一、新城疫病毒F48E9株F基因主要功能区的核苷酸序列分析（论文文献综述）
田健霞[1]（2021）在《嵌合鸡干扰素刺激因子12-2（ISG12-2）新城疫病毒载体疫苗免疫原性的初步评价》文中指出新城疫（Newcastle disease,ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）强毒株引起的严重威胁养禽业的传染病。干扰素（Interferons,IFNs）是宿主天然免疫的关键因子,NDV感染机体后,细胞的病原模式识别受体（PRRs）识别病原相关分子模式（PAMPs）后与线粒体外膜中的接头蛋白（MAVS）结合,激活TANK结合激酶1（TBK1）。由于鸡缺乏调节因子IRF3,TBK1进一步激活IFN调节因子IRF7。激活的IRF7移位到细胞核中与ISRE结合,诱导I型干扰素表达,通过JAK/STAT通路激活大量的ISGs表达,其中包括鸡源干扰素刺激基因12-2[Interferon-stimulated gene 12（2）,ISG12（2）],发挥抗病毒作用。本实验室前期研究发现,NDV感染鸡后能明显上调ISG12（2）的表达,体外实验证实ISG12（2）能抑制NDV的复制,同时IFNs能刺激鸡胚成纤维细胞（DF-1）表达ISG12（2）。同时,ISG12（2）也能促进干扰素及干扰素信号通路一系列分子的表达,表明ISG12（2）对IFN存在正向调节。基于此,推测表达ISG12（2）的NDV载体疫苗,能提高宿主对疫苗的免疫反应,增强疫苗免疫效果,提高对宿主的保护率。本研究首先通过将ISG12（2）嵌合到NDV弱毒载体LaSota上,然后通过本实验室熟练应用的NDV反向遗传操作系统,成功拯救获得ISG12（2）嵌合株,并验证了嵌合株既具有NDV活性,又能成功表达ISG12（2）蛋白,通过检测MDT,ICPI,感染6周龄低抗体鸡,实验结果表明,ISG12（2）嵌合株能显着降低病毒的致病性。最后用拯救的ISG12（2）嵌合株免疫6周龄低抗体鸡,HI抗体效价可以达到免疫保护线24以上,能起到免疫保护效果,免疫三周后用强毒株F48E9攻毒,鸡都能100%存活,体外排毒结果也显示ISG12（2）嵌合株能明显减短排毒时间,转录组结果表明ISG12（2）嵌合株不仅能激活体液免疫,还能激活细胞免疫,发挥更好的免疫保护效果。综上所述,ISG12（2）LaSota嵌合株能刺激机体产生更好的免疫保护效果,ISG12（2）具备作为分子佐剂的能力。本论文的主要研究内容和结果如下:1.ISG12（2）正向调控IFNs的机制探究为了初步探究ISG12（2）如何调节IFN及其通路相关因子的表达,首先构建既能表达ISG12（2）蛋白又能表达EGFP蛋白的质粒pCMV-ISG12（2）-EGFP。然后验证其功能,发现该质粒能抑制NDV的复制,并上调IFN及其通路相关因子的表达。为了提高转录组测序样本质量的可靠性,先将质粒转染于DF-1细胞中,36 h后通过流式分选出表达ISG12（2）蛋白的细胞,提取RNA,进行转录组测序分析。结果显示表达ISG12（2）后,相比不表达ISG12（2）的对照组,共有差异表达基因1327个,其中差异上调表达基因有709个,差异下调表达基因618个,并且KEGG通路富集分析发现,主要的富集通路有m TOR信号通路,TGF-β信号通路,Toll样受体信号通路,细胞因子相互作用信号通路和甲型流感通路等,这些通路都与免疫相关。挑选差异表达基因IFNGR1,IL1R2,IFNAR2,IFNAR1,GHR,CXCR1,CXCL12,CSF1,SMURF2,ACVR2A,SKP1,RPS6KB1进行q RT-PCR验证,检测结果与转录组测序结果相符,说明ISG12（2）的确参与免疫调节,具备激活天然免疫和增强适应性免疫的功能。2.ISG12（2）NDV嵌合株的拯救及生物学特性测定将ISG12（2）嵌合到LaSota病毒载体上拯救毒株。通过PCR、酶切、连接等分子克隆方法,在NDV LaSota原始株（r LaSota）和F蛋白裂解位点突变株（r LaSota/Fmut）的全基因组载体中插入ISG12（2）。在此基础上,借助实验室NDV反向遗传系统,成功拯救了r LaSota、r LaSota/Fmut、r LaSota-ISG12（2）、r LaSota-ISG12（2）/Fmut毒株。通过Western Blot和间接免疫荧光,验证了拯救的嵌合株既能高效表达ISG12（2）蛋白,又具有NDV活性。通过细胞因子检测、病毒增殖能力及致病性测定发现,表达ISG12（2）的嵌合株,相比未表达的NDV,在体内和体外均能更好地促进IFNs、IL-16、IL-18、IL-22等细胞因子的表达,抑制NDV的增殖,从而降低病毒的致病性。病理组织切片观察发现,嵌合了ISG12（2）的毒株感染鸡后,并未在脾脏、法氏囊等免疫器官中引起相关的炎症病理变化。3.嵌合ISG12（2）的LaSota毒株的免疫保护效果评估将成功拯救的毒株通过点眼滴鼻的接种方式,以105 EID50的接种剂量6周龄低抗体鸡,进行免疫-攻毒保护试验。NDV强毒株F48E9攻毒后,通过抗体效价的动态变化监测,4株拯救的病毒均能诱导鸡产生高抗体。通过病毒体外排泄、病毒载量、组织病理变化和存活率的检测发现,r LaSota-ISG12（2）拯救毒株能100%保护鸡群,明显减少病毒体外排泄,降低组织的病毒载量,且阻止NDV强毒株对各组织的病理损伤。进一步研究发现r LaSota-ISG12（2）组,相对r LaSota组,明显上调IFNα、IFNβ、IL-16、IL-18、IL-22等免疫相关因子的表达,并且这些细胞因子的上调,并不会导致脾脏等相关免疫组织的病理变化,避免了细胞因子风暴引起的不良反应。通过对免疫后鸡的脾脏进行转录组测序分析发现,嵌合ISG12（2）后的LaSota拯救毒株,免疫后能更好地激活鸡的体液免疫和细胞免疫,促使该弱毒株发挥更好的免疫保护作用。综上所述,本研究成功构建并拯救了表达ISG12（2）的NDV嵌合株。该嵌合株,借助ISG12（2）促进干扰素、白介素等细胞因子表达的功能,降低病毒的致病性,并且增强鸡的天然免疫和适应性免疫途径,更好地防控鸡不被NDV强毒株感染。这些研究结果,为以鸡源ISG12（2）为分子佐剂增强家禽疫苗的免疫原性,提高疫苗的保护效果,奠定了基础。
卢秀娴,张思远,梁昭平,林举攀,云骜,叶贺佳[2]（2020）在《鹅源新城疫病毒F基因和HN基因的克隆及序列分析》文中认为为了解近年鹅群中新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）的流行变异情况,试验于2018年从广东地区疑似患有新城疫病死鹅的病料中分离到1株NDV,对其进行了生物学毒力测定及致病性研究,并利用RT-PCR技术扩增该分离株F基因和HN基因全长片段,进行克隆与序列分析。结果表明:分离株GD299的生物学毒力指标鸡胚平均致死时间（MDT）、1日龄雏鸡脑内致死指数（ICPI）和6周龄静脉接种指数（IVPI）分别为58 h、1.56和2.2,F基因裂解位点为112R-R-Q-K-R-F117,GD299株为强毒株;F基因和HN基因核苷酸序列和氨基酸序列与参考毒株的同源性为82.9%～99.5%,属于基因群Ⅶ型,其中F基因属于Ⅶf亚型;与经典强毒株La Sota株、F48E9株氨基酸序列进行比较,F基因氨基酸序列出现多处位点变异。说明目前流行的NDV已发生一定变异。
姚舜禹[3]（2020）在《表达NDV蛋白的重组酵母构建及免疫效力评价》文中指出新城疫病毒（Newcastle Disease Virus,NDV）是1927年在英国纽卡斯尔首次出现的一种禽类病毒,主要伤害病禽的消化系统和呼吸系统,甚至导致死亡,是严重威胁全球家禽养殖业的病原之一。应用疫苗是防控新城疫病毒感染的有效手段,现有NDV疫苗所用毒株大多为上世纪50年代开发的毒株所构建,与目前导致新城疫疫情的毒株间已有较大的遗传差距,因此需要开发新的新城疫疫苗。本研究构建了锚定型表达包含NDV融合蛋白（fusion glycoprotein,F）与血凝素-神经氨酸酶蛋白（hemagglutinin-neuraminidase,HN）截短体蛋白的重组酿酒酵母菌株,研究了其表达特性,并通过对动物免疫初步评价了重组酵母菌株作为候选疫苗的免疫效力。主要结果如下:1.NDV F和HN基因的扩增与转录单位构建:根据抗原表位分析,并结合他人的研究成果,选择新城疫F基因第241位碱基至888位碱基以及HN基因的第25位碱基至528位碱基序列,应用生物信息学技术分析这部分片段的一,二,三级结构组成和特点,确定其氨基酸序列,等电点和亲疏水性等理化性质,构建系统进化树,并连接到酿酒酵母表达载体（POT）中,构建带有抗原表位的转录单位。2.NDV F与HN蛋白在酿酒酵母表面的表达及鉴定:采用Yeast Fab Assembly的技术,通过II型内切酶的识别位点与其切割位点不同的特点将转录单位与同源臂和Leu营养筛选标记串联,利用Li Ac转化法将其整合到ST1814-G酵母基因组。经营养缺陷型筛选、PCR基因型验证、Western Blot分析,免疫荧光鉴定,证实成功构建了NDV F与HN蛋白串联展示于酵母细胞表面的菌株,通过生长曲线检测,结合Western Blot灰度分析结果,证实重组蛋白在36小时表达量最高。与阴性对照组相比,外源蛋白F与HN的表达对宿主菌的酵母菌生长影响不大。3.重组酵母菌的免疫效果评价:构建HN蛋白的原核表达载体,并表达纯化HN原核蛋白,以其来检测动物实验鸡血清的Ig G含量,ELISA实验结果证明重组酵母免疫后的鸡血清中的Ig G含量明显高于喂食原始酵母菌（ST1814G）的阴性对照组,表明重组酵母有一定的免疫原性。综上所述,本研究构建的串联表达新城疫病毒F和HN蛋白的重组酿酒酵母菌株,动物免疫结果证实该菌株可诱导产生特异性抗体,表明重组菌具有免疫保护性,可作为NDV预防的潜在候选疫苗进行工业开发。
何颖[4]（2020）在《鸽Ⅰ型副粘病毒的全基因组测序及病原学特性分析》文中提出鸽Ⅰ型副粘病毒（Pigeon paramyxoviruses-1,PPMV-1）是新城疫病毒（Newcastle Disease Virus,NDV）中的基因VI型NDV,广泛分布于世界各地,引起鸟类和家禽感染,并主要引起鸽科鸟类感染发病。目前,针对对此类病原的监测报告和有关疫病的研究尚不充分,导致PPMV-1遗传进化信息和控制措施的缺乏,本文将从PPMV-1的致病机理、诊断方法、遗传多样性和病原学特性等方面进行研究。为了解PPMV-1在野鸽组织中的分布情况,阐明PPMV-1对野鸽的致病机理,本研究采用免疫组化IHC方法,针对2010～2016年间美国自然感染死亡的14只欧亚领鸽和3只岩鸽的48份福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本,进行PPMV-1病原检测和病理组织学研究。结果表明,PPMV-1在17只发病鸽子的多器官组织中均有分布,其中以肾脏、肝脏和脾脏组织阳性率最高,在欧亚领鸽和岩鸽3种脏器中病原阳性率分别为92.9%、92.9%、83.3%和66.7%、33.3%、66.7%。急性至亚急性间质性肾炎和坏死性胰腺炎是野鸽感染PPMV-1后最常见的组织学病变,在欧亚领鸽和岩鸽中样本阳性率分别为50.0%、66.7%和100%、100%;病原在宿主体内广泛分布,并造成多器官的组织学损伤,这些结果证明了PPMV-1对野鸽的潜在致病力和致死原因。为研发适用于FFPE和体液组织样本中PPMV-1诊断的NGS检测技术,对美国野鸽和中国广西养鸽场中PPMV-1流行毒株的遗传多样性进行监测,并为建立最新国际统一的NDV命名分类系统提供数据支持,本文采用第二代测序技术（Next Generation Sequencing,NGS）,对48份美国野鸽FFPE样本和18份广西肉鸽分离株尿囊液样本开展了PPMV-1的全基因组测序,同时比较NGS与和IHC、RT-PCR法的检测结果,研究NGS方法应用于部分核酸降解FFPE样本和体液组织样本的可行性。结果显示,NGS与IHC法阳性样本检测符合率为79.3%,与RT-PCR法的阳性样本检测符合率为100%;FFPE和尿囊液样本中分别测得2,624,877和60,883,067个NDV读数,分别获得美国源23株和中国源18株基因VI型NDV的全基因组序列,覆盖了99-100%的NDV表征。这些毒株的F融合蛋白的氨基酸裂解位点均具有113RKKR↓F117 NDV强毒株的特征。经遗传进化分析,23个美国野鸽FFPE样本中的NDV分类命名为VI.2.1.1.1亚型NDV,分别位于VI.2.1.1.1（VI＿a）和VI.2.1.1.1（VI＿n）两个分支上,遗传距离为4.2%,并且这两个亚型的NDV在遗传进化树上的分支位置与欧亚领鸽和岩鸽这两个野鸽物种在美国的地理分布是一致的。另外,18株广西肉鸽分离NDV分类命名为VI.2.1.1.2.1（VI＿k）和VI.2.1.1.2.2（VI＿j）两个亚型,遗传进化距离为5.3%,是在国内独立维持和持续进化了20多年的两个NDV亚型,与1980～2018年间在世界范围内引起疫情的其他型别的NDV有显着的不同。同时,这些NDV的宿主贮存库仍未知,病毒有可能同时在广西的鸽场和野鸟种群中流行。以上研究所获的41条NDV的F融合基因序列信息纳入了2019年国际统一NDV新分类命名系统的试点数据集和遗传进化树构建指南中。最后,为进一步解析PPMV-1的遗传多样性造成的对不同宿主的致病性和与现有疫苗之间的差异,本研究比较了广西肉鸽PPMV-1和NDV强毒株在鸡和鸽子体内的复制水平、病理组织学变化以及传播方式,并通过分析PPMV-1与Class II NDV疫苗的F融合基因和HN血凝素-神经氨酸酶基因之间抗原性、疏水性和氨基酸位点的变异特征来研究PPMV-1的病原学特性。结果显示,广西肉鸽PPMV-1分离株的平均致死时间MDT在62～114h之间;对1日龄SPF鸡的致病指数ICPI在0.00～0.63之间,说明均为中等或低毒力的NDV毒株。病毒感染鸽子后引起肾脏、胰脏和脑等组织损伤导致死亡;同时研究观察到,PPMV-1虽然引起鸡的脑、心脏、肾脏和肺等组织的部分细胞变性坏死,但不表现临床症状;鸽子和鸡分别感染PPMV-1后,前者体内的病毒滴度和阳性抗体水平均显着高于后者（P<0.01）。PPMV-1和La Sota的血清交叉抑制试验的R系数均小于0.8。另外,分离毒株与La Sota疫苗株相比,F和HN基因的部分氨基酸位点和抗原性、疏水性发生变异。这些结果表明,广西肉鸽PPMV-1分离株与La Sota疫苗株之间存在轻微的抗原差异,这可能是近年来养鸽场使用其他基因型NDV疫苗而得不到完全保护的原因。同时,病毒可在鸡体内复制分泌而不引起临床症状,也意味着PPMV-1的循环对家禽业构成潜在的威胁风险。综上所述,本研究建立了适用于FFPE组织和体液样本中PPMV-1的NGS检测诊断方法,并且采用该方法获得了美国野鸟和广西肉鸽来源的PPMV-1的全基因组测序,为最新国际NDV分类命名系统的建立提供了数据支持,同时本研究对PPMV-1的遗传多样性和病原学特性进行了分析,这些数据将有助于PPMV-1流行病学研究、疫苗开发以及对鸽子和家禽新城疫的有效防控。
孟令宅[5]（2020）在《基因Ⅶ型NDV弱毒株感染性克隆的构建及病毒拯救》文中研究表明新城疫（Newcastle disease,ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）引起的禽类的一种高度接触性、急性、烈性传染病,世界动物卫生组织（OIE）将其列为必须报告的传染病,我国将其列为一类动物疫病。NDV只有单一血清型,但存在多种基因型,目前我国主要流行的是Class Ⅱ类型中基因Ⅶ毒株,常规疫苗株B1、Clone30、La Sota及V4疫苗株属于基因Ⅰ型和Ⅱ型,不能有效防控基因Ⅶ型毒株。因此,应迫切研发与当前流行株基因型一致的新型疫苗。基于此,本研究对一株NDVHB株进行了全基因组测序,以此为基础建立了HB株的反向遗传操作平台,并对其F蛋白进行改造,旨在为研发基因Ⅶ型NDV弱毒疫苗提供科学依据。从河北省某发病鸡场的临床样本中检测到一株新城疫病毒,命名为HB,采用RT-PCR方法对HB株的全基因组序列进行分段扩增,并对其基因序列进行结构特性分析及同源进化分析。结果表明HB株基因组全长为15192 bp,基因组3’端存在长为55 nt的引导序列,5’端存在长为114 nt的尾随序列,主要编码的6种结构蛋白,包括基质蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素-神经氨酸酶蛋白（HN）、核衣壳蛋白（NP）、磷蛋白（P）、以及RNA依赖性RNA聚合酶蛋白（L）,基因组排列顺序为3’-NP-P-M-F-HN-L-5’。全基因组遗传进化分析表明,HB株属于Class Ⅱ中的基因Ⅶ型毒株,与鸭源新城疫毒株BP01、Fujian/FP/02、MMd/CH/LGD/1/2005核苷酸的同源性最高（99.1%～99.2%）,进化树上处于同一分支;与中国广泛使用的V4,Mukteswar和La Sota等疫苗株核苷酸的同源性较低（82.9%～85.6%）,进化树上处于不同分支。基于F基因的系统进化树显示,HB株属于基因Ⅶd亚型,是目前我国流行毒株中的优势亚型毒株。通过与其它毒株的序列进行比对,发现在F蛋白的信号肽,七肽重复区和跨膜结构域中出现了 4、16和2个氨基酸突变,在HN蛋白的功能结构域和中和表位分别出现1和5个氨基酸突变,这些关键位点的突变与病毒的吸附性及免疫逃避有关。应用反向遗传操作技术将HB株全长cDNA分为外部基因质粒（M、F及HN）和内部基因质粒（NP、P及L）两部分构建,通过同义突变将L蛋白的3100位点处的碱基A突变为T作为遗传标记,用以与野毒进行区分;利用融合PCR技术将F蛋白的112～117裂解位点的氨基酸序列突变为弱毒株La Sota裂解位点序列,同时构建了三个辅助质粒PCI-NP,PCI-P,PCI-L,将内部基因质粒、外部基因质粒与三个辅助质粒共转染BSR-T7/5细胞进行病毒拯救,并通过细胞病变、遗传标记检测、基因测序及间接免疫荧光等试验技术对拯救病毒进行鉴定,结果表明,rHB株能在BHK-21细胞上引起典型的细胞病变（CPE）,引入的遗传标记在传代过程中可以稳定遗传,F蛋白裂解位点处氨基酸序列突变成功,病毒拯救成功。对拯救病毒的生长特性进行分析,表明rHB株与HB株在BHK-21细胞上具有相似的生长特性。NDV HB株感染性克隆的成功构建可为进一步研究NDV的致病机制和研发新型基因工程疫苗提供技术平台。
董炳梅[6]（2019）在《鸡新城疫病毒增殖培养细胞系的筛选与稳定表达唾液酸转移酶（ST6Gal）细胞株的构建及其应用》文中认为鸡新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）可在多种原代或传代细胞系上复制增殖,但不同毒株或亚型对宿主细胞均存在偏嗜性。为了筛选适于鸡新城疫（Newcastle disease,ND）疫苗生产的传代细胞系,本研究将我国ND疫苗株NDVⅠ系与Lasota株分别接种BHK-21、Vero、Hela、鸡肝癌细胞（LMH细胞）与DF-1细胞,通过对细胞病变的观察,结合对细胞培养物细胞半数感染量(Median cell culture infective dose,TCID50)和HA效价的测定,对比确定适于NDVⅠ系与Lasota株生长的传代细胞系。结果显示,NDVⅠ系与Lasota株在Vero、BHK-21、DF-1、Hela与LMH细胞上均可增殖,并引起典型的细胞病变,但不同毒株适应细胞的能力不同。较适于NDVⅠ系增殖的细胞系依次为Hela、BHK-21与DF-1细胞;较适于NDV Lasota株增殖的细胞系依次为Hela、LMH与BHK-21细胞。本研究证明了NDVⅠ系与Lasota株均可在LMH细胞上增殖,并产生典型的细胞病变,且LMH细胞更适于NDVⅠ系的增殖培养。NDV侵染细胞的第一步是病毒与细胞膜表面的唾液酸受体结合,NDV的唾液酸受体主要包括Neu5Ac-α-2,3Gal-β-1,4Glc（SAα2,3Gal）和Neu5Ac-2-S-α-2,6Gal10Me（SAα2,6Gal）,两种受体在宿主组织器官中的分布及表达丰度的不同对病毒的宿主范围和毒力等方面具有重要影响。为了在分子水平解释NDVⅠ系与Lasota株对不同细胞系的偏嗜性,本研究首先应用激光共聚焦显微镜对2种唾液酸受体在BHK-21等5种细胞上的分布进行了观察,结果显示,BHK-21、LMH、DF-1、Hela与Vero细胞内均存在TSA-R SAα2,6Gal与SAα2,3Gal,且主要分布于细胞膜与细胞质中;在细胞核部分,BHK-21细胞核有SAα2,3Gal受体分布,而DF-1细胞核中两种受体均有分布。其次,本研究应用流式细胞仪对5种细胞膜表面的两种唾液酸受体进行了定量分析,结果显示5种细胞表面SAα2,3Gal受体的含量显着高于SAα2,6Gal受体,提示5种细胞主要以SAα2,3Gal受体为主;按由多到少排列,SAα2,3Gal在5种细胞膜上的含量依次为Hela、BHK-21、DF-1、LMH与Vero细胞;SAα2,6Gal在5种细胞膜上的含量依次为Hela、LMH、BHK-21、Vero与DF-1细胞。结合NDVⅠ系与Lasota株在不同细胞上的增殖特性的比较,可判断NDVⅠ系更易与SAα2,3Gal受体结合,NDV Lasota株更易与SAα2,6Gal受体结合。NDV虽然可在多种细胞上增殖培养,但效价普遍较低,不能达到生产要求。NDV的两种唾液酸受体分别为SAα2,3Gal和SAα2,6Gal,而介导两种唾液酸受体形成的酶类分别是ST3Gal转移酶和ST6Gal转移酶,因此唾液酸转移酶对唾液酸受体在细胞表面的表达具有重要作用,而细胞表面受体表达丰度的高低对病毒入侵与增殖具有决定性作用。因此,为了提高NDV细胞培养效价及进一步确定不同唾液酸受体对NDV细胞培养的影响,本研究以PCI-neo为载体,在成功构建唾液酸转移酶PCI-neo-ST3与PCI-neo-ST6质粒的基础上,应用脂质体转染的方法将其分别转染BHK-21细胞,共获得22株BHK-ST3细胞与17株BHK-ST6细胞;进而将NDV Lasota株分别接种以上细胞,通过HA效价及TCID50的测定,分别获得了较适于NDV Lasota株增殖的BHK-ST3-22细胞与BHK-ST6-15细胞克隆株。流式细胞仪检测发现,BHK-ST3-22细胞与BHK-ST6-15细胞表面相应的唾液酸受体表达丰度均有显着提高,且BHK-ST6-15细胞较BHK-ST3-22细胞更适合于NDV Lasota株的增殖。为了提高NDV在BHK-ST6-15细胞株的增殖效价,本研究在对应用BHK-ST6-15贴壁细胞增殖培养NDV Lasota株的条件进行优化的基础上,一方面将BHK-ST6-15细胞进行低血清悬浮培养的驯化;另一方面对NDV Lasota株在悬浮培养的BHK-ST6-15细胞上增殖条件进行了优化。结果显示,成功实现了BHK-ST6-15细胞的低血清悬浮培养,应用该细胞增殖培养NDV Lasota株,其细胞培养液效价可达108.375 TCID50/0.1 mL,显着高于BHK-ST6-15贴壁细胞,从而为实现NDV Lasota株细胞悬浮培养产业化生产奠定了良好基础。我国家禽活疫苗的生产主要依靠接种SPF鸡胚制备而成,该工艺主要存在批次间稳定性差、家禽外源病毒污染的风险和鸡胚废弃物无害化处理等问题,因此,影响着家禽活疫苗的生产。为替代传统鸡胚生产工艺、提升产品质量与效益,本研究应用全悬浮细胞培养技术生产NDV Lasota株活疫苗,并根据《中华人民共和国兽药典》2015年版三部的要求对其进行检测。结果显示,NDV Lasota株活疫苗各项指标均符合要求,可完全替代传统鸡胚生产工艺。同时,该技术具有技术成熟、自动化程度高、安全性强、产品质量稳定等优点,且显着降低了生产成本、提高了经济效益,从而为全悬浮细胞培养技术生产NDV Lasota株活疫苗奠定了良好基础。
刘志香[7]（2018）在《新城疫病毒新型可视化RPA-LFD检测方法建立与初步应用》文中研究指明新城疫（Newcastle Disease,ND）是由新城疫病毒（Newcastle Disease Virus,NDV）引起的一种急性、烈性、高度接触性禽类传染病。ND发病的主要特点为呼吸困难、拉稀、神经机能紊乱、粘膜和浆膜出血坏死,具有较高死亡率,对禽类生产造成严重的危害。因此,建立一种简单、快速、准确的NDV检测方法对ND防控以及养禽业的发展具有非常重要的意义。重组酶聚合酶等温扩增技术（Recombinase Ploymerase Amplication,RPA）是一种新型核酸等温扩增技术,具有操作简单、特异性高、敏感性强和不依赖复杂仪器的优点,同时扩增产物易形成气溶胶造成假阳性污染。而全封闭式横向流动试纸条技术（lateral flow dipstick,LFD）是将核酸试纸条置于方便携带的密闭装置中,可避免核酸产物外泄造成的假阳性污染。本研究将RPA技术与LFD技术相结合,通过对反应条件的优化,建立了一种针对NDV的RPA-LFD快速检测方法,对该方法的特异性、敏感性进行了研究和分析,并将该方法进行临床初步应用。研究结果如下:1.NDV RPA-LFD检测方法的建立:本研究根据RPA引物设计原则,针对NDV F基因保守区域设计3对引物,以NDV F48E9株的cDNA为模板,将引物两两组合分别进行RPA反应,通过凝胶电泳检测方法对引物进行筛选并建立RPA凝胶电泳反应体系。再按照nof探针设计原则,选择一条最佳引物作为RPA-nof探针,建立NDV RPA-LFD反应体系。为了确定该检测方法的最适反应条件,我们设计了不同的反应温度、时间、引物和探针的终浓度,对NDV RPA-LFD检测方法反应条件进行优化。综合优化结果,我们选择37℃作为该检测方法反应温度,20 min为该检测方法的反应时间,420 nM、120 nM分别为该检测方法的引物和探针的终浓度。我们以NDV的F48E9株、GM株、Lasota株的cDNA为模板,按照已经确定的优化条件,分别进行RPA-LFD反应,并以ddH2O为空白对照。结果显示,NDV 3种毒株LFD检测装置内检测线和质控线都有两条红色条带,而ddH2O仅在质控线出现一条红色条带,即NDV 3种毒株检测结果均为阳性,表明本研究成功建立了NDV RPA-LFD检测方法,且具有较广的适用性。2.NDV RPA-LFD检测方法特异性、敏感性的研究:将所建立的NDV RPA-LFD检测方法对NDV、禽流感病毒（Avian Influenza virus,AIV）、鸡传染性法氏囊病毒（Infectious bursal disease virus,IBDV）、马立克氏病毒（Marek’s disease virus,MDV）、鸡传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）、沙门氏菌、大肠杆菌其它相关病原进行检测。结果显示,NDV LFD检测装置内检测线和质控线都有两条红色条带,而其它相关病原仅在质控线出现一条红色条带,即该方法对NDV检测结果为阳性,其它相关病原检测结果为阴性,表明NDV RPA-LFD检测方法具有良好的特异性。我们进一步将NDV RPA-LFD检测方法与常规PCR琼脂糖凝胶电泳法、RPA琼脂糖凝胶电泳法进行敏感性比较。结果显示,常规PCR琼脂糖凝胶电泳法、RPA琼脂糖凝胶电泳法、RPA-LFD检测方法可以检测到NDV重组质粒最低检测浓度分别4.46×104 copies/μL、4.46×103 copies/μL、4.46×103 copies/μL;可以检测到NDV的cDNA最低含量分别为66.7 pg、66.7 pg、6.67 pg,表明NDV RPA-LFD检测方法比常规PCR琼脂糖凝胶电泳法更具敏感性。3.NDV RPA-LFD检测方法临床样品的应用:采集23份疑似ND病料,用RPA-LFD方法和常规PCR琼脂糖凝胶电泳法进行检测。结果表明,NDV RPA-LFD方法检出12份阳性,常规PCR扩增后经1%琼脂糖凝胶电泳检出14份阳性,NDV RPA-LFD检测方法与常规PCR琼脂糖凝胶电泳法检测临床病料的阳性符合率为85.7%,表明NDV RPA-LFD检测方法在临床应用上是可行的。综上,本研究通过反应条件的优化,建立了一种NDV RPA-LFD快速检测方法,并对该方法的特异性、敏感性进行研究,临床初步应用进行分析。结果表明,NDV RPA-LFD检测方法具有操作简单、费时少、不需昂贵仪器,结果准确、可视化等优点,适合NDV基层临床检测。
王艳红[8]（2018）在《新城疫病毒F蛋白的裂解位点氨基酸序列多样性及其它区段对细胞膜融合活性的影响》文中研究表明新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）是一种单股、不分节段、含有囊膜的负链RNA病毒,能够引起禽类新城疫（Newcastle disease,ND）,给全球养禽业带来巨大的经济损失。NDV的致病性主要是由病毒的融合蛋白裂解位点（Fusion protein cleavage site,Fcs）氨基酸序列决定的。一般情况下,强毒和中等毒力毒株的Fcs包含多个碱性氨基酸,基序（Motif）为“R/K-R-Q/R/K-R/K-R↓F”;弱毒株Fcs则包含1个或2个碱性氨基酸,基序为“G/E-K/R-Q-G/E-R↓L”。Fcs中的氨基酸种类、性质及其所处的位置因毒株的不同而呈现一定的多样性。虽然已有报道Fcs中单个或多个氨基酸的突变会影响诱导细胞融合能力及病毒的致病性。但是,Fcs中所呈现的氨基酸序列多样性对病毒的影响至今不明。另外,有研究发现,虽然一些毒株的Fcs中氨基酸序列一致,但对诱导细胞融合能力及宿主的致病性有较大差异,说明除了Fcs外,F蛋白其它区段或位点的氨基酸也起着重要的作用。因此,本研究针对Fcs的氨基酸序列通过分析其多样性,分别以强毒株和弱毒株的F基因为骨架,构建Fcs突变体,利用体外细胞实验,探索Fcs的氨基酸序列多样性及特殊Fcs情况下F蛋白其它区段对诱导细胞融合能力的影响。具体研究内容及结果包括以下几个方面:1.NDV自然分离株Fcs氨基酸序列多样性的广泛性分析通过GenBank数据库及文献报道收集了1572株NDV的相关信息,利用软件Lasergene7.1对Fcs氨基酸序列多样性进行统计分析,我们将Fcs分为强毒Fcs（VFcs）和弱毒Fcs（AFcs）2大类,VFcs包含1073个毒株,AFcs包含499个毒株。其中,将VFcs又分为8种类型,毒株基本都属于Class II类基因型;将AFcs分为10种类型,毒株大多属于Class I类基因型,部分属于Class II的基因型I、II和X。通过分析毒株的流行病学,我们发现Fcs与禽的种类、时空分布之间存在显着的关联性,其中一些Fcs类型具有禽类种属依赖性及地域特性。2.Fcs氨基酸序列多样性对F蛋白诱导细胞膜融合能力的影响利用NDV强毒株F48E9和弱毒株La Sota的F蛋白为骨架,将其Fcs氨基酸序列分别突变为10种AFcs和8种VFcs,通过将F突变体和HN质粒共转染BHK-21细胞观察对诱导细胞膜融合活性的影响。结果显示,在VFcs中,当P3位是谷氨酰胺（Q）时,该F蛋白能显着提高细胞融合活性。在连续5个碱性氨基酸情况下,赖氨酸（K）对于细胞融合活性的增强起着重要的作用。VFcs-1和VFcs-2是F蛋白诱导细胞膜融合活性最强的两种类型,VFcs的8种类型对促细胞膜融合活性的作用依次为:VFcs-1、-2>VFcs-3、-4>VFcs-5、-6、-7、-8。在AFcs中,无胰蛋白酶存在时,除AFcs-10类型外,其它几种类型均不能引起合胞体产生;有胰蛋白酶存在时,除了含有P4位为中性氨基酸Q的AFcs-9类型的F蛋白不能诱导细胞膜融合现象,其它均产生程度相似的细胞膜融合效率。3.Fcs为“RRQRR↓L”的F蛋白其它区段对诱导细胞膜融合能力的影响在对Fcs氨基酸序列多样性研究时发现,Fcs“RRQRR↓L”为弱毒裂解位点（AFcs）,通常认为拥有AFcs的无论强毒株还是弱毒株F蛋白都不能有效诱导细胞膜融合,但是,我们发现拥有此Fcs的强毒株F48E9的F蛋白具有很高的细胞膜融合诱导能力,而拥有此Fcs弱毒株LaSota的F蛋白不能有效诱导细胞膜融合。此结果表明除了Fcs,强毒株F蛋白的其它区域触发了细胞膜融合。为了寻找此F蛋白的具体作用区域,我们将F蛋白的主要功能域划分成9个区段,然后将这些区段在强、弱毒株F蛋白之间进行相互替换,通过细胞转染实验分析F蛋白突变体之间对宿主细胞膜融合效率的影响,并根据鉴定结果进一步进行替换或突变,最终明确了在Fcs为“RRQRR↓L”时,F48E9-F蛋白上影响细胞膜融合能力的2个关键氨基酸,即D479,S486。4.一种检测NDV诱导细胞融合新方法的建立NDV感染可引起宿主细胞合胞体的产生,其诱导细胞融合的程度可作为一种衡量毒力强弱的指标。目前对细胞融合程度进行评估时,普遍采用人工计算合胞体中细胞核的平均数量的方法对其进行判定。此法虽然比更早采用的计算合胞体面积判断法要更精确,但费时费力,主观性强易出现较大的误差。为了探索更方便、有效的定量检测NDV诱导细胞融合效率的方法,本研究运用慢病毒转导技术成功筛选出两种荧光细胞系BHK-21/GFP和BHK-21/tRFP。将此两种细胞等比例混合后感染病毒,通过流式细胞技术检测形成合胞体（双荧光阳性）的数量来判定细胞的膜融合效率。结果表明,在不同剂量的NDV感染混合细胞系后,双荧光阳性细胞数所占比例能很好地反应出病毒感染剂量与形成合胞体数量之间的线性关系。本研究为开发方便、有效的定量检测细胞融合效率提供了新的技术手段。综上所述,本研究较为详细的阐明了NDV Fcs氨基酸序列多样性对细胞融合活性的影响,为研究Fcs氨基酸序列多样性对宿主致病性提供必要的理论依据。其次,除Fcs外,F蛋白其它区域在诱导细胞膜融合能力方面也起着重要作用,为NDV F蛋白触发的细胞膜融合作用提供了新的见解,并为设计抗病毒多肽药物提供了理论基础。
林秋燕[9]（2017）在《新城疫基因Ⅶd亚型重组病毒灭活疫苗的制备及评价》文中研究说明新城疫（Newcastle disease,ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）引起的主要感染鸡、鹌鹑、鸽和火鸡等禽类的一种急性、败血性、高度接触性传染病,能导致大多数禽类中枢神经、呼吸道和消化道系统损伤。在《国家中长期动物疫病防治规划（2012-2020）》中,ND被列为优先防治的重大动物疫病之一。目前新城疫主要通过疫苗免疫进行防控。本试验选用新城疫基因Ⅶd亚型重组致弱病毒rGM-Ⅶm,制备油包水型油乳剂灭活疫苗。为了评估该疫苗的免疫效力,我们进行了以下实验:（1）将r GM-Ⅶm和LaSota灭活疫苗分别免疫SPF鸡21 d后,应用GM与LaSota 2种抗原检测免疫后血清抗体水平的动态变化,并采用不同来源/基因型的4种ND强毒分别进行攻击,检测SPF鸡排毒情况和存活率;（2）对SPF鸡和三黄鸡分别免疫重组灭活苗,评估该疫苗的通用性;（3）使用重组灭活苗免疫SPF鸡,监测其免疫持续期;（4）使用不同剂量的重组灭活苗免疫SPF鸡,确定最小免疫剂量;（5）对免疫重组灭活苗后不同HI抗体滴度水平的SPF鸡进行攻毒实验,测定该疫苗的免疫保护临界值。SPF鸡分组免疫新城疫rGM-Ⅶm灭活疫苗和LaSota灭活疫苗后,使用GM株和LaSota株作为诊断抗原测定2种疫苗免疫后的HI抗体水平,结果表明相同基因型的诊断抗原检测的血清HI平均抗体效价略高于不同基因型的诊断抗原检测结果。SPF鸡免疫新城疫rGM-Ⅶm灭活疫苗和LaSota灭活疫苗后的结果表明,新城疫r GM-Ⅶm灭活疫苗所产生的抗体水平较高、各免疫组抗体效价均一性较好,并且在咽喉和泄殖腔中未检测到病毒,攻毒保护率高达100%;免疫新城疫LaSota株灭活疫苗后,90%SPF鸡得到免疫保护,但在咽喉和泄殖腔中仍能检出病毒。新城疫rGM-Ⅶm灭活疫苗的抗体产生时间、上升速度、HI平均抗体效价以及对不同来源不同基因型的毒株的抵抗能力均优于新城疫LaSota灭活疫苗,能够刺激机体持续产生较高的抗体和提供更好的保护效果。最小免疫剂量试验结果表明,SPF鸡免疫20μL时,新城疫效检强毒攻毒保护率即可达到100%。免疫保护临界值试验结果表明,当HI抗体效价在5 log2以上,攻毒保护率可达100%,即达到免疫保护作用。对SPF鸡和三黄鸡的免疫重组灭活苗后的抗体水平进行测定,根据其抗体的消长规律,结合攻毒保护试验结果,本实验室制备的新城疫rGM-Ⅶm灭活疫苗推荐免疫程序为:10日龄鸡,0.2 mL/只,肌肉注射,1次免疫,免疫期为4个月。综上所述,通过对本课题组制备的新城疫rGM-Ⅶm灭活疫苗进行免疫评估的结果表明,与传统的新城疫LaSota灭活疫苗相比,该疫苗具备更好地抵抗目前流行的基因Ⅶ型毒株的能力,并且具有免疫剂量低、抗体上升快、排毒量减少、免疫期长的优点,具有潜在的应用价值。
谭华龙[10]（2017）在《12株NDV F/HN基因分析及鸭源毒株生物学特性测定》文中认为新城疫是由NDV引起禽呼吸道、消化道黏膜严重出血的一种传染病,是目前养禽业极为重视的传染病之一。近年来我国水禽感染NDV的病例报道越来越多,而且水禽感染NDV已经表现出新的流行特点,临床症状不再局限于一般的生产能力下降,感染NDV的水禽发病率、死亡率正在逐渐升高,并以逐年增加的趋势向全国大部分区域蔓延,使得对NDV流行动态作研究分析十分必要。本研究对1997-2016年期间从广东佛山、肇庆、云浮等地疑似患新城疫家禽病料分离鉴定获得的12株NDV,采用RT-PCR方法对12株NDV的F基因和HN基因扩增,扩增产物经克隆并测序后与GenBank数据库中的参考毒株作遗传进化和同源性分析,并对1株番鸭源NDV作了较为系统的生物特性测定,为今后的诊断与免疫防控研究提供更多详细的参考资料。F基因遗传进化分析结果显示:（1）12株分离株中有9株属于基因Ⅶ型,这9株病毒来源禽种覆盖鸡、鸭和鹅,来源地域覆盖广东省4个地级市的6个县级市,来源时间覆盖最初的1997年至最近的2016年。提示,近20年来,基因Ⅶ型可能一直是广东各地、各种禽NDV流行的优势基因型,且自2007年以来,水禽NDV分离率有明显增高;（2）1株来自1997年病鸡的毒株（CK/FS-SS/N/1997株）和1株来自2014年病鸭的毒株（MDK/FS-SS/485/2014株）属于基因Ⅸ型,其来源均为佛山市三水区,提示,基因Ⅸ型一直存在流行的威胁,已经由鸡向水禽传染（或由水禽向鸡传染）,但传播流行速度尚较缓慢,具有一定的区域局限性;（3）鸽源PG/GZ-HD/PN/2011株属于基因Ⅵ型,与国内外鸽源分离株所属基因型一致。F基因和HN基因相似性分析结果显示:（1）12株毒株与参考毒株间的相似性存在较大的差异,所有分离株与目前使用的疫苗株LaSota、B1、Mukteswar和Clone30的相似性在80.9%91.9%之间;（2）2株基因Ⅸ型毒株与传统强毒株F48E8的相似性高于99%,推测2株毒株为F48E8株的亲缘性较近;（3）12株毒株间相似性的差异较大,9株基因Ⅶ型的毒株中的5株鹅源毒株和1株鸭源毒株之间的相似性高于97%,但与其他3株Ⅶ型病毒（MDK/FS-SS/E/2007、WDK/FS-NH/A/2006和CK/YF-LD/L/1997）之间的相似性仅在83.4%87.8%之间。提示,本省流行的基因型相同的毒株之间存在基因亚型的差异。NDV的F基因与HN基因推导的氨基酸序列分析结果显示,12株分离株与NDV强毒株的氨基酸特征相符,有10株病毒的HN基因第514氨基酸残基出现I→V的变异,有9株分离株的F基因和HN基因的中和抗原位点出现变异。另外,2011年后分离的7株毒株中,有6株毒株的HN基因第347氨基酸残基出现E→D。由此推测,当前广东地区大部分的分离株与传统疫苗株之间存在抗原性差异,这可能是目前大部分禽群对于NDV免疫失败的原因之一。本研究对鸭源NDV（MDK/FS-SS/E/2007）的生物特性测定结果显示,该毒株对鸭胚半数致死量为10-8.668/0.1 mL,MDT为75.2 h,ICPI为1.725和IVPI为2.48,均与NDV强毒标准相符。MDK/FS-SS/E/2007株对雏鸭和雏鹅的人工感染试验结果显示,感染雏鸭和雏鹅出现精神沉郁,瘫痪和扭颈等神经症状,剖检可见脑部充血、出血,胰腺、脾脏和肝脏等器官出现变性坏死,其临床症状与病理变化都呈现典型新城疫的特征。另外,利用MDK/FS-SS/E/2007株制备成灭活油乳疫苗免疫雏番鸭,结果表明,对番鸭于1、2、3周龄进行三次免疫后,HI抗体水平均值在第7周龄达到8log2,用约105个ELD50病毒液攻击番鸭,番鸭保护率达100%。提示本毒株对番鸭具有良好的免疫原性和免疫保护效果。另外,本题尚对该毒株的F蛋白进行了表达,并利用抗His标签鼠单克隆抗体对产物进行了Western blot验证,显示在53 kDa位置只有一条清晰的蛋白印迹,可为制备针对F基因的单克隆抗体和诊断水禽源新城疫病提供参考,也为研究相关基因工程疫苗打下了一定基础。
二、新城疫病毒F48E9株F基因主要功能区的核苷酸序列分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、新城疫病毒F48E9株F基因主要功能区的核苷酸序列分析（论文提纲范文）
（1）嵌合鸡干扰素刺激因子12-2（ISG12-2）新城疫病毒载体疫苗免疫原性的初步评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 新城疫及宿主蛋白ISG12(2)研究进展 |
| 1.1 新城疫病毒概述 |
| 1.1.1 NDV的分类地位及基因组结构 |
| 1.1.2 NDV的分子结构及蛋白功能 |
| 1.1.3 NDV的生命周期 |
| 1.1.4 ND的流行现状 |
| 1.2 NDV反向遗传学研究进展 |
| 1.3 新城疫疫苗研究进展 |
| 1.4 干扰素的概述 |
| 1.4.1 干扰素的产生 |
| 1.4.2 干扰素的功能 |
| 1.5 ISG12 蛋白的研究进展 |
| 1.5.1 ISG12 家族相关功能研究 |
| 1.5.2 ISG12 对抗病毒天然免疫的影响 |
| 1.6 本研究目的意义 |
| 试验研究 |
| 第二章 ISG12(2)正向调控IFNs的机制探究 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞、质粒、菌株与毒株 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器及常用试剂配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 pCMV-ISG12(2)-EGFP真核表达载体的构建与鉴定 |
| 2.2.2 ISG12(2)的原核表达 |
| 2.2.3 Western Blot验证ISG12(2)蛋白和EGFP蛋白的表达 |
| 2.2.4 pCMV-ISG12(2)-EGFP真核重组质粒的功能验证 |
| 2.2.5 转录组测序 |
| 2.2.6 统计学分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 ISG12(2)多克隆抗体的制备 |
| 2.3.2 pCMV-ISG12(2)-EGFP真核表达载体的构建与鉴定 |
| 2.3.3 pCMV-ISG12(2)-EGFP质粒促进干扰素表达抑制NDV复制的功能鉴定 |
| 2.3.4 转录组测序分析ISG12(2)激活干扰素信号通路的方式 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 ISG12(2)NDV嵌合株的拯救及生物学特性测定 |
| 3.1 材料与仪器 |
| 3.1.1 细胞与质粒 |
| 3.1.2 鸡胚、1 日龄雏鸡 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 嵌合ISG12(2)的LaSota病毒载体的构建 |
| 3.2.2 重组病毒的拯救 |
| 3.2.3 重组病毒的鉴定 |
| 3.2.4 拯救毒株生物学特性的鉴定 |
| 3.3 试验结果 |
| 3.3.1 重组病毒载体的构建 |
| 3.3.2 重组病毒的拯救及鉴定 |
| 3.3.3 拯救毒株生物学特性的测定 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 嵌合ISG12(2)的LaSota毒株的免疫保护效果评估 |
| 4.1 材料与仪器 |
| 4.1.1 疫苗株与病毒 |
| 4.1.2 低抗鸡和鸡胚 |
| 4.1.3 主要试验试剂和仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 免疫-攻毒试验分组 |
| 4.2.2 免疫-攻毒后HI抗体效价动态监测 |
| 4.2.3 攻毒后体外排毒情况 |
| 4.2.4 攻毒后组织体内病毒载量检测 |
| 4.3.5 攻毒后病理组织学观察 |
| 4.2.6 免疫后脾脏组织中免疫相关因子量的检测 |
| 4.2.7 免疫后脾脏组织的转录组测序分析 |
| 4.2.8 统计学分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 免疫-攻毒后鸡ND抗体效价的动态监测 |
| 4.3.2 免疫-攻毒后存活率 |
| 4.3.3 攻毒后体外排毒情况检测 |
| 4.3.4 攻毒后组织体内病毒载量检测 |
| 4.3.5 病理组织学观察 |
| 4.3.6 免疫后脾脏组织中免疫相关因子的表达 |
| 4.3.7 免疫后脾脏组织的转录组测序分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录1 主要仪器、试剂配方及实验方法 |
| 附录2 转录组测序数据补充材料 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）鹅源新城疫病毒F基因和HN基因的克隆及序列分析（论文提纲范文）
| 1 材料 |
| 1.1 毒株及试验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 引物的设计与合成 |
| 2 方法 |
| 2.1 生物学毒力测定 |
| 2.2 动物回归试验 |
| 2.3 F基因和HN基因的RT-PCR扩增 |
| 2.4 F基因和HN基因的克隆测序 |
| 2.5 遗传进化树的构建 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 生物学毒力测定 |
| 3.2 动物回归试验 |
| 3.3 F基因与HN基因RT-PCR扩增 |
| 3.4 F基因和HN基因序列分析 |
| 3.5 遗传进化分析 |
| 4 讨论与小结 |
（3）表达NDV蛋白的重组酵母构建及免疫效力评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 新城疫病毒概述 |
| 1.1.1 新城疫病毒的发现 |
| 1.1.2 新城疫病毒的理化性质与基因组结构 |
| 1.1.3 新城疫病毒的类型 |
| 1.1.4 新城疫病毒的致病性与感染后临床症状 |
| 1.2 新城疫病毒检测技术 |
| 1.2.1 血清学检测 |
| 1.2.2 分子生物学技术检测 |
| 1.3 新城疫病毒疫苗主要类型 |
| 1.3.1 传统疫苗 |
| 1.3.2 载体疫苗 |
| 1.3.3 病毒样颗粒疫苗 |
| 1.3.4 纳米粒子递送疫苗 |
| 1.3.5 生物佐剂疫苗 |
| 1.4 酿酒酵母表达系统 |
| 1.4.1 酿酒酵母表面展示表达系统 |
| 1.4.2 酿酒酵母表达系统的特点及应用 |
| 1.5 本课题研究的目的与意义 |
| 1.5.1 研究内容 |
| 1.5.2 目的和意义 |
| 第2章 新城疫病毒F与HN基因酿酒酵母表达载体的构建 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验用毒株、质粒及引物 |
| 2.2.2 实验用主要试剂 |
| 2.2.3 培养基的配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 新城疫病毒F和HN蛋白片段的生物信息学分析 |
| 2.3.2 新城疫病毒RNA的提取 |
| 2.3.3 反转录 |
| 2.3.4 目的基因的扩增与克隆 |
| 2.3.5 目的片段纯化回收 |
| 2.3.6 大肠杆菌DH5α感受态细胞制备 |
| 2.3.7 PCR回收产物的酶切及与载体的连接 |
| 2.3.8 连接产物的转化与鉴定 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 新城疫病毒F和HN蛋白片段的生物信息学分析 |
| 2.4.2 新城疫病毒F与HN基因的克隆 |
| 2.4.3 重组质粒验证 |
| 2.5 分析与讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第3章 新城疫病毒F与HN蛋白片段在酿酒酵母表面的表达及鉴定 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验用酵母质粒、引物和菌株 |
| 3.2.2 实验用主要试剂 |
| 3.2.3 主要溶液和培养基配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 PCR反应体系 |
| 3.3.2 酶切构建转化体系 |
| 3.3.3 酵母转化 |
| 3.3.4 酵母基因组提取 |
| 3.3.5 Western blot鉴定 |
| 3.3.6 F与HN蛋白片段酿酒酵母表面展示菌株生长曲线 |
| 3.3.7 免疫荧光 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 酵母转化构建NDV F和 HN蛋白片段表面展示菌株 |
| 3.4.2 重组菌株验证 |
| 3.4.3 新城疫病毒F与HN蛋白酿酒酵母表面展示菌株的生长曲线 |
| 3.4.4 新城疫病毒F与HN蛋白的表达鉴定 |
| 3.4.5 蛋白表达免疫荧光结果 |
| 3.5 分析与讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第4章 新城疫病毒F/HN酿酒酵母表面展示疫苗免疫效果评估 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验用主要试剂 |
| 4.2.2 主要溶液和培养基配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 原核表达载体构建 |
| 4.3.2 蛋白纯化 |
| 4.3.3 酶联免疫吸附测定 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 新城疫病毒HN蛋白原核表达载体构建 |
| 4.4.2 新城疫病毒HN原核蛋白的纯化 |
| 4.4.3 新城疫病毒血清抗体的ELISA检测 |
| 4.5 分析与讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 致谢 |
（4）鸽Ⅰ型副粘病毒的全基因组测序及病原学特性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要英文缩写词 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 禽副粘病毒和新城疫病毒简介 |
| 1.2 NDV的分类命名 |
| 1.2.1 基于毒力和宿主病理特征的NDV分类 |
| 1.2.2 基于基因组序列的早期NDV命名分类系统 |
| 1.2.3 基于基因组序列最新的NDV命名分类系统 |
| 1.3 NDV的检测诊断方法 |
| 1.3.1 NDV的临床诊断 |
| 1.3.2 基于病毒生物学特性的早期检测诊断方法 |
| 1.3.3 传统的分子生物学检测诊断方法 |
| 1.3.4 基于第二代基因组测序技术的检测诊断方法 |
| 1.4 鸽I型副粘病毒(PPMV-1) |
| 1.5 NDV疫苗 |
| 1.5.1 NDV活疫苗 |
| 1.5.2 NDV灭活苗 |
| 1.5.3 NDV重组疫苗 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 第二章 感染PPMV-1野鸽的IHC病理诊断分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 野鸽FFPE组织样本来源 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 野鸽FFPE组织样本的制备 |
| 2.2.2 IHC法检测PPMV-1抗原和判定标准 |
| 2.2.3 RT-PCR方法复核检测野鸽FFPE组织样本中的PPMV-1抗原 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 PPMV-1感染野鸽的体内各组织中病原分布情况 |
| 2.3.2 PPMV-1感染野鸽的病理组织学变化结果 |
| 2.3.3 PPMV-1感染野鸽的病理组织学变化和组织器官病原阳性率统计结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 基于NSG的 PPMV-1全基因组测序及遗传多样性分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 野鸽PPMV-1的FFPE组织样本 |
| 3.1.2 肉鸽PPMV-1尿囊液样本 |
| 3.1.3 试剂 |
| 3.1.4 引物 |
| 3.1.5 仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 野鸽PPMV-1 FFPE样本的IHC诊断检测 |
| 3.2.2 肉鸽PPMV-1尿囊液样本的RT-PCR检测 |
| 3.2.3 FFPE蜡块组织中总RNA的抽提 |
| 3.2.4 尿囊液中总RNA的抽提 |
| 3.2.5 RNA质量分析 |
| 3.2.6 DNA文库的建立和质量分析 |
| 3.2.7 DNA文库的测序上样 |
| 3.2.8 NGS测序及数据处理 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 野鸽FFPE组织样本中PPMV-1的IHC检测结果 |
| 3.3.2 肉鸽分离株尿囊液样本中PPMV-1的RT-PCR检测结果 |
| 3.3.3 样本总RNA抽提及构建DNA文库的质量分析 |
| 3.3.4 不同方法对FFPE和尿囊液组织样本中PPMV-1的检测结果与比较 |
| 3.3.5 美国野鸽FFPE样本PPMV-1的遗传多样性分析结果 |
| 3.3.6 中国广西肉鸽PPMV-1分离株的遗传多样性分析结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 美国野鸽PPMV-1流行株的遗传进化分析 |
| 3.4.2 NGS和 IHC应用于FFPE样本中NDV病原的检测 |
| 3.4.3 中国广西鸽场PPMV-1流行株的遗传进化分析 |
| 3.5 结论 |
| 第四章 广西肉鸽PPMV-1分离毒株的病原学特性分析 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 标准毒株和疫苗株 |
| 4.1.2 细胞和鸡胚 |
| 4.1.3 实验动物和地点 |
| 4.1.4 HA和HI抗原和阳性血清 |
| 4.1.5 试剂 |
| 4.1.6 仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 PPMV-1病毒的分离和鉴定 |
| 4.2.2 PPMV-1 平均鸡胚致死时间 MDT 的测定 |
| 4.2.3 PPMV-1 雏鸡脑内致病指数 ICPI 的测定 |
| 4.2.4 PPMV-1 分离株与La Sota疫苗株的血清交叉中和抑制实验 |
| 4.2.5 NDV攻毒试验 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 广西肉鸽PPMV-1分离株的噬斑纯化结果 |
| 4.3.2 广西肉鸽PPMV-1分离株的毒力判定 |
| 4.3.3 PPMV-1分离株和La Sota疫苗株的血清交叉中和抑制实验结果 |
| 4.3.4 PPMV-1对不同宿主的致病性研究 |
| 4.3.5 PPMV-1在不同宿主体内的复制水平和传播方式研究 |
| 4.3.6 F基因和HN基因的变异对PPMV-1致病性的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 PPMV-1的致病机理和传播方式研究 |
| 4.4.2 广西肉鸽PPMV-1分离株的致病性分析 |
| 4.4.3 广西肉鸽PPMV-1分离株的抗原性和疏水性分析 |
| 4.5 结论 |
| 4.6 下一步工作计划及展望 |
| 全文总结 |
| 本研究创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（5）基因Ⅶ型NDV弱毒株感染性克隆的构建及病毒拯救（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩写词表 |
| 1 引言 |
| 1.1 新城疫病毒概述 |
| 1.1.1 基因组特征 |
| 1.1.2 编码蛋白及其功能 |
| 1.1.3 病毒分类及理化性质 |
| 1.1.4 分子流行病学 |
| 1.2 新城疫疫苗研究概况 |
| 1.2.1 灭活疫苗 |
| 1.2.2 弱毒疫苗 |
| 1.2.3 亚单位疫苗 |
| 1.2.4 病毒样颗粒疫苗 |
| 1.3 反向遗传学 |
| 1.3.1 RNA病毒的反向遗传学研究 |
| 1.3.2 反向遗传学在新城疫病毒上的应用 |
| 1.4 研究目的及意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病毒与细胞 |
| 2.1.2 载体与菌株 |
| 2.1.3 多克隆抗体 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.1.5 溶液配制 |
| 2.1.6 主要设备及仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病毒的检测 |
| 2.2.2 病毒全基因组序列的测定 |
| 2.2.3 辅助质粒的构建 |
| 2.2.4 POK12载体的改造 |
| 2.2.5 全长cDNA克隆质粒的构建 |
| 2.2.6 内部基因的构建 |
| 2.2.7 外部基因的构建 |
| 2.2.8 BSR-T7/5细胞的培养 |
| 2.2.9 病毒的拯救 |
| 2.2.10 拯救病毒的鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 RT-PCR鉴定 |
| 3.2 全基因组扩增 |
| 3.3 全基因组序列分析 |
| 3.3.1 HB株基因组特征 |
| 3.3.2 编码区序列分析 |
| 3.3.3 非编码区序列分析 |
| 3.3.4 F蛋白氨基酸序列分析 |
| 3.3.5 HN蛋白氨基酸序列分析 |
| 3.3.6 遗传进化分析 |
| 3.4 辅助质粒的构建 |
| 3.5 全长cDNA克隆质粒的构建 |
| 3.5.1 POK12载体的改造结果 |
| 3.5.2 内部基因和外部基因扩增 |
| 3.6 F蛋白的改造结果 |
| 3.7 拯救病毒的鉴定 |
| 3.7.1 鸡胚病变 |
| 3.7.2 遗传标记检测 |
| 3.7.3 间接免疫荧光鉴定 |
| 3.7.4 拯救病毒在细胞上的病变 |
| 3.7.5 拯救病毒的TCID50 |
| 3.7.6 拯救病毒的生长特性分析 |
| 3.7.7 F蛋白裂解位点测序结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 HB株全基因组序列分析 |
| 4.2 NDV弱毒株感染性克隆的构建 |
| 4.3 F蛋白裂解位点的改造 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的学术论文 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
| 附件 |
（6）鸡新城疫病毒增殖培养细胞系的筛选与稳定表达唾液酸转移酶（ST6Gal）细胞株的构建及其应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写词表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 鸡新城疫病毒研究进展 |
| 1.1 副黏病毒概述 |
| 1.2 NDV的病原学概述 |
| 1.3 NDV分子生物学特性 |
| 1.4 NDV在宿主细胞内的复制增殖 |
| 第二章 新城疫病毒受体研究进展 |
| 2.1 病毒受体特性 |
| 2.2 NDV的唾液酸受体 |
| 2.3 与唾液酸受体相关的酶类 |
| 2.4 影响NDV与受体结合的因素 |
| 2.5 NDV唾液酸受体的分布 |
| 2.6 NDV培养特性 |
| 第三章 新城疫疫苗研究概况 |
| 3.1 常规疫苗 |
| 3.2 新型疫苗--基因工程疫苗 |
| 第二篇 实验研究部分 |
| 第一章 不同细胞系培养NDV特性的研究 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果与分析 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 唾液酸受体SAα2,3Gal和 SAα2,6Gal在不同细胞系表达的比较 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 表达唾液酸转移酶细胞株的建立与筛选 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 NDV Lasota株在BHK-ST6-15 细胞上培养条件的优化 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 基于BHK-ST6-15 全悬浮细胞培养的NDV Lasota株活疫苗的试验研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 发表的学术论文 |
| 致谢 |
（7）新城疫病毒新型可视化RPA-LFD检测方法建立与初步应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 NDV病原学特点 |
| 1.2 NDV基因组结构特点 |
| 1.3 NDV流行病学特点 |
| 1.4 NDV诊断方法 |
| 1.4.1 病毒分离与鉴定 |
| 1.4.2 血清学诊断 |
| 1.4.2.1 血凝和血凝抑制试验 |
| 1.4.2.2 酶联免疫吸附试验 |
| 1.4.2.3 琼脂扩散试验 |
| 1.4.2.4 免疫组化技术 |
| 1.4.3 分子生物学诊断 |
| 1.4.3.1 反转录-聚合酶链式反应技术 |
| 1.4.3.2 核酸探针技术 |
| 1.4.3.3 电镜技术 |
| 1.5 核酸等温扩增技术研究概况 |
| 1.5.1 重组酶聚合酶等温扩增技术 |
| 1.5.2 全封闭横向流动试纸条技术 |
| 1.5.3 RPA-LFD技术的优点及其应用 |
| 1.6 研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 毒株及细菌 |
| 2.1.2 临床样品 |
| 2.1.3 主要实验器材 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.1.5 主要溶液的配置 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 RPA引物设计 |
| 2.2.2 探针设计 |
| 2.2.3 病毒DNA/RNA提取 |
| 2.2.3.1 病毒DNA提取 |
| 2.2.3.2 病毒RNA提取 |
| 2.2.4 反转合成cDNA |
| 2.2.5 PCR反应 |
| 2.2.6 E.ColiDH5α感受态的制备 |
| 2.2.7 重组质粒的构建 |
| 2.2.7.1 引物设计 |
| 2.2.7.2 PCR产物纯化 |
| 2.2.7.3 连接与转化 |
| 2.2.7.4 质粒的提取 |
| 2.2.7.5 重组质粒拷贝数的计算 |
| 2.2.8 NDVRPA引物筛选及RPA凝胶电泳法的建立 |
| 2.2.9 NDVRPA-LFD检测方法的初步建立 |
| 2.2.10 NDVRPA-LFD检测条件的优化 |
| 2.2.10.1 温度条件的优化 |
| 2.2.10.2 时间条件的优化 |
| 2.2.10.3 引物及探针浓度的优化 |
| 2.2.11 NDVRPA-LFD检测方法NDV毒株间的检测 |
| 2.2.12 NDVRPA-LFD检测方法特异性分析 |
| 2.2.13 NDVRPA-LFD检测方法敏感性分析 |
| 2.2.13.1 NDVRPA-LFD检测方法重组质粒敏感性分析 |
| 2.2.13.2 NDVRPA-LFD检测方法cDNA敏感性分析 |
| 2.2.14 NDVRPA-LFD检测方法临床样品的检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 NDVRPA-LFD引物及RPA凝胶电泳法的建立 |
| 3.1.1 NDVRPA引物筛选 |
| 3.1.2 NDVRPA凝胶电泳法的建立 |
| 3.1.3 NDVRPA-LFD最优引物组合及探针 |
| 3.2 NDVRPA-LFD检测方法的建立 |
| 3.2.1 NDVRPA-LFD检测方法的初步建立 |
| 3.2.2 NDVRPA-LFD检测方法反应条件的优化 |
| 3.2.2.1 温度条件的优化 |
| 3.2.2.2 时间条件的优化 |
| 3.2.2.3 引物及探针浓度的优化 |
| 3.2.2.4 NDVRPA-LFD检测方法最终反应条件和反应体系 |
| 3.3 NDVRPA-LFD检测方法NDV毒株间的检测 |
| 3.4 NDVRPA-LFD检测方法特异性分析 |
| 3.5 NDVRPA-LFD检测方法敏感性分析 |
| 3.5.1 NDVRPA-LFD方法的毒株重组质粒敏感性分析 |
| 3.5.2 NDVRPA-LFD检测方法的cDNA敏感性分析 |
| 3.6 NDVRPA-LFD检测方法临床样品的检测 |
| 4 讨论 |
| 5 总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
（8）新城疫病毒F蛋白的裂解位点氨基酸序列多样性及其它区段对细胞膜融合活性的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 文献综述 |
| 第一章 新城疫病毒 |
| 1.1 新城疫病毒概述 |
| 1.1.1 新城疫病毒 |
| 1.1.2 NDV的病原学特性 |
| 1.2 新城疫病毒的分子流行病学 |
| 1.3 NDV的分子致病机理 |
| 1.4 新城疫病毒F蛋白 |
| 1.4.1 F蛋白 |
| 1.4.2 F蛋白裂解位点氨基酸序列及膜融合机制 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 试验研究 |
| 第二章 NDV天然分离株F蛋白裂解位点氨基酸序列的多样性 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 数据材料 |
| 2.1.2 统计分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 F蛋白裂解位点氨基酸序列的多样性及其分类 |
| 2.2.2 F蛋白裂解位点氨基酸多样性的时空分布特点 |
| 2.2.3 F蛋白裂解位点氨基酸多样性与主要宿主之间的关系 |
| 2.2.4 F蛋白裂解位点各氨基酸种类的保守性分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 F蛋白裂解位点氨基酸序列多样性对细胞膜融合能力的影响 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 质粒 |
| 3.1.2 细胞和病毒 |
| 3.1.3 试剂和仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 引物设计 |
| 3.2.2 野生型毒株F48E9和LaSotaF与HN蛋白表达载体构建 |
| 3.2.3 F蛋白裂解位点氨基酸序列突变的F蛋白表达载体构建 |
| 3.2.4 Westernblotting检测目的蛋白的表达 |
| 3.2.5 细胞融合活性的定性和定量分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 重组质粒pCAG-F48-F-Flag、pCAG-F48-HN和pCAG-La-F-Flag、pCAG-F48-HN的构建 |
| 3.3.2 F和HN蛋白促细胞融合活性呈现剂量依赖性 |
| 3.3.3 含VFcs的F突变体对促细胞膜融合活性的影响 |
| 3.3.4 人工突变的VFcsF突变体对促细胞膜融合活性的影响 |
| 3.3.5 含AFcs的F突变体对促细胞膜融合活性的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 裂解位点氨基酸基序为“RRQRR↓L”的NDVF蛋白HR2区氨基酸突变对细胞膜融合活性的影响 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.2 细胞、质粒和毒株 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 NDVF蛋白的主要功能域划分 |
| 4.2.2 区段替换及点突变引物设计 |
| 4.2.3 各种F蛋白突变体重组载体的构建 |
| 4.2.4 细胞融合活性的定性和定量分析 |
| 4.2.5 流式细胞术(FCM)定量检测F突变体的细胞膜表面表达效率 |
| 4.2.6 免疫荧光试验(IFA)定性分析F蛋白突变体的表达 |
| 4.2.7 实验数据的统计学分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 在Fcs相同情况下,强弱毒F蛋白对细胞膜融合活性的影响 |
| 4.3.2 以F48-F*质粒为骨架的F突变体载体构建及其对细胞融合活性的影响 |
| 4.3.3 以F48/La118-499质粒为骨架的F突变体载体构建及其对细胞融合活性的影响 |
| 4.3.4 F48/La118-499质粒上点突变的F突变体载体构建及其对细胞融合活性的影响 |
| 4.3.5 以La-F*质粒为骨架的F突变体载体构建及其对细胞融合的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 NDV致细胞膜融合作用检测方法的初步建立 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 细胞、病毒与质粒 |
| 5.1.2 试剂和仪器 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 慢病毒空载体包装 |
| 5.2.2 稳定表达GFP和tRFPBHK-21细胞系的建立 |
| 5.2.3 细胞融合检测及融合效率分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 GFP或tRFP蛋白标记的慢病毒载体的包装 |
| 5.3.2 BHK-21-GFP/tRFP稳转细胞系的建立 |
| 5.3.3 不同感染时间及不同剂量条件下NDV对细胞融合活性的影响 |
| 5.3.4 流式细胞术对细胞融合活性的定量分析 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 全文结论 |
| 本论文的创新点 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（9）新城疫基因Ⅶd亚型重组病毒灭活疫苗的制备及评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 常用缩写词 |
| 1 前言 |
| 1.1 新城疫概述 |
| 1.1.1 形态特征 |
| 1.1.2 理化特性 |
| 1.1.3 生物学特性 |
| 1.1.4 抗原性和毒力 |
| 1.2 国内外研究现状和发展趋势 |
| 1.3 NDV疫苗的研究进展 |
| 1.4 研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 毒株 |
| 2.1.2 疫苗 |
| 2.1.3 诊断抗原 |
| 2.1.4 实验动物 |
| 2.1.5 主要试剂 |
| 2.1.6 1%鸡红细胞悬液 |
| 2.1.7 主要仪器设备 |
| 2.1.8 分子生物学软件 |
| 2.1.9 统计软件 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 新城疫rGM-Ⅶm灭活疫苗的制备 |
| 2.2.2 4 株效检用NDV毒株的来源和特性 |
| 2.2.3 新城疫rGM-Ⅶm与LaSota灭活疫苗的免疫效果比较试验 |
| 2.2.4 不同品种鸡免疫新城疫rGM-Ⅶm灭活疫苗后抗体水平的比较研究 |
| 2.2.5 抗体消长规律的测定 |
| 2.2.6 最小免疫剂量试验及免疫保护临界值试验 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 新城疫rGM-Ⅶm灭活疫苗的制备 |
| 3.1.1 新城疫rGM-Ⅶm株生物学特性鉴定结果 |
| 3.1.2 新城疫rGM-Ⅶm灭活疫苗的质量检测结果 |
| 3.2 效检用毒株的来源和特性 |
| 3.2.1 4 株效检用NDV毒株鸡胚半数感染量的测定 |
| 3.2.2 4 株效检用NDV毒株的遗传进化分析 |
| 3.3 新城疫rGM-Ⅶm与LaSota灭活疫苗免疫效果比较试验 |
| 3.3.1 免疫后抗体效价比较 |
| 3.3.2 免疫后攻毒保护比较 |
| 3.3.3 临床症状和病理剖检变化 |
| 3.3.4 新城疫rGM-Ⅶm和LaSota灭活疫苗免疫SPF鸡后病毒分离检测 |
| 3.4 不同品种鸡免疫新城疫rGM-Ⅶm灭活疫苗后抗体水平的比较研究 |
| 3.5 抗体消长规律的测定 |
| 3.6 最小免疫剂量试验及免疫保护临界值试验 |
| 4 讨论与结论 |
| 4.1 全文讨论 |
| 4.1.1 NDV重组病毒疫苗株的选择 |
| 4.1.2 母源抗体对疫苗免疫效果的影响 |
| 4.1.3 同基因型疫苗与不同基因型疫苗免疫保护效果的差异 |
| 4.2 全文结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 硕士研究生期间所获科研成果 |
（10）12株NDV F/HN基因分析及鸭源毒株生物学特性测定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词英汉对照表 |
| 1 前言 |
| 1.1 NDV生物学特性 |
| 1.1.1 NDV结构特征 |
| 1.1.2 NDV的理化特性 |
| 1.1.3 NDV的培养特性 |
| 1.1.4 NDV毒力与致病性 |
| 1.1.5 血凝活性与神经氨酸酶活性 |
| 1.2 NDV基因组与结构蛋白特性 |
| 1.2.1 NDV基因组 |
| 1.2.2 NDV结构蛋白的特性 |
| 1.3 NDV的流行病学 |
| 1.4 NDV疫苗学概况 |
| 1.5 本研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 毒株、标准血清和抗原及雏禽 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要试剂的配制 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病毒复壮 |
| 2.2.2 病毒HA/HI测定 |
| 2.2.3 F基因与HN基因克隆与遗传进化分析 |
| 2.2.4 MDK/FS-SS/E/2007株的生物学特性检测 |
| 2.2.5 动物致病性试验 |
| 2.2.6 动物免疫保护试验 |
| 2.2.7 鸭源MDK/FS-SS/E/2007株F蛋白原核表达载体构建和表达 |
| 2.2.8 阳性重组表达质粒表达 |
| 3 结果 |
| 3.1 HA与HI试验结果 |
| 3.2 F基因与HN基因的PCR扩增结果 |
| 3.3 F基因核苷酸序列与氨基酸序列分析 |
| 3.3.1 F基因遗传进化分析 |
| 3.3.2 F基因核苷酸序列同源性分析 |
| 3.3.3 F蛋白氨基酸序列分析 |
| 3.4 HN基因核苷酸序列与氨基酸序列分析 |
| 3.4.1 HN基因核苷酸序列分析 |
| 3.4.2 HN蛋白氨基酸序列分析 |
| 3.5 MDK/FS-SS/E/2007株的毒力指标的测定结果 |
| 3.5.1 MLD与MDT测定结果 |
| 3.5.2 ICPI的测定结果 |
| 3.5.3 IVPI的测定结果 |
| 3.6 鸭胚ELD_(50)的测定结果 |
| 3.7 动物攻毒试验结果 |
| 3.7.1 雏番鸭攻毒试验结果 |
| 3.7.2 雏鹅攻毒试验结果 |
| 3.8 MDK/FS-SS/E/2007株疫苗免疫保护试验结果 |
| 3.8.1 MDK/FS-SS/E/2007株疫苗对雏鸭免疫应答结果 |
| 3.8.2 免疫保护试验结果 |
| 3.9 F蛋白原核表达载体构建结果 |
| 3.9.1 MDK/FS-SS/E/2007株的F基因PCR扩增结果 |
| 3.9.2 重组质粒pET30a-F-E双酶切鉴定结果 |
| 3.10 表达产物的SDS-PAGE鉴定 |
| 3.10.1 诱导时间的优化结果 |
| 3.10.2 IPTG诱导浓度的优化结果 |
| 3.10.3 重组蛋白可溶性分析结果 |
| 3.11 表达产物的Western-blot鉴定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 水禽源NDV的流行情况 |
| 4.2 12株NDV的F基因与HN基因序列分析 |
| 4.3 12株NDV的F蛋白与HN蛋白的抗原变异分析 |
| 4.4 MDK/FS-SS/E/2007株毒力测定与攻毒试验结果分析 |
| 4.5 MDK/FS-SS/E/2007株灭活疫苗免疫保护试验分析 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文 |
| 致谢 |
四、新城疫病毒F48E9株F基因主要功能区的核苷酸序列分析（论文参考文献）
- [1]嵌合鸡干扰素刺激因子12-2（ISG12-2）新城疫病毒载体疫苗免疫原性的初步评价[D]. 田健霞. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [2]鹅源新城疫病毒F基因和HN基因的克隆及序列分析[J]. 卢秀娴,张思远,梁昭平,林举攀,云骜,叶贺佳. 黑龙江畜牧兽医, 2020(13)
- [3]表达NDV蛋白的重组酵母构建及免疫效力评价[D]. 姚舜禹. 天津大学, 2020
- [4]鸽Ⅰ型副粘病毒的全基因组测序及病原学特性分析[D]. 何颖. 广西大学, 2020(02)
- [5]基因Ⅶ型NDV弱毒株感染性克隆的构建及病毒拯救[D]. 孟令宅. 河北农业大学, 2020(01)
- [6]鸡新城疫病毒增殖培养细胞系的筛选与稳定表达唾液酸转移酶（ST6Gal）细胞株的构建及其应用[D]. 董炳梅. 吉林大学, 2019
- [7]新城疫病毒新型可视化RPA-LFD检测方法建立与初步应用[D]. 刘志香. 华南农业大学, 2018(08)
- [8]新城疫病毒F蛋白的裂解位点氨基酸序列多样性及其它区段对细胞膜融合活性的影响[D]. 王艳红. 西北农林科技大学, 2018(11)
- [9]新城疫基因Ⅶd亚型重组病毒灭活疫苗的制备及评价[D]. 林秋燕. 华南农业大学, 2017(08)
- [10]12株NDV F/HN基因分析及鸭源毒株生物学特性测定[D]. 谭华龙. 佛山科学技术学院, 2017(01)