶点。借助Cytoscape软件和String数据库,分别构建“药物-成分-靶点-疾病”网络和蛋白互作PPI网络,并进行拓扑学分析,筛选关键药效分子和核心靶点。运用Autodock vina软件进行分子对接,并基于R语言对作用靶点进行GO和KEGG富集分析。3、动物实验:选取50只6周龄SPF级C57BL/6雄性小鼠,随机抽取10只分别纳入空白对照组（CTL）、肝纤维化模型组（Model）、柴芪益肝方低剂量组（CQYG-L）、柴芪益肝方高剂量组（CQYG-H）和水飞蓟素治疗组（Silymarin）,共5组。四氯化碳（carbontetrachloride,CCl4）腹腔注射建立小鼠肝纤维化模型:除空白对照组外,其余各组小鼠腹腔注射含15%CCl4的橄榄油5ml·kg-1,每周2次,连续注射8周。从造模第1天起,柴芪益肝方低、高剂量组小鼠分别灌胃给予0.37 g·kg-1·d-1、0.74 g·kg-1·d-1的柴芪益肝方,水飞蓟素组给予100 mg·kg-1·d-1灌胃。实验结束,摘取所有小鼠肝脏、收集血清,对各组小鼠肝组织进行HE、天狼星红、Masson染色;用自动生化分析仪检测血清AST和ALT的含量;ELISA法检测肝组织中MDA、SOD、GSH-Px和Hyp水平;免疫组化法检测肝组织中α-SMA、Collagen I、Vimentin的表达;免疫荧光法检测肝组织中Ki67+和Lgr5+细胞;提取各组肝组织RNA和蛋白,Real-time PCR和Western blot分别检测肝纤维化小鼠肝组织中NF-κB、TGF-β/Smad、Wnt/β-Catenin信号通路相关靶标mRNA和蛋白表达。结果1、临床研究:共纳入符合标准的患者203人,其中,常规治疗组纳入101人,年龄最大者76岁,最小22岁,平均年龄（41.34±0.90）岁;CQYG组纳入102人,年龄最大者67岁,最小27岁,平均年龄（43.13±0.78）岁,两组年龄无统计学差异（P>0.05）,具有可比性。（1）无创肝纤维化指标（LSM、FIB-4、APRI）在两组患者自身治疗前后比较,以及治疗后的组间比较,均无显着性差异（P>0.05）,但两组治疗后LSM均较治疗前有降低趋势。（2）两组患者自身前后比较,乙型肝炎病毒（HBV-DNA）定量和乙肝病毒表面抗原（HBsAg）治疗前和后均无显着性差异（P>0.05）;CQYG组较常规治疗组治疗后HBsAg显着性降低（P<0.05）,CQYG组治疗后HBV-DNA定量和HBsAg较治疗前均有下降趋势。（3）两组患者自身治疗前后血清肝功能指标（ALT、AST、GGT、TBiL、ALB）均在正常范围内,治疗后组间比较肝功能均无显着性差异（P>0.05）。2、网络药理学预测:共获得121种CQYG治疗肝纤维化的潜在活性成分和257个对应的作用靶点,并筛选出14种关键药效分子及28个核心靶点。点度中心性值前10的核心靶点和关键药效分子具有较好的结合活性。GO和KEGG结果主要涉及炎症反应、氧化应激、成纤维细胞增殖、内皮细胞增殖、调节脂质代谢活动、血管生成、肝再生等生物学过程及TNF信号通路、Th17细胞分化信号通路、IL-17信号通路、PI3K/Akt信号通路、Wnt信号通路、NF-κB信号通路等。3、动物实验研究:与模型组相比,CQYG各组和水飞蓟素组小鼠肝组织形态和胶原沉积较模型组改善,水飞蓟素组和CQYG-H小鼠血清ALT、AST水平均显着降低（P<0.01）;CQYG高剂量组肝组织MDA和Hyp的含量显着低于模型组（P<0.05）,SOD和GSH-Px含量显着高于模型组（P<0.05）;免疫组化结果显示,CQYG组和水飞蓟素组α-SMA、CollagenI、Vimentin阳性表达区域较模型组少;免疫荧光结果显示,柴芪益肝方组Ki67阳性细胞和Lgr5阳性细胞数量均较模型组有增多趋势;CQYG组肝组织中p-NF-κBp65、TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白表达水平较模型组显着降低（P<0.05）;与模型组相比,CQYG-H 肝组织 CollagenI、TGF-β、TNF-α、IL-1βmRNA 的表达水平以及 Collagen I、α-SMA、TIMP-1、TGF-β、磷酸化 Smad2/3、Smad2/3、Smad4、Wnt3a、β-Catenin 蛋白表达均较模型组有不同程度降低,而MMP-9、Smad7蛋白表达水平显着升高（P<0.05）。结论1、临床研究:柴芪益肝方加减联合常规治疗有降低慢乙肝肝纤维化患者肝脏硬度值、HBV-DNA和HBsAg含量的趋势,且在降低HBsAg定量上优于单纯常规治疗。2、网络药理学:柴芪益肝方可能通过槲皮素、白藜芦醇、山奈酚等活性成分作用于丝裂原激活蛋白激酶MAPK1/3/8、原癌基因酪氨酸激酶Src、激活子蛋白Jun等靶点,以及TNF信号通路、Th17细胞分化信号通路、IL-17信号通路、PI3K/Akt信号通路、HIF-1信号通路、Rap1信号通路、Wnt信号通路、NF-κB信号通路等,调节肝脏炎症反应、氧化应激、细胞增殖、肝再生等生物学过程发挥治疗肝纤维化的作用。3、动物实验研究:柴芪益肝方能显着减轻四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化,其作用机制可能减轻氧化应激反应、抑制NF-κB介导的炎症信号通路,下调炎症细胞因子IL-6、TNF-α、IL-1β的释放,减轻肝脏炎症,并通过调节TGF-β/Smad、Wnt3a/β-catenin信号通路,抑制肝星状细胞的活化,调节MMP-9和TIMP-1活性平衡,减少细胞外基质α-SMA、Collagen I、Hyp的合成,促进ECM降解相关。4、“推陈致新”学术思想:导师胡世平教授“推陈致新”的学术思想核心在于顺应人体本身的正气祛邪之势和气血津液各自的新陈代谢过程,协助人体自然排邪,促进疾病向愈。在肝纤维化治疗上,通过“推陈致新”,加强气化动力、调节气机升降,使病理产物消除的同时,人体气血津液正常化生。
张嘉鑫[3]（2021）在《基于弹性蛋白合成及降解探讨益肝消积方干预早期肝硬化的机制研究》文中认为背景:肝硬化（Hepatic cirrhosis,HC）为肝脏受各种损伤因素侵袭,出现以肝纤维化、假小叶为特点的疾病,由乙肝病毒、丙肝病毒、酒精等一种或多种病因引起。5年生存率为14-35%,已成为全球成人死亡率第14高的病因。目前的治疗主要集中在病因与并发症防治方面,肝硬化本身能否被逆转一直存在争议。国内外学者认为,肝硬化实现逆转必然涉及以下三方面环节:细胞外基质（extracellular matrix,ECM）降解,肝细胞再生及肝小叶结构重建。其中,ECM降解为重要前提。近年研究提示,弹性蛋白合成、降解及其交联阻碍了 ECM降解,进而影响逆转过程。弹性蛋白是由肝星状细胞（hepatic stellate cells,HSCs）分泌的,为ECM重要组分。其在正常肝脏中也存在,但含量极低,在肝硬化阶段,沉积迅速。目前,中药单体、复方研究多集中于抗纤维化领域,对早期肝硬化关注较少,需要更多基础研究及高质量的临床试验进一步证实中药疗效优势,并对其相关机制进行深入挖掘。中药复方具有多层次、多靶点的先天优势,但现有研究多聚焦于抑制HSCs活化、促进胶原降解或抗肝窦毛细血管化等方向,尚未对中医药潜在的调控弹性蛋白合成及降解的相关机制进行探索。目的:基于益肝消积方对弹性蛋白合成及降解的调控作用,探索在四氯化碳（CCl4）诱导的肝脏发生损伤形成早期肝硬化病变后,该复方干预早期肝硬化的效果及其可能的机制,以期为益肝消积方进一步成果转化提供理论支撑,同时亦为其它防治早期肝硬化药物的研发提供方向。方法:通过给予SPF级雄性Sprague Dawley大鼠（200±10g）1ml/kg腹腔内注射50%CCl4和橄榄油混合液,2次/周,共6周,构建早期肝硬化模型。7周始,予益肝消积方、阳性对照药（安络化纤丸）,1ml/100g剂量灌胃。空白对照、模型对照组予等剂量蒸馏水灌胃,日1次,持续6周。用生化法检测ALT、AST评估肝功能;行组织病理学染色（HE染色、天狼猩红染色及Masson染色）评估早期肝硬化病变进展、检测肝脏胶原沉积;用弹性纤维染色评估肝脏的弹性蛋白沉积;免疫组织化学染色、免疫荧光染色观察肝组织中TGF-β1、CD68、CD80、CD163和α-SMA表达情况;用蛋白免疫印迹（Western blot,WB）分析以及实时定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）检测 Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、CCL2、CCR2、TGF-β1、TGF-βR-Ⅱ、Smad2/3、P-Smad2/3、Smad4、Smad7、Sp1、TNF-α、Ras、MEK1/2、ERK1/2、MMP-2、MMP-9、MMP-12、TIMP-1的蛋白水平及bFGF、弹性蛋白（Elastin）的mRNA水平变化,进而对益肝消积方干预早期肝硬化的作用及其相关机制进行初步探索。结果:1.模型制备:予50%CCl4/橄榄油混合液,腹腔注射,1ml/kg,2次/周。造模6周后,组织病理染色发现,模型组大鼠肝脏出现大量纤维增生,汇管区增宽,形成假小叶,说明模型制备成功。2.一般情况:益肝消积方治疗组及阳性对照安络化纤丸组大鼠毛色、精神状态、进食量等方面均优于模型组。体重上,治疗组大鼠体重均明显高于模型组（P<0.01）;体重增长趋势上,益肝消积方组优于安络化纤丸组。3.肝功能:与正常组相比,模型组大鼠血清中ALT、AST含量升高显着（P<0.01）。益肝消积方和阳性对照组（安络化纤丸）较模型组显着下降（P<0.05或P<0.01）。与安络化纤丸相比,益肝消积方在改善ALT方面疗效较优。4.肝组织病理学表现:从肝脏外观看,模型组大鼠颜色变暗,体积缩小,表面粗糙,边缘较钝,质地较硬韧,部分肝脏在剥离时与胸膜腔其他组织相粘连,难以剥离。益肝消积方和安络化纤丸治疗后的大鼠肝体积缩小不明显,表面粗糙不明显,质地较柔韧,未发现与胸腔其他组织粘连,较易剥离。此外,通过组织学染色（HE染色、Masson染色、天狼猩红染色）发现,与模型组大鼠相比,益肝消积方和安络化纤丸治疗后的大鼠肝脏炎性细胞浸润程度减轻,病变范围减小,汇管区及周围纤维增生程度减轻,假小叶数量明显减少,且胶原纤维等细胞外基质成分沉积减少（P<0.01）。对比安络化纤丸,益肝消积方抑制胶原沉积的效果较好。说明益肝消积方能够有效抑制炎细胞浸润,减少胶原纤维过度沉积,从而发挥干预早期肝硬化的作用。5.弹性纤维染色结果:为观测弹性纤维变化,我们对其进行了特殊染色。实验发现,在早期肝硬化阶段,模型组弹性纤维含量增多迅速,显着高于空白对照组（P<0.01）。益肝消积方、安络化纤丸治疗组与模型组相比,弹性纤维含量显着减少（P<0.01）,且益肝消积方效果较明显。6.免疫组化、免疫荧光染色结果:与空白对照组相比,模型组TGF-β1、α-SMA、CD68、CD80、CD163阳性表达区域明显增多。与模型组相比,益肝消积方、安络化纤丸组阳性区域明显减少。7.qRT-PCR结果:模型组与空白对照组相比,ElastinmRNA表达量显着升高（P<0.01）。与模型组相比,益肝消积方治疗组ElastinmRNA表达量显着下降（P<0.01）。对比安络化纤丸,益肝消积方减少ElastinmRNA表达更显着;模型组bFGF mRNA较正常组升高显着（P<0.01）。对比模型组,益肝消积方治疗组bFGF mRNA表达量显着下降（P<0.01）。对比安络化纤丸,益肝消积方下调bFGF mRNA表达更显着。8.Western blot 结果:与空白对照组相比,模型组 Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、CCL2、CCR2、TGF-β1、TGF-β RⅡ、P-Smad2/3、Smad4、Ras、Sp1、MMP-2、MMP-9、MMP-12、TIMP-1 蛋白表达含量明显升高（P<0.05 或 P<0.01）,Smad7、TNF-α、MEK1/2 蛋白表达含量明显下降（P<0.05或P<0.01）;与模型组相比,益肝消积方治疗组Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、CCL2、CCR2、TGF-β1、TGF-β RⅡ、P-Smad2/3、Smad4、Ras、Sp1、MMP-2、MMP-9、MMP-12、TIMP-1 蛋白表达含量明显降低（P<0.05 或 P<0.01）,Smad7、TNF-α、MEK1/2蛋白表达含量明显上升（P<0.05或P<0.01）。结论:1.予50%CCl4/橄榄油混合液,腹腔注射,1ml/kg,2次/周,共6周,可成功制备早期肝硬化大鼠模型。予益肝消积方干预后,可改善早期肝硬化大鼠体重、肝功能;有效抑制早期肝硬化大鼠肝脏炎性细胞浸润,肝细胞变性、坏死,胶原纤维（Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ）、弹性纤维等ECM沉积,改善病变程度。2.益肝消积方可抑制α-SMA表达,下调CD68、CD80、CD163表达量,抑制CCL2-CCR2通路,进而具有抑制HSCs激活,抑制单核/巨噬细胞浸润,及向M2型巨噬细胞极化,阻止单核/巨噬细胞向损伤肝组织部位迁移,减少Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ和Elastin含量,发挥干预早期肝硬化的作用。3.益肝消积方能通过 TGF-β1/Smads、TGF-β1/Ras/ERK 和 bFGF、TNF-α/MEK/ERK信号转导通路抑制胶原纤维、弹性纤维等ECM合成,发挥干预早期肝硬化的作用。4.益肝消积方可通过调节MMPs/TIMPs酶系,促进胶原纤维、弹性纤维等ECM降解,达到干预早期肝硬化的作用。
袁子文[4]（2020）在《黄连解毒汤治疗小鼠急性溃疡性结肠炎疗效的评价及其作用机制研究》文中进行了进一步梳理黄连解毒汤（Huang-lian-Jie-du decoction,HLJDD）是清热解毒的代表方剂,可用于治疗胃肠道疾病。溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis,UC）是一种以结直肠黏膜及黏膜下层炎症和溃疡性病变为主的炎症性肠病。为探讨HLJDD对急性UC的治疗效果及其作用机制,本研究评价了HLJDD对小鼠急性UC模型的疗效,并从分子水平对其部分作用机制进行了研究。进一步通过体内药效学实验筛选了HLJDD抗溃疡有效部位,并探讨了HLJDD及其有效部位对UC模型小鼠肠道菌群的影响。在此基础上,结合代谢组学技术与分子模拟对接技术,深入探讨了HLJDD及其有效部位抗溃疡作用机制。方法及结果:（1）给予BABL/c小鼠3.5%葡聚糖硫酸钠饮水使其连续自由饮用7天以建立小鼠急性UC模型,造模的同时每天分别灌胃高（9.2 g/kg）、中（4.6 g/kg）、低（2.3 g/kg）剂量的HLJDD进行治疗,并以柳氮磺胺吡啶（0.45 g/kg）为阳性对照药物。试验期间对各组小鼠临床症状进行疾病活动指数（Disease activity index,DAI）评分。实验结束后,取各组小鼠血浆进行IL-1β,TNF-a和IL-10检测;取结肠组织进行病理学及氧化应激检测,并对各组小鼠结肠组织中NF-κB,Nrf2信号通路关键蛋白及肠粘膜紧密链接蛋白进行WB检测与免疫荧光检测。结果显示,HLJDD能显着缓解UC模型小鼠体重下降及DAI的升高（p<0.05）;显着抑制结肠缩短并减轻结肠病理学损伤（p<0.05）;显着降低血浆和结肠MPO水平（p<0.05）。此外,HLJDD治疗能显着升高UC小鼠血浆IL-10含量;显着降低IL-1β和TNF-a含量;显着抑制结肠NF-κB p65、p-IKKα/β、p-IKBα蛋白表达（p<0.05）;HLJDD治疗后UC小鼠结肠NO,MDA含量显着降低（p<0.05）,而GSH,SOD含量和Nrf2,Keap1蛋白表达水平显着升高（p<0.05）。另外,HLJDD治疗还可增加UC小鼠结肠粘液蛋白分泌,并可显着恢复肠黏膜紧密链接蛋白（ZO-1,Occludin）表达（p<0.05）。以上这些结果以HLJDD中剂量组的效果最佳。（2）利用索氏提取器结合系统溶剂提取法,依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水对HLJDD水煎液的冻干粉进行提取,浓缩干燥后获得HLJDD不同极性部位。建立小鼠急性UC模型的同时分别灌胃HLJDD及其不同极性部位（4.6g/kg,以生药材计算）连续治疗7天,以筛选HLJDD抗溃疡有效部位。采集HLJDD及其有效部位治疗后小鼠盲肠内容物,对肠道菌群16S rRNA的V3V4高变区基因进行测序与分析。结果显示,HLJDD-正丁醇部位（HLJDD-n-butanol,HLJDD-NBA）的得率最高（64.45%）。HLJDD-NBA治疗不但能显着地降低UC小鼠DAI,显着改善结肠组织病理学损伤,而且具有显着的抗炎和抗氧化效果（p<0.05）,且这些作用与HLJDD相比均无明显差异。肠道菌群检测结果显示,HLDD和HLJDD-NBA治疗不仅能显着降低UC模型小鼠肠道菌群α多样性,而且能抑制UC模型小鼠肠道内有益菌群（如:Lactobacillus,Parabacteroides,Prevotella等）相对丰度的减少和病原菌（如:Escherichia,Odoribacter,Alloprevotella等）的滋生。此外,HLJDD和HLJDD-NBA还可显着的纠正UC小鼠肠道菌群功能紊乱。（3）采用基于高效液相色谱串联三重四极杆质谱的代谢组学技术及多元统计分析方法对HLJDD和HLJDD-NBA治疗后UC小鼠血浆代谢物进行检测和分析。分别筛选模型组与各组间差异代谢物,并对共有差异代谢物进行代谢通路的富集分析。最后,查阅文献并采用分子模拟对接技术分析HLJDD或HLJDD-NBA中主要活性成分对潜在靶标代谢通路的分子调控机制。结果显示,HLJDD及HLJDD-NBA均可通过回调UC小鼠体内24个差异代谢物的异常变化而显着的改善UC小鼠代谢功能紊乱,且花生四烯酸代谢通路和甘油磷脂代谢通路为二者作用的靶标代谢通路。进一步的文献研究及分子模拟对接分析结果显示,HLJDD可抑制COX-2蛋白表达,且HLJDD中13个活性成分均具有抑制靶标代谢通路中关键蛋白酶（PLA2和5-LOX）活性的潜力。结论:（1）HLJDD可通过抑制NF-κB信号通路,激活Nrf2信号通路和增强肠粘膜屏障功能而有效地治疗小鼠急性UC;（2）HLJDD-NBA为HLJDD治疗小鼠急性UC的有效部位;（3）HLJDD及HLJDD-NBA均可通过抑制UC小鼠肠道菌群结构紊乱和恢复肠道菌群正常功能而维持UC小鼠肠道菌群稳态;（4）花生四烯酸代谢通路和甘油磷脂代谢通路为HLJDD及HLJDD-NBA治疗小鼠急性UC的靶标代谢通路;（5）HLJDD及HLJDD-NBA可能是通过抑制COX-2蛋白表达,5-LOX和PLA2酶活性来抑制花生四烯酸代谢通路和甘油磷脂代谢通路的异常紊乱,进而治疗小鼠急性UC。综上所述,本研究证实了HLJDD对小鼠急性UC的治疗效果并筛选了其有效部位,也揭示了其部分作用机制,为扩展HLJDD临床应用范围提供了科学依据,也为中药复方精制和抗溃疡新药的研发奠定了基础。
李志国[5]（2020）在《抗纤抑癌方治疗肝癌前病变的疗效观察及作用机制研究》文中研究指明背景:原发性肝癌（简称肝癌）是全球最常见的恶性肿瘤之一,我国每年的肝癌发病率和死亡率非常接近,总体呈上升趋势,表明现有的诊疗策略和措施对降低肝癌的五年总死亡率非常有限,这一现状说明迫切需要将肝癌的防治战略前移。中医药在控制肝癌前病变病情、预防癌变等方面优势显着,开展中医药对肝癌前病变的研究,对降低肝癌的发生率意义重大。目的:明确抗纤抑癌方治疗肝癌前病变的临床疗效,探讨哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）、缺氧诱导因子 1 α（hypoxia inducible factor lα,HIF-lα）及血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）表达在肝细胞恶性转变过程（肝硬化-肝癌前病变-肝癌）中的意义;以缺氧微环境和血管生成相关基因为出发点,基于mTOR/HIF-1 α/VEGF信号通路,揭示抗纤抑癌方对肝癌前病变的调控作用,以期为抗纤抑癌方的进一步临床应用提供有力依据。方法:1.抗纤抑癌方治疗肝癌前病变的疗效观察。回顾性收集2008年1月-2019年1月就诊于北京中医药大学东直门医院44例肝癌前病变患者的资料,纳入的患者均经抗纤抑癌方治疗半年以上。对纳入患者的基本信息、基线实验室检查等进行调查分析,观察肝癌前病变患者在抗纤抑癌方治疗期间肝癌前结节的变化情况（包括癌变率及结节稳定率）,并分析肝癌前病变患者基线指标对临床结局的影响。2.基于数据挖掘分析mTOR、HIF-1α及VEGF在肝癌前病变和肝癌中的表达及意义。从Oncomine和TCGA数据库提取MTOR、HIF1A和VEGFA基因在肝癌组织、肝癌前病变组织、肝硬化组织和正常组织中的表达数据,分析各基因在不同疾病阶段的表达情况;使用Kaplan-Meier Plotter在线数据库对肝癌预后与MTOR、HIF1A和VEGFA表达水平的关系进行生存分析。探讨mTOR、HIF-lα及VEGF的肝组织转录情况在肝细胞恶性转变过程中的意义。3.基于临床病例探讨mTOR、HIF-1α及VEGF在肝细胞恶性转变过程中的表达及意义。纳入肝硬化、肝癌前病变、肝癌三组患者,采集并分离患者血清,用酶联免疫吸附法检测三组患者血清mTOR、HIF-1α、VEGF的含量,同时收集三组患者入组时近1个月的甲胎蛋白及生化指标,对三组患者的指标进行比较分析,着重探讨mTOR、HIF-1α及VEGF的血清水平在肝细胞恶性转变过程中的意义。4.抗纤抑癌方通过mTOR/HIF-1α/VEGF信号通路对肝癌前病变的调控作用。采用二乙基亚硝胺诱导大鼠肝癌前病变模型,造模后第9周开始干预,连续6周,于第14周末取肝组织。HE染色及Masson染色观察肝组织病理情况,免疫组织化学法及Western blot检测肝癌前病变标志物胎盘型谷胱甘肽转移酶（glutathione-S-transferases-π,GST-Pi）表达以判定肝癌前病变的程度,Western blot和实时荧光定量PCR检测葡萄糖转运载体蛋白（glucose transporter-1,GLUT1）、M2 型丙酮酸激酶（pyruvate kinase M2,PKM2）、mTOR、HIF-1α 和 VEGF 蛋白表达及 mRNA水平。结果:1.抗纤抑癌方治疗肝癌前病变的疗效观察。本研究纳入共44例肝癌前病变患者,其中男性38例（86.4%）,女性6例（13.6%）,平均年龄:女性66岁（58-73岁）,男性50岁（29-77岁）,女性患者的年龄明显高于男性（P=0.003）。结局方面,共32例（72.7%）患者癌前结节保持稳定（14例）或变小（18例）,12例（27.3%）变大（9例）或癌变（3例）。在临床基线指标对临床结局的影响方面,癌前结节变大或癌变组的中性粒细胞计数明显低于变小或稳定组（P=0.047）;癌前结节变大或癌变组的谷草转氨酶明显高于变小或稳定组（P=0.032）。2.基于临床病例探讨mTOR、HIF-1α及VEGF在肝细胞恶性转变过程中的表达及意义。本研究共纳入67例患者,其中肝硬化组20例、肝癌前病变组23例、肝癌组24例。肝癌组患者年龄高于肝硬化及肝癌前病变组（P<0.01）。肝细胞恶性转化过程中,AFP、谷草转氨酶、γ-谷氨酰转肽酶、直接胆红素、血肌酐水平逐渐升高（P<0.01）,在肝癌形成阶段达到高峰;白蛋白、胆碱酯酶水平、凝血酶原时间和凝血酶原活动度水平逐渐降低（P<0.05）,在肝癌阶段达到最低。三组患者的血清mTOR、HIF-1α、VEGF水平肝细胞恶性转变过程中呈逐渐升高的趋势（P<0.01）,肝癌组血清mTOR、HIF-1α、VEGF水平较肝硬化组明显升高（P＜ 0.01）。3.基于数据挖掘分析mTOR、HIF-1α及VEGF在肝癌前病变和肝癌中的表达及意义。通过Oncomine和TCGA数据库分析发现,在肝癌与正常组织基因差异表达方面,多数队列表明,MTOR、HIF1A及VEGFA在肝癌组织高表达。在肝癌前病变与肝癌组织的基因差异表达方面,MTOR在肝癌组织高表达,而VEGFA基因在肝癌前病变组织中高表达,HIF1A在肝癌前病变与肝癌组织表达无统计学差异。在肝癌患者的预后方面,HIF1A和VEGFA基因高表达组的预后差（P<0.05）,MTOR高表达组与低表达组的患者预后无显着差异（P>0.05）。4.抗纤抑癌方通过mTOR/HIF-1α/VEGF信号通路对肝癌前病变的调控作用。抗纤抑癌方能明显改善二乙基亚硝胺诱导的大鼠肝癌前病变的病理改变,降低PKM2、GLUT-1的表达,显着下调肝组织中mTOR、HIF-1α和VEGF的mRNA和蛋白表达。结论:1.抗纤抑癌方治疗肝癌前病变可有效降低肝癌的发生率。2.通过数据挖掘及临床病例验证,发现mTOR、HIF-1α、VEGF与肝细胞的恶性转变密切相关。3.抗纤抑癌方可抑制糖酵解相关基因PKM2、GLUT-1的表达,并可抑制mTOR/HIF-1α/VEGF通路,这可能是其治疗肝癌前病变的机制之一。
陶月英[6]（2020）在《胆石六号颗粒抗四氯化碳致大鼠肝纤维化作用及机制研究》文中指出目的:对胆石六号颗粒（DSLHG）中3种特征成分进行含量测定,以期进一步有效地控制其质量;基于DSLHG抗肝纤维化作用,应用网络药理学方法预测其可能的作用途径,并探究其对主要信号通路的影响,阐释DSLHG抗肝纤维化的机制。方法:1.采用高效液相色谱（HPLC）法测定DSLHG中栀子苷、虎杖苷和柚皮苷的含量。2.采用四氯化碳（CCl4）诱导大鼠肝纤维化,检测大鼠血清肝功能及肝纤维化指标水平;HE和Masson染色观察肝组织炎性反应及纤维化程度。3.利用公共数据库筛选DSLHG活性成分,并通过PharmMapper数据库搜索其潜在的作用靶点,建立活性成分与相关靶点基因相互作用的网络,并对DSLHG作用于目标疾病的核心靶点进行GO分析和相关通路富集分析,从分子水平上预测DSLHG抗肝纤维化的可能信号途径。4.采用蛋白免疫印迹法检测PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、Caspase-3、cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白的表达;免疫组织化学法检测大鼠肝脏TGF-β1、α-SMA的表达。结果:1.方法学考察表明,建立的含量测定方法专属性强、简便可靠,测得DSLHG中栀子苷、虎杖苷、柚皮苷的含量分别为3.75 mg/g、2.66 mg/g、3.07 mg/g。2.DSLHG能够显着降低大鼠血清中ALT、AST、ALP、HA、LN、PIIINP和Col IV水平,升高血清ALB水平（P<0.01）,对肝脏病理及纤维化程度有明显改善。3.通过数据库检索发现,DSLHG复方中有108个主要成分,参与调控192个潜在靶点,其中与肝纤维化相关的有86个。网络预测分析结果表明,DSLHG抗纤维化作用主要涉及细胞增殖、信号转导、蛋白质磷酸化等多个生物学过程,通过调节Rap1、PI3K/Akt、FoxO等47条信号通路来发挥抗肝纤维化作用,而排名第二的PI3K/Akt信号通路有可能是其发挥抗肝纤维化作用的关键通路。4.DSLHG对PI3K/Akt信号通路和细胞凋亡相关蛋白表达的影响:（1）WB实验结果表明:与正常组大鼠相比,模型组大鼠肝组织p-PI3K、p-Akt、cleaved Caspase-3/Caspase-3、Bax/Bcl-2水平显着升高（P<0.01,P<0.05）;与模型组比较,阳性对照组（水飞蓟宾）和DSLHG各剂量组明显降低了大鼠肝组织p-PI3K、p-Akt、cleaved Caspase-3/Caspase-3及Bax/Bcl-2水平（P<0.01,P<0.05）。（2）免疫组化结果显示:与正常组大鼠相比,模型组TGF-β1和α-SMA的表达量均有所升高（P<0.05,P<0.01）;而与模型组比较,DSLHG能够有效降低TGF-β1和α-SMA的表达水平（P<0.05）。结论:1.建立的含量测定方法准确可靠,重复性好,实现对栀子、虎杖、枳壳的质量控制,可作为DSLHG质量控制方法之一。2.DSLHG具有抗CCl4诱导大鼠肝纤维化的作用,能够显着改善大鼠肝功能,减缓肝纤维化病变。3.网络药理学预测出DSLHG可通过调控多个靶点和多种途径来发挥抗肝纤维化作用,PI3K/Akt信号通路可能是其抗肝纤维化的关键通路。4.DSLHG可减轻CCl4诱导的大鼠肝纤维化,其机制可能与TGF-β1/PI3K-Akt/Caspase-3依赖的凋亡途径有关。
杨清煜[7]（2020）在《基于BDNF-TrkB通路探讨文王一支笔对D-半乳糖致大鼠肝损伤的保护作用》文中认为【摘要】目的通过对大鼠进行皮下注射D-半乳糖（D-Galactose,D-gal）,建立大鼠肝损伤的模型。用文王一支笔的提取物液进行干预,观察肝损伤大鼠肝组织相关蛋白和病理形态的改变,探讨文王一支笔对肝损伤大鼠肝脏的保护作用及可能的机制,为中医药治疗肝损伤提供理论和实验依据。方法选取雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠60只,根据随机数字表法将其均分为正常组,模型组,文王一支笔低、中、高剂量组,阳性对照组（n=10）。对模型组、文王一支笔各剂量组及阳性对照组的大鼠分别进行100 mg/kg D-gal皮下注射构建肝损伤模型。同时,文王一支笔低、中、高剂量组分别给与50、100、200 mg/kg文王一支笔溶液灌胃干预,阳性对照组给予0.05mg/kg亚硒酸钠灌胃处理。正常组、模型组给予等体积蒸馏水灌胃,持续42d。动物麻醉后灌注取材,采集心脏血检测血清ALT、AST、DBIL;HE染色观察肝组织的形态;免疫组化染色检测脑源性神经营养因子（Brain-derived neurotrophic factor,BDNF）、特异性酪氨酸激酶B受体（Tyrosinekinase receptor B,Trk B）在肝组织中的表达及分布;TUNEL染色检测肝细胞凋亡的情况;蛋白免疫印迹法（Western Blot,WB）检测Bax、Bcl-2、Caspase-3、BDNF、Trkb蛋白的表达;硫代巴比妥酸法、黄嘌呤氧化酶法分别测定肝组织内MDA含量、SOD活性。结果1大鼠肝损伤一般情况:正常组大鼠举止行为敏捷、灵活,毛发色泽明亮,进食和饮水如常,体重增加。与正常组相比,模型组大鼠活动较少,毛发较稀疏,有脱毛表现,进食偏少。与模型组相比,文王一支笔和亚硒酸钠干预后,上述状态均有明显改善,体重也相对增加。2血清检测结果:与正常组相比,模型组大鼠血清中ALT和AST的活性和DBIL的含量明显升高（P<0.05）,说明D-gal对大鼠肝功能有明显的影响,提示D-gal诱导的肝损伤造模成功。与模型组相比,文王一支笔低、高剂量组和亚硒酸钠组（阳性对照组）大鼠血清中ALT、AST活性降低（P<0.05）,且DBIL的含量也呈现降低的趋势（P<0.05）。与模型组相比,文王一支笔中剂量组大鼠血清中ALT、AST活性明显降低（P<0.05）,且DBIL的含量也呈现显着降低的趋势（P<0.05）。3形态学变化:（1）大鼠肝脏解剖变化:正常组大鼠肝脏红润,表面光滑,富有弹性,并无病变;与正常组相比,模型组大鼠肝脏泛黄;与模型组相比,文王一支笔低、中、高剂量组和亚硒酸钠组大鼠的肝脏有所改善。（2）肝组织切片HE染色结果:正常组大鼠肝小叶结构清晰,肝细胞排列整齐,细胞核大而圆,无炎性浸润和病理变化。模型组肝损伤大鼠肝小叶结构不完整,排列紊乱,并出现细胞体积肿胀增大、变性、坏死等现象,可见少许淋巴细胞浸润。药物干预后,文王一支笔各剂量组和亚硒酸钠组可不同程度地改善肝脏受损情况。与模型组相比,文王一支笔低、中、高剂量组和亚硒酸钠组可见较为清晰的肝小叶结构,细胞排列相对整齐,且细胞体积肿胀增大、变性、坏死等情况有所减轻。（3）肝组织BDNF、Trk B的免疫组化结果:在正常组中,大鼠肝组织中无BDNF、Trk B的表达;与正常组相比,模型组大鼠肝组织中BDNF、Trk B阳性表达颗粒明显增多,呈特异性的黄色或棕黄色。与模型组相比,文王一支笔低、高剂量组和亚硒酸钠组大鼠肝组织中BDNF、Trk B阳性表达颗粒降低,且呈现淡黄色。与模型组相比,文王一支笔中剂量组大鼠肝组织中BDNF、Trk B的阳性表达颗粒显着降低,且呈现微黄色。（4）TUNEL检测结果:与正常组相比,模型组肝细胞凋亡明显增多（P<0.05）;与模型组相比,文王一支笔低、高剂量组和亚硒酸钠组凋亡细胞降低（P<0.05）;与模型组相比,文王一支笔中剂量组细胞凋亡叶显着降低（P<0.05）。4大鼠血清中SOD和MDA水平的影响:与正常组相比,模型组肝组织中SOD活性明显降低（P<0.05）,模型组肝组织中MDA含量明显增加（P<0.05）。与模型组相比,文王一支笔低、高剂量组和亚硒酸钠组肝组织中SOD活性升高（P<0.05）,MDA含量降低（P<0.05）;与模型组相比,文王一支笔中剂量组肝组织中SOD活性明显升高（P<0.05）,MDA含量明显降低（P<0.05）。5 Western Blot结果:与正常组相比,模型组大鼠肝组织中的Bcl-2表达量显着下降,Bax、Caspase-3的表达量显着上升（P<0.05）,提示肝损伤大鼠肝细胞凋亡显着。与模型组相比,文王一支笔低、中、高剂量组和亚硒酸钠组的Bcl-2表达量均明显上升（P<0.05）,BAX和Caspase-3的表达明显降低（P<0.05）。正常组中BDNF、Trk B均无表达;与正常组相比,模型组内BDNF、Trk B蛋白的表达明显升高（P<0.05）;与模型组相比,文王一支笔低、中、高剂量组和亚硒酸钠组的BDNF、Trk B的表达含量显着降低（P<0.05）。结论文王一支笔可以通过提高肝组织Bcl-2的表达、抑制Bax和Caspase-3的表达,提高SOD的活性,降低MDA的含量,具有抑制肝细胞凋亡的作用。文王一支笔提取物对肝脏的保护可能与降低肝细胞BDNF和Trk B的表达有关。
谢骏[8]（2020）在《中药筋脉通对糖尿病大鼠的髓鞘保护作用及其对肠道菌群的影响》文中研究指明[目的]从整体和分子水平探讨中药筋脉通（Jinmaitong,JMT）对链脲佐菌素（streptozotocin,STZ）诱导的糖尿病（diabetes mellitus,DM）模型大鼠的髓鞘保护作用及对其肠道菌群的影响,探索中药筋脉通防治糖尿病周围神经病变（diabetic peripheral neuropathy,DPN）的潜在机制。[方法]采用一次性腹腔注射STZ 55 mg/kg的方法制备DM模型大鼠,将造模成功后的DM大鼠按随机数字表法分为三组:糖尿病模型对照组（DM）,筋脉通组（JMT）,神经妥乐平（Neurotropin,NTP）组（NTP）,同时配以同周龄的正常对照组（CON）大鼠。分组后分别按JMT 13.9g/（kg·d）、NTP 1.6单位/（kg·d）灌胃给药,CON组与DM组大鼠予以等量蒸馏水灌胃,每日1次,连续12 w。分别于干预前及干预后4w、8w、12w检测各组大鼠随机血糖和体重。灌胃12w后检测各组大鼠机械痛阈值,并收集大鼠粪便样品,腹主动脉采血后取大鼠坐骨神经组织与足底皮肤组织。光学显微镜及透射电子显微镜下观察坐骨神经的形态变化,免疫荧光法检测大鼠坐骨神经中接触蛋白相关蛋白（contactin-associated protein,Caspr）与淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein,APP）的表达,分析大鼠足底皮肤表皮神经纤维密度（intraepidermal nerve fiber density,IENFD）,酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）法检测大鼠血清神经调节蛋白 1（Neuregulin 1,NRG1）浓度。同时,提取大鼠粪便基因组并进行16S rRNA基因测序,分析正常组与模型组大鼠肠道菌群组成结构的差异,以及筋脉通干预对模型组大鼠肠道菌群的影响;并将组间差异性肠道微生物的丰度与大鼠随机血糖、体重、机械痛阈值、IENFD、NRG1水平等生理、病理观察指标进行相关性分析。[结果]1.血糖、体重及机械痛阈检测:造模后不同时间点,各造模组大鼠随机血糖均较CON组升高（P<0.05）;同一时间点各造模组大鼠之间的血糖无统计学差异（P>0.05）。干预前各组大鼠体重均无统计学差异（P>0.05）;干预后各时间点,各造模组大鼠体重较CON组均明显降低（P<0.001）。除灌胃第8 w NTP组较DM组体重增加外（P<0.05）,其余时间点各造模组大鼠之间的体重无显着差异（P>0.05）。与CON组相比,除JMT组左侧机械痛阈值外,各造模组大鼠左、右两侧机械痛阈值及平均机械痛阈值较CON组均降低（P<0.01）;与DM组相比,JMT组及NTP组左、右两侧机械痛阈及平均机械痛阈值均显着提高（P<0.001）;JMT组与NTP组相比未见统计学差异（P>0.05）。2.坐骨神经病理结构变化:HE染色显示,大鼠坐骨神经组织轴索与髓鞘呈深红色,雪旺细胞细胞核位于髓鞘边缘呈蓝紫色。CON组大鼠坐骨神经组织致密,轮廓规则,髓鞘完整,分布均匀,DM组大鼠坐骨神经组织松散,轮廓不规则,部分神经纤维髓鞘脱失,轴索萎缩,分布稀疏;透射电镜下可见CON组大鼠坐骨神经轴索饱满、均匀,形态规则,髓鞘致密、均一,结构完整,局部可见髓鞘板层轻微断裂;DM组大鼠坐骨神经轴索形态不规则,髓鞘结构紊乱,板层分离形成大量空泡,部分可见髓鞘向轴索及间质突出,形成“瘤状”结构。形态测量学统计分析显示,DM组大鼠每5000 μm2面积内的有髓神经纤维数量明显减少（P<0.001）,结构形态异常的神经纤维比例增高（P<0.05）;JMT组与NTP组大鼠坐骨神经病变与DM组相似,但程度均较DM组减轻,每5000 μm2面积内的有髓神经纤维数量增加（P<0.05）,结构形态异常的神经纤维比例明显减少（P<0.001）;各组大鼠的gratio值（轴索直径与髓鞘外径比值）无统计学差异（P>0.05）。3.免疫荧光法检测大鼠坐骨神经接触蛋白相关蛋白Caspr与淀粉样前体蛋白APP的表达:与CON组相比,DM组大鼠坐骨神经每mm2面积内对称性的郎飞氏结结侧区数量与比例均降低（P<0.01）、非对称性的郎飞氏结半结比例增高（P<0.01）,DM组与NTP组大鼠坐骨神经中APP与βⅢ-tubulin蛋白共定位表达的区域比例升高（P<0.05）;与DM组相比,JMT组大鼠坐骨神经每mm2面积内对称性的郎飞氏结结侧区数量与比例均升高（P<0.05）、非对称性的郎飞氏结半结比例降低（P<0.01）,JMT组大鼠坐骨神中APP与βⅢ-tubulin蛋白共定位表达的区域比例降低（P<0.05）;与NTP组相比,JMT组大鼠坐骨神经每mm2面积内对称性的郎飞氏结结侧区数量增多（P<0.05）,其余指标二者无统计学差异（P>0.05）。各组间非对称性的郎飞氏结半结数量均未见统计学差异（P>0.05）。4.免疫荧光法检测分析大鼠足底皮肤表皮神经纤维密度IENFD:与CON组相比,DM组与NTP组IENFD降低（P<0.05）,JMT组IENFD与CON组相比无统计学差异（P>0.05）;与DM组相比,JMT组ⅢNFD升高（P<0.05）,NTP组与DM组相比无统计学差异（P>0.05）;JMT组与NTP组之间IENFD无统计学差异（P>0.05）。5.ELISA法检测大鼠血清NRG1的表达:与CON组相比,DM组、JMT组及NTP组大鼠血清NRG1浓度均降低（P<0.001）;与DM组相比,JMT组大鼠血清NRG1浓度升高（P<0.01）,NTP组与DM组相比差异无统计学意义（P>0.05）;JMT组与NTP组之间差异无统计学意义（P>0.05）。6.16S rRNA基因测序分析大鼠的肠道菌群结构变化:基于以上实验结果可判定DPN模型成功,就此更名DM组为DPN组。相比CON组,DPN组和JMT组大鼠肠道菌群的Alpha多样性指数明显降低（P<0.001）,DPN组与JMT组之间的Alpha多样性指数无统计学差异（P>0.05）。Beta多样性的 Weighted-UniFrac 与 Unweighted-UniFrac 分析结果均提示,CON、DPN、JMT 三组大鼠肠道菌群的Beta多样性具有显着性差异（P<0.01）。相比CON组大鼠,DPN组大鼠的肠道菌群中显着富集了以下10种差异性肠道微生物:pBacteroidetes,cBacteroidia,oBacteroidales,fPorphyromonadaceae,fPrevotellaceae,fOxalobacteraceae,gKlebsiella,gCoprococcus,gPrevotella,gOxalobacter。相比DPN组,JMT组大鼠的肠道菌群中显着富集了 17种差异性肠道微生物,且其中有 9 种与 CON 组一致:pActinobacteria,pProteobacteria,cBetaproteobacteria,cActinobacteria,cEpsilonproteobacteria,oBurkholderiales,oCampylobacterales,fHelicobacteraceae,gHelicobacter,说明筋脉通对上述9种肠道微生物的丰度具有回调作用。7.差异性肠道微生物丰度与DPN观察指标的Spearman相关性分析:在DPN组与CON组对比时富集到的10种差异性肠道微生物中,所有肠道微生物丰度均与大鼠第12 w随机血糖水平呈正相关（|r|>0.45,P<0.05）,并且与大鼠第12w体重呈负相关（|r|>0.45,P<0.05）;除fPrevotellaceae与大鼠血清NRG1水平无相关性外（|r|<0.40,P>0.05）,其余9种的微生物丰度还同时与大鼠血清NRG1水平呈负相关（|r|>0.45,P<0.05）。在DPN组显着富集的10种差异性肠道微生物中,fPorphyromonadaceae和gPrevotella的丰度同时与大鼠的机械痛阈值和IENFD呈负相关（|r|>0.40,P<0.05）。筋脉通可显着回调的9种肠道微生物的丰度均与大鼠血清NRG1水平呈正相关（|r|>0.40,P<0.05）。除cBetaproteobacteria和oBurkholderiales外,其余7种肠道微生物的丰度均与大鼠机械痛阈值（|r|>0.5,P<0.05）和IENFD（|r|>0.45,P<0.05）呈正相关。其中,pActinobacteria,pProteobacteria 和 cActinobacteria的丰度同时与大鼠第 12 w体重呈正相关（|r|>0.5,P<0.01）,与大鼠第12w随机血糖水平呈负相关（|r|>0.55,P<0.01）。[结论]1.DM大鼠12 w后出现痛觉过敏,坐骨神经病理形态学改变,及足底皮肤IENFD降低,表明DPN模型建立成功;DM大鼠血清NRG1分泌减少,坐骨神经Caspr表达抑制,APP表达增强,符合典型的糖尿病周围神经病变的病理特征。2.筋脉通可通过升高DM大鼠血清NRG1水平,促进坐骨神经Caspr表达,抑制APP表达,增加足底皮肤IENFD,改善其痛觉过敏及坐骨神经病理形态异常,发挥其髓鞘保护作用。3.筋脉通在维持坐骨神经正常结构形态与对称性的郎飞氏结结侧区数量上优于阳性对照药物NTP。4.DPN组大鼠的肠道菌群结构较CON组发生了明显变化,肠道菌群的物种丰富度、多样性与均匀性显着降低,可能通过富集fPorphyromonadaceae和gPrevotella影响DPN的各观察指标。5.筋脉通改变了 DPN大鼠肠道微生物群落的整体组成,回调了 9种在CON组显着富集的差异性肠道微生物,并可能通过富集pActinobacteria、pProteobacteria和c Actinobacteria参与发挥髓鞘保护作用。[创新点]通过整体动物实验,从分子水平研究了中药筋脉通对糖尿病大鼠坐骨神经组织中接触蛋白相关蛋白Caspr、淀粉样前体蛋白APP,以及血清神经调节蛋白1表达的影响,并尝试从肠道菌群的角度解释中药筋脉通防治DPN与发挥髓鞘保护作用的潜在机制,为中药筋脉通治疗DPN的临床应用提供了新的实验依据。
严志祎[9]（2020）在《抑郁症肝郁脾虚证小鼠RIPK1/RIPK3/MLKL介导的坏死性凋亡发生机制及逍遥散的调节作用》文中研究指明研究背景肝郁脾虚证是以出现肝失疏泄、脾失健运相关的病理改变为主的一种中医临床常见证候。《素问》曰:“人或患怒,气逆上而不下,即伤肝也”、“脾藏意,在志为思”、“思则伤脾”、“余知百病生于气也,……,思则气结”、《金匮要略·脏腑经络先后病脉证第一》曰:“见肝之病,知肝传脾,当先实脾,四季脾旺不受邪,即勿补之”。上述这些论述均可说明肝郁脾虚证与人的情志变化和肝脾功能联系紧密,情志不畅等应激刺激可以导致人体生理改变、免疫功能失常以及神经内分泌紊乱等。抑郁症是全球最严重的精神疾病之一,并危及人的生命的健康,抑郁症的临床病理机制尚不明确,各类治疗效果也不一致,因此被认为是一种异质性疾病,并且肝郁脾虚证也是其主要证候类型之一。炎症是机体抵抗外界损伤或疾病发生发展的一种防御性免疫应答,涉及多种疾病和人体各个系统的病理变化。慢性炎症可持续引发细胞功能紊乱,继而引发组织器官功能紊乱和疾病的发生,是疾病发展的关键环节,其导致多种慢性疾病的作用机理已经是现代研究的热门课题之一。在现代研究中发现,抑郁症的发病机制包含免疫系统激活和炎症细胞因子的释放,且肝郁脾虚证涉及中医临床中内、外、妇、儿等多种疾病,发病机制十分复杂,并且与慢性炎症的发生有一定的关联。因此,对慢性炎症物质基础进行研究是解析肝郁脾虚证候机理的一条重要途径。近年来随着对细胞死亡机制研究的深入,发现细胞的坏死并非是无序的,而是具有确切调控分子机制的程序性坏死过程。坏死性凋亡除了会引起显着而广泛的炎性反应外,还是神经元死亡的一种重要方式,涉及多种中枢神经系统损伤机制,同时也包含在肝细胞死亡和肝损伤等相关疾病的机制之中。肝郁脾虚证作为临床的一种常见证候,其发病机制涉及神经内分泌、免疫、消化、代谢等机体多个系统和功能的改变。因此可以推测,肝郁脾虚证的发生和发展可能与坏死性凋亡途径介导的慢性炎症存在一定的联系。研究慢性炎症与坏死性凋亡的相关机制能够为探索坏死性凋亡和肝郁脾虚证之间的联系搭起一座桥梁,以此也能进一步充实肝郁脾虚证的科学内涵。研究目的从目前的研究来看,脂质运载蛋白Lipocalin-2发挥其关键作用的位点在抑郁症和肝郁脾虚证的机制,以及逍遥散作用机理所包含的部位高度重叠,都涉及中枢神经系统、免疫炎症反应、肝脏功能、糖脂代谢以及能量代谢,并且都极有可能与坏死性凋亡途径存在一定的联系。因此,本研究旨在探讨肝郁脾虚证的现代生物学基础是否包括坏死性凋亡途径介导的慢性炎症机制,观察逍遥散能否调节坏死性凋亡途径,以及炎症相关功能蛋白Lipocalin-2是否能作为逍遥散治疗抑郁症肝郁脾虚证的潜在靶点,以期能为逍遥散的应用提供新的理论依据与实验支持,同时也从炎症致病的角度为方证相关的肝郁脾虚证现代研究提供新的思路。研究方法（1）造模采用慢性不可预知温和应激（chronic unpredictable mild stress,CUMS）的方法复制了小鼠抑郁症肝郁脾虚证候病证结合模型。通过小鼠的一般状态以及糖水偏好、强迫游泳、新环境抑制进食、旷场实验等行为评价手段对模型小鼠的“肝郁”表现进行客观评价,然后通过血清D-木糖、体重、进食量等方法评价模型动物的“脾虚”表现。同时通过以方测证,观察逍遥散对抑郁症肝郁脾虚证模型小鼠的治疗作用。（2）检测坏死性凋亡途径在抑郁症肝郁脾虚证模型小鼠海马中的发生情况。采用坏死性凋亡抑制剂Necrostatin-1阻断坏死性凋亡的相关途径,通过Western Blot、免疫组化检测坏死性凋亡途径中关键蛋白质RIPK1、RIPK3和MLKL的表达情况,通过Western Blot、免疫组化以及免疫荧光观察MLKL的磷酸化水平以确认坏死性凋亡是通过RIPK1/3介导的MLKL所激活。（3）检测海马 IL-1β、Lipocalin-2 和 Iba-1 以及下丘脑 IL-1β、Lipocalin-2、MC4R 的表达情况,以此探讨Lipocalin-2参与的中枢海马小胶质细胞活化和MC4R抑食通路与肝郁脾虚证中枢炎症的相互关系。（4）检测血清ALT、AST、DBIL、TBIL以及TBA的含量水平,之后观察肝脏组织中IL-1β和炎症相关功能蛋白Lipocalin-2的蛋白和基因水平,以此探讨Lipocalin-2的表达与肝郁脾虚证相关的炎性肝损伤之间的联系。（5）观察逍遥散对坏死性凋亡途径介导的慢性炎症和Lipocalin-2功能的调节作用,从炎症致病的角度分析逍遥散治疗抑郁症肝郁脾虚证的中枢和外周机制,以此进一步诠释肝郁脾虚证的现代科学内涵。研究结果（1）实验一采用6周CUMS的造模方法复制了抑郁症肝郁脾虚证小鼠病证结合模型,通过小鼠的一般状态表现,体重与进食量变化,血清D-木糖含量,糖水偏好实验、强迫游泳实验、新环境抑制进食实验和旷场实验等行为学评价方法,并结合逍遥散的治疗作用,以方测证对模型进行了评价。（2）实验二证实了坏死性凋亡途径的激活与CUMS诱导的模型小鼠海马功能紊乱密切相关,探讨了坏死性凋亡在抑郁症肝郁脾虚证发病中的可能机制。与此同时,发现逍遥散的治疗作用可能是通过改善模型小鼠海马RIPK1,RIPK3,MLKL的基因蛋白表达及MLKL的磷酸化水平,调节坏死性凋亡途径,从而缓解海马的神经炎症与小胶质细胞活化。（3）实验三发现抑郁症肝郁脾虚证模型小鼠下丘脑中MC4R抑食通路的表达可能与坏死性凋亡途径的激活存在一定联系。同时,发现逍遥散对模型小鼠摄食调节的作用机制可能与改善小鼠坏死性凋亡水平,调节Lipocalin-2的表达从而干预下丘脑室旁核MC4R相关的食欲调节通路有关。（4）实验四观察了抑郁症肝郁脾虚证模型小鼠肝脏功能的变化,并且进一步证实了坏死性凋亡与模型小鼠肝脏功能紊乱有关,同时发现逍遥散对模型小鼠的肝功能损伤具有明显的治疗作用,并且这一作用机制可能与逍遥散改善坏死性凋亡水平,调节Lipocalin-2的表达有关。结论本实验成功复制了小鼠抑郁症肝郁脾虚证的病证结合模型,并且通过观察中药复方逍遥散对模型小鼠一般状态及行为学变化的有效干预作用从方证对应上进行了验证。同时,发现坏死性凋亡抑制剂Necrostatin-1也对模型小鼠的行为变化具有一定的调节作用,表明抑郁症和肝郁脾虚证的发病机制中可能存在坏死性凋亡途径的激活。研究中发现抑郁症肝郁脾虚证模型小鼠海马神经炎症的发生及小胶质细胞过度活化与坏死性凋亡的发生存在联系,并且坏死性凋亡可能通过调节炎症相关活性蛋白Lipocalin-2参与了抑郁症和肝郁脾虚证的MC4R依赖食欲调节机制以及慢性炎症相关的肝脏功能损伤机制。与此同时,中药复方逍遥散对抑郁症和肝郁脾虚证的作用功效可能与坏死性凋亡的上述途径有关。
李甜甜[10]（2020）在《青盲一号方对RGC-5细胞Bcl-2/BAX信号通路影响及其治疗青盲病网络药理学研究》文中研究指明第一部分 青盲一号方对RGC-5谷氨酸损伤模型Bcl-2/Bax信号通路影响目的:青盲一号方作为燕京韦氏中医眼科第四代传人韦企平教授治疗视神经萎缩的经验方。本实验在其大量临床研究的基础上,进行体外实验研究,探讨该方在抑制视神经损伤后RGCs凋亡方面的调控机制。方法:（1）实验采用STSN诱导RGC-5神经元性分化;采用CCK-8法,筛选RGC-5谷氨酸损伤模型中L-谷氨酸钠最佳损伤浓度和损伤时间,以及青盲一号方药物血清对RGC-5细胞干预所需要的低、中、高剂量浓度。（2）根据检测目标的需要,将RGC-5细胞按照1 × 105/ml接种至相应培养板中;经STSN诱导后的,分别标记为6个实验组:细胞对照组（A组）、谷氨酸模型组（B组）、空白血清组（C组）、青盲一号方低剂量血清组（D组）、青盲一号方中剂量血清组（E组）、青盲一号方高剂量血清组（F组）。A组添加DMEM-H培养基,B-F组加入所筛选的最佳L-谷氨酸钠损伤浓度培养基。根据筛选出的L-谷氨酸钠损伤时间孵育后,按照分组进行加样:A组加入DMEM-H培养基,B组加入同浓度的L-谷氨酸钠培养基,C组加入筛选出的空白血清培养基,D-F组分别加入筛选出的低、中、高剂量青盲一号方药物血清培养基。培养24h后进行检测。（3）实验指标检测:采用CCK-8法检测各实验组RGC-5细胞的存活率;流式细胞术检测各组细胞凋亡率;Western-blot检测各组细胞Bcl-2、BAX、Caspase 9、Caspase 3蛋白的表达水平;Real-Time PCR检测各组Bcl-2、BAX mRNA表达量。结果:（1）经筛选,浓度为0.125 μmol/L STSN培养基孵育1h可诱导RGC-5发生神经元形态改变。浓度为8 mmol/L的L-谷氨酸钠干预18h所建立的RGC-5损伤模型,细胞凋亡率能够达到46.2%（最接近IC50）。2.5%的空白血清组RGC-5细胞活性接近细胞对照组;2.5%的青盲一号方药物血清组的细胞活性也同样接近对照组,作为低剂量组;中剂量和高剂量药物血清浓度分别按照低剂量的2倍和4倍,选择血清浓度为5%,10%的药物血清。（2）CCK-8检测结果显示:与A组相比,B组细胞存活率仅为26.6%;C-F组可将细胞存活率维持在初始谷氨酸损伤（初始凋亡率约46.2%）水平,且各药物血清组的存活率高于C组。其中,E组的药物血清组的存活率最高为51.1%,与C组OD值相比,差异有统计学意义（PC:E=0.001<0.05）。（3）流式细胞凋亡检测结果显示各组RGC-5细胞凋亡率分别为:A组2.2%,B组13.1%,C组5%,D组4.1%,E组3.9%,F组6.0%。与C组相比,E组的凋亡率最低,F组不能抑制凋亡,且在一定程度上促进了这一过程。（4）Bcl-2/BAX凋亡信号通路相关蛋白表达水平:各组间BAX蛋白表达无明显差异（P=0.112>0.05）;C组各目的蛋白表达量与A组相比无明显差异（P值均>0.05）。B 组 Bcl-2 较 A 组明显下降（P=0.007<0.05）;BAX 下游 Caspase 9、Caspase 3 表达量显着上升（PCaspase 9 A:B=0.002<0.05,PCaspase 3 A:B=0.001<0.05）。青盲一号方药物血清各组中,D组除BAX外,其他目的蛋白的表达量与C组相比具有明显差异性（PBcl-2 C:D=0.046<0.05,PCaspase9C:D=0.005<0.05,PCaspase3 C:D=0.015<0.05）,而与B组无明显差异性,说明低剂量青盲一号方药物血清无法抑制谷氨酸损伤后RGC-5细胞的凋亡进程;E组中各Bcl-2/BAX凋亡调控蛋白与B组相比有显着性差异（PBcl-2 B:E=0.029<0.05,PCaspase 9 B:E=0.01 2<0.05,PCaspase 3 B:E=0.004<0.05）,而与 D 组和F组相比,差异性并不显着。但中剂量组Bcl-2/BAX蛋白比值均高于模型组、低剂量组和高剂量组（PB:E<0.0001,PD:E=0.001<0.05,PE:F=0.019<0.05）,且其下游的 Caspase 9、Caspase 3表达量明显低于模型组。这从一定程度上说明了中剂量组可通过提高Bcl-2/BAX蛋白的比率来抑制RGC-5的凋亡进程。（5）Real-Time PCR检测Bcl-2、BAX基因表达情况:C组Bcl-2及BAX的mRNA表达均值接近于A组。与C组相比,B组Bcl-2 mRNA表达水平较明显下调（P=0.001<0.05）;BAX mRNA表达则显着上升（P=0.001<0.05）。青盲一号方药物血清各组与C组相比,D组的Bcl-2呈低表达,BAX呈高表达,差异具有统计学意义（PBcl-2C:D=0.006<0.05,PBAXC:D=0.008<0.05）;E组Bcl-2基因与C组相比表达上调,BAX基因表达量下调,但均无明显差异（PBcl-2 C:E=0.681>0.05,PBAX C:E=0.1 34>0.05）;E 组 Bcl-2 及 BAX 基因与 D 组及 F 组相比,Bcl-2 表达明显上调（PBcl-2D:E=0.003<0.05;PBcl-2E:F=0.025<0.05）,BAX 基因表达差异性并不显着。结论:（1）青盲一号方药物血清能够有效抑制谷氨酸对RGC-5的凋亡损伤,提高其存活率;但给药剂量过大可能会导致RGCs的凋亡。（2）药物血清浓度为5%的青盲一号方能够发挥明显的抗凋亡作用,该作用可能通过促进抗凋亡基因Bcl-2的表达,提高蛋白Bcl-2/BAX的比值,稳定线粒体膜电位实现的。第二部分 青盲一号方治疗青盲病的网络药理学研究目的:基于网络药理学及生物信息学的研究思路,探究青盲一号方治疗代表性青盲病Leber氏家族遗传性视神经病变（LHON）的潜在分子网络调控机制。方法:（1）在TCMSP数据库中检索青盲一号方12味药物的主要活性成分及其作用靶点;同时从GEO datasets数据库中检索LHON病变相关的基因芯片,筛选出GSE103619基因表达微阵列。（2）通过perl软件绘制LHON疾病差异基因的火山图及聚类热图。（3）通过R程序语言编辑软件筛选青盲一号方有效成分作用靶点及LHON疾病差异基因的交集基因及对应的药物有效成分;并通过Cytoscape软件构建中药有效成分-LHON基因的调控网络。（4）将所筛选的青盲一号方对LHON的调控基因（蛋白）进行蛋白互作（PPI）分析,利用Cytoscape提取核心互作网络。（5）通过DAVID数据库对交集基因进行GO富集分析及KEGG调控通路富集分析。结果:（1）本研究共获得青盲一号方药物有效成分254个,作用靶点249个,成分-靶点关系3505种;LHON差异表达基因共514个,其中上调基因134个,下调基因380个。（2）经Perl分析,共得到青盲一号方治疗LHON的相关基因靶点1 1个,对应青盲一号方候选化合物19个。（3）通过PPI分析及网络拓扑分析,共筛选出Bcl-2、AHSA1、VCAM1三个核心靶点。（4）GO富集分析结果显示,青盲一方作用的这些靶点主要富集于细胞内质网、高尔基体和细胞质中;所涉及的生物学过程包括了脂蛋白的生物合成、运输,胆固醇稳态等;相关的分子功能主要是脂类的转运。KEGG调控通路富集分析结果显示,青盲一号方作用于LHON可能的调控通路包括脂质的代谢调控途径以及NF-κB调控途径。结论:通过对青盲一号方治疗LHON的网络药理学分析,我们推论青盲一号方对LHON治疗的潜在调控机制,还可以通过维持线粒体膜脂质的稳定性以及促进RGCs内Bcl-2上游的NF-κB调控通路来起到视神经保护作用。
二、实验性肝癌前期病变的研究及中药复方861对其的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、实验性肝癌前期病变的研究及中药复方861对其的影响（论文提纲范文）
（1）健脾化瘀解毒法调节NF-κB活性抑制胃“炎-癌”转化细胞迁移机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 第一节 胃“炎—癌”转化的机制及研究现状 |
| 一、胃“炎—癌”转化在胃癌进展中发挥重要作用 |
| 二、胃“炎—癌”转化中西医治疗现状 |
| 第二节 NF-κB信号通路与胃“炎—癌”转化及细胞增殖迁移 |
| 一、NF-κB家族及其信号通路 |
| 二、NF-κB信号通路与炎症发生的关系 |
| 三、NF-κB信号通路与肿瘤的发生的关系 |
| 第三节 肿瘤转移与上皮—间质转化 |
| 一、TGF-β/Smads信号通路介导的上皮-间质转化 |
| 二、EMT基因与分子标志物 |
| 第四节 基于胃“炎-癌”转化病理组织学进程的中医精准防治规律研究 |
| 一、中医药以健脾益胃法为主靶向胃黏膜萎缩阶段 |
| 二、中医药以健脾益胃化瘀法为主靶向胃黏膜萎缩伴IM阶段 |
| 三、中医药以健脾化瘀解毒法为主靶向胃黏膜萎缩伴LGIN阶段 |
| 第五节 健脾化瘀解毒法靶向胃“炎—癌”转化关键关节发挥作用 |
| 一、健脾化瘀解毒法靶向“炎-癌”转化环节改善GPL病理组织结构 |
| 二、健脾化瘀解毒法通过有氧糖酵解及自噬凋亡等途径逆转胃“炎-癌”转化 |
| 三、健脾化瘀解毒法通过抑制NF-κB信号通路控制甚至逆转胃“炎-癌”转化 |
| 四、健脾化瘀解毒方是临床治疗胃癌前病变的有效方剂 |
| 第二章 实验研究 |
| 第一节 胃痞消体外抑制GPL模型细胞和胃癌SGC7901上皮-间质转化研究 |
| 一、实验材料与试剂 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 第二节 健脾化瘀解毒方中有效活性成分的分析 |
| 一、实验材料与试剂 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 第三节 健脾化瘀解毒方对胃“炎—癌”转化小鼠病理模型的的干预效应 |
| 一、实验材料与试剂 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 第四节 健脾化瘀解毒方通过抑制NF-κB信号通路逆转胃“炎—癌”转化 |
| 一、实验材料与试剂 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 第五节 健脾化瘀解毒方通过NF-κB信号通路抑制胃癌前病变细胞的早期迁移 |
| 一、实验材料与试剂 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况、参与课题与获奖情况 |
| 致谢 |
| 附件 |
（2）柴芪益肝方治疗肝纤维化的临床和实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 中西医治疗肝纤维化的研究进展 |
| 第一节 西医诊断和治疗肝纤维化的研究进展 |
| 第二节 中医药治疗肝纤维化的研究进展 |
| 第二章 柴芪益肝方治疗肝郁脾虚型慢性乙型肝炎肝纤维化的临床回顾性研究 |
| 前言 |
| 第一节 临床资料 |
| 第二节 分组与治疗 |
| 第三节 结果分析 |
| 第四节 讨论与小结 |
| 第三章 基于网络药理学探讨柴芪益肝方治疗肝纤维化的作用机制 |
| 前言 |
| 第一节 资料与方法 |
| 第二节 结果 |
| 第三节 讨论与小结 |
| 第四章 柴芪益肝方对四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化的作用及机制研究 |
| 前言 |
| 第一节 材料与研究方法 |
| 第二节 指标检测 |
| 第三节 结果 |
| 第四节 讨论与小结 |
| 结语 |
| 创新点 |
| 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
（3）基于弹性蛋白合成及降解探讨益肝消积方干预早期肝硬化的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 中医药防治肝硬化的研究现状 |
| 1 肝硬化病名渊源 |
| 2 中医对肝硬化病因病机的认识 |
| 3 中医治疗肝硬化思路 |
| 4 导师论治肝硬化的经验 |
| 5 中医药防治肝硬化的机制探讨 |
| 6 小结 |
| 参考文献 |
| 综述二 弹性蛋白及其调控因子在早期肝硬化中的作用 |
| 1 流行病学 |
| 2 肝硬化现代研究进展 |
| 3 弹性蛋白在肝硬化发生中的作用 |
| 4 调控弹性蛋白合成的细胞因子 |
| 5 调控弹性蛋白降解的细胞因子 |
| 6 小结 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第二部分 实验研究 |
| 研究一 益肝消积方对早期肝硬化的干预作用 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 研究二 益肝消积方调控弹性蛋白合成干预早期肝硬化的机制研究 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 研究三 益肝消积方调控弹性蛋白降解干预早期肝硬化的机制研究 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 个人简历 |
（4）黄连解毒汤治疗小鼠急性溃疡性结肠炎疗效的评价及其作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| SUMMARY |
| 中英文缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.黄连解毒汤药理学作用研究进展 |
| 1.1 抗炎作用 |
| 1.2 抗氧化及神经元保护作用 |
| 1.3 抗癌/肿瘤作用 |
| 1.4 降压、降血脂、预防动脉粥样硬化作用 |
| 1.5 消化道黏膜保护作用 |
| 2.溃疡性结肠炎 |
| 2.1 UC的病因 |
| 2.2 UC发病机理 |
| 2.2.1 肠道菌群失调 |
| 2.2.2 肠粘膜屏障损伤 |
| 2.2.3 免疫功能失调 |
| 2.3 UC的流行病学 |
| 2.4 UC的临床表现 |
| 2.5 UC的诊断 |
| 2.6 中医对UC的研究 |
| 2.7 UC严重程度的分类 |
| 3.UC的治疗及其药物研究进展 |
| 3.1 轻度至中度UC的治疗 |
| 3.1.1 氨基水杨酸类 |
| 3.1.2 糖皮质激素 |
| 3.2 中度至重度UC的治疗 |
| 3.2.1 免疫抑制剂 |
| 3.2.2 生物制剂 |
| 3.3 急性重度UC的治疗——结肠切除术 |
| 3.4 中药复方治疗UC |
| 3.5 新型UC治疗药物 |
| 3.5.1 益生菌 |
| 3.5.2 益生元 |
| 3.5.3 肠道菌群移植 |
| 4.小结 |
| 第二章 黄连解毒汤治疗小鼠急性溃疡性结肠炎疗效评价及其分子调控机制 |
| 1.材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 药材和试剂 |
| 2.方法 |
| 2.1 HLJDD的制备 |
| 2.2 动物模型制备及药物治疗 |
| 2.3 疾病活动指数评分 |
| 2.4 样品采集及结肠眼观评分 |
| 2.5 结肠病理组织学检测 |
| 2.6 血浆和结肠组织MPO活力检测 |
| 2.7 血浆细胞因子及结肠组织抗氧化指标检测 |
| 2.8 WB检测 |
| 2.9 免疫荧光检测 |
| 2.10 统计学分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 HLJDD改善DSS诱导的小鼠UC |
| 3.2 结肠组织病理学检测及评分 |
| 3.3 HLJDD对急性UC小鼠血浆细胞因子的作用 |
| 3.4 HLJDD对急性UC小鼠结肠氧化应激参数的影响 |
| 3.5 HLJDD对 NF-κB信号通路的调节作用 |
| 3.6 HLJDD对 NRF2 信号通路的调节作用 |
| 3.7 HLJDD对 UC小鼠肠黏膜的保护作用 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 第三章 黄连解毒汤治疗小鼠急性UC有效部位的筛选及其对肠道菌群的影响 |
| 1.材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 材料和试剂 |
| 2.方法 |
| 2.1 HLJDD及其不同极性部位的的制备 |
| 2.2 动物模型制备及给药 |
| 2.3 疾病活动指数评分 |
| 2.4 样品采集和结肠眼观评分 |
| 2.5 结肠病理组织学检测 |
| 2.6 血浆细胞因子检测 |
| 2.7 结肠组织抗氧化参数检测 |
| 2.8 粪便样品总DNA提取和ILLUMINA MISEQ SEQUENCING测序 |
| 2.9 测序数据处理与分析 |
| 2.10 统计学分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 HLJDD及其有效部位改善DSS诱导的小鼠UC |
| 3.2 结肠组织病理学检测 |
| 3.3 血浆细胞因子检测 |
| 3.4 氧化应激参数检测 |
| 3.5 HLJDD及其有效部位对UC小鼠肠道菌群多样性的影响 |
| 3.6 HLJDD及 HLJDD-NBA对 UC小鼠肠道菌群结构的影响 |
| 3.7 HLJDD及 HLJDD-NBA对 UC小鼠肠道菌群功能的影响 |
| 3.8 HLJDD主要活性成分与生理生化参数及肠道菌群关联分析 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 第四章 基于代谢组学的黄连解毒汤及其有效部位治疗小鼠急性UC作用机制的研究 |
| 1.材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 材料和试剂 |
| 2.方法 |
| 2.1 HLJDD及其正丁醇部位的制备 |
| 2.2 动物模型建立及给药 |
| 2.3 疾病活动指数评分 |
| 2.4 样品采集与处理 |
| 2.5 结肠病理组织学检测 |
| 2.6 细胞因子检测 |
| 2.7 血浆代谢组学样品预处理 |
| 2.8 UPLC-Q/TOF-MS/MS检测 |
| 2.9 代谢组学数据处理与多元统计分析 |
| 2.10 差异代谢物的标准品验证 |
| 2.11 代谢通路的富集分析 |
| 2.12 分子模拟对接分析 |
| 2.13 统计学分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 HLJDD及其有效部位改善UC小鼠临床症状 |
| 3.2 结肠组织病理学评分 |
| 3.3 血液学检测 |
| 3.4 细胞因子检测 |
| 3.5 血浆代谢物轮廓分析 |
| 3.6 血浆差异代谢物的筛选 |
| 3.7 部分差异代谢物的标准品验证 |
| 3.8 代谢通路分析 |
| 3.9 HLJDD中13个活性成分与靶标代谢通路关键酶的分子模拟对接分析 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 在读期间发表论文和研究成果等 |
| 导师简介 |
（5）抗纤抑癌方治疗肝癌前病变的疗效观察及作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词 |
| 文献综述 |
| 综述一 中医药防治肝癌前病变的研究现状 |
| 1 病名渊源 |
| 2 中医学对肝癌前病变病因病机的认识 |
| 3 中医药防治肝癌前病变的机制研究 |
| 4 导师论治肝癌前病变的经验 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 综述二 肝病缺氧微环境研究进展 |
| 1 肝脏的分区与氧气 |
| 2 肝病的缺氧微环境 |
| 3 HIF的结构与调节 |
| 4 HIF与肝病 |
| 5 mTOR/HIF/VEGF通路 |
| 6 结语 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第一部分 抗纤抑癌方治疗肝癌前病变的疗效观察 |
| 方法 |
| 1 研究对象 |
| 2 肝癌前病变的诊断标准 |
| 3 纳入和排除标准 |
| 4 治疗方案 |
| 5 资料收集 |
| 6 观察指标 |
| 7 随访 |
| 8 统计方法 |
| 结果 |
| 1 纳入患者的基本特征 |
| 2 临床结局 |
| 3 临床基线指标比较 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 基于数据挖掘分析mTOR、HIF-1α及VEGF在肝癌前病变和肝癌中的表达及意义 |
| 方法 |
| 1 目的 |
| 2 数据来源 |
| 3 研究方法 |
| 结果 |
| 1 Oncomine数据库中MTOR、HIF1A和VEGFA在不同类型肿瘤中的表达 |
| 2 Oncomine数据库中MTOR、HIF1A和VEGFA基因在不同肝病中的表达 |
| 3 基于TCGA数据库分析MTOR、HIF1A和VEGFA的差异表达 |
| 4 基于Kaplan-Meier Plotter数据库分析MTOR、HIF1A和VEGFA表达在HCC预后中的意义 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 基于临床病例探讨mTOR、HIF-1α及VEGF在肝细胞恶性转变过程中的表达及意义 |
| 方法 |
| 1 研究对象 |
| 2 诊断标准 |
| 3 纳入排除标准 |
| 4 观察指标 |
| 5 医学伦理及注册 |
| 6 样本采集及检测 |
| 7 统计方法 |
| 结果 |
| 1 一般资料 |
| 2 三组患者实验室指标的差异 |
| 3 三组患者血清mTOR、HIF-1α VEGF水平的差异 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 基于mTOR/HIF-1α/VEGF信号通路探讨抗纤抑癌方对肝癌前病变的调控作用 |
| 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 结果 |
| 1 大鼠肝脏组织病理表现 |
| 2 大鼠肝组织GST-Pi免疫组化及蛋白表达 |
| 3 抗纤抑癌方对大鼠肝组织GLUT1和PKM2的影响 |
| 4 抗纤抑癌方对大鼠肝组织mTOR、HIF-1αVEGF的影响 |
| 讨论 |
| 1 肝癌前病变缺氧微环境的能量代谢 |
| 2 抗纤抑癌方对肝癌前病变缺氧微环境能量代谢的调控作用 |
| 3 mTOR/HIF-1α/VEGF信号通路在肝癌前病变形成中的作用 |
| 4 抗纤抑癌方对mTOR/HIF-1α/VEGF信号通路的调控作用 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）胆石六号颗粒抗四氯化碳致大鼠肝纤维化作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 胆石六号颗粒中栀子苷、虎杖苷、柚皮苷的含量测定 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 胆石六号颗粒抗CCl_4致大鼠肝纤维化的作用研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 基于网络药理学预测胆石六号颗粒抗肝纤维化的可能信号途径 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 胆石六号颗粒对肝纤维化大鼠PI3K/Akt信号通路的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附件 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（7）基于BDNF-TrkB通路探讨文王一支笔对D-半乳糖致大鼠肝损伤的保护作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一章 理论研究 |
| 1 中医对肝损伤的认识 |
| 2 西医对肝损伤的认识 |
| 3 BDNF-Trk B信号通路与肝损伤 |
| 第二章 实验研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 中医药治疗化学性肝损伤的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间的研究成果、参加学术会议及获奖 |
| 致谢 |
（8）中药筋脉通对糖尿病大鼠的髓鞘保护作用及其对肠道菌群的影响（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 中药筋脉通对糖尿病大鼠坐骨神经的髓鞘保护作用 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 中药筋脉通对糖尿病周围神经病变大鼠肠道菌群的影响 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述1 中药筋脉通防治糖尿病周围神经病变的中医理论基础与现代药理学研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述2 基于肠道菌群调节作用的糖尿病中医药干丽究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 博士期间发表论文 |
（9）抑郁症肝郁脾虚证小鼠RIPK1/RIPK3/MLKL介导的坏死性凋亡发生机制及逍遥散的调节作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 文献研究 |
| 第一部分 坏死性凋亡的发生与炎症反应的激活 |
| 1. 细胞的死亡方式 |
| 2. 坏死性凋亡的物质基础 |
| 3. 坏死性凋亡的机制 |
| 4. 坏死性凋亡介导的炎症反应 |
| 5. 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 脂质运载蛋白Lipocalin-2的生物学特点及功能研究 |
| 1. Lipocalin-2的概述 |
| 2. Lipocalin-2的功能 |
| 3. Lipocalin-2的表达与疾病 |
| 4. 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 基于慢性炎症机制的逍遥散-肝郁脾虚证方证机理探讨 |
| 1. 肝郁脾虚证相关的现代生物学基础 |
| 2. 逍遥散复方机理研究 |
| 3. 小结 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 实验研究 |
| 实验一 小鼠抑郁症肝郁脾虚证候病证结合模型的建立与评价 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 实验二 基于坏死性凋亡的抑郁症肝郁脾虚证小鼠海马神经炎症与小胶质细胞活化机制及逍遥散的调节作用 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 实验三 基于坏死性凋亡的抑郁症肝郁脾虚证小鼠下丘脑Lipocalin-2参与MC4R食欲抑制通路机制及逍遥散的调节作用 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 实验四 基于坏死性凋亡的抑郁症肝郁脾虚证小鼠肝脏功能损伤机制及逍遥散的调节作用 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 1. 发表论文 |
| 2. 主持及参与课题 |
| 3. 获奖情况 |
| 个人简历 |
（10）青盲一号方对RGC-5细胞Bcl-2/BAX信号通路影响及其治疗青盲病网络药理学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词对照表 |
| 文献综述一 中医对青盲病的认识及治疗进展 |
| 1. 青盲病生理基础——目系与各脏腑经络气血的关系 |
| 1.1 中医对于目系的认识 |
| 1.2 目系与各脏腑经脉的关系 |
| 2. 青盲病的病因病机 |
| 3. 中医眼科医家对青盲病的认识和临床治疗经验 |
| 3.1 中医眼科医家对青盲病的认识和临床经验 |
| 3.2 针灸治疗 |
| 4. 青盲一号方介绍 |
| 4.1 燕京韦氏眼科学术流派及青盲一号方源流 |
| 4.2 青盲一号方组方原则 |
| 4.3 青盲一号方前期临床疗效研究 |
| 4.4 青盲一号方对视网膜神经节细胞损伤后机制研究的意义 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 视神经损伤机制及中药现代化对视神经保护的研究进展 |
| 1. 视神经损伤的原因及机制 |
| 1.1 视神经损伤的后组织病理学改变 |
| 1.2 视神经损伤后,RGCs细胞凋亡机制 |
| 2. 现代中医药在抑制视神经损伤方面的机制研究 |
| 2.1 单味药在神经保护方面的药理研究 |
| 2.2 植物提取物在视神经保护方面的药理研究 |
| 2.3 中药复方在视神经保护方面的药理研究 |
| 3. 小结 |
| 参考文献 |
| 研究一 青盲一号方对STSN诱导后RGC-5细胞谷氨酸损伤模型细胞凋亡的影响 |
| 前言 |
| 1. 实验材料及仪器设备 |
| 2. 实验准备 |
| 3. 实验方案 |
| 3.1 筛选STSN对RGC-5诱导浓度 |
| 3.2 CCK-8法筛选RGC-5谷氨酸损伤模型最佳浓度及时间 |
| 3.3 CCK-8法筛选青盲一号方药物血清干预的低、中、高剂量浓度 |
| 3.4 CCK-8法检测青盲一号方对STSN诱导后RGC-5细胞谷氨酸损伤模型细胞存活率 |
| 3.5 流式细胞术检测青盲一号方对STSN诱导后RGC-5细胞谷氨酸损伤模型细胞凋亡率 |
| 4. 统计方法 |
| 5. 实验结果 |
| 5.1 STSN对RGC-5诱导的浓度 |
| 5.2 L-谷氨酸钠构建RGC-5谷氨酸损伤模型最佳的浓度及时间 |
| 5.3 青盲一号方药物血清干预的低、中、高剂量浓度筛选结果 |
| 5.4 青盲一号方对STSN诱导后RGC-5细胞谷氨酸损伤模型细胞存活率的影响 |
| 5.5 流式细胞术检测青盲一号方对STSN诱导后RGC-5细胞谷氨酸损伤模型细胞凋亡情况 |
| 研究二 青盲一号方对RGC-5谷氨酸损伤模型BCL-2/BAX凋亡信号通路的影响 |
| 前言 |
| 1. 实验材料及仪器设备 |
| 2. 实验准备 |
| 3. 实验方案 |
| 3.1 Western-blot检测STSN诱导后RGC-5细胞谷氨酸损伤模型相关凋亡蛋白表达 |
| 3.2 Real-Time PCR检测STSN诱导后RGC-5细胞谷氨酸损伤模型凋亡Bcl-2/BAX基因表达 |
| 4. 统计方法 |
| 5. 实验结果 |
| 5.1 STSN诱导后RGC-5细胞谷氨酸损伤模型Bcl-2/BAX凋亡信号通路蛋白表达情况 |
| 5.2 STSN诱导后RGC-5细胞谷氨酸损伤模型凋亡信号通路Bcl-2、BAX基因表达情况 |
| 研究三 基于中药网络药理学探讨青盲一号方治疗LHON的作用机制 |
| 前言 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 青盲一号方药物活性成分及作用靶点检索 |
| 1.2 LHON表达谱芯片数据下载及数据整理 |
| 1.3 MT-ND4突变的LHON与正常对照的差异表达基因筛选 |
| 1.4 青盲一号方作用于LHON的基因靶点分析 |
| 1.5 青盲一号方作用于LHON基因的GO富集分析及KEGG调控通路富集分析 |
| 2. 结果 |
| 2.1 青盲一号方有效成分及其作用靶点筛选结果 |
| 2.2 LHON差异表达基因筛选结果 |
| 2.3 构建青盲一号方作用靶点基因与LHON差异基因的调控网络 |
| 2.4 构建青盲一号方活性成分对LHON作用靶点的PPI网络 |
| 2.5 青盲一号方作用于LHON基因的GO富集分析及KEGG调控通路富集分析结果 |
| 讨论 |
| 1. 视神经病变体外实验常用视网膜神经节细胞(系)的选择 |
| 1.1 原代RGCs |
| 1.2 视网膜前体细胞系R28 |
| 1.3 RGC-5细胞系 |
| 2. 青盲一号方对于RGC-5谷氨酸损伤后凋亡的影响分析 |
| 2.1 谷氨酸神经毒性对SNST诱导后RGC-5的评价 |
| 2.2 青盲一号方药物血清对RGC-5谷氨酸损伤模型中细胞凋亡的抑制作用分析 |
| 3. 青盲一号方对于RGC-5谷氨酸损伤后凋亡的作用机制分析 |
| 3.1 谷氨酸兴奋毒性损伤后,RGCs的线粒体Bcl-2/BAX凋亡信号通路机制 |
| 3.2 青盲一号方对RGC-5细胞Bcl-2/BAX信号通路的调控作用 |
| 4. 青盲一号方对于线粒体遗传病LHON的潜在作用靶点及调控通路分析 |
| 4.1 青盲一号方有效成分对LHON调控的潜在靶点 |
| 4.2 青盲一号方治疗LHON机制的KEGG调控通路富集分析及GO富集分析 |
| 4.3 PPI蛋白互作网络中核心靶点蛋白调控作用 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
四、实验性肝癌前期病变的研究及中药复方861对其的影响（论文参考文献）
- [1]健脾化瘀解毒法调节NF-κB活性抑制胃“炎-癌”转化细胞迁移机制研究[D]. 李思怡. 广州中医药大学, 2021(02)
- [2]柴芪益肝方治疗肝纤维化的临床和实验研究[D]. 周怡驰. 北京中医药大学, 2021(01)
- [3]基于弹性蛋白合成及降解探讨益肝消积方干预早期肝硬化的机制研究[D]. 张嘉鑫. 北京中医药大学, 2021(01)
- [4]黄连解毒汤治疗小鼠急性溃疡性结肠炎疗效的评价及其作用机制研究[D]. 袁子文. 甘肃农业大学, 2020
- [5]抗纤抑癌方治疗肝癌前病变的疗效观察及作用机制研究[D]. 李志国. 北京中医药大学, 2020(04)
- [6]胆石六号颗粒抗四氯化碳致大鼠肝纤维化作用及机制研究[D]. 陶月英. 遵义医科大学, 2020(12)
- [7]基于BDNF-TrkB通路探讨文王一支笔对D-半乳糖致大鼠肝损伤的保护作用[D]. 杨清煜. 湖北民族大学, 2020(02)
- [8]中药筋脉通对糖尿病大鼠的髓鞘保护作用及其对肠道菌群的影响[D]. 谢骏. 北京协和医学院, 2020(05)
- [9]抑郁症肝郁脾虚证小鼠RIPK1/RIPK3/MLKL介导的坏死性凋亡发生机制及逍遥散的调节作用[D]. 严志祎. 北京中医药大学, 2020(04)
- [10]青盲一号方对RGC-5细胞Bcl-2/BAX信号通路影响及其治疗青盲病网络药理学研究[D]. 李甜甜. 北京中医药大学, 2020(04)