扫描电镜和透射电镜联合观察豚鼠耳蜗

扫描电镜和透射电镜联合观察豚鼠耳蜗

一、扫描电镜和透射电镜对豚鼠耳蜗的联合观察(论文文献综述)

丁大连,亓卫东,杨琨,李鹏,孙虹,Richard Salvi[1](2016)在《内耳病理学研究技术的进展》文中研究表明内耳病理学是一门从组织形态学角度研究内耳疾病的发生原因和发展过程及其损害机制的边缘医学基础学科。内耳病理学的样品制备观察技术包括颞骨切片技术、膜迷路切片技术、耳蜗和前庭膜迷路取材铺片技术、内耳组织学和组织化学技术、内耳扫描电镜和透射电镜样品制备技术、以及电镜下的超微细胞化学技术等。通过分析各项内耳病理研究技术的发生、发展和现状,并结合实践经验和技术革新经验,深入讨论上述各项技术的优缺点和技术细节。

李永贺,李威,陈浩,吴剑,万良财[2](2013)在《盐酸椒苯酮胺对豚鼠耳蜗缺血再灌注损伤的听力保护作用》文中研究表明目的探讨盐酸椒苯酮胺(piperphentonamine hydrochloride,PPTA)对豚鼠耳蜗缺血再灌注损伤后听功能保护作用及其对耳蜗组织形态的影响。方法将32只成年豚鼠随机分为4组,每组8只,第1组为正常组(不做任何处理),第2组为空白对照组(手术切开颈前正中皮肤,分离出双侧椎动脉、双侧颈总动脉,但不做其它处理),第3组为缺血再灌注对照组(阻断双侧椎动脉及右侧颈总动脉建立豚鼠耳蜗缺血再灌注模型,再灌注同时股静脉给予与PPTA同等剂量生理盐水),第4组为缺血再灌注实验组(手术造模成功后,再灌注同时静脉给予PPTA 10mg/kg)。测量实验前后各组动物的听性脑干反应(ABR)波Ⅲ反应阈。动物造模成功后24小时迅速断头取听泡,每组取4只扫描电镜下观察耳蜗结构、另外4只用透射电镜观察耳蜗结构。结果实验前4组动物ABR波Ⅲ反应阈差异无统计学意义(P>0.05),缺血再灌注24h后第3组ABR波Ⅲ反应阈显着高于第1组和第2组(P<0.05),第4组ABR波Ⅲ反应阈比第3组明显降低(P<0.05);扫描及透射电镜下可见第3组耳蜗外毛细胞纤毛倒伏、脱落,内毛细胞纤毛散乱,血管纹内皮细胞核固缩、边集,神经元可见脱髓鞘改变,而第4组的耳蜗组织损伤明显减轻。结论 PPTA可以防止耳蜗缺血再灌注损伤后毛细胞损伤缺失,对豚鼠耳蜗缺血再灌注听力损伤有保护作用。

丁大连,范静平,龚忠萍,皇甫慕三[3](1992)在《扫描电镜和透射电镜对豚鼠耳蜗的联合观察》文中研究表明以扫描电镜和透射电镜联合观察正常豚鼠和噪声损伤豚鼠耳蜗同一区域毛细胞表面及细胞内亚微结构,结果为:正常豚鼠耳蜗螺旋器在两种电镜观察下均保持良好的亚微结构;而噪声损伤后立即处死的豚鼠耳蜗毛细胞病变程度有所不同。说明联合样品制备步骤不会造成人为的伪迹,提示本法有助于研究耳蜗同一区域毛细胞表面和内部病变的关系。

李永贺[4](2013)在《盐酸椒苯酮胺抗豚鼠耳蜗缺血—再灌注损伤作用及其机制》文中研究指明听力障碍是影响公众身体健康和生活质量的重要因素,数以亿计的人受到威胁。世界卫生组织2013年2月27日在日内瓦表示,全世界有3.6亿人患有耳聋或听力障碍,占全球人口的5%,其中三分之二在发展中国家。中国是世界上最大的发展中国家,有13亿人口,听力障碍残疾人有2057万,占全国人口的16.79%o,绝大部分为感音神经性聋。感音神经性聋的病理改变主要是毛细胞损伤、螺旋神经节、支持细胞及神经末梢的器质性改变,发病原因公认有缺血、病毒感染、耳毒性药物中毒及老年性退行性变等,尤其缺血因素最为常见。而血流障碍中只有少数为单纯的缺血损伤,大部分是缺血后的再灌注损伤。例如突发性耳聋,目前多认为是内耳微循环障碍所致的感音神经性聋。有研究指出缺血后再灌注造成的损伤大于单纯缺血造成的损伤。所以探讨内耳缺血/再灌注损伤(I/RI)的机制将非常有利于内耳疾病的研究。盐酸椒苯酮胺(piperphentonamine hydrochloride,简称椒苯酮胺,PPTA)是由中国医学科学院药物研究所合成筛选出的化学创新药。相关研究表明椒苯酮胺对缺血再灌注损伤的心肌具有保护作用,是钙增敏剂类强心药及心肌保护剂。另外有研究表明其对缺血再灌注损伤脑组织也有保护作用,但国内外尚无椒苯酮胺抗内耳缺血再灌注损伤作用的研究。本实验从听觉功能、细胞形态、炎性因子及细胞凋亡四个方面对豚鼠耳蜗的(I/RI)进行研究,旨在探讨椒苯酮胺对内耳(I/RI)的保护作用及可能机制,为椒苯酮胺用于缺血性内耳疾病的治疗提供药理学依据。本研究分为四个部分:第一部分耳蜗缺血/再灌注(I/R)豚鼠模型的建立目的建立豚鼠耳蜗缺血/再灌注损伤模型,探讨豚鼠耳蜗缺血/再灌注损伤后听功能改变。方法将24只健康、耳廓反射灵敏,体重200-250g豚鼠随机分成3组,分别为正常组、空白对照组、缺血再灌注组。缺血再灌注模型通过暂时性微动脉夹夹闭双侧椎动脉、结扎线活结结扎右侧颈总动脉,实验中激光多普勒检测耳蜗血流(CoBF)。各组动物分别于手术前、缺血再灌注6h、24h、48h行听性脑干反应(auditory brainstem response,ABR)测定,观察ABR各波潜伏期、Ⅰ—Ⅲ波间期和Ⅲ波阈值。结果正常组、假手术组术前、术后ABR阈值无显着变化;缺血再灌注组再灌注6小时、24小时后ABR闽值显着升高(P<0.05),24小时达到高峰,48小时ABR阈值有所恢复,但未恢复正常。结论通过暂时性微动脉夹夹闭双侧椎动脉及右侧颈总动脉,夹闭1小时制造缺血模型,松开三条动脉制造再灌注模型。可致耳蜗损伤,表现为听功能下降,在再灌注后6h、24h、48h,以24h听阈最高,即耳蜗损伤最为严重。第二部分PPTA对耳蜗缺血再灌注损伤的听力保护作用及耳蜗组织扫描电镜和透射电镜观察目的探讨盐酸椒苯酮胺(PPTA)对豚鼠耳蜗缺血再灌注损伤后听功能及耳蜗形态的影响。方法采用前述的缺血再灌注模型,将32只豚鼠随机分为4组,每组8只,每组4只用于扫描电镜观察,剩余4只用于透射电镜观察。分为正常组,假手术组,缺血再灌注对照组,缺血再灌注+盐酸椒苯酮胺组。缺血再灌注+盐酸椒苯酮胺组再灌注后立即经股静脉注射盐酸椒苯酮胺,缺血再灌注对照组以等量生理盐水代替椒苯酮胺注射。测量实验前后各组的听性脑干反应(ABR)波Ⅲ反应阈的变化。24小时迅速断头取听泡,,在扫描电镜、透射电镜下观察耳蜗结构。结果1、正常组、假手术组实验前后ABR波Ⅲ反应阈值无显着变化(P>0.05),缺血再灌注对照组,造模成功后ABR波Ⅲ显着升高(P<0.05),缺血再灌注+盐酸椒苯酮胺组,造模成功后ABR波Ⅲ升高,但低于缺血再灌注对照组(P<0.05)。2、扫描电镜下观察耳蜗组织的形态学变化:正常组及空白对照组豚鼠耳蜗基底膜居外侧3排外毛细胞,1排内毛细胞呈刷状,排列整齐,内、外毛细胞纤毛排列整齐,无缺失、倒伏。缺血再灌注对照组外毛细胞肿胀、缺失,纤毛排列紊乱、倒伏,部分缺失。缺血再灌注+盐酸椒苯酮胺组少量外毛细胞有纤毛倒伏。3、透射电镜下观察:正常组及空白对照组耳蜗毛细胞细胞核圆、核染色质分布均匀,线粒体形态正常,分布均匀,毛细胞突触结构清晰。螺旋神经节神经元未见明显脱髓鞘改变,血管纹内皮细胞核呈梭形;IR组耳蜗毛细胞核边界不清,可见固缩、边集现象,突触结构消失。螺旋神经节可见大量脱髓鞘改变。血管纹内皮细胞核可见固缩、边集现象,呈现充血改变;缺血再灌注+盐酸椒苯酮胺组毛细胞核边界清楚,核染色质分布均匀,线粒体形态分布均匀,无明显肿胀,突触结构尚清晰。螺旋神经节可见少量脱髓鞘变。血管纹内皮细胞核膜完整,无固缩、边集现象。结论PPTA对豚鼠耳蜗的缺血再灌注听力损伤有保护作用,并且可以防止耳蜗缺血再灌注损伤后毛细胞的损伤缺失。第三部分盐酸椒苯酮胺对缺血再灌注后IL-1β和TNF-α的mRNA表达的影响目的1.探讨耳蜗炎性反应与缺血再灌注损伤的关系。2.探讨缺血再灌注后豚鼠耳蜗IL-1β和TNF-α的mRNA的表达与炎性反应的关系。3.探讨PPTA对豚鼠耳蜗缺血再灌注损伤的保护作用机制。方法采用前述的缺血再灌注模型,将24只豚鼠随机分为4组,每组6只,分别为正常组、假手术组、缺血再灌注对照组和缺血再灌注PPTA组。缺血再灌注PPTA组于缺血1小时再灌注后立即经股静脉注射盐酸椒苯酮胺(10mg/kg),缺血再灌注对照组以等量生理盐水代替椒苯酮胺注射,24小时后取标本。用RT-PCR法检测IL-1β和TNF-α的mRNA的表达。用SPSS13.0软件对实验数据进行方差分析,若满足方差齐性,用LSD检验比较组间差异,若不满足方差齐性,用Dunnett’sT3比较组间差异,P<0.05为有统计学意义。结果缺血再灌注对照组耳蜗组织IL-1βmRNA表达量显着高于正常组和假手术组(P<0.001);缺血再灌注PPTA保护组耳蜗组织IL-1βmRNA表达量显着低于缺血再灌注对照组(P<0.001);缺血再灌注PPTA保护组耳蜗组织IL-1βmRNA表达量与正常组差异无统计学意义(P=0.056>0.05)。缺血再灌注对照组耳蜗组织TNF-α mRNA表达量显着高于正常组和假手术组(P<0.001);缺血再灌注PPTA保护组耳蜗组织TNF-α mRNA表达量显着低于缺血再灌注对照组(P<0.001);缺血再灌注PPTA保护组耳蜗组织TNF-α mRNA表达量高于正常组(P=0.009<0.05)。结论1. PPTA具有拮抗耳蜗组织缺血再灌注损伤作用2. PPTA可能通过抑制炎性反应实现对耳蜗缺血再灌注损伤的拮抗作用第四部分PPTA对豚鼠耳蜗缺血再灌注损伤后细胞凋亡和Fas蛋白、caspase-1的mRNA表达的影响目的:1.观察缺血再灌注损伤后豚鼠耳蜗细胞凋亡的情况。2.对缺血再灌注损伤后豚鼠耳蜗Fas蛋白、caspase-1的mRNA的表达与细胞凋亡间的关系进行分析。3.探讨PPTA对豚鼠缺血再灌注损伤后凋亡细胞的保护作用。方法:采用前述的缺血再灌注模型,将48只豚鼠随机分为4组,每组12只,分别为正常组、假手术组、缺血再灌注组对照组、缺血再灌注PPTA组(缺血60min行再灌注后立即经股静脉注射10mg/kg盐酸椒苯酮胺),缺血再灌注对照组以等量生理盐水代替椒苯酮胺注射,24小时后取标本。用免疫组织化学法(SP)观察Fas蛋白的表达和分布,并用Motic图象分析系统分析单位面积下阳性细胞的积分光密度(IOD);用TUNEL法观察细胞凋亡的情况;用RT-PCR法检测caspase-1的mRNA的表达,并比较PPTA干预前后的变化。运用SPSS13.0统计软件对实验数据进行方差分析,用LSD检验比较组间差异,P<0.05为有统计学意义。结果:免疫组织化学染色见正常组、假手术组和缺血再灌注PPTA组耳蜗血管纹、螺旋神经节、Corti器Fas表达为弱阳性,缺血再灌注组表达显着增强。IOD值显示正常组、假手术组、缺血再灌注PPTA组之间差异无统计学意义(P>0.05),缺血再灌注组较其他三组显着增强(P<0.05)。TUNEL法显示正常组、假手术组和缺血再灌注PPTA组耳蜗各部位没有或仅有个别部位出现细胞凋亡,缺血及再灌注对照组耳蜗凋亡细胞明显增多,PPTA干预后凋亡细胞显着减少。缺血再灌注组耳蜗组织Caspase-1mRNA表达量显着高于正常组、假手术组和缺血再灌注PPTA组(P<0.001);缺血再灌注PPTA组耳蜗组织Caspase-1mRNA表达量显着高于正常组(P<0.001);正常组和假手术组耳蜗组织Caspase-1mRNA表达量差异无统计学意义(P=0.825)。结论:通过豚鼠耳蜗缺血再灌注损伤模型PPTA及对照试验。正常组豚鼠耳蜗各部位Fas为弱阳性表达,无或罕有凋亡细胞。缺血再灌注组Fas表达增强,凋亡细胞增多,进行干预后使凋亡细胞显着减少。缺血再灌注耳蜗组织Caspase-1mRNA的表达显着增高,PPTA可部分但有效地降低Caspase-1mRNA的表达。提示细胞凋亡是耳蜗缺血再灌组损伤的一种细胞损伤形式,PPTA可能通过抑制Fas蛋白及Caspase-1mRNA的表达,通过减少细胞凋亡而对缺血再灌注损伤后的耳蜗起保护作用。

吴彩琴[5](2012)在《内淋巴积水豚鼠前庭器的形态变化及外膜半规管力学建模与分析》文中研究指明人和哺乳动物的内耳由骨迷路和膜迷路两套复杂管道组成,其中膜迷路内充满内淋巴液,并含有位觉感受器(前庭器)和听觉感受器(耳蜗)。前庭器由三个半规管、椭圆囊和球囊组成,感受自身运动状态及头部在空间位置,并与身体的平衡调节有关。半规管是头部角加速度感受器,机械刺激是前庭器感知头部位置变化的始动因素。内淋巴积水(endolymphatic hydrops, EH)是由于各种原因导致内淋巴产生过多或吸收障碍引起的内耳膜迷路内淋巴液增多,又称膜迷路积水。梅尼埃病(Meniere’s disease, MD)是一种特发性膜迷路积水综合征,临床表现为反复发作性眩晕,感音神经性听力下降,耳鸣和耳胀闷感。一般认为其病因和发病机制与EH密切相关。EH可引起蜗管、球囊、椭圆囊的膨胀。蜗管的膨胀可能改变基底膜振动的行波方式,影响MD患者的听力,而半规管、椭圆囊的膨胀是否影响膜半规管内淋巴液与壶腹帽的相互作用,导致MD患者产生前庭症状,尚未见文献报道。本研究在光镜和电镜下观察正常和EH对豚鼠前庭终器的形态学影响,发现豚鼠外膜半规管壶腹嵴毛细胞纤毛束(hair cell bundles, HBC)的损伤存在明显的区域差别,外半规管壶腹嵴嵴顶和椭圆囊斑微纹处的HBC损伤最为严重。在Micro-CT图像清晰显示前庭器膜性壁的基础上进行三维(three-dimensional,3D)重建,观察豚鼠前庭器结构的形态、空间位置及相互毗邻关系;测量外膜半规管和椭圆囊在垂直于流体流动方向横断面的管径,结果显示外膜半规管横断面为椭圆形,其长径和短径之比恒定;椭圆囊和壶腹长径与短径之比明显大于外膜半规管。EH豚鼠椭圆囊和外膜壶腹的管径明显增大,而外膜半规管管径无明显改变,该模型为研究内淋巴液在外膜半规管和椭圆囊的流动特征、内淋巴液与壶腹嵴的相互作用提供了形态几何参数。借助逆向工程软件Geomagic Studio对MIMICS重建输出的3D表面模型进行去除毛噪、修补和曲面优化等处理,分别建立前庭膜迷路、外膜半规管和椭圆囊的三维几何模型。根据外膜半规管和椭圆囊各部分的管径测量结果,建立正常和EH豚鼠外膜半规管和椭圆囊二维(two-dimensional,2D)有限元模型,分析正常和EH豚鼠头部旋转过程中内淋巴液与壶腹帽的流固耦合作用,结果显示由于内淋巴液的惯性作用而滞后于半规管的运动而引起壶腹帽的变形,产生的位移和剪切应变有所不同。提示壶腹帽剪切应变可能是带动壶腹嵴毛细胞纤毛偏转的主要因素,EH豚鼠椭圆囊和半规管壶腹的膨大导致壶腹帽剪切应变的增加或振幅增大,可能是EH豚鼠壶腹嵴嵴顶HBC损伤的重要原因之一本研究探讨EH对豚鼠前庭器形态和功能的影响,利用外膜半规管2D有限元模型,模拟EH豚鼠在头部水平旋转运动过程中,内淋巴液和壶腹帽的流固耦合作用,分析外膜半规管壶腹嵴HBC受损的力学因素。EH后豚鼠球囊、椭圆囊和膜壶腹存在不同程度的膨胀,而膜半规管未见明显改变。EH对豚鼠外半规管壶腹嵴HBC的损伤在嵴顶最为明显。壶腹帽的最大剪切应变集中在壶腹嵴嵴顶附近,EH时明显增加。EH时椭圆囊和壶腹的膨胀,影响了内淋巴液对壶腹帽的作用,壶腹嵴嵴顶附近壶腹帽的剪切应变的增大或振幅增加,可能导致此处HBC的损伤。上述研究结果有助于理解EH发生发展过程中前庭器损伤的力学因素,加深对前庭的病理生理过程的认识。

李朝军,刘兆华,朱佩芳,王正国,杨成,陈海斌,周继红,宁心[6](2006)在《豚鼠冲击波负压暴露后耳蜗毛细胞扫描电镜和透射电镜观察》文中认为目的探讨冲击波负压(BUP)暴露后豚鼠耳蜗毛细胞的超微结构变化特点。方法将豚鼠暴露于不同强度的实验性BUP 1次,8h7d后应用扫描电镜和透射电镜技术观察耳蜗基底膜毛细胞的超微结构变化。结果负压峰值为-22.4-63.3kPa的BUP暴露后,豚鼠耳蜗毛细胞的超微结构变化发生了不同程度的病理性改变,主要表现为第2、3排外毛细胞散在性缺失,甚至节段性外毛细胞缺失、纤毛融合甚至巨纤毛形成及胞浆溢出,纤毛内微丝解聚、线粒体肿胀、溶酶体数量增多和胞浆内空泡形成。结论不同强度的BUP暴露可导致豚鼠耳蜗毛细胞的超微结构病变,且BUP强度越高,病变越重。

陈浩,谢民强,吴剑,李威,李永贺[7](2014)在《盐酸椒苯酮胺通过降低caspase-3表达减轻庆大霉素豚鼠耳蜗损伤》文中提出目的研究盐酸椒苯酮胺(PPTA)对庆大霉素耳蜗损伤的保护作用及抗凋亡机制。方法听力正常豚鼠分3组:正常组、GM组和PPTA组。采用庆大霉素致豚鼠耳蜗损伤模型,PPTA腹腔注射,ABR分析听力变化,Western blot检测耳蜗组织中caspase-3蛋白表达,TUNEL染色、扫描电镜和透射电镜观察形态学改变。结果 ABR反应阈:GM组、PPTA组显着高于正常对照组(P<0.05),PPTA组显着低于GM组;Western blot测caspase-3的表达:结果表明用药后GM组豚鼠caspase-3表达显着增加(P<0.001),PPTA组显着高于正常组但显着低于GM组(P<0.001);TUNEL、扫描和透射电镜观察见:GM组毛细胞损伤严重,耳蜗螺旋器、血管纹和螺旋神经节存在大量凋亡细胞形态;而PPTA组耳蜗组织损伤较GM组明显减轻。结论 PPTA可以通过降低caspase-3蛋白表达抑制凋亡,对庆大霉素豚鼠耳蜗损伤起到保护作用。

韩浩伦,吴玮,王鸿南,王刚,屈昌北,丁瑞英,薄少军,李保卫[8](2012)在《头低位模拟失重状态对豚鼠耳蜗听功能与超微结构的影响》文中认为目的探讨头低位模拟失重对豚鼠耳蜗听功能与超微结构的影响。方法 22只豚鼠随机分为实验组16只和对照组6只。实验组采用头低位模拟失重法,身体纵轴与水平线呈-30°,于实验前、失重5天后即刻及脱离失重3天后分别测试豚鼠听性脑干反应(ABR),然后取耳蜗行扫描电镜和透射电镜观察。对照组不作任何处理。结果对照组豚鼠ABR反应阈为23.48±6.04dB SPL,实验组实验前为24.22±4.04,模拟失重5天后即刻ABR反应阈为41.61±7.01dB SPL,与实验前和对照组比较差异有显着统计学意义(P<0.05);脱离失重3天后实验组ABR反应阈为27.50±3.54dB SPL,与实验前相比差异无显着统计学意义(P>0.05)。扫描电镜观察发现失重5天后即刻豚鼠耳蜗内、外毛细胞散在缺失,纤毛融合、倒伏;透射电镜检查见内、外毛细胞细胞局部空泡形成,脱离失重3天后上述病变均有明显恢复,但未完全恢复正常。结论模拟失重5天即可以导致豚鼠耳蜗听觉功能和超微结构的损伤,脱离失重3天后听功能可以恢复正常,但其超微结构还没有完全恢复正常。

陈浩[9](2013)在《盐酸椒苯酮胺对庆大霉素豚鼠耳蜗损伤保护作用及机制》文中研究表明听力障碍是一类常见疾病,严重影响着人类的身体健康和生活质量,据世界卫生组织(WHO)估计,全世界有轻度听力损失的人近6亿,2.5亿人患有中度以上听力损失,其中三分之二在发展中国家。而每出生700—1000个新生儿中,就有一个听障患儿。中国是世界上最大的发展中国家,13亿人口中听力障碍残疾人就有2780万,为各类残疾之首。能否找到有效的方法预防和治疗听力障碍,是我们共同面临的巨大挑战。听力障碍分传导性、感音神经性和混合性,绝大部分为感音神经性。感音神经性聋是耳鼻咽喉头颈外科学中常见病,是内耳及其神经传导通路一系列病变所致听力损失的总称,发病原因有遗传性、缺血性、耳毒性、感染性、老年性、噪声性、创伤性、代谢性、自身免疫、突发或特发性、中枢性、听神经病、肿瘤、功能性等,其中以缺血、病毒感染、耳毒性药物中毒及老年性退行性变等最常见。病理改变主要是耳蜗毛细胞损伤、螺旋神经节、支持细胞及神经末梢的器质性改变以及耳蜗神经、脑干听觉通路及听觉中枢病变或受损。耳蜗内包含两种类型感觉细胞:内毛细胞(IHC)和外毛细胞(OHC),它们负责将声音转化为电信号进行传递,这些信号经过螺旋神经节神经元(SGC)换元传递到听觉脑干通路。而这些IHC、OHC和SGC都缺乏再生的能力,因此,耳蜗的任何损伤都会导致不可逆的听力损失。在耳蜗损伤所导致的听力障碍里,耳毒性药物所致损伤是当前临床治疗上的难题,众多研究围绕其发病机制及治疗展开,希望可以为临床治疗耳毒性药物损伤提供更好的方法。关于药物性损伤的机制,目前多认为与自由基损伤、钙离子超载等有关[2],其中氨基糖苷类所致的耳毒性感音神经性聋属于临床中常见的类型。氨基糖苷类抗生素(Aminglycosides, AmAn)具有抗菌谱广、杀菌抑菌作用强、价格便宜等许多适用于临床使用的优点,但因其具有耳毒性、肾毒性等严重的不良反应,限制了临床应用,在短期应用AmAn治疗的病例中,耳毒性发生率为20%,而在治疗结核及其他严重细菌(尤其是革兰阴性细菌)感染的长期应用中,耳毒性发生率可高达80%[3]。近年来由于结核和其他新的感染性疾病如抗艾滋病的发生率增高,使AmAn又有新的应用。有研究表明AmAn可与HIV中的RNA的逆转录病毒蛋白应答因子(RRE)结构域结合,使HIV的RRE. Rev(逆转录病毒蛋白)相互作用产生抑制,从而具有阻遏HIV复制的活性[4],使得AmAn的很多应用不可替代。属于氨基糖苷类抗生素的庆大霉素(gentamicin, GM)是由绛红小单孢菌、棘孢小单孢菌等发酵产生的一种杀菌力较强的广谱抗菌素,目前被广泛用于临床。GM由于廉价抗菌谱广,在临床广泛应用,以至出现了不少致感音神经性聋的病例。同时,因GM的肝肾毒性较其他AmAn小,使其成为是实验研究中制造感音神经性聋动物模型的理想药物。GM在机体内的药理学分布特点是不易进入胞内,不易透入关节腔,也不易透过血脑屏障,其主要集中在细胞外液,特别是内耳淋巴液。庆大霉素的内耳淋巴液的蓄积[7]构成了其耳毒性的生理基础,机制较为复杂,一直是国内外众多学者研究的热点。目前认为内耳毛细胞受损与氧有自由基、钙超载和启动凋亡等相关。氧自由基主要通过一系列的过氧化反应造成组织细胞的损伤,往往损害细胞膜磷脂分子中不饱和脂肪酸的过氧化,最终使生物膜受到严重损伤。郭玉芬等证实聚天冬氨酸酶对庆大霉素致耳蜗组织氧自由基的产生有抑制作用,从而拮抗了庆大霉素所致耳蜗毒性的发生。McFadden等已证实一种超氧化物歧化酶的类似物,可防止由庆大霉素引起的毛细胞损伤。氧自由基和钙超载除直接造成细胞损伤外还可导致细胞的凋亡[11]。也有学者证明,细胞凋亡是氨基糖苷类抗生素致聋的主要方式,细胞凋亡的“瀑布式”级联反应主要有两条途径:①细胞外途径,即死亡受体途径。②细胞内途径,研究比较多的是线粒体途径。但两种途径最终都依赖于Caspase-3的活化,caspase-3在凋亡级联反应中处于核心地位,是凋亡的最终执行者。Shimizu等通过研究发现凋亡抑制剂—钙蛋白酶和半胱天冬酶抑制剂可以阻止AmAn耳毒性的产生,促进前庭毛细胞的存活,表明凋亡与AmAn前庭耳毒性有着紧密关系。目前临床上仍然缺乏治愈感音神经性听力障碍和保护听觉功能的有效的方法。虽然近年来一些研究报道了哺乳动物甚至人的内耳前庭及耳蜗毛细胞在受伤后可能再生,但哺乳动物OHC、IHC和SGC再生的在体试验尚未取得成功。有研究提出耳聋基因概念,认为耳聋与线粒体DNA突变有关,发现tRNAIleA4317G同质性突变,确认A1555G和C1494T突变与感音神经性耳聋和氨基糖甙类耳聋有关。上述研究停留在实验阶段,尚未展开临床应用。感音神经性耳聋多数治疗效果不佳,大多数药物治疗无效的患者只能选择配戴助听器或行人工耳蜗植入术。当前人工耳蜗植入术可以赝复重度的感音神经性耳聋,但价格昂贵。所以,探索对各种因素导致内耳损伤的早期干预和有效治疗药物就显得尤为重要。由中国医学科学院药物研究所自主创新研制的化合物盐酸椒苯酮胺(peperphentonamine hydrochloride,PPTA),3个发明专利已获授权,2个国内和1个国际PCT发明专利己申请。2008年获11类化学药品临床试验批件并已完成127例Ⅰ期临床试验。临床前研究提示其具有清除再灌注损伤时自由基,抑制脂质过氧化反应的作用。徐江平研究PPTA对脑细胞受损所产生的氧自由基具有清除作用,可增加SOD活力和GSH含量。也有实验表明PPTA有抗钙超载的作用,对心肌损伤线粒体有明显的保护作用。PPTA也可使线粒体膜流动性保持正常,明显减轻线粒体的超微结构损伤。而氧自由基和钙超载往往导致机体大多数组织和细胞损伤,而线粒体的损伤又可活化Caspase-3启动细胞凋亡。有研究表明PPTA具有显着降低Caspase-3mRNA的表达,表现出良好的抗调亡作用。这为PPTA用于感音神经性耳聋的干预和治疗奠定了基础。本研究以庆大霉素的耳毒性制造耳蜗损伤豚鼠作为实验动物,采用鼓阶开窗微孔注入技术和腹腔注射方法,观察PPTA对耳蜗的保护作用,通过听性脑干反应(ABR)、免疫组化(IHC)、脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记技术(ternial-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeing, TUNEL)、蛋白质免疫印迹技术(Western blot)、扫描电镜(SEM)等方法,透射电镜(TEM)等方法检测ABR RT、PL、T-SOD、GSH、Caspase-3等指标及凋亡和坏死等形态学变化,探讨GM的耳毒性机理及PPTA对耳蜗损伤的保护机制,为感音神经性聋药物治疗提供新的实验依据。本研究分为以下三个部分:第一部分庆大霉素致豚鼠耳蜗损伤模型和鼓阶开窗微孔注入技术的建立目的建立庆大霉素制造豚鼠的耳蜗损伤模型和鼓阶开窗微孔注入技术,探讨在模型豚鼠上ABR的应用及听力学特征,并研究经鼓阶开窗手术对听力和耳蜗组织的影响。方法听力正常实验级豚鼠30只,随机分为三组:A组(Control group):10只,生理盐水,等量,每日称重,按体重计算用量,肌注,28d;B组(GM group):10只,硫酸庆大霉素注射液,120mg/(kg-d),每日称重,按体重计算用量,肌注,28d。C组(Fenestration group):10只,左耳行鼓阶开窗微孔注入手术,注入人工外淋巴液,正常饲养7d。A、B两组GM前1h及第28天测ABR;A、C两组术前及术后7d测ABR。数据以X±S表示,采用SPSS13.0软件包进行统计学分析。对实验前后数据进行协方差分析,若实验前ABR反应阈对试验后ABR无影响,则用独立样本t-test检验两组前后差异,用配对样本t-test检验同一组前后差异。结束后将A,B,C组豚鼠断头取听泡,行扫描电镜(SEM)形态学观察、免疫组化(IHC)细胞染色观察。结果用药28天后,GM组比正常组ABR RT显着升高(t=18.108,P<0.001);经鼓阶开窗微孔注入术7天后,C组和正常组ABR RT无显着差异(t=0.000, P=1.000)。IHC及SEM观察见GM组毛细胞纤毛倒伏、断裂、细胞缺失,细胞核出现固缩、棕染等,A组及C组未见这些现象。结论庆大霉素可以建立稳定的感音神经性聋动物模型;庆大霉素耳毒性体现在RT提高,耳蜗OHC、IHC、SGC、SV细胞坏死及凋亡;通过豚鼠耳蜗鼓阶钻孔开窗,微孔注入手术后对豚鼠听力及耳蜗组织没有产生明显影响。第二部分鼓阶微孔注入PPTA对庆大霉素豚鼠耳蜗损伤的保护作用及相关机制研究目的将PPTA经鼓阶开窗微孔注入技术注入豚鼠耳蜗,研究其对庆大霉素耳毒性的拮抗作用及氧自由基机制。方法听力正常豚鼠45只,分为三组:A组(Control group)15只,以等量生理盐水肌肉注射,连续3d;B组(GM group)15只,以GM160mg/kg.d,肌肉注射,连续3d;C组(PPTA+GM group)15只,以GM160mg/kg.,3d,每日GM1小时前,行双侧鼓阶开窗微孔技术注入PPTA (浓度2mg/ml)10μl。(注:每组都以10只做统计学分析,额外为扫描电镜做形态学观察用)。三组动物分别在用药前,第3天用药后测ABR。在最后一次测ABR每组取10只迅速断头取听泡取左侧耳蜗(n=10)行T-SOD活力检测,取右侧耳蜗(n=10)行GSH含量检测;各组ABR RT、T-SOD、GSH统计使用SPSS13.0分析软件,数据以X±S表示,用协方差分析处理数据,若实验前ABR反应阈对实验后无影响,对试验后数据进行单因素方差分析。每组剩余5只豚鼠耳蜗行扫描电镜(SEM)形态学观察。结果用药3d后,GM组ABR RT显着高于正常组(P<0.05),GM组T-SOD活力、GSH含量显着显着低于GM+PPTA组(P<0.05);经鼓阶开窗微孔技术注入PPTA3d后,PPTA+GM组ABR RT明显高于Control组(P<0.05),但显着低于GM组(P<0.05)。PPTA+GM组比GM组及正常组T-SOD活力、GSH含量显着低于正常组(P<0.05),但显着高于GM组(P<0.05)。SEM观察见:GM后毛细胞纤毛倒伏、断裂、细胞缺失等,PPTA+GM组亦有此现象,但较GM组轻微,正常组未见这些现象。结论促耳蜗组织内产生过量OFR造成耳蜗组织细胞损伤,是GM耳毒性的一个重要原因。经鼓阶开窗微孔技术注入PPTA可拮抗GM所致听力和耳蜗组织损伤;PPTA可以通过清除耳蜗组织内氧自由基和增强抗氧化能力从而发挥耳蜗保护作用。第三部分腹腔注入PPTA对庆大霉素豚鼠耳毒性拮抗作用及对耳蜗组织Caspase-3表达的影响目的研究PPTA全身给药对庆大霉素耳毒性的拮抗作用及相关机制。方法听力正常豚鼠45只,分为三组:A组(Control group)15只,以等量生理盐水肌肉注射,连续14d;B组(GM group)15只,GM120mg/kg.d,肌肉注射,连续14d;C组(PPTA+GM group)15只,PPTA10mg/kg.d腹腔注射+GM120mg/kg.d (1h后),肌注,连续14d。三组动物在用药前1h,第14天用药后测ABR。在最后一次测ABR后所有动物迅速断头取听泡,以左侧耳蜗(n=10)行Western blot检测Caspase-3表达,统计使用SPSS13.0分析软件,数据以X±S表示,用协方差分析处理数据,若实验前ABR反应阈对实验后无影响,对试验后数据进行单因素方差分析。以右侧耳蜗行TUNEL染色,每组剩余5只一侧耳做扫描电镜另一侧耳做透射电镜观察。结果GM组、PPTA+GM组ABR RT显着高于Control组(P<0.05), PPTA+GM组ABR RT显着低于GM组;Western blot结果表明用药后GM组豚鼠caspase-3表达显着增加(P<0.001); PPTA+GM组caspase-3的表达显着高于Control组但显着低于GM组(P<0.001)。SEM/TEM和TUNEL观察见:GM组毛细胞损伤严重,耳蜗Corti器、侧壁的血管纹和螺旋神经节存在阳性细胞,出现了凋亡和坏死的形态学特征;而PPTA+GM组损伤较GM组明显减轻;Control组未见阳性细胞。而结论庆大霉素耳毒性所致耳蜗组织损伤中,凋亡与坏死并存,GM通过caspase-3途径参与了耳蜗细胞凋亡;PPTA具有拮抗GM耳毒性所致的耳蜗功能和结构损伤的作用;PPTA通过降低caspase-3蛋白表达,抑制凋亡,从而对豚鼠耳蜗组织起到保护作用。

陈浩,谢民强,吴剑,李威,李永贺[10](2014)在《鼓阶微孔注入盐酸椒苯酮胺对豚鼠庆大霉素耳蜗损伤的保护作用》文中研究表明目的观察盐酸椒苯酮胺(peperphentonamine hydrochloride,PPTA)对豚鼠庆大霉素(gentamicin,GM)耳蜗损伤的保护作用及机制。方法将听力正常的45只健康豚鼠随机分为空白对照组、GM组和PPTA组,每组15只。空白对照组行鼓阶开窗微孔注入人工外淋巴液10μl/d,连用3天;GM组给GM 160mg·kg-1·d-1肌肉注射,连用3天;PPTA组行鼓阶开窗微孔技术注入PPTA 10μl/d和肌肉注射GM 160mg·kg-1·d-1注,连用3天。分别于用药前和用药3天后对三组动物行听性脑干反应(auditory brainstem response,ABR)测试;第二次ABR测试后处死豚鼠,取出耳蜗,检测各组豚鼠耳蜗组织中过氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量,并以扫描电镜和透射电镜观察耳蜗细胞形态学改变。结果空白对照组、GM组、PPTA组ABR反应阈实验前比较差异无统计学意义,用药三天后分别为12.75±3.80、47.75±11.08、23.47±9.21dB SPL,各组间比较差异有统计学意义(P<0.001);空白对照组、GM组、PPTA组SOD值比值分别为50.24±9.08、28.23±4.95、43.09±4.59U/mgprot,PPTA组SOD值显着高于GM组(P<0.001);空白对照组、GM组、PPTA组GSH值分别为3.03±0.33、1.51±0.13、2.50±0.16Ggsh/L,PPTA组GSH值显着高于GM组(P<0.001);扫描电镜观察PTTA组耳蜗各回外毛细胞肿胀、倒伏、缺失等较GM组轻,内毛细胞正常,而GM组内毛细胞亦有轻微损伤;透射电镜观察PPTA组耳蜗毛细胞肿胀、线粒体体聚集等改变明显轻于GM组。结论经鼓阶开窗微孔技术注入PPTA可通过清除GM产生的过量氧自由基从而发挥耳蜗保护作用。

二、扫描电镜和透射电镜对豚鼠耳蜗的联合观察(论文开题报告)

(1)论文研究背景及目的

此处内容要求:

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例:

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

(2)本文研究方法

调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、扫描电镜和透射电镜对豚鼠耳蜗的联合观察(论文提纲范文)

(1)内耳病理学研究技术的进展(论文提纲范文)

1 病理学与内耳病理学
2 内耳切片技术的发展
3 内耳膜迷路取材铺片技术的发展
4 内耳组织化学技术的发展
5 内耳样品电镜技术的发展
6 内耳电镜细胞化学技术的发展

(2)盐酸椒苯酮胺对豚鼠耳蜗缺血再灌注损伤的听力保护作用(论文提纲范文)

1 材料与方法
    1.1 实验动物及分组
    1.2 实验方法
        1.2.1 建立右侧耳蜗缺血再灌注动物模型
        1.2.2 ABR检测
        1.2.3 耳蜗扫描电镜标本及透射电镜标本制备
    1.3 统计学方法
2 结果
    2.1 实验前后各组豚鼠的ABR反应阈比较
    2.2 耳蜗组织扫描电镜观察
    2.3 耳蜗组织透射电镜观察
3 讨论

(4)盐酸椒苯酮胺抗豚鼠耳蜗缺血—再灌注损伤作用及其机制(论文提纲范文)

摘要
ABSTRACT
第一部分 豚鼠耳蜗缺血再灌注模型的建立及ABR应用
    1.1 实验材料
    1.2 实验方法
    1.3 结果
    1.4 讨论
    1.5 结论
    参考文献
第二部分 PPTA对耳蜗缺血再灌注损伤的听力保护作用及耳蜗组织扫描电镜和透射电镜观察
    2.1 实验材料
    2.2 实验方法
    2.3 结果
    2.4 讨论
    2.5 结论
    参考文献
第三部分 PPTA对耳蜗缺血再灌注后IL-1β和TNF-α mRNA表达的影响
    3.1 实验材料
    3.2 实验方法
    3.3 结果
    3.4 讨论
    3.5 结论
    参考文献
第四部分 PPTA对缺血再灌注损伤后豚鼠耳蜗细胞凋亡和Fas蛋白、caspase-1 mRNA表达的影响
    4.1 实验材料
    4.2 实验方法
    4.3 实验结果
    4.4 讨论
    4.5 结论
    参考文献
全文结论
缩略词表
综述
    参考文献
博士在读期间的论文发表
致谢
统计合格证明

(5)内淋巴积水豚鼠前庭器的形态变化及外膜半规管力学建模与分析(论文提纲范文)

目录
图表索引
主要词表
中文摘要
Abstract
第一章 引言
    1.1 研究背景
    1.2 前庭器结构及功能概述
    1.3 内淋巴循环及其障碍
    1.4 前庭器的生物力学研究
    1.5 问题的提出
第二章 正常豚鼠前庭器的形态学研究
    2.1 前言
    2.2 材料和方法
    2.3 结果
    2.4 讨论
    2.5 小结
第三章 内淋巴积水对前庭器形态及功能的影响
    3.1 前言
    3.2 材料和方法
        3.2.1 内淋巴积水豚鼠模型制备
        3.2.2 豚鼠耳蜗及前庭功能检测
        3.2.3 内淋巴积水豚鼠前庭器光镜和电镜标本制作及观察
        3.2.4 内淋巴积水豚鼠前庭器的Micro-CT成像观察及形态测量方法
        3.2.5 统计学处理
    3.3 结果
    3.4 讨论
    3.5 小结
第四章 豚鼠前庭器三维模型的转换和优化
    4.1 前言
    4.2 豚鼠前庭器三维模型的曲面优化
    4.3 豚鼠前庭器模型的验证
    4.4 讨论
    4.5 小结
第五章 豚鼠头部水平旋转运动时外膜半规管的数值模拟
    5.1 前言
    5.2 正常豚鼠外膜半规管内淋巴与壶腹帽相互作用分析
    5.3 内淋巴积水豚鼠外膜半规管内淋巴与壶腹帽相互作用分析
    5.4 讨论
    5.5 小结
全文结论
创新性
展望
全文参考文献
综述
    参考文献
在读期间参与的科研活动和发表论文
致谢

(6)豚鼠冲击波负压暴露后耳蜗毛细胞扫描电镜和透射电镜观察(论文提纲范文)

1 材料与方法
2 结 果
    2.1 BUP物理参数
    2.2 豚鼠ABR阈值
    2.3 耳蜗毛细胞扫描电镜观察
    2.4 耳蜗毛细胞透射电镜观察
3 讨 论

(7)盐酸椒苯酮胺通过降低caspase-3表达减轻庆大霉素豚鼠耳蜗损伤(论文提纲范文)

1 材料和方法
    1.1 材料
    1.2 方法
    1.3 统计学处理
2 结果
    2.1 ABR结果对照
    2.2 Western blot检测耳蜗组织caspase-3基因蛋白表达
    2.3 TUNEL染色组织切片观察(图1)
    2.4 扫描电镜结果
    2.5 透射电镜结果
3 讨论

(8)头低位模拟失重状态对豚鼠耳蜗听功能与超微结构的影响(论文提纲范文)

1 材料与方法
    1.1 实验动物及分组
    1.2 实验组头低位模拟失重方法
    1.3 ABR反应阈测试
    1.4 耳蜗超微结构观察
        1.4.1 扫描电镜 (scanning electron microscopy, SEM) 观察
        1.4.2 透射电镜 (transmission electron microscope, TEM) 观察
    1.5 统计学方法
2 结果
    2.1 ABR反应阈值
    2.2 扫描电镜观察结果
    2.3 透射电镜观察结果
3 讨论

(9)盐酸椒苯酮胺对庆大霉素豚鼠耳蜗损伤保护作用及机制(论文提纲范文)

摘要
ABSTRACT
参考文献
第一部分 庆大霉素致豚鼠耳蜗损伤模型和鼓阶开窗微孔注入技术的建立
    1.1 材料和方法
    1.2 结果
    1.3 讨论
    1.4 结论
    1.5 参考文献
第二部分 鼓阶微孔注入PPTA对庆大霉素豚鼠耳蜗损伤的保护作用及相关机制研究
    2.1 材料和方法
    2.2 结果
    2.3 讨论
    2.4 结论
    2.5 参考文献
第三部分 腹腔注入PPTA对庆大霉素豚鼠耳毒性拮抗作用及耳蜗组织Caspase-3表达的影响
    3.1 材料和方法
    3.2 结果
    3.3 讨论
    3.4 结论
    3.5 参考文献
全文结论
缩略词表
致谢
统计学认证

(10)鼓阶微孔注入盐酸椒苯酮胺对豚鼠庆大霉素耳蜗损伤的保护作用(论文提纲范文)

1 材料与方法
2 结果
3 讨论

四、扫描电镜和透射电镜对豚鼠耳蜗的联合观察(论文参考文献)

  • [1]内耳病理学研究技术的进展[J]. 丁大连,亓卫东,杨琨,李鹏,孙虹,Richard Salvi. 中国耳鼻咽喉颅底外科杂志, 2016(03)
  • [2]盐酸椒苯酮胺对豚鼠耳蜗缺血再灌注损伤的听力保护作用[J]. 李永贺,李威,陈浩,吴剑,万良财. 听力学及言语疾病杂志, 2013(06)
  • [3]扫描电镜和透射电镜对豚鼠耳蜗的联合观察[J]. 丁大连,范静平,龚忠萍,皇甫慕三. 临床耳鼻咽喉头颈外科杂志, 1992(01)
  • [4]盐酸椒苯酮胺抗豚鼠耳蜗缺血—再灌注损伤作用及其机制[D]. 李永贺. 南方医科大学, 2013(03)
  • [5]内淋巴积水豚鼠前庭器的形态变化及外膜半规管力学建模与分析[D]. 吴彩琴. 复旦大学, 2012(02)
  • [6]豚鼠冲击波负压暴露后耳蜗毛细胞扫描电镜和透射电镜观察[J]. 李朝军,刘兆华,朱佩芳,王正国,杨成,陈海斌,周继红,宁心. 重庆医学, 2006(16)
  • [7]盐酸椒苯酮胺通过降低caspase-3表达减轻庆大霉素豚鼠耳蜗损伤[J]. 陈浩,谢民强,吴剑,李威,李永贺. 南方医科大学学报, 2014(03)
  • [8]头低位模拟失重状态对豚鼠耳蜗听功能与超微结构的影响[J]. 韩浩伦,吴玮,王鸿南,王刚,屈昌北,丁瑞英,薄少军,李保卫. 听力学及言语疾病杂志, 2012(03)
  • [9]盐酸椒苯酮胺对庆大霉素豚鼠耳蜗损伤保护作用及机制[D]. 陈浩. 南方医科大学, 2013(03)
  • [10]鼓阶微孔注入盐酸椒苯酮胺对豚鼠庆大霉素耳蜗损伤的保护作用[J]. 陈浩,谢民强,吴剑,李威,李永贺. 听力学及言语疾病杂志, 2014(02)

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扫描电镜和透射电镜联合观察豚鼠耳蜗
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