一、中药黄芪对小鼠腹腔巨噬细胞功能的影响（论文文献综述）
孙文静[1]（2021）在《地锦多糖的制备及对小鼠免疫增强活性研究》文中研究指明多糖是中药的重要组成部分,具有增强免疫、抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、抗衰老、等生物活性。多糖作为免疫增强剂对动物疾病具有增强抵抗力的作用。地锦草在我国分布范围广且药理作用广泛,具有显着的抗氧化、抗肿瘤以及抗菌抗炎的功效,有重要的临床应用和开发价值。本研究选择地锦多糖作为研究对象,从提取纯化、结构鉴定、对淋巴细胞免疫活性、对巨噬细胞功能及对小鼠巨噬细胞的抗氧化等方面初步筛选出3个效果较好的活性部位,进一步研究其体内对免疫抑制小鼠的免疫调节作用。试验Ⅰ地锦多糖的提取纯化采用一步醇沉和分步醇沉法提取粗地锦总多糖(EHPS tc)和各分级多糖EHPS60c、EHPS70c和EHPS80c。然后以脱色率、多糖保留率为指标,采用L25（56）正交设计对双氧水加入量、反应温度、p H值、反应时间等脱色条件进行优选。脱色后EHPStc经DEAE-Sephadex A-25葡聚糖凝胶柱层析,得到纯化的地锦多糖1(EHPStp-1)和地锦多糖2(EHPStp-2),分别用苯酚-硫酸法和考马斯亮兰法测定多糖和蛋白含量。结果表明,EHPStc最优脱色条件为反应温度50℃、反应时间4 h、p H值为2、双氧水加入量4%时,多糖脱色率达到71.10%,保留率为63.31%,多糖含量为74.52%。经柱层析纯化后EHPStp-1糖含量提高为95.36%,EHPStp-2糖含量提高为92.35%。因此可以看出,地锦多糖经过DEAE-Sephadex A-25葡聚糖凝胶柱的洗脱纯化可以显着提高多糖含量;经验证试验发现双氧水脱色工艺有效可行。试验Ⅱ地锦多糖的结构鉴定采用红外光谱法（IR）、紫外光谱法（UVS）、PMP柱前衍生高效液相色谱法（PMP-HPLC）、高效凝胶渗透色谱（HPGPC）法、硫酸咔唑法、刚果红法和核磁共振波谱法（NMR）等方法分析各多糖结构。结果表明,EHPStc和EHPStp-2中可能含有少量蛋白。EHPStc、EHPStp-1和EHPStp-2均符合多糖类物质红外光谱基本特征。EHPStp-1主要包括Glc（83.1%）、Gal（6.1%）、Glc UA（1.6%）;EHPStp-2主要包括Gal（25.6%）、Gal UA（22.2%）、Ara（16.6%）;EHPStc主要包括Glc（53.5%）、Ara（16.8%）、Gal（14.3%）。EHPStc和EHPStp-1的重均分子量分别为26.2和26.0 k Da;EHPStp-2重均分子量分别为145.6 k Da和8.9 k Da。EHPStp-1和EHPStp-2的糖醛酸含量分别为15.9%和27.9%。EHPStc和EHPStp-1均具有明显的三螺旋结构。EHPStp-1存在α构型的单糖;EHPStc存在α和β构型的单糖。经结构鉴定,水提醇沉提取物均为多糖,但多糖结构复杂,要得到具体的结构成分还需进一步检测。试验Ⅲ地锦多糖对淋巴细胞免疫活性的影响将EHPS60c、EHPS70c、EHPS80c、EHPStc、EHPStp-1和EHPStp-2加入到小鼠外周血淋巴细胞培养体系中,用MTT法测定其安全浓度;然后取安全浓度范围内6个多糖,分别单独或协同PHA加入到小鼠外周血淋巴细胞中,培养48 h后,测定淋巴细胞增殖(细胞A570值和最高淋巴细胞增殖率)的变化,筛选增强免疫活性的较好部位;将筛选出的3个多糖在31.25μg/m L时刺激淋巴细胞,分别在24 h、48 h和72 h收集细胞处理后,在流式细胞仪上检测各个时间点的周期分布情况和CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群的变化;ELISA法测定免疫球蛋白IgA、IgG和细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IFN-r的含量。结果表明,多糖单独刺激时EHPStp-1在15.625μg/m L时的细胞增殖率最高,为15.099%,其次为EHPStp-2在相同浓度时,达到12.129%;多糖与PHA共同刺激时,EHPStc在15.625μg/m L时的细胞增殖率最高,为23.820%;其次为EHPStp-1在31.25μg/m L时,为20.499%。综合评价,筛选出EHPStc、EHPStp-1和EHPStp-2可能是增强免疫活性的较好部位。细胞周期分布结果表明,与EHPStc相比较,EHPStp-1和EHPStp-2处理细胞48 h和72 h后,SPF值和PI值显着升高。EHPStp-1和EHPStp-2处理细胞48 h后,CD4+、CD8+淋巴细胞百分率显着高于EHPStc对照组。EHPStp-1、EHPStp-2和EHPStc均能显着促进IgA、IgG和IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ的分泌。说明,地锦多糖能够有效提高小鼠淋巴细胞免疫活性,其中EHPStc、EHPStp-1和EHPStp-2免疫增强活性最强。试验Ⅳ地锦多糖对巨噬细胞功能的影响取安全浓度范围内5个浓度的6个多糖,分别单独或协同LPS加入到培养的小鼠腹腔巨噬细胞中,培养48 h后,测定巨噬细胞增殖的变化;检测小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬活性、NO和iNOS分泌;ELISA法测定细胞因子IL-2、IL-6、IFN-γ、MCP-1、MIP-1?的含量;流式细胞术分析CD14和MHC-II表达。结果表明,多糖单独刺激时EHPStp-1在31.25μg/m L时的细胞增殖率最高,为23.17%;其次为EHPStc,在31.25μg/m L时的细胞增殖率为16.42%;协同LPS刺激巨噬细胞时,EHPStp-1在31.25μg/m L时的细胞增殖率最高,为20.29%;其次为EHPS60c,在31.25μg/m L时的细胞增殖率为17.41%。在31.25～1.953μg/m L时,EHPStc和EHPStp-1促进小鼠腹腔巨噬细胞吞噬作用最强,且在31.25～15.625μg/m L时,EHPStc促进噬细胞吞噬作用显着强于EHPStp-1。EHPStc、EHPStp-1和EHPStp-2分别在31.25～1.953μg/m L和31.25～3.907μg/m L时,对小鼠腹腔巨噬细胞NO和iNOS分泌功能显着强于其余多糖组。EHPStp-1、EHPStp-2和EHPStc均能显着促进细胞因子的分泌。在31.25～7.813μg/m L时,EHPStp-1组对CD14和MHC-II的表达显着高于EHPStp-2组和BL组。说明,地锦多糖能够有效促进小鼠腹腔巨噬细胞功能,其中EHPStc、EHPStp-1和EHPStp-2免疫增强活性最强。试验Ⅴ地锦多糖对小鼠巨噬细胞的抗氧化作用取安全浓度范围内5个浓度的EHPStc、EHPStp-1和EHPStp-2,加入到培养的小鼠腹腔巨噬细胞中,培养48 h后,ELSIA法测定EHPStc、EHPStp-1和EHPStp-2对小鼠巨噬细胞的SOD、GSH-PX、MDA及MPO含量。结果表明,EHPStc、EHPStp-1和EHPStp-2均可显着提高小鼠SOD酶、GSH-PX酶活性,其中EHPStp-1组地锦多糖SOD酶、GSH-PX酶活力显着高于其他多糖组。EHPStc、EHPStp-1和EHPStp-2在7.813～31.25μg/m L均能显着降低MDA含量,减少体内脂质过氧化程度。EHPStc、EHPStp-1和EHPStp-2作用小鼠巨噬细胞后MPO酶活力均有显着降低。其中31.25μg/m L组MPO酶活力显着低于其他多糖组。说明,EHPStc、EHPStp-1和EHPStp-2具有显着的抗氧化作用,以减轻动物机体自由基损伤,保护动物机体,增强免疫功能。试验Ⅵ地锦多糖对免疫抑制小鼠的免疫调节作用建立环磷酰胺（CTX）小鼠免疫抑制模型,测定EHPStc和EHPStp-1对免疫抑制小鼠的免疫调节作用。小鼠随机分为5组（n=10）。分别为正常对照组（NC）、模型对照组（MC）、EHPStc组、EHPStp-1组、阳性对照组（PC组）。NC组小鼠,每天灌胃给予生理盐水,2个多糖组小鼠每天灌胃150 mg/kg EHPStc和EHPStp-1,PC组小鼠给予左旋咪唑（100 mg/kg）。实验持续24 d。第15、16、17 d腹腔注射100 mg Cy/kg bw,对小鼠进行免疫抑制造模。NC组和MC组灌胃0.1 m L/10g生理盐水。结果显示,EHPStc和EHPStp-1在大多时间点能促进T淋巴细胞增殖、促进淋巴细胞进入S期和G2/M期,提高CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群的百分率,提高血清中免疫球蛋白和细胞因子水平,提高小鼠免疫器官指数及脾脏抗氧化指标。说明,EHPStc和EHPStp-1能够有效提高免疫抑制小鼠细胞免疫、体液免疫能力。综合评价EHPStp-1免疫增强活性最强。本研究首先通过对地锦多糖提取脱色纯化后,获得总多糖和各分级多糖,利用小鼠外周血淋巴细胞、巨噬细胞和免疫抑制小鼠检测了多糖的淋巴细胞免疫活性、巨噬细胞功能和抗氧化能力及其对免疫抑制小鼠的免疫调节作用,发现地锦多糖具有显着的免疫增强作用。本研究为地锦草等中药多糖在防治动物疾病中的推广应用提供了理论依据。
刘佳[2]（2021）在《女贞子免疫增强活性成分分离鉴定及作用机制研究》文中研究说明女贞子Ligustri Lucidi Fructus系木犀科植物女贞Ligustrum lucidum Ail.的干燥成熟果实,性味甘、苦,凉;归肝、肾经;功能补肝肾,强筋骨,明目;主治阴虚内热,腰肢无力,肾虚滑精,视力减退等。研究表明,女贞子主要含有齐墩果酸、熊果酸、特女贞苷、女贞子苷等化学成分,具有免疫调节、保肝、抗炎、抗菌和抗病毒等作用。已有文献证明女贞子可以提高家畜的生产性能和免疫功能,然而目前的研究未能阐释女贞子发挥免疫增强活性的化学成分,对其作用机制的研究更是少见。本研究进行了女贞子免疫增强活性部位筛选、活性成分分离鉴定、活性成分增强巨噬细胞和淋巴细胞免疫活性的作用及机制研究,取得以下主要结果:（1）女贞子免疫增强活性部位的筛选通过乙醇提取法和液-液萃取法制备女贞子五个极性部位,通过巨噬细胞吞噬试验和淋巴细胞增殖试验检测五部位萃取物的免疫活性。结果表明,女贞子石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和水部位萃取物得率分别为1.64%、1.28%、1.13%、11.15%和26.96%;女贞子石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水部位萃取物均可不同程度地提高RAW264.7巨噬细胞吞噬中性红的能力,且正丁醇和乙酸乙酯部位萃取物的增强效果较好;女贞子乙酸乙酯、正丁醇和水部位萃取物均可不同程度地促进淋巴细胞增殖,其中正丁醇和乙酸乙酯萃取物的促增殖效果较好。说明正丁醇和乙酸乙酯部位为女贞子的主要免疫增强活性部位。（2）女贞子免疫增强活性成分的分离纯化与结构鉴定通过大孔树脂、硅胶和Sephadex LH-20柱色谱法及制备薄层色谱法,对女贞子正丁醇部位萃取物进行分离纯化,并运用1H-NMR、13C-NMR和HR-ESI-MS对单体化合物进行结构鉴定;通过巨噬细胞吞噬试验和淋巴细胞增殖试验检测大孔树脂乙醇洗脱段和单体化合物的免疫活性。结果表明,女贞子正丁醇部位萃取物的大孔树脂水洗脱段、30%、50%、70%和90%乙醇洗脱段得率分别为8.54%、25.62%、58.34%、1.42%和1.07%,其中30%乙醇洗脱段的免疫活性较强;对30%乙醇洗脱段进行分离纯化得到10个单体化合物,结构鉴定为:橄榄苦苷酸（oleuropeinic acid）、女贞子苷（nuezhenide）、异女贞子苷（isonuezhenide）、红景天苷（salidroside）、异女贞苷酸（isoligustrosidic acid）、ligulucidumoside A、8（E）-女贞子苷（8（E）-nuezhenide）、羟基酪醇（hydroxytyrosol）、橄榄苦苷（oleuropein）和p-hydroxyphenethyl 7-β-D-glucosideelenolic acid eater,其中橄榄苦苷酸、红景天苷、羟基酪醇、橄榄苦苷和p-hydroxyphenethyl7-β-D-glucosideelenolic acid eater有不同程度增强免疫细胞活性的作用,且羟基酪醇的作用最强。说明羟基酪醇等是女贞子的主要免疫增强活性成分。（3）女贞子活性成分羟基酪醇增强巨噬细胞免疫活性的作用及机制通过荧光显微镜观察羟基酪醇作用于RAW264.7巨噬细胞后细胞抗原摄取能力,ELISA检测细胞因子分泌,Griess法检测一氧化氮（NO）释放,荧光显微镜和流式细胞术检测活性氧（ROS）产生,流式细胞术检测细胞表面分子和共激活分子的表达,并通过Western blot检测NF-κB和TLR4信号通路相关靶点蛋白的表达。结果表明,羟基酪醇能显着增强巨噬细胞对FITC-OVA的摄取能力,提高肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素1β（IL-1β）等分泌,促进NO释放和ROS产生,并显着上调细胞表面分子MHC-Ⅱ和共激活分子CD80和CD86的表达;进一步研究表明,羟基酪醇可以显着上调细胞核NF-κB p65表达,下调细胞浆IκB-α表达,同时还能显着上调TLR4,My D88,TRIF和IKKβ的表达,说明羟基酪醇对RAW264.7巨噬细胞的活化可以通过TLR4/My D88（TRIF）/IKKβ介导的信号反应激活细胞内NF-κB信号通路实现。（4）女贞子活性成分羟基酪醇增强淋巴细胞免疫活性的作用及机制通过ELISA检测细胞因子和免疫球蛋白分泌,流式细胞术检测细胞亚群比例,荧光显微镜和流式细胞术检测细胞内Ca2+浓度,微板法检测细胞中钙调神经磷酸酶（Calcineurin）活力,并通过Western blot检测核转录因子NFAT和NF-κB信号通路相关靶点蛋白表达。结果表明,羟基酪醇可显着增加白细胞介素4（IL-4）、γ干扰素（IFN-γ）和TNF-α分泌,提高淋巴细胞亚群CD3+和CD4+/CD8+比例;进一步研究表明,羟基酪醇可以显着增加细胞内Ca2+浓度,提高Calcineurin活力,并且显着上调细胞核NFAT和NF-κB p65表达,同时下调细胞浆NFAT和IκB-α表达,说明羟基酪醇可以通过促进Ca2+/Calcineurin/NFAT和NF-κB信号通路的级联反应,激活脾淋巴细胞。综上所述,本研究发现女贞子正丁醇和乙酸乙酯部位萃取物为其主要免疫增强活性部位,并分离和筛选得到多个具有免疫增强活性的单体化合物,其中羟基酪醇活性最好;进一步研究阐释了羟基酪醇可以通过影响细胞信号通路的传递,引起NF-κB p65和NFAT的入核来增强巨噬细胞和淋巴细胞的免疫活性。本论文研究结果为今后将女贞子开发为免疫增强剂提供了理论依据,为发展可以替代抗生素的中兽药饲料添加剂提供思路。
王莹[3]（2020）在《枸杞多糖的分离纯化及基于对肠道菌群调节的免疫作用机制研究》文中认为研究目的枸杞的水溶性多糖是枸杞发挥生物活性的主要成分,具有良好的免疫增强作用,但其免疫调节作用机制尚在探索研究中。近些年来肠道菌群研究的不断深入,为多糖等低生物利用度产品的作用机制探究提供了新的思路。枸杞多糖（The polysaccharides of Lycium barbarumL.,LBP）对肠道菌群会产生怎样的影响以及其与免疫功能之间是否存在相关性,目前尚不清楚。本研究以环磷酰胺致免疫抑制小鼠和RAW 264.7细胞为模型,考察了 LBP体内外免疫功能以及对小鼠肠道菌群的影响,且结合LBP肠跨膜转运情况,以期深入探讨LBP的免疫活性及免疫调节作用途径。多糖的结构与活性有着紧密的联系,建立能反映其结构、纯度特性的多糖质控方法对于多糖产品的有效性、稳定性、均一性和安全性有重要意义。然而由于多糖结构的复杂性,导致其质控方法研究进展缓慢。本研究拟采用多种分析技术联用方式对LBP初级结构进行测定,通过构效关系分析得到影响LBP免疫活性发挥的主要结构特征,形成能反映LBP关键结构特征的质控方法,以控制和指导LBP的制备;同时结合体外免疫和抗氧化活性测定对不同产地枸杞中LBP进行比较,为我国枸杞资源质量评价提供理论基础。研究方法1、采用水提醇沉法得到枸杞粗多糖;采用苯酚硫酸-UV法测定总糖含量;咔唑硫酸-UV法测定酸性糖含量;建立PMP衍生化-HPLC-PDA法测定LBP中单糖组成及摩尔百分比;采用GPC-RI-MALLS联用法测定LBP的相对分子量（Mw）、分散系数（PDI）以及空间构象（α）;采用甲基化-GC/MS法对LBP糖的连接位置进行测定。2、在LBP分离纯化过程中,分别对乙醇沉淀法、膜分离法、色谱柱分离法进行考察,以获得高纯度的均一的LBP成分。3、以人工胃液和肠液模拟体外消化状态,考察LBP在消化液中的稳定性。采用FITC对LBP进行荧光标记,再采用Caco-2细胞模型对FITC-LBP的跨膜吸收进行研究,获得表观渗透系数Papp。4、以RAW264.7小鼠单核巨噬细胞为模型,考察LBP对细胞增殖活性、吞噬能力及相关细胞因子表达量的影响;同时采用Western-blot法初步分析LBP对信号通路的影响。5、采用CTX致免疫抑制小鼠模型,考察LBP对小鼠免疫器官、巨噬细胞吞噬指数、脾脏中淋巴细胞、T细胞亚群及血清中IgG、IgM水平的影响。6、采用16S rDNAV3+V4高变区测定技术,对不同实验组小鼠肠道菌群的多样性及群落结构进行统计;同时采用Pearson统计法分析肠道菌群与免疫功能之间的相关性。采用HE染色法对小鼠肠粘膜形态进行观察。7、对不同产地（宁夏、新疆、青海）枸杞中的LBP进行提取和纯化,采用已建立的方法对其产率和初级结构进行测定,并对LBP单糖组成及糖连接方式指纹图谱进行相似度评价。同时对不同产地LBP体外免疫活性及抗氧化活性进行比较。研究结果1、LBP初级结构测定本实验所得LBP是总糖含量为66.9%的酸性杂多糖;由9种单糖组成,分别为:甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖;LBP分子量测定呈现出2个分离不完全的色谱峰,峰1的Mw为 1.37×106Da（PDI为 1.58）;峰 2 的 Mw 为 8.83 × 104Da（PDDI为 1.48）;α（Rg-M曲线的斜率值）为0.237,初步推断LBP在0.1%NaCl溶液中呈现紧缩的球型;LBP中主要有14种糖的连接方式,以（1→4）GalA连接为主。本实验采用的定量测定方法灵敏度高、准确性好,经方法学验证符合实验要求。2、LBP的分离纯化 采用DEAE-52纤维素柱和HW-65层析柱相结合的方法对LBP进行分离,获得两个高纯度均一成分:LBP1和LBP2,其Mw分别为1207400 Da和 125000 Da。3、LBP在体外消化液中的稳定性及肠跨膜转运能力 通过Mw测定表明LBP1和LBP2在人工胃液和人工肠液中均未发生降解;在肠跨膜转运实验中培养的Caco-2单细胞模型经验证紧密性和完整性良好,可模拟小肠上皮细胞;采用经验证标记成功的FITC-LBP1和FITC-LBP2进行Caco-2细胞跨膜转运实验,其累积转运率分别为0.99%和1.15%,Papp<1.0 × 10-6cm·s-1,说明两个LBP组分在小肠中均不易被吸收。4、LBP对巨噬细胞的免疫调节及其机制研究 LBP1和LBP2均能显着促进RAW 264.7细胞增殖,增强其吞噬能力;提高细胞中IL-6、TNF-α、IL-1β和iNOS的mRNA表达量,呈剂量依赖性;同时诱导巨噬细胞p-JNK MAPKs信号通路的激活,且其激活程度随着浓度的增加而逐渐增强。在对RAW 264.7的调节作用上,LBP1效果优于LBP2（P<0.05）。5、LBP对免疫抑制小鼠免疫功能的影响 相比于模型组,LBP1和LBP2均显着提高小鼠胸腺和脾脏指数;促进脾脏中T、B淋巴细胞的增殖;提高血清中IgG、IgM的含量;同时调节CD4+、CD8+T淋巴细胞数量及CD4+/CD8+比例,均呈现剂量依赖性。在体内免疫调节功能上,LBP1效果优于LBP2（P<0.05）。6、LBP对免疫抑制小鼠肠道菌群及肠粘膜的影响 高剂量LBP1和LBP2给药组可逆转由CTX导致的肠道菌群紊乱,使OTU多样性及菌群结构恢复到对照组水平。比较不同实验组菌群结构发现:LBP可显着提高双歧杆菌、乳杆菌、拟杆菌、普雷沃氏菌科和理研菌科的相对丰度;降低某些菌群,如大肠杆菌,Parabacteroides和Ruminococcus的相对丰度。通过相关性分析得出:在科水平上,乳杆菌、拟杆菌、普雷沃氏菌和双歧杆菌与免疫调节呈显着正相关,而大肠杆菌、瘤胃菌科与毛螺旋菌科与免疫调节呈显着负相关。同时发现低剂量LBP组对肠道菌群无明显调节作用。此外,经LBP干预后可一定程度修复由CTX引起的小鼠肠道粘膜损伤。7、基于LBP测定的不同产地枸杞质量评价 不同产地LBP结构和体外活性具有高度相似性,且单糖组成和糖的连接位置指纹图谱相似度均大于0.90;但不同产地枸杞中LBP的产率相差较大,在1.6%～4.4%之间,青海枸杞LBP的平均产率显着低于新疆和宁夏枸杞子（P<0.05）。研究结论1、基于不同产地LBP结构共性特征及构效关系分析,初步形成了 LBP质控方法。包括对LBP中半乳糖醛酸、阿拉伯糖、半乳糖和葡萄糖四种主要单糖进行含量测定,对LBP的Mw及PDI的范围进行检查,同时以LBP单糖组成对照指纹图谱对待测LBP进行相似度分析,相似度应不得低于0.90。此法极大提高LBP检测的专属性,可有效的反映LBP关键结构属性,且检测指标与其活性密切相关,可将LBP及其相关产品与其他中药多糖进行有效区分。2、不同产地枸杞中LBP结构及体外活性具有高度一致性,但LBP产率存在较大差异。推测对于多糖成分,种属对其结构和生物活性有关键影响,而地域对多糖产率有较大影响。宁夏一直被认为是枸杞的道地产区,本研究从多糖的角度部分阐明了宁夏产区枸杞的质量优势。3、体内外实验均表明LBP具有较强的免疫调节功能。RAW264.7细胞实验表明LBP可通过激活p-JNK MAPKs细胞通路对巨噬细胞免疫调节作用产生影响;免疫抑制小鼠模型实验表明LBP可改善CTX导致的小鼠免疫器官萎缩,并从体液免疫和细胞免疫两方面增强机体免疫功能。同时发现LBP1的效果优于LBP2,说明Mw是影响LBP免疫活性的关键因素之一。4、高剂量LBP可改善免疫抑制小鼠菌群多样性,提高某些菌群的相对丰度,此类菌群或可直接激活相关免疫通路,促进T淋巴细胞的分化;或与SCFA的产生相关,可增强肠道粘液屏障功能。同时发现LBP可降低某些潜在的致病菌,而此类致病菌亦与结肠炎、结肠癌等疾病相关。5、结合LBP在Caco-2跨膜研究中转运率很低的结果,初步推测LBP进入肠道后对肠道菌群的调节作用是其发挥免疫功能的重要途径之一;低剂量LBP无明显肠菌群调节作用,说明LBP免疫作用途径与其剂量紧密相关。
曹宇欣[4]（2020）在《基于多糖分子量分布和免疫活性比较的黄芪质量研究》文中提出选题依据:黄芪是山西大宗道地药材之一。多糖作为黄芪中的主要免疫活性成分,却因结构可控性难题,未能作为质控指标。近年来随着膜材料、色谱填料技术等发展,超滤法、新一代凝胶色谱法的应用,使得多糖组分可以根据分子量进行系统表征和分离。新技术、新表征方法的应用不仅可避免了多糖结构测定的技术瓶颈,而且从整体上可以精准表征中药材多糖的结构特点。基于TSK凝胶色谱法进行黄芪多糖分子量分布的糖谱表征可鉴别出不同种属、不同基原、不同生长方式下黄芪药材的差异。通过超滤法可截留制备出不同分子量黄芪多糖,为系统免疫活性筛选奠定了基础。因此本研究通过TSK凝胶色谱分离法和超滤截留法,进行不同分子量黄芪多糖糖谱表征和制备,分别进行结构研究（单糖组成、连接位点分析）,同时进行非特异性和特异性免疫活性筛选（体外细胞活性评价和体内动物活性验证）,找出黄芪多糖中活性最强组分,建立黄芪多糖特征糖谱结合细胞免疫活性评价方法进行不同来源黄芪质量比较。研究不仅为阐明黄芪多糖药理功能物质奠定了基础,而且促进了药物研发。目的:将黄芪多糖（APS）按分子量分布情况分离不同组分,解析各组分结构并筛选出免疫活性最强的组分。并通过建立黄芪多糖、寡糖和单糖糖谱,结合技术成熟的细胞免疫活性实验,建立以多糖为评价指标的黄芪品质评价方法。方法:（1）采用水提醇沉法对山西浑源黄芪药材中的多糖成分进行提取。并按分子量分布情况采用超滤截留的方法将APS进行分离,通过测定不同组分的单糖组成,红外光谱,甲基化和核磁共振（NMR）波谱分析比较它们之间的结构差异。（2）将制备出的三种不同分子量的APS通过体外作用于小鼠免疫细胞,用MTT法测脾淋巴细胞增殖活性和ELISA法测LPS诱导的脾淋巴细胞分泌IgG水平,以检测APS特异性免疫;用吞噬中性红法测腹腔巨噬细胞吞噬功能和乳酸脱氢酶测定法测脾NK细胞活性,来检测APS的非特异性免疫。从而筛选出APS中免疫活性最强的组分。（3）将制备出的三种不同分子量的APS体内作用于环磷酰胺免疫抑制小鼠模型,测定血常规、脾脏指数及对特异性免疫和非特异性免疫功能的影响,来评估不同分子量黄芪多糖的免疫调节活性,筛选出APS中免疫活性最强的组分。（4）本研究采用采用高效凝胶过滤色谱法建立不同黄芪药材的多糖特征图谱,基于部分酸水解的HILIC特征图谱分析法建立不同黄芪药材的寡糖特征图谱,以及通过总多糖的酸降解方法,结合柱前衍生化,采用HPLC-UV建立不同黄芪药材的单糖特征图谱。找出不同产地及种植方式蒙古黄芪的相似性和差异性,并通过小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红试验比较三种蒙古黄芪中APS的免疫调节活性以及每种APS水解产物与总多糖之间的免疫调节活性。结果:1.本研究中提取的黄芪多糖总多糖含量为74.6%,蛋白质含量为0.42%,分子量分布情况为300 Da2 MDa,测得其单糖组成为鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖,它们的物质的量比为0.43:0.23:19.36:0.69:1。采用超滤截留法将APS分为三个部分,即APS-I（>2 MDa）,APS-II（约10 kDa）和APS-Ⅲ（约300 Da）。并比较了APS中三个不同分子量组分的单糖组成和连接信息,发现三者之间的结构差异。它们虽然具有相同的单糖组成,但是每种单糖的物质的量比不同。在APS-I中Rha,Gal A,Gal,Glu,Ara的比例约为0.1:0.39:13.4:17.2:1;在APS-II中约为0.14:0.14:9.6:24.04:1;在APS-Ⅲ中约为0.375:0.375:18.8:90.5:1。由IR确定它们具有相似的官能团。甲基化和NMR分析显示三者单糖残基的连接位点不同:APS-1单糖残基连接方式为β-L-Ara-（1→,→2）-α-D-Gal-（1→,→4）-α-L-Rha-（1→,→6）-α-D-Glu-（1→,→6）-β-D-Gal-（1→,→4）-α-D-Glu-（1→。APS-II单糖残基连接方式为→2,3）-α-L-Rha-（1→,→5）-α-L-Ara-（1→,→3,4）-β-D-Gal-（1→,→6）-β-D-Gal-（1→,→4）-α-D-Glu-（1→,→3,5）-β-D-Glu-（1→。APS-Ⅲ单糖残基连接方式为→5）-α-L-Ara-（1→,→6）-β-D-Gal-（1→,→4）-α-D-Glu-(1→。2.将制备出的三种不同分子量的APS通过体外作用于小鼠免疫细胞,结果表明:不同分子量的APS都能通过不同程度地增强小鼠脾淋巴细胞增殖活性和脾淋巴细胞分泌IgG水平,来增强APS特异性免疫;通过增强腹腔巨噬细胞吞噬功能和脾NK细胞活性,来增强APS的非特异性免疫。并且最终筛选出APS免疫活性的主要贡献者是APS-II（约10 kDa）。这表明,APS的生物活性与其相对分子质量有关。3.将制备出的三种不同分子量的APS通过体内作用于环磷酰胺诱导地免疫低下小鼠来筛选活性多糖,结果表明,APS-II对改善环磷酰胺免疫抑制小鼠的体重和免疫器官重量具有最明显的作用。增加其特异性和非特异性免疫力的能力最强。这与体外免疫细胞活性筛选实验的结果相互验证,更有利地证明了APS免疫活性的主要贡献者是APS-II（约10 kDa）,表明APS的相对分子质量对生物活性有显着影响,除单糖或双糖外,低分子量的APS比高分子量的APS具有更好的免疫调节作用。4.通过对36批黄芪多糖、寡糖和单糖糖谱地分析,结果表明山西浑源仿野生黄芪多糖含量和增强巨噬细胞吞噬活性的能力较高于移栽芪,且黄芪多糖的部分酸水解产物增强巨噬细胞吞噬活性的能力较高于未水解的总黄芪多糖。山西浑源、山西五寨和甘肃陇西的黄芪多糖具有相似的分子量分布,但每个部分的峰面积占总峰面积的百分比具有明显差异,山西黄芪多糖中分子量为10 kDa左右的部分高于甘肃黄芪,PCA显示可以将山西黄芪和甘肃黄芪区分开。从寡糖图谱可以看出,同种APS的部分酸水解产物之间的相似性很高,三种不同APS部分酸水解产物之间差异较大,主要差异在于不同聚合度（DP）寡糖的种类及相对比例。通过建立HILIC-MS法来对特征性寡糖片段进行分析表征,结果表明,三种不同的黄芪多糖均主要为1→4连接的线性葡聚糖,水解后得到DP 38的葡寡糖。从单糖图谱可以看出,三者都是由鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和半乳糖醛酸5种单糖组成的。但3个产地的APS具有不同的单糖物质的量比。PCA显示可以将3种不同的蒙古黄芪区分开。结论:本论文分析比较了APS中不同分子量的三个多糖组分之间的结构差异。并通过体内体外免疫活性筛选实验找出APS中最具免疫活性的片段。为进一步研究具有不同结构的APS与免疫活性之间的关系奠定了基础,以及为进一步开发APS产品提供了指导。还采用将糖谱技术与APS对细胞免疫功能的影响相结合的方法为不同产地及不同种植方式黄芪的品质评价及质量控制提供了依据。
王启龙[5]（2019）在《基于免疫亲和色谱的中药多糖活性筛选与构效关系研究》文中进行了进一步梳理多糖是由醛糖和（或）酮糖通过糖苷键将单糖连接在一起的一类天然大分子聚合物,是机体生命活动必不可少的物质。糖生物组学已经成为继基因组学、蛋白质组学之后的第3个生物学里程碑。多糖具有多种重要的生物活性,特别是在调节机体免疫、增强细胞抗肿瘤活性等方面。目前对多糖的免疫活性成分的筛选方法是在传统的提取、分离和结构解析的基础上利用药理模型对多糖进行免疫活性测试,但该方法比较繁琐,且耗时较长。巨噬细胞（macrophagocyte,Mφ）是多糖发挥免疫调节作用的最主要的效应细胞,在免疫系统中发挥关键作用。多糖对Mφ的免疫调节作用主要通过对Mφ分泌细胞因子的影响及调节Mφ激活的信号通路两个方面进行。黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase,XOD）是机体催化黄嘌呤或次黄嘌呤转化为尿酸关键酶,同时XOD催化过程中生成的氧自由基影响整个免疫系统:尿酸过多会在关节处沉积,形成炎症,诱发机体的免疫反应;氧自由基也具有调节免疫活性、前列腺素合成、Mφ吞噬等作用。多糖可以通过对XOD的作用,发挥其免疫调节活性。本论文的研究目的是构建复壁碳纳米管修饰的Mφ脂筏免疫亲和色谱系统以及XOD酶免疫亲和色谱系统,实现多糖免疫活性的在线筛选,建立起一套快速、准确、使用寿命长的多糖免疫活性筛选系统。主要研究内容如下:1.Mφ脂筏免疫亲和色谱及XOD免疫亲和色谱在线筛选模型的构建:1)亲和色谱固定相材料的制备:首先将酰化的复壁碳纳米管（Carbon Nanotube Multi-walled,CNTm）与硅烷化的硅胶反应制备复壁碳纳米管包裹的硅胶（CNTm@SiO2）。将人单核细胞（monocytes,THP-1）诱导分化成Mφ,采用蔗糖梯度密度溶液超速离心法,获取脂筏;在冰浴条件下,分别向Mφ脂筏溶液、XOD溶液中加入CNTm@SiO2,制备Mφ包裹的CNTm@SiO2色谱固定相（Mφ@CNTm@SiO2）及XOD包裹的CNTm@SiO2色谱固定相（XOD@CNTm@SiO2）。扫面电子显微镜表征及免疫活性检测等结果表明:提取脂筏活性稳定,制备成固定相后,脂筏及XOD很好的吸附于CNTm@SiO2表面,且XOD与脂筏的免疫活性基本没受影响。2)亲和色谱系统的性能考察:采用低压装柱法制备亲和色谱柱,并对其免疫亲和色谱系统进行考察。分别考察Mφ@CNTm@SiO2色谱固定相及色谱系统、XOD@CNTm@SiO2色谱固定相及色谱系统的稳定性、专属性和使用寿命。实验结果显示色谱系统的稳定性和专属性良好,连续在线使用240 h后,其色谱活性没受影响,色谱柱活性保持良好,且使用寿命与未修饰的脂筏色谱相比大大延长。3)对不同分子量葡聚糖在这两种色谱上的保留行为分别进行研究,发现葡聚糖分子量的Ln值与其在色谱系统的保留时间成反比,回归方程的线性关系良好,为后续多糖筛选和免疫活性强弱判断奠定基础。2.中药多糖免疫活性在线筛选研究:选取十五味中药材,利用有机溶剂先除色素,经水提醇沉及除蛋白得到粗多糖,再利用大孔树脂层析柱、离子交换层析柱和凝胶过滤层析柱对粗多糖进一步分离纯化,得到分子量相对均一的纯化多糖组分17个,利用亲和色谱在线活性筛选模型筛选多糖的免疫活性。1)多糖的分离纯化:药材用石油醚和无水乙醇脱色后,超纯水提取浓缩后用95%乙醇沉淀多糖,沉淀物用Sevage法除蛋白质,超纯水透析两天,得到十五味中药的粗多糖。利用AB-8、D-101和D-315型大孔吸附树脂对粗多糖进行脱色。最后,将脱色后的粗多糖依次用离子交换层析柱和葡聚糖凝胶层析柱进行纯化,得到分子量相对均一的纯化多糖。2)多糖纯度鉴定:采用紫外分光光度法测定纯化多糖的纯度,元素分析仪对纯化多糖进行元素含量检测;采用高效液相色谱对多糖的纯度及分子量的进行测定。综合分析纯度检测结果,可证实所分离纯化的多糖分子量均相对均一,几乎均不含蛋白质、核酸、小分子化合物、色素、无机盐等杂质,多糖的纯度均较高。3)多糖含量测定:采用苯酚-硫酸法对多糖的总糖含量进行检测。以葡聚糖浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标,绘制标准曲线:y=8.177x-0.0414,R2=0.9976,线性范围良好。分离纯化得到的17种多糖的总多糖含量均超过98.5%。4)蛋白质含量测定:采用考马斯亮蓝法检测蛋白质含量。以牛血清蛋白浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标,标准曲线:y=0.0299x+0.0028,R2=0.9901,线性关系良好。分离纯化得到的17种多糖的蛋白质含量均未超过0.5%。5)纯化多糖免疫活性在线筛选:分别用Mφ@CNTm@SiO2色谱系统及XOD@CNTm@SiO2色谱系统对多糖的免疫活性进行在线筛选。通过与多糖在Mφ@CNTm@SiO2免疫亲和色谱柱上的理论保留时间相比较,发现金银花-2多糖、川牛膝多糖、黄芩多糖、苦参多糖、当归多糖、金针菇多糖、白芍-1多糖在Mφ@CNTm@SiO2免疫亲和色谱柱上实际保留时间明显延迟;通过与多糖在XOD@CNTm@SiO2免疫亲和色谱柱上的理论保留时间相比较,金银花-2多糖、川牛膝多糖、黄芩多糖、苦参多糖、金针菇多糖、白芍-1多糖、白芍-2多糖在XOD@CNTm@SiO2免疫亲和色谱柱上的实际保留时间明显延迟。3.中药多糖免疫活性体内外评价采用体内体外结合的方法检测多糖对XOD和Mφ活性的影响,验证Mφ@CNTm@SiO2免疫亲和色谱以及XOD@CNTm@SiO2免疫亲和色谱在线筛选多糖免疫活性结果的准确性。1)多糖对体外培养的Mφ吞噬的影响:采用紫外分光光度法来考察多糖对Mφ的吞噬的情况。研究结果表明,金银花-2多糖组、川牛膝多糖组、黄芩多糖组、苦参多糖组、金针菇多糖组、白芍-1多糖组、白芍-2多糖组均可以显着影响Mφ的吞噬行为。2)多糖对Mφ分泌的NO和TNF-α的影响:ELISA试剂盒检测结果表明,金银花-2多糖组、川牛膝多糖组、黄芩多糖组、苦参多糖组、金针菇多糖组、白芍-1多糖组、白芍-2多糖组、当归多糖组均可以显着提高NO、TNF-α分泌量;黄芪多糖组显着提升Mφ分泌NO的能力。3)多糖对体内Mφ吞噬能力影响:采用小鼠腹腔Mφ吞噬鸡红细胞试验测定多糖对Mφ体内吞噬能力的影响。实验结果表明,金银花-2多糖组、川牛膝多糖组、黄芩多糖组、苦参多糖组、金针菇多糖组、白芍-1多糖组、白芍-2多糖组的小鼠Mφ吞噬能力显着提高。4)纯化多糖的体外抑制XOD活性研究:用紫外分光光度法检测尿酸的含量,推断多糖对XOD抑制活性。研究结果:金银花-2多糖、川牛膝多糖、黄芩多糖、苦参多糖、金针菇多糖、白芍-1多糖、白芍-2多糖有抑制XOD的活性。5)多糖在体内对XOD抑制活性研究:建立高尿酸症大鼠模型,检测纯化多糖对大鼠的血清及肝脏中XOD活性的影响,研究结果表明,金银花-2多糖组、川牛膝多糖组、黄芩多糖组、苦参多糖组、金针菇多糖组、白芍-1多糖组、白芍-2多糖组可以显着降低血清及肝脏中XOD的活性。6)纯化多糖对大鼠血尿酸水平影响:大鼠高尿酸血症模型的建立,可以通过检测尿酸浓度,在一定程度上反应多糖对XOD的抑制活性。研究结果表明,金银花-2多糖组、川牛膝多糖组、黄芩多糖组、苦参多糖组、金针菇多糖组、白芍-1多糖组、白芍-2多糖组、山药多糖组、黄芪多糖组、白芨多糖组可明显降低大鼠血尿酸浓度。通过以上实验证明建立的两种亲和色谱具有可靠的多糖免疫活性筛选能力,采用阴性对照品葡聚糖所建立的半定量分析方法准确性高。4.多糖的结构解析及构效关系初步探讨本章对分离纯化的17种多糖的结构进行初步解析,主要采用高效液相、红外光谱、核磁共振、高碘酸氧化、刚果红实验等分析方法和分析仪器。对多糖的初级及高级结构进行研究,结合前期多糖的免疫活性的测定,初步探索多糖的构效关系。1)多糖分子量与活性关系:在一定范围内,大分子量的多糖具有更多数量的单糖,糖键的连接方式更多,聚合种类也更多,所以空间结构更加复杂,有可能会提高其生物活性。2)单糖组成与活性关系:采用柱前衍生化-高效液相色谱法对多糖的单糖组分进行检测。研究发现,具有葡聚糖主链结构,含有阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖的多糖具有较强的促进免疫活性作用;糖醛酸可以明显增加多糖的免疫活性。3)糖苷键的类型与活性关系:采用高碘酸氧化多糖反应分析糖苷键连接类型。研究发现,免疫活性强的多糖中的1→3糖苷键所占比例比其他纯化多糖组分的比列高。推测可能是因为1→3糖苷键为非还原性糖苷键,其比例越大,稳定性和耐受性越高,活性所受影响越小。4)异头碳类型与活性的关系:采用傅里叶变换-红外光谱分析及1H-NMR分析异头碳类型。结果表明,异头碳的联合类型与多糖免疫活性大小的关系不明显。5)多糖高级结构与活性的关系:采用刚果红实验以及透射电镜分析多糖的高级构象。研究表明,具有三螺旋空间构象的多糖其免疫活性相应较强,而透射电镜的分析结果也证明这几个纯化多糖具有类似蠕虫链状的空间构象,与其三螺旋空间构象类似。
陈彦旭[6]（2019）在《补肾解毒方抗小鼠免疫性肝损伤的机制研究》文中进行了进一步梳理目的:研究补肾解毒方全方、拆方、单方水煎干浸膏对Con A诱导的小鼠免疫性肝损伤模型的作用;研究上述药物对人肝LO2细胞和脾细胞增殖的调节作用;研究上述药物小鼠原代脾淋巴细胞与腹腔巨噬细胞细胞因子表达的影响。以期阐释补肾解毒方治疗慢性肝损伤的作用机制。方法:1.建立昆明种小鼠Con A诱导的免疫性肝损伤模型;2.补肾解毒方干预Con A模型小鼠,通过HE法观察肝脏组织病理,生化法检测血清ALT、AST水平和肝匀浆上清中的SOD、MDA、CAT水平,ELISA法检测脾细胞上清中的IFN-γ水平,研究补肾解毒方对肝损伤的保护作用;3.补肾解毒方对人肝LO2细胞进行干预,MTT法检测其增殖能力,研究补肾解毒方对肝细胞增殖的调节作用;4.补肾解毒方对小鼠原代脾细胞和腹腔巨噬细胞进行干预,MTT法检测脾细胞增殖,ELISA法检测脾淋巴细胞上清中的IFN-γ水平和腹腔巨噬细胞上清中的TNF-α水平,研究补肾解毒方对免疫细胞的调控作用。结果:1.补肾解毒方对小鼠免疫性肝损伤的保护作用:（1）中药对小鼠脏器系数的影响:与正常组比较,模型组小鼠肝脏系数显着升高（P<0.05）,胸腺系数降低（P>0.05）;与模型组比较,全方、活血解毒拆方与醋青皮组的肝脏指数显着降低升高（P<0.05）;（2）中药对模型小鼠肝脏病理的改变:与正常组比较,模型组小鼠病理切片显示明显的肝细胞坏死区域并伴有大量炎症细胞聚集和纤维细胞的增生;与模型组比较,用药组肝细胞坏死区域缩小,炎症细胞聚集减少,出现双核或多核肝细胞;（3）中药对小鼠肝功能的调节作用:与正常组比较,模型组小鼠血清ALT、AST水平明显升高（P<0.05）;与模型组比较,活血解毒拆方组小鼠血清AST水平降低（P<0.01）,巴戟天、淫羊藿和苦参组的小鼠血清ALT水平降低（P<0.05）;（4）中药对小鼠肝脏内抗氧化能力指标表达的影响:与正常组比较,模型组小鼠肝匀浆上清中的SOD与CAT酶活力降低（P>0.05）;与模型组相比,苦参、丹参、猫爪草、醋青皮组肝匀浆上清的SOD酶活力提高（P<0.05）;（5）中药对小鼠脾淋巴细胞IFN-γ表达水平的影响:与正常组相比,模型组小鼠脾淋巴细胞IFN-γ表达水平升高（P<0.001）;与模型组相比,全方一组、补肾拆方组、巴戟天和苦参组的小鼠IFN-γ的表达水平降低（P<0.05）;2.补肾解毒方对人肝LO2细胞增殖的调节作用:（1）全方和三种拆方在10、50、100和250μg/m L有明显促增殖活性（P<0.05）,且呈良好的量效关系;（2）淫羊藿、地黄、灵芝250μg/m L有促增殖作用（P<0.05）,丹参和醋青皮50、100和250μg/m L均有促增值作用（P<0.05）;（3）全方在50、100和250μg/m L对H2O2抑制肝细胞增殖有明显的调节作用（P<0.05）,且呈良好量效关系;（4）补肾拆方和活血解毒拆方在250μg/m L对H2O2抑制肝细胞增殖有明显的调节作用（P<0.05）;50μg/m L丹参与100、250μg/m L醋青皮对H2O2抑制肝细胞增殖有明显的调节作用（P<0.05）;3.补肾解毒方对免疫细胞的调控作用:（1）全方和三个拆方水煎干浸膏对小鼠原代脾细胞均无明显增殖作用,对Con A刺激和LPS刺激的脾细胞增殖有拮抗作用（P<0.05）;（2）全方对小鼠原代脾细胞IFN-γ表达水平无影响,但可以降低腹腔巨噬细胞TNF-α的表达水平（P>0.05）;（3）补肾拆方、健脾拆方、活血解毒拆方在250μg/m L升高脾细胞IFN-γ的表达水平（P<0.05）,50μg/m L补肾拆方、10μg/m L健脾拆方与活血解毒拆方降低腹腔巨噬细胞TNF-α的表达水平（P<0.05）。结论:1.补肾解毒方主要通过降低血清转氨酶水平和升高肝脏SOD酶活力对免疫性肝损伤小鼠有治疗作用,并且全方效果优于拆方与单方。2.补肾解毒方的全方、补肾拆方、健脾拆方、活血解毒拆方、淫羊藿、地黄、灵芝、丹参和醋青皮促进肝细胞的增殖,抑制H2O2诱导的肝细胞的氧化损伤和凋亡。3.补肾解毒方调节小鼠原代脾细胞和腹腔巨噬细胞的免疫作用。
张槐[7]（2019）在《复方芪术颗粒的研制及其免疫增强作用研究》文中研究指明多数补气类中药在增强动物免疫力和恢复受免疫抑制动物的免疫力方面具有独特功效。本研究选用具有免疫增强作用的黄芪和白术两味补气类药材,经过水提醇沉、制粒、干燥等工序制备成复方芪术颗粒（Compound Huangqi&Baizhu granules,CHBG）,并进行了药物制剂学、毒理学以及药效学方面的研究,以期获得一种新的兽用免疫增强剂。现将研究结果分述如下:1.CHBG黄芪白术配比筛选为了获取疗效更优的CHBG,本文以雏鸡为试验动物,以黄芪与白术1:3～3:1不同比例配伍制备的颗粒为试验药物,同时设立疫苗免疫对照组,通过考察试验药物对新城疫（ND）疫苗抗体水平影响而筛选黄芪与白术的配伍比例。结果显示,当黄芪与白术比例为1:1时,雏鸡ND抗体水平较疫苗免疫对照组显着升高（P<0.05）,且其抗体水平在所有药物试验组中最高。结果表明,黄芪与白术比例为1:1时的颗粒剂具有较好的免疫增强作用,因此以此为基础制备CHBG。2.CHBG的制备及稳定性研究为了制备质量稳定、可控的GHBG,本文采用薄层色谱（TLC）和高效液相色谱（HPLC）法确定黄芪、白术的药材质量;在此基础上采用Ca（OH）2的碱水提醇沉的方法获取黄芪白术提取物,然后加入辅料、采用湿法制粒、干燥的工艺制得CHBG,再通过加速试验和长期稳定性试验考察稳定性。结果显示:（1）在黄芪和白术各自TLC图谱中,样品药材和对照品药材在相同位置显示相同荧光斑点;且两味药材的HPLC特征图谱与对照品药材的相似度均达到0.90以上,说明选用药材合格;（2）制得黄芪、白术的混合粗多糖,试验三批次的多糖平均得率为7.58%,其多糖含量为73.83%。制得的CHBG成品,每1 g相当于原生药2 g;（3）CHBG以市售铝塑包装密封后,在温度40±2℃,相对湿度为75±5%的环境中加速试验6个月以及在温度25±2℃、相对湿度60±10%的环境中放置18个月后,其外观性状、鉴别、含量等质量指标均符合CHBG质量标准要求。以上实验结果表明:选用合格的药材,采用Ca（OH）2的碱水提醇沉、喷雾干燥、湿法制粒获得的CHBG质量稳定,有效期可达18个月。3.CHBG质量标准研究为使CHBG质量可控,借鉴药典方法和采用TLC、HPLC等方法,建立CHBG的质量标准。结果:参考中国兽药典建立了 CHBG的含量检测方法以及确定了 CHBG的外观性状、水分、粒度、溶化性、微生物限度等检查项目;采用TLC法建立了 CHBG定性鉴别多糖、黄芪甲苷、白术的方法;参考中国兽药典建立了 HLPC检查CHBG中单糖、双糖含量的方法,并规定了检出限度;同时,采用HLPC法对9批CHBG特征图谱进行了考察,建立了 CHBG的指纹图谱。结果表明,本试验建立的质量标准可用于CHBG的质量控制。4.CHBG安全性评价采用改良寇氏法和最大耐受药量试验法评价CHBG安全性,为临床安全用药提供依据。改良寇氏法未能测定出CHBG对小鼠口服的LD50,但最大耐受药量试验法测得CHBG对小鼠口服的最大耐受剂量为180 g/（kg·bw）。在最大耐受药量时,小鼠体质量和脏器指数无明显变化。实验结果表明:CHBG对实验小鼠是安全的。5.CHBG对小鼠非特异性免疫调节作用研究为探讨CHBG对免疫缺陷动物的免疫调节作用,本文以小鼠为试验对象,采用环磷酰胺（cyclophosphamide,Cy）制作免疫抑制模型,再分别设立空白组、Cy组、Cy+CHBG3.75组（注:给药剂量为3.75g/（kg.bw）,本节下同）、Cy+CHBG7.5组、Cy+CHBG15.0组,并分别考察CHBG对小鼠免疫器官指数、碳粒廓清功能、脾淋巴细胞增殖、血清溶菌酶及TNF-α、IL-2、IL-4、IFN-γ等细胞因子的影响。同时设立空白组、黄芪多糖组、CHBG3.75组、CHBG7.5组、CHBG15.0组,采用流式细胞术测定CHBG对正常小鼠脾淋巴细胞亚群的影响。实验结果显示:（1）Cy处理可引起脾脏指数、胸腺指数下降,并能抑制脾淋巴细胞增殖,导致血清溶菌酶含量以及TNF-α、IL-2、IL-4、IFN-y等细胞因子水平下降。其中脾脏指数、血清溶菌酶含量以及IFN-y等细胞因子水平比空白组显着下降（P<0.05）,说明Cy处理引起了明显的免疫抑制。（2）与Cy组比较,CHBG15.0可显着提高脾脏指数、IFN-y的含量（P<0.05）,极显着提高血清溶菌酶的含量（P<0.01）;CHBG7.5可极显着提高脾脏指数、胸腺指数、血清溶菌酶的含量（P<0.01）;CHBG3.75可显着恢复并促进小鼠脾淋巴细胞增殖、显着提高IL-4的含量（P<0.05）,极显着提高脾脏指数、血清溶菌酶的含量（P<0.01）。CHBG各剂量组均可提高碳粒廓清指数和吞噬指数,但差异不显着（P>0.05）;对TNF-α、IL-2的生成也无明显影响。（3）CHBG3 75可显着降低正常小鼠CD8+T细胞的数量（P<0.05）,并显着提高CD4+/CD8+比值（P<0.05）,且除CHBG15.0组的CD4+T细胞的数量和CD4+/CD8+的比值显着低于黄芪多糖组（P<0.05）,CD8+T细胞的数量显着高于黄芪多糖组（P<0.05）外,CHBG3 75组和CHBG7.5组的CD4+、CD8+T细胞的数量以及CD4+/CD8+的比值均与黄芪多糖组的差异不显着（P>0.05）。以上试验结果表明:CHBG可明显恢复Cy所致小鼠免疫器官发育的抑制作用,能增强Con A诱导的脾淋巴细胞增殖反应;增强单核巨噬细胞的吞噬功能、促进溶菌酶释放,诱导机体产生IFN-γ、提高血清中IL-4的含量,还可提高CD4+/CD8+T淋巴细胞比值。6.CHBG对ND疫苗免疫效果的影响为考察CHBG对ND疫苗免疫效果。以口服0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 g/L的剂量在每次免疫后连续给药7 d,考察不同剂量CHBG对雏鸡ND抗体水平的影响;以整个免疫期连续给药、首免和二免后连续给药1周以及首免后给药1周的三种方案给药,考察CHBG的不同给药方案对雏鸡ND抗体水平的影响。结果显示:（1）当口服不同剂量CHBG时,与疫苗免疫对照组比较,在首免后的第1、2周,CHBG10（注:给药剂量为1.0 g/L饮水给药,本节下同）组的抗体水平显着升高（P<0.05）,在二免后第1、2周时,抗体水平极显着升高（P<0.01）。与黄芪多糖组比较,CHBG各剂量组中除CHBG5.0组在35日龄时的ND抗体水平显着低于黄芪多糖组外（P<0.05）,而其余各组与其差异均不显着（P>0.05）。（2）采取不同给药方案时,与免疫对照组比较,在几种方案中,以每次免疫ND疫苗后,饮水给予1.0 g/L剂量的CHBG,并连续给药7 d的方案较好,其在首免后第1、2周,雏鸡ND抗体水平可显着增加（P<0.05）,在二免后第1、2周时,雏鸡ND抗体水平极显着增加（P<0.01）;且用药成本低。综上所述,采用本试验方法制备的CHBG安全、稳定;同时建立了 CHBG质量标准,其检测方法简单、可行,可用于CHBG的质量控制。动物试验证实CHBG既可以恢复和增强机体的非特异性免疫,也能增强机体的特异性免疫,同时提供了 CHBG的临床使用方案,即每次免疫后以1.0 g/L剂量饮水连续给药7 d,有助于雏鸡ND抗体水平的提高,可为雏鸡提供更好的保护。
徐书雯[8]（2019）在《胞内pH敏感型黄芪多糖PLGA纳米粒作为抗原佐剂的研究》文中进行了进一步梳理中药黄芪,是豆科植物黄耆（AstragalusL.（Leguminosae））干燥的根,现代医学认为其具有增强机体免疫力、降血压、保肝利尿和抗应激效果。研究发现,黄芪内的主要活性成分黄芪多糖（Astragalus polysaccharides,APS）在提高免疫力方面发挥着巨大的作用,但由于黄芪多糖在体内代谢快,靶向作用弱,很大程度上削减了其在临床上的应用。聚乳酸-羟基乙酸共聚物（Poly（lactic-co-glycolic acid）,PLGA）是一种载体材料,安全无毒、无特异性免疫原性,将其作为纳米材料制备成载药纳米微粒可在体内将药物缓慢地释放出来,还能增加药物对特定部位的定位,改善药物的生物活性和利用度,降低毒副作用。本研究通过双重乳化-溶剂挥发法制备黄芪多糖PLGA纳米粒（APSP）,利用响应面法对APSP的制备条件进行优化,在优化的制备参数基础上对纳米粒做pH敏感性修饰,制备成pH敏感型黄芪多糖PLGA纳米粒（pH-responsive APSP）,并对纳米粒进行质量评估,通过体内和体外试验研究了pH-responsive APSP的免疫增强活性。试验主要由以下4部分组成:试验Ⅰ胞内pH敏感型黄芪多糖PLGA纳米粒的制备及条件优化 本章旨在筛选出制备pH敏感型黄芪多糖PLGA纳米粒（pH-responsive APSP）的最佳条件。采用多重乳化溶剂挥发法制备pH-responsive APSP,用SephadexG-50微柱凝胶分离游离多糖与装载多糖的纳米粒,苯酚-硫酸法检测纳米粒多糖含量,计算纳米粒的包封率和载药量。在此基础上选择中层油相与内部水相体积比（W1:O）、外部水相与初乳体积比（W2:WPE）、泊洛沙姆浓度（%）、APS与PLGA质量比、初乳超声功率（%）和碳酸氢铵浓度（mg.mL-1）六个单因素进行试验,得到对pH-responsive APSP包封率有较大影响的3个单因素:中层油相与内部水相体积比（W1:O）、外部水相与初乳体积比（W2:WPE）、泊洛沙姆浓度（%）。响应面法优化,得到最优的条件组合。试验结果显示,调整后的最优制备参数是:中层油相与内部水相体积比（W1:O）、外部水相与初乳体积比（W2:WPE）、泊洛沙姆浓度（%）分别为7:1、5:1和1.1%,测得纳米粒实际平均包封率为65.23±0.51%,响应面BBD法设计的模型拟合度较好。试验Ⅱ胞内pH敏感型黄芪多糖PLGA纳米粒的表征检测及质量评价 本章旨在对制备得到的纳米粒是否适合用作药物载体进行质量评估。对空白PLGA纳米粒（BP）、常规黄芪多糖PLGA纳米粒（APSP）和pH敏感型黄芪多糖PLGA纳米粒（pH-responsive APSP）的表征进行测定。以最佳参数制备出纳米粒,检测其水合粒径,电势及PDI,APSP和pH-responsive APSP的粒径大小分别为100.6±1.1 nm和127.0±1.2 nm,粒子表面均带负电荷,PDI分别为0.44±0.016和0.127±0.015,均小于0.5,说明纳米粒较为分散,无聚团现象;TEM观察各纳米粒超微形态,可见大量类球体,形态无异,表层圆整;体外APS和OVA释放结果表明,APSP在不同pH环境下均呈现缓慢释放,累计释放率不高,而pH-responsive APSP在酸性环境下呈现爆发式释放,且累计释放率均高于APSP;于透射电子显微镜下观察pH-responsive APSP体外释放过后的超微形态,在酸性环境下（pH为5.0）,纳米粒表面破损严重,但在中性环境下（pH为7.4）,纳米粒表面仍相对光滑圆整,说明了碳酸氢铵的成功包被;将pH-responsive APSP置于一般贮存条件下28天后,进行纳米粒的稳定性检测,结果表明pH-responsive APSP稳定性良好。试验Ⅲ胞内pH敏感型黄芪多糖PLGA纳米粒对小鼠脾脏淋巴细胞以及腹腔巨噬细胞的影响 本章旨在研究APSP和pH敏感型APSP对小鼠脾脏淋巴细胞和腹腔巨噬细胞的体外活化作用。MTT法检测pH-responsive APSP对淋巴细胞的毒性作用、增殖作用的影响,流式细胞术（FCM）检测对淋巴细胞表型CD4+,CD8+变化的影响;运用MTT法检测纳米粒对腹腔巨噬细胞的毒性,FCM检测巨噬细胞表面分子MHC-Ⅱ、CD80和CD86表达和吞噬能力,激光共聚焦显微镜（LSCM）观察巨噬细胞抗原摄取能力变化。试验结果表明,pH-responsiveAPSP能降低药物的细胞毒性,刺激淋巴细胞增殖,刺激CD4+T细胞分化成熟能力显着,并且能够提升脾脏淋巴细胞免疫活性。能显着刺激小鼠腹腔巨噬细胞成熟,上调细胞表面分子MHC-II,CD80和CD86表达量,显着增强巨噬细胞的吞噬能力和抗原摄取能力,与单独多糖相比具有显着的细胞活化作用。试验Ⅳ胞内pH敏感型黄芪多糖PLGA纳米粒的佐剂活性研究 本章旨在研究新型药物载体装载黄芪多糖后的体内佐剂活性。对胞内pH敏感型黄芪多糖PLGA纳米粒与OVA混合后免疫小鼠,研究小鼠免疫应答。将168只8周龄ICR雌性小鼠随机分为7组,每组24只,第0天进行第一次皮下免疫,隔一周第二次免疫。疫苗分组为:①PBS组;②OVA组;③OVA/FIA组;④OVA/APS组;⑤OVA/BP组;⑥OVA/pH-responsive APSP组;⑦OVA/APSP组。在第一次免疫后96 h,每组随机选4只小鼠,采淋巴结,FCM检测树突细胞的CD80、MHC-Ⅱ和CD86表面分子;二免后第7天（D21）、14天（D28）、21天（D35）和28天（D42）,每组任选4只小鼠,眶静脉取血,检测血清IgG、IgG2a和IgG1的含量,以及细胞因子IL-4、IL-6、IFN-y和TNF-α的浓度;二免后第7天（D21）和第35天（D49）,每组任选4只小鼠,无菌采集脾脏,制备淋巴单细胞悬液,体外培养44-48小时,MTT法检测淋巴细胞增殖情况,FCM检测T淋巴细胞活化情况。由试验结果可知,APSP和pH-responsive APSP用作佐剂佐剂与单独多糖相比,可显着促进树突细胞成熟,刺激机体产生更多的抗原特异性IgG抗体和细胞因子,有利于T淋巴细胞的增殖和分化,引起相应的免疫反应。此外,在免疫初期,pH-responsive APSP起的促进免疫应答效果优于常规黄芪多糖PLGA纳米粒,与表征检测的结果相符,具有靶向性增强机体免疫能力的效果,而常规黄芪多糖PLGA纳米粒能够起到缓释的作用,具有延长药物作用时间的效果。
伯若楠[9]（2019）在《枸杞多糖脂质体的免疫增强作用及其机理的研究》文中研究说明枸杞是一味常用的传统滋补中药,始载于《神农本草经》,列为上品,谓之:“久服坚筋骨,轻身不老,耐寒暑”。枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharide,LBP）是从枸杞浆果中提取的主要活性成分,具有抗衰老、抗肿瘤、抗氧化、免疫调节等广泛的药理活性。然而,LBP分子量在24-241kD之间,分子量较大,存在着多方面的缺陷,诸如代谢快,很难在血浆中保持高浓度,靶向性差,作用范围不集中,临床用量大等等。脂质体是一种通过磷脂分子在水性介质中自组装而形成的双层囊泡,由于其具有高生物相容性,多样化和高负载能力,被广泛用作递送各种治疗药物的载体。并且脂质体相对容易制备和表面装饰,以产生多功能的特性。脂质体作为安全有效的载药系统,同时又可以作为佐剂使用;枸杞多糖具有调节机体免疫力的功能。本研究选用脂质体作为递送载体,包封枸杞多糖,用于提高疫苗的免疫保护效果,增强机体的细胞免疫和体液免疫。首先采用逆向蒸发法将枸杞多糖最大程度地装载到脂质体中,以实现多糖的高效装载以及靶向递送,并对枸杞多糖脂质体（Lycium barbarum polysaccharide liposome,LBPL）进行 了质量评价;其次对 LBPL的体外免疫增强作用进行了测定;再次对LBPL包裹两种不同类型的抗原进行了动物体内试验,检测其对动物机体的免疫增强作用以及免疫佐剂活性;最后考察了 LBPL对抗原递呈细胞巨噬细胞以及树突状细胞（DCs）的作用及其激活Toll样受体4（TLR4）通路发挥免疫增强作用的机理。试验分为以下八个部分:试验Ⅰ 枸杞多糖脂质体的制备及其制备条件的优化本试验的目的在于筛选出枸杞多糖脂质体（LBPL）的最优制备方法和条件。采用逆向蒸发法制备LBPL,并用响应曲面法优化LBPL制备的最佳条件。用微柱离心法分离未包封的药物与载药脂质体,用苯酚-浓硫酸法测定LBP的浓度,计算脂质体的包封率。以LBPL的包封率和载药量为指标,考察了脂药比、超声时间、水浴温度、膜材比等4个单因素对LBPL制备的影响。结果发现,脂药比、超声时间、膜材比3个单因素对LBPL的包封率影响比较大。根据单因素试验的筛选,采用响应曲面法,包封率为响应值,研究3个重要因素对LBPL包封率的影响,共17个试验。试验结果显示LBPL的最优制备条件组合为:脂药比为25:1,超声时间为14min,膜材比为2.4:1。然后进行验证性试验,得到LBPL包封率为86.37±0.63%,与包封率预测值87.671%相比,相对误差较小。表明逆向蒸发法制备的LBPL包封率较高,响应曲面法能够较好地优化LBPL的制备条件,包封率可以达到85%以上。试验Ⅱ 枸杞多糖脂质体的质量评价本试验旨在对LBPL的形态特征、粒径大小、稳定性、药物释放进行评价。采用前一章所得最优条件制备的LBPL,在透射电子显微镜下观察脂质体超微形态,用激光粒度分析仪测定LBPL的粒径和电势。将LBPL和空白脂质体储存在4℃,分别在7、15、30、45 d四个时间点监测脂质体粒径及其多分散性系数（PDI）的变化。将LBPL和枸杞多糖加入透析袋中,模拟体液环境,在96 h内测定多糖释放曲线。试验结果显示LBPL微粒接近球形,分布均匀,形状大小均一;测得平均粒径为120.7±0.84 nm,呈电中性;在45 d内,LBPL的粒径和PDI变化都不大。LBPL中的多糖在pH 7.4条件下缓慢释放。表明LBPL形态表征良好,粒径大小均一,稳定性良好,脂质体作为药物载体在pH 7.4条件下,对包封其中的枸杞多糖具有很好的缓释作用。试验Ⅲ 枸杞多糖脂质体对小鼠脾脏淋巴细胞增殖和分化的影响本试验的目的是为了考察LBPL的最大安全浓度以及作用于小鼠脾脏T、B淋巴细胞的增殖和T淋巴细胞表型的影响。首先采用MTT法,测定了 LBPL和LBP对于小鼠脾脏淋巴细胞的最大安全浓度。分别用11个浓度的LBPL和LBP作用细胞48 h后,不显着低于对照组的最大浓度定为最大安全浓度。选取低于LBPL和LBP安全浓度的5个浓度,单独或者协同PHA,刺激T淋巴细胞增殖;单独或者协同LPS,刺激B淋巴细胞增殖。最后,取LBPL和LBP最大安全浓度之后的三个浓度,加入淋巴细胞作用48 h后,加入CD3、CD4以及CD8三种抗体在4℃避光孵育0.5 h,采用流式细胞仪上机进行检测。结果显示,在单独刺激、协同PHA/LPS刺激T/B淋巴细胞增殖时,与LBP相比,LBPL具有更显着的增殖作用,能联合PHA协同促进T淋巴细胞的增殖,也能和LPS协同促进B淋巴细胞增殖,并且增殖的效果显着强于LBP,且显效范围大。LBPL高浓度组刺激淋巴细胞产生CD3+表型的比率最高,中浓度组刺激淋巴细胞引起CD4+/CD8+的比例最高,并且LBPL高、中浓度组显着高于其他各对照组。表明LBP经由脂质体包封后安全浓度升高,显着地提高了 LBP对脾脏淋巴细胞增殖和表型分化的作用。试验Ⅳ 枸杞多糖脂质体对巨噬细胞免疫功能的影响本试验旨在探究LBPL激活小鼠腹腔巨噬细胞免疫功能的作用。体外分离培养小鼠腹腔巨噬细胞,在吞噬FITC荧光标记的大肠杆菌的试验中,采用流式细胞仪检测其荧光强度,计算吞噬作用的百分比。将LBPL与LBP分别作用于小鼠腹腔巨噬细胞,采用ELIS A方法,检测LBPL对小鼠腹腔巨噬细胞分泌促炎性细胞因子以及炎症因子NO、iNOS的水平。试验结果显示,LBPL激活了巨噬细胞,增强了其吞噬功能,LBPL低浓度组的平均荧光强度最大,显着高于包括LPS 阳性对照组在内的其他各组（P<0.05）。LBPL影响巨噬细胞分泌IL-1β、TNF-α、IFN-γ以及炎症因子NO、iNOS的水平并得到了不同程度的提高。表明LBPL能促使巨噬细胞的吞噬功能显着增强,LBPL低浓度组巨噬细胞吞噬荧光标记大肠杆菌后平均每个细胞内的荧光强度最大,作用率最高,激活巨噬细胞的免疫功能。试验Ⅴ 枸杞多糖脂质体对骨髓源树突状细胞成熟以及抗原递呈的影响本试验的目的是为了考察LBPL对抗原递呈细胞DCs的成熟、细胞因子的分泌以及抗原递呈的作用。分离小鼠胫骨和股骨中的骨髓,制成骨髓单核细胞悬液,培养15 h后,分别加入LBPL、LBP和BL,另设细胞对照组（BC）,LPS作为阳性对照组,培养48 h后,采用MTT法检测LBPL对DCs前体细胞增殖的影响。加入刺激因子诱导,分化为未成熟的DCs,于第七天加入125 μg·mL-1的LBPL、LBP和BL,作用48 h后,加入MHC-Ⅱ、CD86、CD80抗体避光共孵育0.5h,利用流式细胞仪检测LBPL对骨髓源树突状细胞表面共刺激分子的表达水平;采用ELISA方法,检测LBPL对DCs分泌细胞因子IL-12p40和TNF-α水平的影响;在激光共聚焦显微镜下观察在LBPL的刺激下,DCs对FITC标记的抗原摄取的影响。结果显示,与其他对照组相比,LBPL显着促进了树突状前体细胞的增殖;LBPL作用DCs显着增加表面共刺激分子MHC-Ⅱ、CD86和CD80的表达量;LBPL显着提高DCs分泌细胞因子IL-12p40和TNF-α的水平;在LBPL的刺激下,DCs对抗原的摄取量明显增加。表明将LBP包裹在脂质体中对DCs具有更显着的促成熟分化的作用;刺激DCs细胞摄取抗原的能力得到了提高。试验Ⅵ 枸杞多糖脂质体对小鼠免疫OVA疫苗的佐剂活性作用本试验旨在探究LBPL对包封抗原OVA疫苗免疫小鼠的免疫佐剂作用。将OVA（250 μg·mL-1）包封于LBPL,并通过反复冻融来提高包封率。检测了 LBPL-OVA在4℃条件下保存45 d的粒径以及PDI的变化;LBPL-OVA在4℃和37℃条件下包封率的稳定性。LBPL-OVA分别在中性（pH 7.4）和酸性（pH 5.0）磷酸盐缓冲液两种释放介质中,在120 h内特定时间点检测抗原释放曲线。将120只5周龄的BALB/c小鼠随机均分成 6 个组,分别为 LBPL-OVA、BL-OVA、LBP-OVA、OVA、CFA-OVA和BC组,每只小鼠皮下免疫0.2 mL,每周免疫一次,共免疫三次。在首免后24 h和48 h,采取各试验组小鼠的淋巴结,采用流式细胞术检测DCs细胞表型;在首次免疫后7 d,采取各试验组小鼠的淋巴结,做免疫组化切片;在第三次免疫后第14、28 d,从各组中随机抽取4只,无菌条件摘取脾脏,采用MTT法测定抗原再刺激以及协同PHA和LPS分别对T、B淋巴细胞的刺激指数;采用流式细胞仪检测T淋巴细胞的表型变化;第7、14、21、28 d采血收集血清,用ELISA方法测定OVA特异性IgG、IgG1和IgG2a以及细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-4和IL-6的浓度。试验结果显示,LBPL-OVA的包封率较高且在4℃条件下更稳定,在pH 7.4时缓慢持续释放抗原。LBPL-OVA免疫小鼠后,淋巴结中DCs细胞三种表面分子的表达量均显着升高;淋巴结中抗原量增多;淋巴细胞刺激指数升高;淋巴细胞中CD3+亚群的比率、CD4+/CD8+T细胞比例增大;血清中抗原特异性抗体和细胞因子的量升高;LBPL-OVA组的IgG2a/IgG1比例显着高于其他各组。表明LBPL-OVA激活了引流淋巴结中的DCs并检测到DCs递呈至淋巴结的抗原量增多,有效地刺激CD4+/CD8+T细胞增殖,能够显着地提高机体的体液免疫和细胞免疫反应,而且有偏向Th1型免疫反应的趋势。试验Ⅶ 枸杞多糖脂质体对小鼠免疫PCV2疫苗的佐剂活性作用本试验的目的在于研究LBPL对于PCV2作为抗原的疫苗免疫佐剂活性。LBPL与PCV2抗原按体积比3:1混合搅拌,反复冻融提高包封率,检测LBPL-PCV2的粒径和PDI大小。将125只5周龄的BALB/c小鼠随机分为5组,每组25只。以皮下免疫的方式免疫两次,中间间隔2周,疫苗分组:LBPL-PCV2（LBPL与PCV2的体积比为3:1,下同）,BL-PCV2,LBP-PCV2,阳性对照组W/O-PCV2,PBS作为空白对照组（BC）。于第二次免疫后收集小鼠血清,测定了血清中的抗体、Th1型细胞因子（IFN-γ和TNF-α）和Th2型细胞因子（IL-4）。在第二次免疫两周后,收集各组小鼠的脾脏,进行H&E染色,在显微镜下观察脾脏的组织形态学变化。试验结果显示,LBPL-PCV2的平均粒径为122.1±0.78mm,多分散指数（PDI）为0.248。LBPL作为免疫佐剂可以显着增加PCV2特异性抗体IgG和抗体IgG1产生,促进细胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-4的分泌。LBPL-PCV2组的脾脏发生最明显的变化,白髓中部的外围淋巴鞘增厚,脾小体的数量和体积增加,充满淋巴细胞,脾脏生发中心明显。表明LBPL-PCV2能够刺激机体产生有效的Th1和Th2型免疫反应,LBPL作为疫苗佐剂,对脾脏具有很好的改善和刺激作用。试验Ⅷ 枸杞多糖脂质体激活树突状细胞TLR4/MyD88/NF-KB通路的作用本试验旨在探索LBPL发挥免疫增强作用的机制。分离培养小鼠骨髓源树突状细胞（DCs）,加入粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子诱导,定向分化为未成熟的树突状细胞。分别加入三个不同浓度的LBPL,PLH（125 μg·mL-1 LBPL）,PLM（62.5μg·mL-1 LBPL）,PLL（31.25 μg·mL-1 LBPL）处理细胞。药物作用细胞24h后,采用qPCR方法比较分析了树突状细胞中TLR4信号通路相关分子mRNA的表达水平。通过Western Blot检测比较分析了不同药物组处理后的DCs细胞核中TLR4、TRAF6、MyD88和NF-κB的蛋白表达水平。试验数据显示,在三个浓度的LBPL作用下,树突状细胞中NF-κB的mRNA相对转录量都有显着地提高。LBPL组在浓度125 μg·mL-1时,TLR4信号通路中4个相关分子的mRNA相对转录量都得到显着的提高,在三个浓度中表达量最高。PLH组的DCs细胞核中TLR4、TRAF6、MyD88和NF-κB的蛋白表达水平高于除LPS阳性对照之外的其余各组。表明LBPL对DCs的TLR4/MyD88/NF-κB途径中相关分子的mRNA和蛋白表达都起到正调节作用,LBPL通过激活TLR4/MyD88/NF-κB途径对DCs发挥作用,进而达到免疫增强效果。
刘振广[10]（2018）在《灵芝多糖脂质体和脂质立方液晶纳米粒免疫增强作用的研究》文中研究表明灵芝是担子菌纲多孔科灵芝属真菌,是我国传统的补益药。现代药理学研究表明,灵芝多糖作为灵芝中主要的活性成分之一,具有调节免疫、抗衰老、抗肿瘤、保肝护肝、抗氧化和强心等作用。但灵芝多糖（Ganoderma lucidum polysaccharide,GLP）属于大分子多糖,在应用时存在体内代谢较快,作用时间短、靶向性弱、易聚集等不足。因此,为了提高灵芝多糖靶向性或延长其作用时间,对其新剂型的开发显得尤为重要。脂质体是一种微小囊泡,它具有类似生物膜结构的磷脂双分子层。脂质体不仅能够有效递送药物,而且能作为疫苗递送系统。脂质立方液晶纳米粒具有两亲性脂质分散在水溶液中自组装成含双连续水区和脂质区的闭合脂质双层“蜂窝状”结构,能够包封各种不同极性和剂量的药物,具有多样化的药物包裹性,具有很多应用功能,如保护药物活性、控制药物释放、靶向给药以及阻止药物分子间发生聚集等。脂质立方液晶纳米粒因其独特的内部结构能够有效地运载药物或抗原。将灵芝多糖包封于脂质体和脂质立方液晶纳米粒中,不仅可以利用脂质体和脂质立方液晶纳米粒的良好药物载体优势帮助灵芝多糖有效递送,还可以利用二者优点,弥补二者不足,从而更有效地发挥免疫增强作用。因此,本研究将灵芝多糖分别包封于脂质体和脂质立方液晶纳米粒中,制备成灵芝多糖脂质体（Ganoderma lucidum polysaccharide liposome,GLPL）和灵芝多糖脂质立方液晶纳米粒（Ganoderma lucidum polysaccharide Cubosome,GLPC）,对其质量和稳定性进行了评价,并从体外试验和体内试验研究了其免疫增强作用和作用机理。试验分为以下八个部分:试验Ⅰ 灵芝多糖脂质体的制备及制备条件的优化为了得到包封率高的灵芝多糖脂质体,本试验采用逆相蒸发法制备灵芝多糖脂质体并用响应曲面法优选GLPL制备的最佳条件。首先,以GLPL的包封率和载药量为指标,考察了 4个单因素对GLPL制备的影响,筛选出磷脂与胆固醇质量比、磷脂与吐温80的质量比、超声时间等对GLPL制备影响较大的3个单因素。然后,采用响应面分析法以包封率为响应值研究单因素试验筛选出的3个因素对GLPL制备的影响,经过优化后得到GLPL最佳制备条件为:磷脂与胆固醇质量比11:1,磷脂与吐温80质量比为10.5:1和超声时间为1 1min。在最佳制备条件下进行验证试验,得到的GLPL的包封率实测平均值为71.43±0.49%,与包封率预测值相比,相对误差仅为1.6%。所制备的GLPL,经过透射电镜观察发现形状呈类球形,大小均一;经过马尔文粒度分析仪测得粒径为164.3±9.2 nm。试验Ⅱ灵芝多糖脂质体对小鼠脾脏淋巴细胞增殖和分化的影响为了研究灵芝多糖脂质体对小鼠脾脏淋巴细胞增殖及分化的影响。本试验将不同浓度的灵芝多糖脂质体单独或者与LPS或PHA同时加入小鼠脾脏淋巴细胞中,采用MTT法和流式细胞仪分别测定了 GLPL对小鼠脾脏淋巴细胞增殖和脾脏淋巴细胞分化的影响。结果显示,在单独或者协同LPS、PHA作用下,GLPL均能明显刺激小鼠脾淋巴细胞的增殖。在浓度为62.5μg/mL时,GLPL单独或者协同LPS、PHA刺激淋巴细胞增殖的作用最强,且显着好于GLP、BL及空白对照组;与GLP相比,GLPL能够更加有效地促进T淋巴细胞向CD4方向分化。试验表明GLP经过脂质体包封后对脾脏淋巴细胞增殖的作用和对脾脏淋巴细胞的分化得到明显增强。试验Ⅲ 灵芝多糖脂质体对小鼠腹腔巨噬细胞功能的影响为了研究灵芝多糖脂质体对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力、分泌细胞因子等功能的影响,本试验将不同浓度的GLPL、GLP和空白脂质体加入到小鼠腹腔巨噬细胞中,利用流式细胞仪检测药物对腹腔巨噬细胞吞噬荧光标记的大肠杆菌的能力和MHCⅡ分子表达的影响,采用ELISA法测定药物对小鼠腹腔巨噬细胞分泌细胞因子以及炎症因子NO、iNOS的影响。结果显示,GLPL能显着增强小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能和表面MHCⅡ分子的表达,能显着促进巨噬细胞分泌IL-1β、TNF-α、IFN-γ等细胞因子,并通过促进iNOS的活性进一步促进NO的产生,且在一定浓度下,效果好于GLP。试验表明GLP经过脂质体包封后活化巨噬细胞的能力更强。试验Ⅳ 灵芝多糖脂质体对OVA免疫小鼠的免疫增强作用为了研究灵芝多糖脂质体包封OVA后的质量评价和免疫增强作用,本试验首先采用冷冻复融法将OVA包封于GLPL中,分别测定在4℃和37℃保存时在不同时间点的脂质体中OVA的包封率和4℃保存时不同时间点的脂质体的粒径和分散系数。然后,将120只5周龄的BALB/c小鼠随机均分成6个组,分别皮下免疫含不同免疫增强剂的OVA,每周免疫一次,重复免疫三次。在首免后24h和48h,收集小鼠淋巴结,采用流式细胞仪检测树突状细胞表面分子的表达;在三免后14天,各组随机抽取4只,无菌取脾脏,分离脾淋巴细胞,分别采用MTT法和流式细胞仪测定脾脏淋巴细胞增殖和分化;收集不同时间段的小鼠血清,采用ELISA法测定OVA特异性IgG、IgG1、IgG2a以及细胞因子IFN-y、TNF-α、IL-4、IL-6的浓度。结果显示,GLPL包封抗原后在4℃保存时,包封率下降速度低于37℃保存时;其粒径和分散系数在28天内变化较小,稳定性较好;佐剂活性试验结果显示,GLPL能显着促进小鼠淋巴结中DCs的成熟,促进脾脏淋巴细胞的增殖和分化,提高小鼠体内OVA特异性抗体、IFN-γ、TNF-α和IL-4的水平以及IgG2a/IgG1的比值,且效果均好于GLP。试验表明GLP经过脂质体包封后不仅促进小鼠淋巴结内树突状细胞的成熟和活化脾脏淋巴细胞的能力增强,而且提高小鼠体液免疫和细胞免疫应答的作用也增强。试验Ⅴ 灵芝多糖脂质体对PCV-2苗免疫小鼠的免疫增强作用为了研究灵芝多糖脂质体作为PCV-2苗佐剂的免疫增强作用,本试验将100只小鼠分成5组,分别免疫不同免疫增强剂的PCV-2疫苗,一周后二免。在一免后7、14和21天,采用ELISA法测定血清中特异性IgG水平及抗体亚型IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和细胞因子IL-4、IFN-γ、IL-17、IL-12p70和TNF-α的浓度;并在一免后的21天,采集小鼠脾脏,制作组织切片,采用HE染色观察各组脾脏组织学变化。结果显示,与GLP组和BL组相比,GLPL更能有效地促进小鼠产生PCV-2特异性IgG、抗体亚型IgG1.、IgG2a、IgG3及细胞因子IFN-γ、IL-17、IL-12p70和TNF-α;脾脏组织学结果显示,GLPL能够显着刺激小鼠脾脏脾小体的增大。试验表明GLPL作为PCV-2苗的免疫增强剂能够显着提高小鼠对PCV-2的特异性体液免疫应答和细胞免疫应答,且效果好于GLP。试验Ⅵ 灵芝多糖脂质立方液晶纳米粒的制备方法优选及质量评价为了制备稳定性良好和包封率高的灵芝多糖脂质立方液晶纳米粒,本试验对GLPC的制备方法进行了筛选,比较了不同分散介质对GLPC质量的影响,并对其基本特征进行了分析检测。结果发现,乙醇分散法制备的GLPC包封率较高;以双蒸水为分散介质制备的GLPC更加稳定;所制备的GLPC平均包封率为89.5±3.51%,粒径分析发现脂质立方液晶纳米粒包封GLP后,GLPC的粒径发生了轻微的增大,小角X散射实验SAXS（small-angle x-ray scattering,SAXS）结果显示GLPC晶型为Pn3m。试验表明采用乙醇分散法制备灵芝多糖脂质立方液晶纳米粒质量较好。试验Ⅶ 灵芝多糖脂质立方液晶纳米粒对PCV-2苗免疫小鼠的免疫增强作用为了探讨灵芝多糖脂质立方液晶纳米粒作为PCV-2疫苗免疫增强剂的免疫增强作用,本试验分别将灵芝多糖脂质立方液晶纳米粒、灵芝多糖和空白脂质立方液晶纳米粒作为PCV-2的免疫增强剂,免疫小鼠,在一免后7、14和21天,采用ELISA法测定血清中特异性IgG水平及抗体亚型IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和细胞因子IL-4、IFN-γ、IL-17、IL-12p70和TNF-α的浓度;在一免后24h和48h,采集淋巴结,采用流式细胞仪测定了淋巴结中DCs的成熟状态;在一免后7天,分别采用免疫组化法和流式细胞仪检测了淋巴结中抗原的含量和中央记忆T细胞和效应记忆T细胞的比例。结果显示,GLPC不仅能显着提高血清中PCV-2特异性IgG的水平和抗体亚型IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3的浓度,而且能够显着地促进血清中细胞因子IL-4、IFN-γ、IL-17和TNF-α的分泌;同时,结果显示GLPC能够促进淋巴结中DCs的成熟,提高抗原从皮下到淋巴结的转运效率和中央记忆细胞与效应记忆细胞的比例,与GLP相比效果更好。试验表明GLPC能够显着地促进淋巴结中DCs的成熟和记忆T细胞的产生,从而提高机体对PCV-2产生更强的体液免疫和细胞免疫应答。试验Ⅷ修饰后灵芝多糖脂质立方液晶纳米粒对小鼠免疫OVA的免疫增强作用为了将OVA吸附到灵芝多糖脂质立方液晶纳米粒的表面并研究其佐剂作用机理,本试验首先将两种阳离子修饰物十六烷基三甲基溴化按（cetyltrimeth-ylammonium bromide,CTAB）和聚二烯丙基二甲基氯化铵(Poly（diallyldimethylammo-nium chloride,PDDAC）分别修饰到GLPC的表面,制备成阳离子脂质立方液晶纳米粒。然后,将阳离子脂质立方液晶纳米粒作为OVA免疫增强剂,免疫小鼠,以GLPC为对照。在首免后24h和48h,收集小鼠淋巴结,采用流式细胞仪检测淋巴结中树突状细胞表面分子的表达;在三免后14天,分别采用MTT法和流式细胞仪检测并计算脾脏淋巴细胞增殖指数和淋巴细胞分化;在三免后14和28天,收集小鼠血清,采用ELISA法测定特异性IgG、IgG1、IgG2a以及细胞因子IFN-y、TNF-α、IL-4、IL-6的浓度。在三免后28天,采用转录组测序技术检测小鼠脾脏基因表达变化。结果显示,经过PDDAC 修饰的脂质立方液晶（PDDAC modified GLPC,PDDAC-GLPC）作为 OVA免疫增强剂同GLPC相比,不仅能有效地促进机体产生OVA特异性IgG,提高细胞因子的分泌和刺激脾脏CD4+和CD8+T细胞增殖,而且能明显地促进小鼠淋巴结内树突状细胞的成熟,效果好于GLPC。CTAB修饰的脂质立方液晶（CTAB modified GLPC,CTAB-GLPC）作为OVA免疫增强剂,除了在提高特异性IgG的效果与GLPC相比差异不显着外,其他方面效果均好于GLPC组。进一步经过对脾脏基因测序发现PDDAC-GLPC的免疫增强作用主要通过NOD样受体通路、PI3K-ATK信号通路、细胞因子互作和白细胞跨内皮迁移作用激活脾脏的免疫反应。试验表明PDDAC-GLPC能显着地促进淋巴结DCs的成熟和脾脏中4条信号通路的活化,从而促进机体产生更强的体液免疫和细胞免疫应答。
二、中药黄芪对小鼠腹腔巨噬细胞功能的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、中药黄芪对小鼠腹腔巨噬细胞功能的影响（论文提纲范文）
（1）地锦多糖的制备及对小鼠免疫增强活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 地锦草的研究进展 |
| 1.1.1 地锦草的化学成分 |
| 1.1.2 地锦草的药理作用 |
| 1.1.3 地锦草的临床应用 |
| 1.2 多糖的研究进展 |
| 1.2.1 多糖的生物活性 |
| 1.2.2 多糖结构的研究 |
| 1.2.3 多糖的提取及分离纯化 |
| 1.2.4 多糖在动物生产中的应用 |
| 1.3 本研究的目的意义 |
| 第二章 地锦多糖的提取与脱色纯化 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 药材 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 地锦样品的前处理 |
| 2.2.2 地锦多糖的提取 |
| 2.2.3 地锦多糖的含量测定 |
| 2.2.4 地锦多糖中蛋白含量测定 |
| 2.2.5 地锦多糖双氧水脱色的最佳条件的优化 |
| 2.2.6 地锦多糖的纯化 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 地锦多糖的提取结果 |
| 2.3.2 地锦多糖的纯化结果 |
| 2.3.3 地锦多糖双氧水脱色的单因素试验结果 |
| 2.3.4 地锦多糖双氧水脱色的正交试验结果 |
| 2.3.5 地锦多糖双氧水脱色的验证试验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 地锦多糖的提取方法 |
| 2.4.2 多糖的含量测定方法 |
| 2.4.3 地锦多糖的双氧水脱色 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 地锦多糖的结构鉴定 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 地锦多糖 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 地锦多糖的紫外光谱分析 |
| 3.2.2 地锦多糖的红外光谱分析 |
| 3.2.3 地锦多糖的单糖组成分析 |
| 3.2.4 地锦多糖的分子量检测 |
| 3.2.5 地锦多糖的糖醛酸含量测定 |
| 3.2.6 地锦多糖的刚果红试验 |
| 3.2.7 地锦多糖的核磁共振波谱测定 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 地锦多糖的紫外光谱分析结果 |
| 3.3.2 地锦多糖的红外光谱分析结果 |
| 3.3.3 地锦多糖的单糖组成结果 |
| 3.3.4 地锦多糖的分子量结果 |
| 3.3.5 地锦多糖的糖醛酸含量结果 |
| 3.3.6 地锦多糖的刚果红试验结果 |
| 3.3.7 地锦多糖的核磁试验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 多糖的光谱分析 |
| 3.4.2 多糖的分子量及及糖醛酸分析 |
| 3.4.3 多糖的核磁分析 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 地锦多糖对小鼠外周血淋巴细胞免疫活性的影响 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 地锦多糖 |
| 4.1.2 试验动物 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 主要仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 小鼠外周血淋巴细胞的分离和培养 |
| 4.2.2 地锦多糖对小鼠外周血淋巴细胞最大安全浓度的测定 |
| 4.2.3 地锦多糖对小鼠外周血淋巴细胞增殖的影响 |
| 4.2.4 地锦多糖对小鼠外周血淋巴细胞周期的影响 |
| 4.2.5 地锦多糖对小鼠外周血CD4~+、CD8~+T淋巴细胞亚群的影响 |
| 4.2.6 地锦多糖对小鼠淋巴细胞免疫球蛋白IgA、IgG的影响 |
| 4.2.7 地锦多糖对小鼠淋巴细胞细胞因子分泌的影响 |
| 4.2.8 数据分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 地锦多糖对小鼠外周血淋巴细胞最大安全浓度的测定 |
| 4.3.2 地锦多糖单独刺激时各组淋巴细胞增殖的结果 |
| 4.3.3 地锦多糖协同PHA刺激时淋巴细胞增殖的结果 |
| 4.3.4 地锦多糖对小鼠外周血淋巴细胞周期的影响结果 |
| 4.3.5 地锦多糖对CD4~+、CD8~+T 淋巴细胞亚群的影响结果 |
| 4.3.6 地锦多糖对小鼠外周血淋巴细胞免疫球蛋白IgA、IgG的影响结果 |
| 4.3.7 地锦多糖对小鼠外周血淋巴细胞细胞因子分泌的影响结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 地锦多糖对细胞生长的影响 |
| 4.4.2 地锦多糖对淋巴细胞增殖的影响 |
| 4.4.3 地锦多糖对淋巴细胞周期的影响 |
| 4.4.4 地锦多糖对CD4~+、CD8~+T 淋巴细胞亚群的影响 |
| 4.4.5 地锦多糖对淋巴细胞细胞因子分泌的影响 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 地锦多糖对小鼠腹腔巨噬细胞功能的影响 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 地锦多糖 |
| 5.1.2 试验动物 |
| 5.1.3 主要试剂 |
| 5.1.4 主要仪器 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 小鼠腹腔巨噬细胞的分离和培养 |
| 5.2.2 地锦多糖对小鼠腹腔巨噬细胞最大安全浓度的测定 |
| 5.2.3 地锦多糖对小鼠腹腔巨噬细胞增殖的影响 |
| 5.2.4 地锦多糖对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力的影响 |
| 5.2.5 地锦多糖对小鼠腹腔巨噬细胞分泌NO和iNOS生成的影响 |
| 5.2.6 地锦多糖对小鼠腹腔巨噬细胞细胞因子的影响 |
| 5.2.7 地锦多糖对小鼠腹腔巨噬细胞CD14和MHC-II表达 |
| 5.2.8 数据分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 地锦多糖对小鼠腹腔巨噬细胞最大安全浓度的测定 |
| 5.3.2 地锦多糖对小鼠腹腔巨噬细胞增殖的影响结果 |
| 5.3.3 地锦多糖对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力的影响结果 |
| 5.3.4 地锦多糖对小鼠腹腔巨噬细胞分泌NO和iNOS生成的影响结果 |
| 5.3.5 地锦多糖对小鼠腹腔巨噬细胞细胞因子的影响结果 |
| 5.3.6 地锦多糖对小鼠腹腔巨噬细胞CD14和MHC-II表达的影响结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 地锦多糖对巨噬细胞增殖的影响 |
| 5.4.2 地锦多糖对巨噬细胞吞噬能力的影响 |
| 5.4.3 地锦多糖对巨噬细胞分泌NO和iNOS生成的影响 |
| 5.4.4 地锦多糖对巨噬细胞细胞因子的影响 |
| 5.4.5 地锦多糖对巨噬细胞CD14和MHC-II表达的影响 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 地锦多糖对小鼠腹腔巨噬细胞的抗氧化作用研究 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 地锦多糖 |
| 6.1.2 试验动物 |
| 6.1.3 主要仪器 |
| 6.1.4 主要试剂 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 小鼠腹腔巨噬细胞的分离和培养 |
| 6.2.2 小鼠腹腔巨噬细胞形态学观察 |
| 6.2.3 地锦多糖对H_2O_2诱导的巨噬细胞氧化损伤细胞存活率影响 |
| 6.2.4 地锦多糖对小鼠腹腔巨噬细胞抗氧化作用的测定 |
| 6.2.5 数据分析 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 地锦多糖对小鼠腹腔巨噬细胞形态的影响 |
| 6.3.2 地锦多糖对H_2O_2诱导的小鼠腹腔巨噬细胞氧化损伤细胞存活率影响 |
| 6.3.3 地锦多糖对小鼠腹腔巨噬细胞SOD酶活力的影响 |
| 6.3.4 地锦多糖对小鼠腹腔巨噬细胞GSH-PX酶活力的影响 |
| 6.3.5 地锦多糖对小鼠腹腔巨噬细胞MDA含量的影响 |
| 6.3.6 地锦多糖对小鼠腹腔巨噬细胞MPO酶活力的影响 |
| 6.4 讨论 |
| 6.4.1 地锦多糖对巨噬细胞SOD酶活力的影响 |
| 6.4.2 地锦多糖对巨噬细胞GSH-PX酶活力的影响 |
| 6.4.3 地锦多糖对巨噬细胞MDA含量的影响 |
| 6.4.4 地锦多糖对巨噬细胞MPO酶活力的影响 |
| 6.5 小结 |
| 第七章 地锦多糖对免疫抑制小鼠的免疫调节作用研究 |
| 7.1 材料 |
| 7.1.1 地锦多糖 |
| 7.1.2 试验动物 |
| 7.1.3 主要仪器 |
| 7.1.4 主要试剂 |
| 7.2 方法 |
| 7.2.1 动物分组及处理 |
| 7.2.2 地锦多糖对免疫抑制小鼠免疫器官指数分析 |
| 7.2.3 地锦多糖对免疫抑制小鼠脾细胞增殖和腹腔巨噬细胞增殖的影响 |
| 7.2.4 地锦多糖对免疫抑制小鼠脾淋巴细胞周期的影响 |
| 7.2.5 地锦多糖对免疫抑制小鼠脾淋巴细胞CD4~+、CD8~+T亚群的影响 |
| 7.2.6 地锦多糖对免疫抑制小鼠脾淋巴细胞免疫球蛋白的影响 |
| 7.2.7 地锦多糖对免疫抑制小鼠脾淋巴细胞细胞因子分泌的影响 |
| 7.2.8 地锦多糖对免疫抑制小鼠抗氧化作用指标的测定 |
| 7.2.9 数据分析 |
| 7.3 结果 |
| 7.3.1 地锦多糖对免疫抑制小鼠免疫器官指数分析 |
| 7.3.2 地锦多糖对免疫抑制小鼠脾细胞增殖和腹腔巨噬细胞增殖的结果 |
| 7.3.3 地锦多糖对免疫抑制小鼠脾淋巴细胞周期的影响结果 |
| 7.3.4 地锦多糖对免疫抑制小鼠脾淋巴细胞CD4~+、CD8~+T亚群的影响结果 |
| 7.3.5 地锦多糖对免疫抑制小鼠脾淋巴细胞免疫球蛋白IgA、IgG的影响结果 |
| 7.3.6 地锦多糖对免疫抑制小鼠脾淋巴细胞细胞因子分泌的影响结果 |
| 7.3.7 地锦多糖对免疫抑制小鼠抗氧化活性的影响结果 |
| 7.4 讨论 |
| 7.4.1 多糖对免疫抑制小鼠周期和CD4+、CD8+的影响 |
| 7.4.2 多糖对免疫抑制小鼠细胞因子和免疫球蛋白的影响 |
| 7.5 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）女贞子免疫增强活性成分分离鉴定及作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 中药增强免疫研究进展 |
| 1.1.1 中药促进免疫器官发育 |
| 1.1.2 中药增强免疫细胞功能 |
| 1.1.3 中药调节免疫分子生成 |
| 1.1.4 中药影响信号通路传递 |
| 1.2 女贞子研究进展 |
| 1.2.1 女贞子化学成分 |
| 1.2.2 女贞子药理作用 |
| 1.2.3 女贞子兽医临床应用 |
| 1.3 研究目的与意义 |
| 第二章 女贞子免疫增强活性部位的筛选 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 药材 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 女贞子五部位萃取物得率 |
| 2.2.2 女贞子不同部位萃取物对巨噬细胞活性的影响 |
| 2.2.3 女贞子不同部位萃取物对巨噬细胞吞噬功能的影响 |
| 2.2.4 女贞子不同部位萃取物对淋巴细胞增殖的影响 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 女贞子五部位萃取物的制备 |
| 2.3.2 女贞子免疫增强活性部位的筛选 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 女贞子免疫增强活性成分的分离纯化与结构鉴定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 药物 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 大孔树脂吸附法分离女贞子正丁醇部位萃取物试验结果 |
| 3.2.2 不同乙醇洗脱段的免疫活性检测结果 |
| 3.2.3 分离纯化和结构鉴定结果 |
| 3.2.4 单体化合物的免疫活性检测结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 女贞子正丁醇部位萃取物的分离纯化 |
| 3.3.2 女贞子免疫增强活性化合物的筛选 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 女贞子活性成分羟基酪醇增强巨噬细胞免疫的作用机制 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 药物 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.1.4 方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 羟基酪醇对巨噬细胞摄取FITC-OVA的影响 |
| 4.2.2 羟基酪醇对细胞因子TNF-α和IL-1β分泌的影响 |
| 4.2.3 羟基酪醇对NO释放的影响 |
| 4.2.4 羟基酪醇对ROS产生的影响 |
| 4.2.5 羟基酪醇对细胞表面分子MHC-Ⅱ及共激活分子CD80、CD86表达的影响 |
| 4.2.6 羟基酪醇对NF-κB信号通路关键蛋白表达的影响 |
| 4.2.7 羟基酪醇对TLR4/MyD88(TRIF)/IKKβ通路蛋白表达的影响 |
| 4.2.8 信号阻断试验 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 羟基酪醇增强巨噬细胞免疫活性 |
| 4.3.2 羟基酪醇活化巨噬细胞的分子机制 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 女贞子活性成分羟基酪醇增强淋巴细胞免疫的作用机制 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 药物 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.1.4 方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 羟基酪醇对细胞因子和免疫球蛋白分泌的影响 |
| 5.2.2 羟基酪醇对淋巴细胞亚群的影响 |
| 5.2.3 羟基酪醇对胞内Ca~(2+)浓度的影响 |
| 5.2.4 羟基酪醇对钙调神经磷酸酶的影响 |
| 5.2.5 羟基酪醇对核转录因子NFAT和NF-κB转运的影响 |
| 5.2.6 信号阻断试验 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 羟基酪醇增强淋巴细胞免疫活性 |
| 5.3.2 羟基酪醇激活淋巴细胞的分子机制 |
| 5.4 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）枸杞多糖的分离纯化及基于对肠道菌群调节的免疫作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 综述一 中药多糖制备及质量控制体系初探 |
| 1 中药多糖质量控制标准现状 |
| 2 中药多糖制备及质量控制标准研究进展及评价 |
| 3 中药多糖质量控制新技术 |
| 4 中药多糖质控体系亟待解决的问题 |
| 5 总结与展望 |
| 综述二 枸杞多糖结构特征及免疫活性研究进展 |
| 1 枸杞多糖的结构特征 |
| 2 枸杞多糖的免疫调节及其作用机制 |
| 3 总结 |
| 前言 |
| 技术路线图 |
| 第一章 枸杞多糖的提取纯化及理化性质研究 |
| 第一节 枸杞多糖结构分析方法的建立 |
| 第二节 枸杞多糖的分离纯化 |
| 第三节 枸杞多糖在胃肠液中的稳定性及肠跨膜研究 |
| 第二章 枸杞多糖对巨噬细胞的免疫调节作用及其机制研究 |
| 第三章 枸杞多糖对免疫抑制小鼠免疫功能的影响 |
| 第四章 枸杞多糖对小鼠肠道菌群的影响及与免疫功能相关性分析 |
| 第一节 枸杞多糖基于对肠道菌群调节的免疫作用机制研究 |
| 第二节 枸杞多糖对免疫抑制小鼠肠粘膜形态的影响 |
| 第五章 枸杞多糖质量控制及基于其结构和活性测定的产品质量评价 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
（4）基于多糖分子量分布和免疫活性比较的黄芪质量研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 引言 |
| 1.1 立题背景和意义 |
| 1.2 本课题的研究内容、技术路线图及创新点 |
| 1.2.1 本课题的研究内容 |
| 1.2.2 本课题的技术路线图 |
| 1.2.3 创新点 |
| 第二章 文献综述 |
| 2.1 黄芪多糖化学结构的复杂性 |
| 2.2 黄芪多糖的分离纯化工艺 |
| 2.2.1 分级/分步醇沉法 |
| 2.2.2 凝胶柱层析法 |
| 2.2.3 离子交换剂柱层析法 |
| 2.2.4 超滤法 |
| 2.3 黄芪多糖的免疫学研究进展 |
| 2.3.1 黄芪多糖在细胞水平的免疫调节作用 |
| 2.3.2 黄芪多糖在动物水平的免疫调节作用 |
| 2.3.3 黄芪多糖免疫调节作用的临床应用 |
| 2.3.4 黄芪多糖免疫调节作用的机制研究 |
| 2.4 黄芪多糖质量控制现状 |
| 2.4.1 黄芪多糖中总糖含量测定方法 |
| 2.4.2 黄芪多糖分子量大小和分布测定方法 |
| 2.4.3 黄芪多糖的单糖组成分析 |
| 2.4.4 黄芪多糖中杂质的检测 |
| 2.4.5 糖谱法的应用 |
| 第三章 黄芪多糖中不同分子量多糖组分的分离及结构解析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 植物材料 |
| 3.2.2 仪器 |
| 3.2.3 试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 黄芪多糖的制备及分析鉴定 |
| 3.3.2 不同分子量黄芪多糖的分离制备 |
| 3.3.3 不同分子量黄芪多糖的单糖组成测定 |
| 3.3.4 不同分子量黄芪多糖的红外光谱测定 |
| 3.3.5 不同分子量黄芪多糖的甲基化分析 |
| 3.3.6 不同分子量黄芪多糖的核磁共振波谱测定 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 黄芪多糖的制备和分析鉴定 |
| 3.4.2 不同分子量黄芪多糖的纯度及分子量 |
| 3.4.3 不同分子量黄芪多糖的单糖组成分析 |
| 3.4.4 不同分子量黄芪多糖的红外光谱分析 |
| 3.4.5 不同分子量黄芪多糖的甲基化分析 |
| 3.4.6 不同分子量黄芪多糖的核磁共振波谱分析 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 基于体外免疫细胞活性评价的黄芪多糖中活性多糖的筛选 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 植物材料 |
| 4.2.2 仪器 |
| 4.2.3 试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 APS对体外培养小鼠脾淋巴细胞增殖的影响 |
| 4.3.2 APS影响LPS诱导的小鼠脾淋巴细胞分泌IgG水平试验 |
| 4.3.3 APS影响小鼠腹腔巨噬细胞吞噬活性试验 |
| 4.3.4 APS影响体外培养小鼠脾NK细胞活性试验 |
| 4.3.5 统计分析 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 不同Mw APS协同ConA对体外培养小鼠脾淋巴细胞增殖的影响 |
| 4.4.2 不同Mw APS协同LPS对体外培养小鼠脾淋巴细胞增殖的影响 |
| 4.4.3 不同Mw APS对 LPS诱导的脾淋巴细胞分泌IgG的影响 |
| 4.4.4 不同Mw APS对小鼠腹腔巨噬细胞体外吞噬活性的影响 |
| 4.4.5 不同Mw APS对脾NK细胞活性的影响 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 基于体内免疫活性评价的黄芪多糖中活性多糖的筛选 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 植物材料 |
| 5.2.2 实验动物 |
| 5.2.3 仪器 |
| 5.2.4 试剂 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 动物分组与样本收集 |
| 5.3.2 黄芪多糖对环磷酰胺免疫抑制小鼠血常规的影响 |
| 5.3.3 黄芪多糖对环磷酰胺免疫抑制小鼠体重的影响 |
| 5.3.4 黄芪多糖对环磷酰胺免疫抑制小鼠免疫器官重量的影响 |
| 5.3.5 黄芪多糖对环磷酰胺免疫抑制小鼠特异性免疫的影响 |
| 5.3.6 黄芪多糖对环磷酰胺免疫抑制小鼠非特异性免疫的影响 |
| 5.3.7 统计分析 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 黄芪多糖对环磷酰胺免疫抑制小鼠血常规的影响 |
| 5.4.2 黄芪多糖对环磷酰胺免疫抑制小鼠体重的影响 |
| 5.4.3 黄芪多糖对环磷酰胺免疫抑制小鼠免疫器官重量的影响 |
| 5.4.4 黄芪多糖对环磷酰胺免疫抑制小鼠特异性免疫的影响 |
| 5.4.5 黄芪多糖对环磷酰胺免疫抑制小鼠非特异性免疫的影响 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 基于糖谱及免疫细胞活性的不同来源黄芪的质量评价 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验材料 |
| 6.2.1 植物材料 |
| 6.2.2 仪器 |
| 6.2.3 试剂 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 黄芪多糖的制备 |
| 6.3.2 黄芪多糖总糖含量的测定 |
| 6.3.3 黄芪多糖分子量的测定 |
| 6.3.4 黄芪多糖部分酸水解 |
| 6.3.5 单糖组成的测定 |
| 6.3.6 黄芪多糖对RAW264.7 细胞免疫功能的影响 |
| 6.3.7 数据处理 |
| 6.4 结果与分析 |
| 6.4.1 黄芪多糖得率和总糖含量的测定 |
| 6.4.2 不同产地APS HPGFC-ELSD特征图谱分析及质量评价 |
| 6.4.3 正交试验优化酸水解条件 |
| 6.4.4 不同产地APS水解产物HILIC-ELSD特征图谱分析及质量评价 |
| 6.4.5 基于LC-MS不同产地APS酸水解产物的结构表征 |
| 6.4.6 不同产地黄芪多糖单糖组成的测定 |
| 6.4.7 不同产地黄芪多糖免疫活性的测定 |
| 6.5 小结 |
| 第七章 总结与展望 |
| 7.1 研究工作总结 |
| 7.1.1 黄芪多糖中不同分子量多糖组分的分离及结构解析 |
| 7.1.2 基于体内外免疫活性评价的黄芪多糖中活性多糖的筛选 |
| 7.1.3 基于糖谱及免疫细胞活性的不同来源黄芪的质量评价 |
| 7.2 展望 |
| 参考文献 |
| 研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简况及联系方式 |
（5）基于免疫亲和色谱的中药多糖活性筛选与构效关系研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 概述 |
| 1.多糖的免疫活性研究 |
| 1.1 多糖免疫调节机理 |
| 1.2 多糖对免疫细胞的免疫调节作用 |
| 1.3 多糖对黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase, XOD)的免疫调节作用 |
| 2.多糖的分离纯化及结构解析研究 |
| 2.1 多糖的分离纯化方法 |
| 2.2 多糖纯度的鉴定 |
| 2.3 多糖的结构解析 |
| 3.亲和色谱在中药活性成分筛选中的应用研究 |
| 3.1 基于细胞膜的亲和色谱筛选 |
| 3.2 基于脂筏的亲和色谱筛选 |
| 3.3 基于酶、受体及蛋白的亲和色谱筛选 |
| 3.4 亲和色谱存在的问题及发展前景 |
| 4.本文研究的目的与内容 |
| 1.脂筏亲和色谱及XOD亲和色谱在线筛选模型的构建 |
| 2.中药多糖筛选方法的建立 |
| 3.中药多糖免疫活性体内外评价 |
| 4.中药多糖构效关系的初步研究 |
| 第二章 巨噬细胞脂筏免疫亲和色谱及黄嘌呤氧化酶免疫亲和色谱的制备 |
| 1 仪器和试剂 |
| 1.1 仪器设备 |
| 1.2 试剂 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 免疫亲和色谱柱固定相硅胶材料CNTm@SiO_2 的制备 |
| 2.2 Mφ脂筏类生物材料的制备 |
| 2.3 Mφ脂筏免疫亲和色谱固定相的制备 |
| 2.4 XOD免疫亲和色谱固定相的制备 |
| 2.5 Mφ@CNTm@SiO_2和XOD@CNTm@SiO_2 免疫亲和色谱固定相的表征 |
| 2.6 Mφ@CNTm@SiO_2 的免疫活性的评价 |
| 2.7 XOD@CNTm@SiO_2 的酶活性评价 |
| 2.8 Mφ脂筏免疫亲和色谱柱及XOD免疫亲和色谱柱的装填 |
| 2.9 Mφ脂筏免疫亲和色谱及XOD免疫亲和色谱的色谱系统性能考察 |
| 2.10 影响免疫亲和色谱色谱行为的相关因素考察 |
| 2.11 不同分子量葡聚糖的亲和色谱保留行为的研究 |
| 2.12 不同批次制备的Mφ@CNTm@SiO_2及XOD@CNTm@SiO_2 色谱柱的色谱保留时间考察 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 CNTm@SiO_2 材料的制备 |
| 3.2 Mφ脂筏的表征 |
| 3.3 Mφ脂筏亲和色谱及XOD亲和色谱固定相的SEM表征 |
| 3.4 Mφ@CNTm@SiO_2 的免疫活性的评价 |
| 3.5 XOD与 XOD@CNTm@SiO_2 酶活性评价 |
| 3.6 Mφ脂筏免疫亲和色谱及XOD免疫亲和色谱的色谱性能的评价 |
| 3.7 影响Mφ@CNTm@SiO_2 色谱和XOD@CNTm@SiO_2 色谱保留行为的相关因素考察结果 |
| 3.8 不同分子量葡聚糖的亲和色谱保留行为的结果 |
| 3.9 不同批次制备的两种亲和色谱的色谱保留行为的结果 |
| 4 本章小结 |
| 第三章 中药多糖免疫活性在线筛选研究 |
| 1 仪器和试剂 |
| 1.1 仪器设备 |
| 1.2 试剂耗材 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 十五味中药多糖的提取、分离及纯化 |
| 2.2 多糖纯度的鉴定 |
| 2.3 多糖含量的检测 |
| 2.4 蛋白质含量的检测 |
| 2.5 纯化多糖免疫活性在线筛选 |
| 3 结果及讨论 |
| 3.1 多糖的分离纯化 |
| 3.2 多糖纯度鉴定 |
| 3.3 多糖的含量测定 |
| 3.4 蛋白质含量的测定 |
| 3.5 纯化多糖免疫活性在线筛选结果 |
| 4.本章小结 |
| 第四章 中药多糖免疫活性体内外评价 |
| 1 仪器和试剂 |
| 1.1 仪器 |
| 1.2 试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 纯化多糖对体外培养的Mφ的免疫活性影响 |
| 2.2 纯化多糖对体内Mφ吞噬能力影响 |
| 2.3 纯化多糖的体外抑制XOD活性研究 |
| 2.4 纯化多糖在大鼠体内抑制XOD活性研究 |
| 2.5 统计学处理 |
| 3 结果及讨论 |
| 3.1 多糖对Mφ吞噬能力的影响结果 |
| 3.2 多糖对Mφ分泌NO能力的影响 |
| 3.3 多糖对Mφ分泌TNF-α能力的影响 |
| 3.4 多糖对体内Mφ吞噬能力影响 |
| 3.5 体外抑制XOD活性检测结果 |
| 3.6 纯化多糖在大鼠体内抑制XOD活性结果 |
| 3.7 纯化多糖在大鼠体内降尿酸活性结果 |
| 4 本章小结 |
| 第五章 多糖的结构解析及构效关系初步探讨 |
| 1 仪器与试剂 |
| 1.1 仪器 |
| 1.2 试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 分子量的检测 |
| 2.2 单糖组成分析 |
| 2.3 高碘酸氧化多糖反应 |
| 2.4 傅里叶变换-红外光谱分析 |
| 2.5 ~1H-NMR分析 |
| 2.6 刚果红实验 |
| 2.7 透射电镜分析 |
| 3 结果及讨论 |
| 3.1 多糖的分子量检测 |
| 3.2 单糖组成分析 |
| 3.3 高碘酸氧化分析 |
| 3.4 傅里叶变换-红外光谱分析 |
| 3.5 NMR分析 |
| 3.6 刚果红实验结果 |
| 3.7 透射电子显微镜分析 |
| 3.8 多糖构效关系的初步分析 |
| 4 本章小结 |
| 全文总结 |
| 一 主要研究内容 |
| 二 创新点 |
| 参考文献 |
| 发表文章 |
| 致谢 |
| 附图 |
（6）补肾解毒方抗小鼠免疫性肝损伤的机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词索引 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 补肾解毒方全方、拆方、单方水煎干浸膏对ConA模型小鼠免疫性肝损伤的作用研究 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 补肾解毒方的药物组成 |
| 1.2 动物和用药 |
| 1.3 实验仪器和试剂 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 补肾解毒方全方水煎干浸膏的制备 |
| 2.2 补肾解毒方拆方水煎干浸膏的制备 |
| 2.3 补肾解毒方单方水煎干浸膏的制备 |
| 2.4 ConA诱导免疫性肝损伤小鼠模型的建立方法和给药方案 |
| 2.5 免疫性肝损伤小鼠药理活性指标的测定方法 |
| 2.6 统计学方法 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 补肾解毒方全方、拆方、单方水煎干浸膏的得率 |
| 3.2 补肾解毒方全方、拆方、单方水煎干浸膏对小鼠脏器系数的影响 |
| 3.3 补肾解毒方全方、拆方水煎干浸膏对小鼠肝脏组织病理的影响 |
| 3.4 补肾解毒方全方、拆方、单方水煎干浸膏对小鼠血清ALT、AST表达水平的影响 |
| 3.5 补肾解毒方全方、拆方、单方水煎干浸膏对小鼠肝脏SOD、CAT、MDA表达水平的影响 |
| 3.6 补肾解毒方全方、拆方、单方水煎干浸膏对小鼠脾细胞上清IFN-γ表达水平的影响 |
| 4.小结 |
| 第二部分 补肾解毒方全方、拆方、单方水煎干浸膏对H2O2抑制人肝LO2细胞增殖的调节作用 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 细胞 |
| 1.2 供试品 |
| 1.3 实验仪器和试剂 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 补肾解毒方全方、拆方、单方水煎干浸膏对人肝LO2细胞增殖活性及调节双氧水(H2O2)抑制LO2细胞增殖的影响 |
| 2.2 统计学方法 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 补肾解毒方全方、拆方、单方水煎干浸膏对人肝LO2细胞增殖活性的影响 |
| 3.2 补肾解毒方全方、拆方、单方水煎干浸膏对双氧水(H_2O_2)抑制人肝LO2细胞增殖的调节作用 |
| 4.小结 |
| 第三部分 补肾解毒方全方、拆方、单方水煎干浸膏对小鼠原代脾细胞与腹腔巨噬细胞的调控作用 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 动物 |
| 1.2 供试品 |
| 1.3 实验仪器和试剂 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 补肾解毒方全方、拆方对小鼠原代脾细胞的增殖作用 |
| 2.2 补肾解毒方全方、拆方对小鼠原代脾淋巴细胞的IFN-γ表达水平的影响 |
| 2.3 补肾解毒方全方、拆方对小鼠原代腹腔巨噬细胞的TNF-α表达水平的影响 |
| 2.4 统计学方法 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 全方对小鼠原代脾细胞增殖能力的影响 |
| 3.2 拆方对小鼠原代脾细胞的增殖能力的影响 |
| 3.3 全方和拆方对小鼠原代脾淋巴细胞IFN-γ表达水平的影响 |
| 3.4 全方和拆方对小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α表达水平的影响 |
| 4.小结 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ 文献综述 慢乙肝治疗药物的研究近况 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅱ 已发表文章 |
| 附录Ⅲ 已获得专利 |
（7）复方芪术颗粒的研制及其免疫增强作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一章 免疫增强剂研究概述 |
| 1. 免疫增强剂研究进展 |
| 2. 中兽药免疫增强剂研究进展 |
| 3. 黄芪、白术免疫增强作用研究进展 |
| 4. 导致动物免疫抑制的因素 |
| 5. 本研究目的及意义 |
| 参考文献 |
| 第二章 复方芪术颗粒中黄芪与白术配比筛选 |
| 1. 材料 |
| 1.1 主要药品与试剂 |
| 1.2 主要仪器、设备及器具 |
| 2. 方法 |
| 2.1 试验药品制备 |
| 2.2 试验分组及指标测定 |
| 2.3 统计学方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 处方依据 |
| 4.2 黄芪、白术的配比选择 |
| 参考文献 |
| 第三章 复方芪术颗粒的制备及稳定性研究 |
| 1. 材料 |
| 1.1 主要药品与试剂 |
| 1.2 主要仪器、设备及器具 |
| 2. 方法 |
| 2.1 CHBG的研制 |
| 2.2 CHBG的稳定性研究 |
| 3. 结果 |
| 3.1 CHBG的制备 |
| 3.2 CHBG的稳定性研究结果 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 CHBG的制备工艺 |
| 4.2 CHBG的稳定性 |
| 参考文献 |
| 第四章 复方芪术颗粒的质量标准研究 |
| 1. 材料 |
| 1.1 主要药品与试剂 |
| 1.2 主要仪器、设备及器具 |
| 2. 方法 |
| 2.1 颗粒剂的鉴别方法 |
| 2.2 颗粒剂单糖和双糖检查方法 |
| 2.3 颗粒剂制剂通则项目检查方法 |
| 2.4 颗粒剂HPLC指纹图谱研究方法 |
| 2.5 颗粒剂总多糖含量检测方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 颗粒剂鉴别结果 |
| 3.2 颗粒剂单糖和双糖检查结果 |
| 3.3 颗粒剂制剂通则项目检查结果 |
| 3.4 颗粒剂HPLC指纹图谱研究结果 |
| 3.5 总多糖含量检测 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 复方芪术颗粒急性毒性试验研究 |
| 1. 材料 |
| 1.1 主要药品与试剂 |
| 1.2 主要仪器、设备及器具 |
| 1.3 试验动物及其生活环境情况 |
| 2. 方法 |
| 2.1 预实验 |
| 2.2 最大耐受药量试验 |
| 2.3 小鼠体质量和脏器指数的变化 |
| 2.4 统计学方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 预实验结果 |
| 3.2 最大耐受药量试验 |
| 3.3 小鼠体质量和脏器指数的变化 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 复方芪术颗粒对小鼠非特异性免疫调节作用研究 |
| 1. 材料 |
| 1.1 主要药品、试剂 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 实验仪器 |
| 2. 方法 |
| 2.1 CHBG对小鼠免疫器官指数及碳粒廓清功能的影响 |
| 2.2 CHBG对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响 |
| 2.3 CHBG对小鼠血清溶菌酶及部分细胞因子的影响 |
| 2.4 CHBG对小鼠脾淋巴细胞亚群分布的影响 |
| 2.5 统计学方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 CHBG对小鼠脾脏、胸腺指数的影响 |
| 3.2 CHBG对小鼠碳粒廓清指数和吞噬指数的影响 |
| 3.3 CHBG对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响 |
| 3.4 CHBG对小鼠血清中IFN-γ含量的影响 |
| 3.5 CHBG对小鼠血清中TNF-α含量的影响 |
| 3.6 CHBG对小鼠血清中IL-2含量的影响 |
| 3.7 CHBG对小鼠血清中IL-4含量的影响 |
| 3.8 CHBG对小鼠溶菌酶含量的影响 |
| 3.9 CHBG对小鼠淋巴细胞亚群分布的影响 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 CHBG对小鼠免疫器官的促进作用 |
| 4.2 CHBG对小鼠免疫细胞增殖以及免疫细胞功能的促进作用 |
| 4.3 CHBG诱导细胞因子释放的促进作用 |
| 参考文献 |
| 第七章 复方芪术颗粒对新城疫疫苗免疫效果的影响 |
| 1. 材料 |
| 1.1 主要药品、试剂 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 实验仪器 |
| 2. 方法 |
| 2.1 口服不同剂量CHBG对雏鸡ND抗体水平的影响 |
| 2.2 不同给药方案对雏鸡ND抗体水平的影响 |
| 2.3 统计学方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 口服不同剂量的CHBG对雏鸡ND抗体水平的影响 |
| 3.2 不同给药方案对雏鸡ND抗体水平的影响 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论与创新 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 攻读学位期间申请的专利 |
（8）胞内pH敏感型黄芪多糖PLGA纳米粒作为抗原佐剂的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号及缩略语 |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 黄芪多糖研究进展 |
| 1.1 黄芪多糖的化学成分 |
| 1.2 黄芪多糖的药理作用 |
| 2 靶向药物治疗研究进展 |
| 2.1 纳米载体用于靶向药物治疗 |
| 2.2 智能药物载体用于靶向药物治疗 |
| 2.3 pH敏感型载体用于靶向药物治疗 |
| 2.4 发展趋势 |
| 3 本研究的目的意义 |
| 参考文献 |
| 第二章 胞内pH敏感型黄芪多糖PLGA纳米粒的制备及条件优化 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验药物 |
| 1.2 试验材料 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 pH敏感型黄芪多糖PLGA纳米粒的制备 |
| 1.6 pH敏感型黄芪多糖PLGA纳米粒多糖包封率和载药量测定 |
| 1.7 pH敏感型黄芪多糖PLGA纳米粒制备工艺优化 |
| 1.8 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 葡萄糖标准曲线 |
| 2.2 单因素试验结果 |
| 2.3 BBD响应面试验设计及结果 |
| 2.4 响应面优化分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 胞内pH敏感型黄芪多糖PLGA纳米粒的表征检测及质量评价 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验药物 |
| 1.2 试验材料 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 PLGA纳米粒的表征检测 |
| 1.6 胞内pH敏感型黄芪多糖PLGA纳米粒的稳定性检测 |
| 1.7 PLGA纳米粒的形态观察 |
| 1.8 体外药物释放 |
| 2 结果 |
| 2.1 PLGA纳米粒的表征检测 |
| 2.2 纳米粒稳定性检测 |
| 2.3 PLGA纳米粒的形态观察 |
| 2.4 体外药物释放 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 胞内pH敏感型黄芪多糖PLGA纳米粒对小鼠脾脏淋巴细胞以及腹腔巨噬细胞的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 试验药物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 胞内pH敏感型黄芪多糖PLGA纳米粒对小鼠脾脏淋巴细胞的影响 |
| 1.6 胞内pH敏感型黄芪多糖PLGA纳米粒对小鼠腹腔巨噬细胞的影响 |
| 1.7 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 纳米粒对小鼠脾脏淋巴细胞的影响 |
| 2.2 纳米粒对小鼠腹腔巨噬细胞的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 胞内pH敏感型黄芪多糖PLGA纳米粒的佐剂活性研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 试验药物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 动物分组及免疫程序 |
| 1.6 免疫检测 |
| 1.7 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 对淋巴结内树突细胞成熟的影响 |
| 2.2 对血清中OVA特异性抗体水平的影响 |
| 2.3 Th1/Th2免疫反应倾向性分析 |
| 2.4 对血清中细胞因子水平的影响 |
| 2.5 对小鼠淋巴细胞增殖能力的影响 |
| 2.6 对脾脏T淋巴细胞活化的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 攻读硕士期间发表的论文 |
| 致谢 |
（9）枸杞多糖脂质体的免疫增强作用及其机理的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号及缩略语 |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 疫苗 |
| 1.1 开发疫苗的重要性 |
| 1.2 疫苗安全性与有效性 |
| 1.3 疫苗的分类 |
| 2 免疫佐剂 |
| 2.1 佐剂的必要性和优势 |
| 2.2 佐剂的类型及作用机理 |
| 2.3 佐剂的作用机制 |
| 3 脂质体作为疫苗递送系统的研究进展 |
| 3.1 脂质体作为疫苗递送系统的特征 |
| 3.2 脂质体作为疫苗递送系统的临床应用 |
| 4 多糖作为免疫佐剂的研究进展 |
| 4.1 多糖作为免疫佐剂的结构和优缺点 |
| 4.2 几种中草药多糖作为免疫佐剂的结构和理化性质 |
| 4.3 几种中草药多糖作为免疫佐剂的功能 |
| 5 本研究的目的和意义 |
| 参考文献 |
| 第二章 枸杞多糖脂质体的制备及其制备条件的优化 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验药物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 LBPL的制备 |
| 1.5 LBPL包封率的测定 |
| 1.6 LBPL包封率及载药量的计算 |
| 1.7 LBPL制备条件的优化 |
| 2 结果 |
| 2.1 葡萄糖标准曲线的绘制 |
| 2.2 单因素试验结果 |
| 2.3 响应面优化条件结果 |
| 2.4 响应面结果分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 枸杞多糖脂质体的质量评价 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验药物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 LBPL形态特征的测定 |
| 1.5 LBPL粒径大小的测定 |
| 1.6 LBPL稳定性的测定 |
| 1.7 LBPL体外药物释放的测定 |
| 1.8 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 LBPL的形态特征 |
| 2.2 LBPL的粒径 |
| 2.3 LBPL的稳定性 |
| 2.4 LBPL的体外药物释放曲线 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 枸杞多糖脂质体对小鼠脾脏淋巴细胞增殖和分化的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1试验动物 |
| 1.2 试验药物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 LBPL和LBP最大安全浓度的测定 |
| 1.6 LBPL对脾脏T、B淋巴细胞增殖的测定 |
| 1.7 LBPL对脾脏T淋巴细胞表型影响的测定 |
| 1.8 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 LBPL和LBP的最大安全浓度 |
| 2.2 LBPL对脾脏淋巴细胞增殖的影响 |
| 2.3 LBPL对脾脏淋巴细胞表型的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 枸杞多糖脂质体对巨噬细胞免疫功能的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 试验药物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 腹腔巨噬细胞的分离培养 |
| 1,6 LBPL对巨噬细胞吞噬荧光素标记大肠杆菌的作用 |
| 1.7 LBPL对巨噬细胞上清细胞因子分泌的作用 |
| 1.8 LBPL对巨噬细胞上清中炎症因子NO和iNOS含量的作用 |
| 1.9 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 LBPL对巨噬细胞吞噬荧光标记大肠杆菌作用的影响 |
| 2.2 LBPL对巨噬细胞分泌细胞因子作用的影响 |
| 2.3 LBPL对巨噬细胞分泌炎症因子NO和iNOS作用的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 枸杞多糖脂质体对骨髓源树突状细胞成熟以及抗原递呈的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 试验药物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 骨髓来源树突状细胞的分离培养 |
| 1.6 LBPL对DCs前体细胞增殖的作用 |
| 1.7 DCs的诱导与培养 |
| 1.8 LBPL对DCs表面分子表达的作用 |
| 1.9 LBPL对DCs分泌细胞因子的作用 |
| 1.10 LBPL对DCs抗原摄取能力的作用 |
| 1.11 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 LBPL对DCs前体细胞增殖的影响 |
| 2.2 LBPL对DCs表面分子表达的影响 |
| 2.3 LBPL对DCs分泌细胞因子的影响 |
| 2.4 LBPL对DCs摄取抗原的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第七章 枸杞多糖脂质体对小鼠免疫OVA疫苗的佐剂活性作用 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 试验药物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 LBPL包封抗原OVA稳定性和包封率的测定 |
| 1.6 LBPL体外抗原释放的测定 |
| 1.7 动物分组及免疫程序 |
| 1.8 淋巴结中树突状细胞(DCs)表面分子的测定 |
| 1.9 淋巴结免疫组化切片 |
| 1.10 淋巴细胞刺激指数(SI)的测定 |
| 1.11 T淋巴细胞亚群CD3~+、CD4~+/CD8~+表型的测定 |
| 1.12 血清中OVA特异性抗体以及细胞因子的测定 |
| 1.13 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 LBPL-OVA的稳定性 |
| 2.2 LBPL-OVA抗原包封率稳定性 |
| 2.3 LBPL的体外抗原释放曲线 |
| 2.4 LBPL-OVA对淋巴结中DCs细胞表面分子表达的影响 |
| 2.5 LBPL-OVA对淋巴结中的抗原量的影响 |
| 2.6 LBPL-OVA对淋巴细胞刺激指数(SI)的影响 |
| 2.7 LBPL-OVA对T淋巴细胞亚群CD3~+、CD4~+/CD8~+的影响 |
| 2.8 LBPL-OVA对抗原特异性IgG及IgG亚型的影响 |
| 2.9 LBPL-OVA对血清中细胞因子分泌的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第八章 枸杞多糖脂质体对小鼠免疫PCV2疫苗的佐剂活性作用 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 试验药物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 LBPL-PCV2粒径和PDI的测定 |
| 1.6 动物分组及免疫程序 |
| 1.7 抗体以及细胞因子的测定 |
| 1.8 脾脏组织切片H&E染色 |
| 1.9 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 LBPL-PCV2粒径和PDI的结果 |
| 2.2 LBPL-PCV2对抗原特异性IgG的影响 |
| 2.3 LBPL-PCV2对IgG1含量的影响 |
| 2.4 LBPL-PCV2对IgG2a/IgG1比例的影响 |
| 2.5 LBPL-PCV2对细胞因子分泌的影响 |
| 2.6 LBPL-PCV2对脾脏的组织学变化的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第九章 枸杞多糖脂质体激活树突状细胞TLR4/MyD88/NF/κB通路的作用 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 试验药物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 骨髓来源树突状细胞的分离培养与药物作用 |
| 1.6 树突状细胞总RNA的提取 |
| 1.7 反转录(RT) |
| 1.8 PCR引物的设计 |
| 1.9 荧光定量PCR的测定 |
| 1.10 LBPL对DCs细胞核中TLR4通路相关蛋白表达的影响 |
| 1.11 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 LBPL对DCs中NF-κB和MyD88的mRNA相对表达量的影响 |
| 2.2 LBPL对DCs中TLR4和TRAF6的mRNA相对表达量的影响 |
| 2.3 LBPL对DCs细胞核中NF-κB和MyD88蛋白表达的影响 |
| 2.4 LBPL对DCs细胞核中TLR4和TRAF6蛋白表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 攻读博士期间发表的论文 |
（10）灵芝多糖脂质体和脂质立方液晶纳米粒免疫增强作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号及缩略语 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 疫苗佐剂 |
| 1.1 佐剂在疫苗中的作用 |
| 1.2 疫苗的免疫应答 |
| 1.3 佐剂的免疫应答 |
| 2 纳米粒作为疫苗或药物递送系统的研究 |
| 2.1 脂质体 |
| 2.2 脂质立方液晶纳米粒 |
| 2.3 聚乳酸-羟基乙酸共聚物 |
| 2.4 聚谷氨酸 |
| 3 中药多糖的免疫调节作用 |
| 3.1 中药多糖对免疫器官的影响 |
| 3.2 中药多糖对免疫细胞的影响 |
| 3.3 中药多糖对细胞因子的影响 |
| 4 本研究的目的和意义 |
| 参考文献 |
| 第二章 灵芝多糖脂质体的制备及制备条件的优化 |
| 1 材料与仪器 |
| 1.1 试验药物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 灵芝多糖脂质体的制备 |
| 2.2 灵芝多糖脂质体包封率的测定 |
| 2.3 灵芝多糖脂质体制备工艺的优化 |
| 2.4 灵芝多糖脂质体粒径的测定和形态观察 |
| 3 结果 |
| 3.1 单因素试验结果 |
| 3.2 BBD试验设计及分析 |
| 3.3 响应面结果分析 |
| 3.4 GLPL粒径以及电镜下的形态 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 灵芝多糖脂质体对小鼠脾脏淋巴细胞增殖和分化的影响 |
| 1 材料与仪器 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 试验药物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 小鼠脾脏淋巴细胞增殖的测定 |
| 2.2 脾脏淋巴细胞分化的检测 |
| 2.3 数据分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 药物单独刺激脾脏淋巴细胞增殖的变化 |
| 3.2 药物协同LPS刺激脾B淋巴细胞增殖的变化 |
| 3.3 药物协同PHA刺激脾T淋巴细胞增殖的变化 |
| 3.4 对小鼠脾脏淋巴细胞分化的作用 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 灵芝多糖脂质体对小鼠腹腔巨噬细胞功能的影响 |
| 1 材料与仪器 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 试验药物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 小鼠腹腔巨噬细胞的诱导、分离与培养 |
| 2.2 腹腔巨噬细胞活性检测 |
| 2.3 腹腔巨噬细胞吞噬能力测定 |
| 2.4 腹腔巨噬细胞表面分子MHCⅡ表达的测定 |
| 2.5 NO含量以及iNOS活性的测定 |
| 2.6 细胞因子含量测定 |
| 2.7 数据处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 灵芝多糖脂质体对腹腔巨噬细胞活性的影响 |
| 3.2 灵芝多糖脂质体对腹腔巨噬细胞吞噬作用的影响 |
| 3.3 GLPL对巨噬细胞表面表达分子MHCⅡ表达的影响 |
| 3.4 GLPL对细胞因子水平的影响 |
| 3.5 GLPL对巨噬细胞NO产量的影响 |
| 3.6 GLPL对巨噬细胞iNOS活性的影响 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 灵芝多糖脂质体对OVA免疫小鼠的免疫增强作用 |
| 1 材料与仪器 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 试验药物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 粒径稳定性的测定 |
| 2.2 抗原包封率稳定性检测 |
| 2.3 动物分组及免疫程序 |
| 2.4 淋巴结中树突状细胞(DCs)表面分子的测定 |
| 2.5 淋巴细胞增殖的测定 |
| 2.6 小鼠脾脏T淋巴细胞分化的测定 |
| 2.7 血清中OVA特异性抗体及抗体亚型的测定 |
| 2.8 细胞因子的测定 |
| 2.9 数据分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 OVA包封率的变化 |
| 3.2 粒径及PDI的变化 |
| 3.3 淋巴结中DCs的成熟 |
| 3.4 脾脏淋巴细胞增殖的变化 |
| 3.5 小鼠脾脏淋巴细胞的分化 |
| 3.6 OVA特异性IgG及其亚型的变化 |
| 3.7 细胞因子水平的变化 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 灵芝多糖脂质体对PCV-2苗免疫小鼠的免疫增强作用 |
| 1 材料与仪器 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 试验药物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 疫苗配制 |
| 2.2 动物分组及处理 |
| 2.3 ELISA法测定PCV-2特异性IgG的浓度 |
| 2.4 ELISA法测定IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3的浓度 |
| 2.5 血清细胞因子含量测定 |
| 2.6 脾脏组织学分析 |
| 2.7 数据处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 GLPL对血清中PCV-2特异性IgG及抗体亚型含量的影响 |
| 3.2 GLPL对血清中IL-4、IFN-γ、IL-17、IL-12p70和TNF-α含量的影响 |
| 3.3 脾脏组织学变化 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第七章 灵芝多糖脂质立方液晶纳米粒的制备方法优选及质量评价 |
| 1 材料与仪器 |
| 1.1 试验药物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 灵芝多糖脂质立方液晶纳米粒的制备 |
| 2.2 乙醇分散法中分散介质的优化 |
| 2.3 灵芝多糖脂质立方液晶纳米粒包封率的测定 |
| 2.4 灵芝多糖脂质立方液晶纳米粒粒径和Zeta电位的测定 |
| 2.5 灵芝多糖脂质立方液晶纳米粒的形态观察 |
| 2.6 灵芝多糖脂质立方液晶纳米粒小角X散射测定 |
| 3 结果 |
| 3.1 两种制备方法对GLPC包封率的影响 |
| 3.2 乙醇分散法中不同分散介质对GLPC包封率和稳定性的影响 |
| 3.3 灵芝多糖脂质立方液晶纳米粒粒径及Zeta电势 |
| 3.4 灵芝多糖脂质立方液晶纳米粒表面形态 |
| 3.5 GLPC小角X散射分析 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第八章 灵芝多糖脂质立方液晶纳米粒对PCV-2苗免疫小鼠的免疫增强作用 |
| 1 材料与仪器 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 试验药物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 疫苗制备 |
| 2.2 动物分组及处理 |
| 2.3 血清中PCV-2特异性IgG含量的测定 |
| 2.4 血清中IgGl、IgG2a、IgG2b和IgG3浓度的测定 |
| 2.5 血清中细胞因子的测定 |
| 2.6 淋巴结中记忆T细胞反应的检测 |
| 2.7 检测淋巴结中抗原含量的检测 |
| 2.8 淋巴结中树突状细胞（DCs)表面分子的测定 |
| 2.9 数据处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 血清中PCV-2特异性抗体和抗体亚型的变化 |
| 3.2 GLPC对血清中IL-4、IFN-γ、IL-17、IL-12p70和TNF-α含量的影响 |
| 3.3 淋巴结中抗原量变化 |
| 3.4 淋巴结中DCs的成熟 |
| 3.5 淋巴结中记忆T细胞的变化 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第九章 修饰后灵芝多糖脂质立方液晶纳米粒对OVA免疫小鼠的免疫增强作用 |
| 1 材料与仪器 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 两种阳离子修饰灵芝多糖脂质立方液晶纳米粒的制备及质量评价 |
| 2.2 两种修饰脂质立方液晶纳米粒对小鼠免疫OVA的免疫增强作用 |
| 2.3 脾脏组织转录组测序分析 |
| 2.4 数据分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 不同修饰脂质立方液晶纳米粒的粒径、电势、OVA吸附率及SAXS分析 |
| 3.2 两种修饰脂质立方液晶纳米粒对小鼠免疫应答的影响 |
| 3.3 小鼠脾脏基因表达情况 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 攻读博士学位期间发表和完成的论文 |
| 致谢 |
四、中药黄芪对小鼠腹腔巨噬细胞功能的影响（论文参考文献）
- [1]地锦多糖的制备及对小鼠免疫增强活性研究[D]. 孙文静. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [2]女贞子免疫增强活性成分分离鉴定及作用机制研究[D]. 刘佳. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [3]枸杞多糖的分离纯化及基于对肠道菌群调节的免疫作用机制研究[D]. 王莹. 北京中医药大学, 2020(04)
- [4]基于多糖分子量分布和免疫活性比较的黄芪质量研究[D]. 曹宇欣. 山西大学, 2020
- [5]基于免疫亲和色谱的中药多糖活性筛选与构效关系研究[D]. 王启龙. 江苏大学, 2019
- [6]补肾解毒方抗小鼠免疫性肝损伤的机制研究[D]. 陈彦旭. 上海中医药大学, 2019(03)
- [7]复方芪术颗粒的研制及其免疫增强作用研究[D]. 张槐. 扬州大学, 2019
- [8]胞内pH敏感型黄芪多糖PLGA纳米粒作为抗原佐剂的研究[D]. 徐书雯. 南京农业大学, 2019(08)
- [9]枸杞多糖脂质体的免疫增强作用及其机理的研究[D]. 伯若楠. 南京农业大学, 2019
- [10]灵芝多糖脂质体和脂质立方液晶纳米粒免疫增强作用的研究[D]. 刘振广. 南京农业大学, 2018(07)