一、用PCR方法对虎DNA进行特异性检测（论文文献综述）
徐向东[1]（2021）在《鉴定鸡球虫种类的多重PCR方法的建立与应用》文中指出鸡球虫病是由艾美耳球虫（Eimeria spp.）寄生于鸡肠道引起的一种寄生虫病,其病原有7种,常为混合感染。各种鸡球虫的流行病学、致病性、免疫原性以及对药物敏感性不尽一致。因此,对鸡球虫种类鉴定与流行病学调查有助于鸡球虫病的防控。鸡球虫种类鉴定的传统方法,主要根据卵囊形态、虫体寄生部位、眼观病变特征、潜在期等生物学特征,这不仅要饲养无球虫感染的雏鸡,而且鉴定过程费时费力。为此,本文根据鸡球虫核糖体DNA内转录间隔区1（ITS-1）序列设计7对种特异性引物,建立鉴定鸡球虫种类的单重PCR与多重PCR方法;构建球虫ITS-1重组质粒,以重组质粒DNA为球虫rDNA阳性标准品;最后用多重PCR方法对如东县20个养殖户的31个鸡群进行鸡球虫流行病学调查。本研究建立的方法为鸡球虫病的防控提供了技术手段。1.鸡球虫种类鉴定的单重PCR方法的建立根据GenBank中柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）、毒害艾美耳球虫（E.necatrix）、堆型艾美耳球虫（E.acervulina）巨型艾美耳球虫（E.maxima）、早熟艾美耳球虫（E.praecox）、和缓艾美耳球虫（E.mitis）和布氏艾美耳球虫（E.brunetti）的ITS-1序列,设计7对种特异性引物,以7种鸡球虫的全基因组DNA为模板,分别进行PCR扩增,优化反应条件,建立7种球虫的单重PCR方法,并对其特异性和敏感性进行了研究。结果显示,每对引物均能扩增出特异性条带,其大小分别为278bp（柔嫩艾美耳球虫）、383bp（毒害艾美耳球虫）、476bp（堆型艾美耳球虫）、220bp（巨型艾美耳球虫）、390 bp（早熟艾美耳球虫）、350bp（和缓艾美耳球虫）和311 bp（布氏艾美耳球虫）,其最小检测浓度为0.01 ng。在刚地弓形虫、火鸡组织滴虫、住白细胞虫对照样本中均未扩增出任何条带,表明建立的方法具有很强特异性和较高敏感性。2.鸡球虫种类鉴定的多重PCR方法的建立在7种鸡球虫中,柔嫰、堆型和巨型艾美耳球虫在临床上最常见;柔嫰、毒害和布氏艾美耳球虫致病性大,均在盲肠中形成卵囊,且卵囊形态相似;早熟、和缓和堆型艾美耳球虫潜在期相近,卵囊形态相似。快速鉴别这些球虫种类,有助于鸡球虫病的准确诊断与防控。为此,应用上述鸡球虫虫种特异性引物,建立了能同时鉴定3种鸡球虫的多重PCR方法,并分别对其特异性和敏感性进行了研究。结果显示,每个多重PCR反应中的3对引物均能扩增出其特异性条带,其最小检测浓度为0.01 ng,其敏感性与单重PCR一致,在刚地弓形虫、火鸡组织滴虫、住白细胞虫对照样本中均未扩增出任何条带,表明建立的多重PCR方法具有很强特异性和较高敏感性。3.鸡球虫ITS-1序列重组质粒的构建及其在PCR检测中的应用纯化7种鸡球虫的单重PCR扩增产物,分别连接到pGEM-TEasy载体中,转入大肠杆菌DH5α感受态细胞,经蓝白斑筛选及限制性酶切分析,获得含ITS-1序列的重组质粒;对重组质粒中插入的片段进行测序,用MegAgin 7.1.0软件进行序列分析,并采用邻位相连法（Neighbor-joiningmethod,NJ）构建系统发育进化树;分别以含鸡球虫ITS-1序列的重组质粒DNA为模板,对应已知球虫的卵囊DNA为阳性对照,用上述特异性引物进行PCR扩增,验证构建的7种鸡球虫重组质粒作为球虫rDNA阳性标准品的可能性。结果显示,柔嫩、毒害、巨型、堆型、早熟、和缓和布氏艾美耳球虫的ITS-1 片段大小分别为 278 bp、383 bp、220 bp、476 bp、390 bp、350 bp、311 bp,经系统发育进化树分析,均与GenBank中相应虫种处于同一分枝,表明重组质粒DNA可用作球虫rDNA 阳性标准品。4.多重PCR方法在鸡球虫流行病学调查中的初步应用采用饱和盐水漂浮法和多重PCR方法对如东县20个养殖户的31个鸡群进行鸡球虫种类调查。结果显示,饱和盐水漂浮法检查,65%（13/20）养殖户和64.5%（20/31）鸡群感染球虫;多重PCR检测,75%（15/20）养殖户和70.9%（22/31）鸡群感染球虫;共检测到7种球虫,柔嫩艾美耳球虫感染率为64.5%（20/31）,毒害艾美耳球虫为38.7%（12/31）,堆型艾美耳球虫为35.5%（11/31）,早熟艾美耳球虫为45.2%（14/31）,巨型耳艾美球虫为19.4%（6/31）,和缓艾美耳球虫为19.4%（6/31）,布氏艾美耳球虫为12.9%（4/31）;优势种为柔嫩艾美耳球虫;布氏艾美耳球虫感染率最低;球虫均为混合感染（100%）,混合感染2种球虫最多,为36.3%（8/22）。地面圈养鸡群的球虫感染率（80.0%）高于笼养（33.3%）。调查结果为该地区鸡球虫病有效防治提供了依据。
王立冬[2]（2021）在《水貂圆环病毒RPA检测方法的建立及亚单位疫苗研制》文中认为背景:水貂是一种肉食性小型哺乳动物。水貂的皮毛轻柔结实,毛绒丰厚,可以制成多种毛皮制品,广受消费者欢迎。近年来,我国水貂产业发展迅速。然而,在水貂产业持续向好发展的同时,水貂的疫病,尤其是病毒性传染病给水貂养殖业带来了很大困扰。水貂的顽固性腹泻是一种由水貂圆环病毒（Mink circovirus,MiCV）感染引起的一种季节性传染病。该病发生在每年秋冬交替季节,主要引起水貂的红白痢,并伴有厌食、被毛粗乱等症状,发病率达到70-80%,多数病貂痊愈后毛皮质量下降,母貂次年繁殖能力降低;7-8%的病貂后期病情加重,出现黑色血便,口鼻苍白,最终死亡。自从上世纪70年代以来,该病一直在我国呈季节性暴发流行,严重威胁水貂养殖业的发展。然而,目前针对该病的防控技术非常有限,并且对该病的流行规律也缺乏系统全面的研究。目的:对我国主要水貂养殖区的MiCV感染情况进行流行病学调查,分析该病的流行规律,为该病的防控提供理论依据;建立MiCV重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification,RPA）方法,为该病的防控提供一种先进的检测手段;利用杆状病毒表达系统表达MiCV的Cap蛋白,并以此为基础研制针对MiCV的亚单位疫苗,为该病的防控和清除提供技术支持。即本课题拟从流行病学规律研究、检测方法建立、疫苗研制三方面为水貂顽固性腹泻的防控提供全套的解决方案。方法:1.于2019年和2020年,前往辽宁庄河、河北昌黎、山东诸城地区的水貂养殖场,对水貂顽固性腹泻发病情况进行现场调查并采集粪便样品进行检测,比较该病不同年份和不同地区的流行情况;比较不同性别、不同年龄水貂发病、死亡和感染情况,对发病水貂进行剖检,观察各组织脏器病变情况并取各组织脏器制作病理切片分析研究。检测发病水貂各组织脏器内的MiCV;通过对Cap基因进行序列比对分析2020年三地的MiCV Cap基因相比于2013年的突变情况。2.以英国Twist Dx公司的RPA试剂盒为基础,设计探针及若干对候选引物,从中筛选出扩增效果最佳的引物对,分别建立MiCV的基础RPA检测方法和实时荧光RPA检测方法。用不同浓度梯度的质粒作为模板进行RPA反应评估这两种方法的灵敏性;用PRA方法检测MiCV及其他几种水貂病毒,比较检测结果,评估RPA方法的特异性;对相同样品进行多次重复检测评估RPA方法的重复性;进一步优化反应条件,确定最佳反应温度、时间等参数;用这两种RPA方法检测46份临床样品,并与PCR方法检测结果进行对比。3.构建含有Cap基因的重组转移载体,将重组转移载体转化进含有杆状病毒基因组的DH10Bac感受态细胞内。扩增培养后用碱裂解法抽提DNA获得重组杆粒,将重组杆粒转染Sf9细胞,构建重组杆状病毒。扩增培养重组杆状病毒,测定病毒滴度;比对第1、5、10、15、20代病毒Cap基因序列评估其传代稳定性;用间接免疫荧光、SDS-PAGE及Western blotting的方法鉴定Cap蛋白是否成功表达。将重组杆状病毒接种High Five细胞,并进行悬浮培养,摸索最佳接毒量及培养时间从而获得最大产量的Cap蛋白。利用Cap蛋白配合合适的佐剂制成亚单位疫苗,分别在辽宁庄河和山东诸城的两个水貂养殖场进行田间免疫试验,免疫组和对照组水貂分别经肌肉注射了一剂次的亚单位疫苗和对照制剂。大约9月末开始,即水貂顽固性腹泻疫情来临时持续观察两组水貂的粪便形态,并采集粪便样品检测MiCV,统计比较两组水貂的发病率和粪便样品阳性率,从而评估疫苗的效力。此外,还统计了两组水貂次年的平均每窝产仔数。结果:1.对辽宁庄河、河北昌黎和山东诸城地区水貂养殖场顽固性腹泻进行流行病学调查显示:2019年辽宁庄河地区MiCV感染率为42.0%,发病率为36.6%,病死率为6.1%;2020年辽宁庄河地区MiCV感染率为36.0%,发病率为30.3%,病死率为4.8%;河北昌黎地区MiCV感染率为31.0%,发病率为14.3%,病死率为3.3%;山东诸城地区感染率为26.0%,发病率为1.8%,病死率为0%。相比于2013年,MiCV感染率、发病率和病死率均有所下降;从地区来看,辽宁庄河地区的水貂群体MiCV流行情况最严重,河北昌黎地区次之,而山东诸城地区流行情况最轻微,红痢占比较低,即便有发病个体也鲜有死亡。从性别来看,雄性和雌性水貂对于MiCV的感染率、发病率和病死率没有区别。从年龄来看,多年貂相比于当年新貂,MiCV感染率和发病率都更低。剖检观察到了发病水貂脾脏、肾脏和肠的病变;病理切片研究表明:发病水貂的肝小叶中央静脉和门管区以及肾小球旁发生炎性细胞浸润;肠上皮内杯状细胞数量增加。对发病水貂不同脏器进行MiCV检测的结果显示,发病水貂大肠、肝、脾和肾等组织均存在MiCV病毒DNA。对2020年三地MiCV Cap基因测序分析并与2013年进行对比,结果表明辽宁庄河、河北昌黎、山东诸城三地的MiCV Cap基因相比于2013年出现了多处碱基突变。其中MiCV-DL20 Cap基因产生14处碱基突变,导致4处氨基酸变化;MiCV-Hebei20 Cap基因碱基发生11处突变,导致3处氨基酸变化;MiCV-Shandong20 Cap基因发生3处碱基突变,但未引起氨基酸变化。2.成功建立了MiCV基础RPA检测方法和实时荧光RPA检测方法。基础RPA方法的灵敏度为5.4×102 copies/μL,而PCR方法的灵敏度为5.4×103copies/μL,基础RPA方法的灵敏性略高;用该方法对貂肠炎病毒、犬瘟热病毒及阿留申貂病病毒基因组进行扩增,未出现扩增条带,说明该方法具有良好的特异性;对不同浓度质粒标准品进行三次重复检测,灵敏度均能达到最大值,说明该方法的重复性良好;经过反应条件优化,确定了该方法的最佳反应条件为39℃、20min。该方法总检测耗时约为40 min,较PCR方法明显缩短。在此基础上,进一步建立了实时荧光RPA检测方法,其灵敏度达到了5.4×101copies/μL,灵敏度进一步提升。同样具有良好的特异性;批间重复试验和批内重复试验中,每次检测灵敏度都能够达到最大值,cq值变异系数在合理区间内,说明该方法重复性良好。经过反应条件优化,确定了该方法的最佳反应条件为39℃、20 min,醋酸镁浓度为140 m M。该方法相比基础RPA方法进一步缩短了检测时间,整个检测过程仅需20 min,并且配合便携式荧光扩增仪能实现现场快速检测。用这两种RPA方法和PCR方法检测同一批临床样品,两种RPA方法检测结果阳性率略高,但统计分析表明检测结果与PCR方法无显着差异。3.构建了重组转移载体、重组杆粒,并成功拯救出重组杆状病毒,培养滴度达到108TCID50/m L,传代稳定性良好,传代至第20代Cap基因也没有出现突变。间接免疫荧光、SDS-PAGE及Western blotting结果表明Cap蛋白得到了表达。随后将重组杆状病毒接种High Five细胞并实现了悬浮培养,经估算Cap蛋白产量最高达到了200μg/m L。以Cap蛋白为基础制备了MiCV亚单位疫苗。田间免疫试验结果显示:免疫组2000只水貂只有36只出现了典型腹泻症状,发病率为1.8%;而对照组1000只水貂有745只出现了典型腹泻症状,发病率为74.5%,免疫组的发病率明显低于对照组。对粪便样品进行检测显示,免疫组粪便样品MiCV阳性率为2.1%,而对照组为70.0%。整个田间试验过程中,未发现水貂接种疫苗后产生不良反应。此外,次年春天通过统计两组的怀孕母貂数和产仔总数得知,免疫组的平均每窝产仔数比对照组更高。结论:1.相比于2013年,水貂顽固性腹泻的感染率、发病率和病死率均有所下降;不同地区该病的流行情况有较大差异。不同性别水貂对于该病的易感性没有差异;而多年貂相比于当年新貂对于该病的易感性下降。发病水貂肝、脾、肾、肠上皮出现病变,多种组织脏器内存在MiCV病毒;辽宁庄河、河北昌黎、山东诸城三地2020年的MiCV毒株Cap基因序列相比于2013年发生了多处碱基突变,并引起了相应氨基酸的变化。2.成功建立了MiCV的基础RPA检测方法以及实时荧光RPA检测方法,检测灵敏度分别达到了5.4×102 copies/μL和5.4×101 copies/μL,且具备良好的特异性和重复性。这两种方法相比于PCR方法具有灵敏度高、反应速度快、常温下即可反应的优势。其中,实时荧光RPA方法能实现现场检测。3.成功构建了一株高效表达MiCV Cap蛋白的重组杆状病毒。利用表达的Cap蛋白制备了MiCV亚单位疫苗。田间试验表明该疫苗能显着减低水貂群体顽固性腹泻的发病率和感染率,且无明显不良反应,说明该疫苗具有良好的效力和安全性。此外还观察到免疫组水貂次年的平均每窝产仔数更高。本研究为MiCV的防控工作提供了理论依据和技术支持。
蒲勤丽[3]（2021）在《RNA表观遗传修饰生物传感检测新方法研究》文中研究指明真核生物的RNA中含有多种表观遗传修饰。其中,N6-甲基腺苷（m6A）是最常见且含量最丰富的甲基化修饰,尤其是在信使RNA（mRNA）和长链非编码RNA（lncRNA）中。最新研究表明,m6A在调控DNA复制、蛋白翻译、基因表达等生命过程中发挥着重要作用。然而,甲基化对各种疾病的具体调控机制（如肿瘤发生、髓样分化、干细胞分化、细菌感染及耐药调节等）仍不清楚。因此,构建特异、灵敏的m6A修饰检测方法对推动RNA表观遗传修饰在精准医疗方面的进一步研究具有重要意义。由于RNA中的m6A修饰（m6A-RNA）对核酸碱基性质影响较小,几乎不干扰Watson–Crick碱基配对。因此,单纯用测序和核酸杂交的方法无法直接有效检测。鉴于甲基化碱基的不可复制性,采用常规的扩增方法（如聚合酶链反应或核酸等温扩增策略）会导致甲基化信息丢失。且m6A修饰在实际样本中相对含量低,难以实现低甲基化样本的灵敏检测。此外,RNA样本具有不稳定性,在预处理环节容易降解,影响检测结果的准确性。根据目前m6A检测所面临的问题,本论文通过结合生物分子技术,电化学传感技术,纳米技术,荧光技术等,开发了类修饰纳米信号探针的m6A-RNA电化学生物传感检测方法;针对RNA中特定位点m6A修饰构建了甲基化特异性PCR扩增技术;以及整合CRISPR/Cas12a技术用于低甲基化样本的超灵敏检测。具体研究内容如下:1.基于类修饰纳米探针的电化学生物传感策略检测RNA中的m6A修饰本章节的研究以甲基化特异性抗体作为m6A的识别元件。基于抗体既能识别RNA中的m6A修饰,也能识别DNA中的m6A修饰。在这里,我们设计了一条类修饰的DNA探针（m6A-DNA）,可与m6A-RNA竞争结合电极表面的抗体。采用一步法合成具有优异催化性能的多孔铂钴纳米球（PtCo-MPNs）,将m6A-DNA与PtCo-MPNs结合,组装成类修饰纳米信号探针。纳米探针通过与靶标在电极表面的竞争反应,催化H2O2产生DPV信号输出,实现对m6A-RNA定量检测。构建的电化学传感方法在0.005100 n M范围内具有较好的线性,检测限低至2.1 p M。并实现了对多细胞提取的RNA样本的检测验证,与m6A免疫检测试剂盒结果具有较高的一致性。2.类核酸探针介导甲基化特异性PCR用于RNA特定位点m6A修饰检测研究前期构建的电化学免疫传感是对总m6A-RNA定量检测的有效方法。随着RNA修饰在生命科学中的深入研究,对总RNA修饰定量检测已经难以满足对疾病调控机制的精细剖析和临床检测诊断的需求,而特定位点m6A单碱基分辨定量检测成为近两年的研究趋势。此外,由于m6A在扩增过程中的不可复制性,在没有复杂的预处理情况下,常规扩增方法难以对m6A进行有效的检测,对特定位点m6A的灵敏分析仍存在困难。在这里,我们提出一种简单的类核酸（XNA）探针介导的甲基化特异性逆转录定量聚合酶链反应（MsRT-qPCR）。本实验设计了一条XNA探针来封闭未修饰RNA（A-RNA）模板的m6A对应腺嘌呤（A）位点。基于m6A-RNA和A-RNA与锁核酸（LNA）之间的解链温度差异,反转录引物选择性的与m6A-RNA上的XNA探针发生链置换反应结合在模板上,实现了对m6A-RNA模板选择性的PCR扩增。为了进一步保证方法的准确性和灵敏度,采用新型寡核苷酸修饰的磁性纳米探针取代抗体依赖的免疫沉淀法（Immunoprecipitation,IP）分离纯化细胞提取的RNA样本。构建的方法可对m6A-RNA甲基化分数为0.11.0范围内的线性检测。利用该方法,我们也成功定量了Hela细胞lncRNA中2577位点的m6A分数。并对Hela和HEK393T细胞的mRNA和lncRNA中的多个已知甲基化位点进行检测验证,与文献报道的结果具有高度一致性。构建的方法成本低廉,只需常规的实时PCR仪即可进行检测,有望实现临床和常规实验室的转化应用。3.MsRT-PCR整合CRISPR/Cas12a信号放大检测RNA特定位点的m6A修饰由于人类细胞lncRNA和mRNA中大部分m6A位点甲基化分数在6%80%之间,前期构建的MsRT-qPCR方法在低甲基化分数样本检测的扩增循环曲线ΔCt差异较小,难以准确高效的区分这些低甲基化位点差异。基于短回文重复序列（CRISPR）基因编辑系统是近年来研究较多的基因特异性编辑工具。本研究将前期构建的甲基化特异性PCR反应和CRISPR/Cas12a系统整合,采用PCR扩增的双链DNA（dsDNA）产物激活CRISPR/Cas12a系统对报告探针的剪切,实现荧光信号的放大输出,进一步提高了检测方法的灵敏度。通过信号扩增,检测甲基化分数为0.050.2的m6A-RNA样本具有较好的检测线性。并对细胞mRNA样本中的多个低甲基化位点进行检测,与前期qPCR结果相比,检测灵敏度具有明显提升。
李俚[4]（2020）在《水貂阿留申病流行病学调查及EvaGreen荧光定量PCR方法的建立与应用》文中指出水貂阿留申病（Aleutian Disease of Mink,AMD）是由水貂阿留申病毒（Aleutian Mink Disease Virus,AMDV）感染水貂而引起的一种高度传染性疾病,该病可降低水貂的生产性能,增加仔貂的死亡率,使水貂毛皮品质下降,从而引起水貂业巨大的经济损失。我国水貂主要从国外引进,尽管引进过程中,海关部门对水貂全群进行了严格的检疫,但在此后的一年左右时间,几乎所有进口水貂场都发现了AMDV的感染。一些水貂场利用对流免疫电泳（Counter-immunoelectrophoresis,CIEP）技术对群体水貂进行检疫,并以此淘汰染病水貂,对貂场实施净化,然而效果并不理想。因此,本研究拟对进口水貂场AMDV的来源进行分析,探讨CIEP方法检疫净化失败的原因,并建立一种适用于我国水貂AMD检测的手段,为AMD防控工作提供必要的理论依据和技术支撑。本研究的内容分为以下6部分:（1）选择位于水貂主要养殖地区（黑龙江、辽宁、山东和河北）的四个水貂场开展AMDV流行情况的调查。四个水貂场中的三个为进口水貂场。2015年～2017年,四个水貂场收集共计442,180份血液样品,于不同时期用CIEP对AMDV的感染情况进行监测,并根据监测结果对其中两个进口水貂场实施净化。结果发现,这两个水貂场AMDV的抗体阳性率呈波浪式逐年递增,表明利用CIEP检疫并淘汰阳性水貂的策略虽可减缓AMD的扩散,但无法借以实现对该病的净化,CIEP检测方法可能存在敏感性不足的问题。另外,通过对比各场水貂的年平均产仔数发现,当群体AMDV感染率较低的情况下,水貂年平均产仔数几乎未受到影响;但随着场内AMDV感染率的上升,水貂的年均产仔数呈下降的趋势;在相同感染率的情况下,进口水貂养殖场相比本地的水貂年均产仔数受AMD的影响更大,因此有必要加强对进口水貂AMD的防控。（2）为研究不同检测方法监测AMD的效果,本研究分别利用CIEP、免疫胶体金（Immune colloidal gold technique,GICT）和PCR方法,对50只水貂来源的样品进行了检测。结果显示,CIEP的检出率为44%,GICT的检出率为42%,两者的阳性符合率是61.90%。常规PCR检测阳性检出率为84%,CIEP和GICT与PCR方法的阳性符合率分别为54.76%和42.85%。不同方法之间符合率较低,应与AMDV感染水貂后,水貂体内产生抗体和病毒血症的复杂性有关。（3）为探讨CIEP在应用过程中检出率低的原因,本研究从四个地区来源的样品中分离了12株AMDV毒株,分别对这些分离毒株的全基因组、NS1基因和VP2基因,以及各毒株的VP2蛋白进行了分析。结果显示,目前我国流行的AMDV毒株相互间的遗传关系较近,而与国外报道的毒株间遗传关系较远,进口水貂场感染的AMDV应源自国内,感染的途径应与水貂的频繁跨省串种有关。通过比较AMDV VP2的氨基酸序列发现,VP2基因共编码645-647个氨基酸,12个分离毒株与其它参考毒株间共存在37个位点变异,在232-242位氨基酸之间存在一段氨基酸高变区,不同来源毒株差异较大。利用IEDB在线分析工具分析VP2氨基酸的抗原性,共获得22个预测的B细胞表位。其中,6个表位在不同毒株之间完全一致,7个表位位点存在1个氨基酸差异,2个表位位点存在2个氨基酸差异,4个表位位点存在3个氨基酸差异,3个表位位点存在4个氨基酸差异。氨基酸变异多存在于预测的抗原表位上,可能是导致AMDV免疫原性发生变化的主要原因,具体哪些位点起到主要作用还需要进一步研究。（4）为了建立可靠的AMDV检测方法,针对NS1基因保守区域设计引物,建立了Eva Green荧光定量PCR方法,该方法最低可检测到1拷贝/μL的AMDV基因组和3pg/μL的病毒DNA样品,且具有良好的特异性和重复性。分别用Eva Green荧光定量PCR、常规PCR方法和进口Taq Man荧光定量PCR试剂盒对83例水貂临床血样进行检测,Eva Green荧光定量PCR的检出率为97.59%,常规PCR方法和Taq Man荧光定量PCR的检出率分别是89.15%、0.00%。为探究Taq Man试剂盒未检出阳性样品的原因,本研究使用试剂盒中的引物和探针混合液,利用Eva Green染料法对上述样品进行了再次的检测,该方法的阳性检出率为95.18%。通过分析其扩增产物序列发现,试剂盒不工作的原因是因为Taq Man探针与国内分离的AMDV基因序列不匹配,所以进口Taq Man试剂盒不适用于我国AMDV的检测。而Eva Green荧光定量PCR不仅能够检测到国内的病毒分离株,还能检测到美国的ADV-G病毒株,是一种通用型的检测技术。（5）为评价Eva Green荧光定量PCR方法在环境样品检测中的应用效果,本研究利用该方法对不同水貂场的环境样品进行了检测。结果显示,AMDV感染水貂场中不同类别物品表面AMDV的污染程度不同。消毒物品未检出AMDV,或检出数量很低;与水貂直接接触的物品,如水貂笼、水槽、捉貂手套以及粪坑土中AMDV的污染程度相对较高;而间接接触的物品,如工作鞋底、场内地面、车辆轮胎表面的污染程度相对较低;对于场外环境,如场外地面、工人自用鞋底,尽管污染的程度很低,但仍有AMDV被检出,表明AMDV可随人员及物品的流动散播。对于清空了水貂但未经消毒的感染水貂场,其场内环境中仍有AMDV检出,因此建议旧场在引入健康水貂前必须彻底消毒。（6）为评价Eva Green荧光定量PCR在AMD净化中的应用效果,本研究采用Eva Green荧光定量PCR与GICT联合检疫的方法,对AMDV感染率在23.71%的水貂场开展检疫净化工作。第二年同期该场AMD的感染率为17.24%,较上一年同期有显着下降,表明Eva Green荧光定量PCR可用于AMD的检疫净化。综上,本研究对位于我国主要养殖地区水貂场的AMD流行情况开展了调查,分析了四个省份AMDV流行毒株的遗传进化特征,明确了进口水貂场所感染的AMDV应源自国内,探讨了CIEP漏检造成的“AMD净化困难”,并在此基础上建立了敏感性、特异性和重复性良好的Eva Green荧光定量PCR方法。该方法的初步应用结果表明,Eva Green荧光定量PCR不仅能够应用于AMD的检疫净化,还可以用于水貂进境前的场地选址,新引进水貂的群体感染状况和水貂场环境污染的监测工作中,为防控AMD提供了有效的技术手段。
回卫荣[5]（2020）在《河北省PCV2和PCV3分子流行病学调查及双重纳米PCR检测方法的建立》文中指出圆环病毒病是由圆环病毒感染所引起的器官功能性障碍或繁殖障碍疾病,该病是世界范围内公认的严重危害养猪业的主要疾病之一,当与其他病毒混合感染时往往对猪造成严重的危害。为了解PCV2在河北省流行特点及遗传演化规律,本研究建立PCV2和PCV3双重纳米PCR检测方法,对河北省养猪场的379份临床样品进行PCV2和PCV3检测,并对47阳性样品进行了PCV2 ORF2基因测序分析,部分PCV2和PCV3全基因序列分析,结果如下:1.应用PCR方法对379份临床样品进行检测。结果发现PCV2的阳性感染率达到53.6%,PCV3的阳性感染率较低为25.6%,而PCV2和PCV3混合感染率为12.1%,表明我省北部地区PCV2和PCV3感染较普遍。47个强阳性样品的PCV2 ORF2基因遗传演化分析,结果发现20152019年间河北省PCV2优势流行毒株为PCV2b和PCV2d亚型,但亦存在少数PCV2e的流行。2.应用PCR检测方法对2株PCV2（HB-PCV2-5、HB-PCV2-182）和1株PCV3（HB-PCV3）阳性毒株的全基因进行扩增、克隆、测序和遗传进化分析。结果显示,QHD1-PCV2-5属于PCV2e,QHD2-PCV2-182属于PCV2d,与参考毒株间同源性为93.3%-99.6%;与2010年后分离的毒株同源性高,亲缘关系近,提交至GenBank的登陆号为MT711855和MT711856。QHD-PCV3属于PCV3b亚型,GenBank的登陆号为MT71187。3.参照GenBank上PCV2和PCV3的完整序列,用Premier 5.0软件设计了两对特异性圆环病毒检测引物,分别为PCV2-F/R,PCV3-F/R,通过基因扩增等方法将阳性组织样品DNA制作成重组质粒pMD-PCV2和pMD-PCV3,以重组质粒为模板,对引物用量和退火温度进行摸索优化。结果显示,重组质粒pMD-PCV2和pMD-PCV3双重纳米PCR方法在温度为54.5℃,引物用量为1.0μL时,扩增效率最高。敏感性试验表明纳米PCR方法的灵敏度是普通PCR的100倍,其中质粒pMD-PCV2和pMD-PCV3的最低模板检出量为1.2×103copies/μL,特异性试验表明病毒核酸之间不存在交叉反应。
瞿展[6]（2020）在《牛源性成分环介导等温扩增检测方法和转基因玉米C0030.2.4基体标准物质研制》文中提出本研究第一部分的研究内容为牛源性成分环介导等温扩增检测方法的建立。动物源性成分检测是我国动物源性制品安全管理的重要内容,目前市场上肉制品良莠不齐,不但损害消费者利益,还带来食品安全隐患,因此亟待建立一种快速、稳定的肉制品来源检测方法。本研究建立了一种可靠的环介导等温扩增（Loop mediated isothermal amplification,LAMP）方法,实现肉制品中牛源性成分（牦牛、水牛、美洲野牛）的快速检测。通过建立筛选物种特异性基因组DNA序列的生物信息算法,获得普通牛及其近缘种具有种间相似性的保守基因组DNA序列,并完成测序验证,在此基础上建立牛共用LAMP体系和特异LAMP体系,并进行参数优化。在1小时内,牛共用LAMP方法能特异地检测出普通牛、牦牛、水牛和美洲野牛成分,普通牛特异LAMP方法能特异地检测出普通牛成分,美洲野牛特异LAMP方法能特异地检测美洲野牛成分。三种方法的灵敏度均达到0.02 ng/μL。在实际样品检测中,牛共用LAMP方法特异地检测出了含有牛肉成分的市售样品。建立的方法具有高特异性,高灵敏度,反应快速、操作简便、无需精密仪器等优势,可应用于市售肉及其制品中牛源性成分的实际检测,为市售动物源性制品成分的真实性与我国食品安全管理提供保障。本研究第二部分的研究内容为转基因生物检测标准物质的研制。一直以来,我国十分重视转基因生物安全及其检测工作,颁布了一系列转基因生物安全管理标识制度、法律法规和相关国家标准。其中转基因检测标准物质是转基因生物安全研究中必不可少的保障。本研究制备了具有抗虫耐除草剂特性的转基因玉米C0030.2.4基体标准物质。通过对转基因玉米C0030.2.4及其受体材料候选物进行筛选与特异性鉴定,分别冷冻研磨,然后按照50 mg/g、10 mg/g、5 mg/g质量配比的理论值分别进行配比混合,得到三种不同浓度的转基因玉米C0030.2.4基体标准物质C0030.2.4a、C0030.2.4b、C0030.2.4c。基于实时荧光定量PCR方法,分别测试其均匀性、最小取样量和稳定性。均匀性分析结果表明研制的三种标准物质均具备良好的瓶间与瓶内均匀性。稳定性分析结果表明研制的三种标准物质均可在-20℃、4℃、25℃、37℃下保持4周稳定,能够常温运输,同时可在-20℃、4℃下稳定储存至少6个月。标准物质每瓶分装1 g,最小取样量为100 mg。用重量法配比的质量分数作为标准值并评估不确定度,C0030.2.4a、C0030.2.4b、C0030.2.4c分别赋值为（50.73±1.84）mg/g、（10.15±1.69）mg/g、（5.09±0.37）mg/g。用微滴式数字PCR方法测定拷贝数分数并进行不确定度分析,C0030.2.4a、C0030.2.4b、C0030.2.4c的量值分别赋值为（49.81±1.96）mg/g、（10.11±1.71）mg/g、（5.01±0.38）mg/g。经过一系列的质量评估,本研究所研制的三种转基因玉米C0030.2.4基体标准物质能够稳定地应用于转基因玉米C0030.2.4特异性定性、定量检测方法评价,对进一步推进我国转基因检测标准物质的研究进程与贯彻实施我国转基因生物安全管理法规具有深远意义。
宋海港[7]（2020）在《江苏地区水禽源重要病原菌的临床检测及大肠杆菌的分子流行病学和部分特性研究》文中进行了进一步梳理近年来,水禽疫病并没有因为规模化程度的提高而降低,并且多种病原继发或并发使得细菌病病情更加复杂,加之部分地区药物敏感性监测、综合性防治措施和流行病学数据尚不完善,因而造成抗生素药物的乱用和滥用,在生产养殖中给水禽细菌病的预防和控制带来了严峻的挑战。为快速检测江苏地区水禽源的4种重要病原菌,根据大肠杆菌F1菌毛A亚基基因（fimA）与P菌毛C亚基基因（papC）、鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白（OmpA）基因（ompA）、产单核细胞李氏杆菌溶血素基因（hlyA）、沙门氏菌肠毒素基因（stn）,合成5对引物,建立了快速检测的PCR方法。于2017～2019年采集江苏10个地级市水禽规模养殖场的768份样品,其中包括临床健康肛拭子样品510份,临床发病水禽组织样品258份。运用PCR方法对4种水禽重要病原菌进行了检测,结果发现江苏地区水禽样品大肠杆菌F1菌毛基因与P菌毛基因的平均检出率分别为74.21%（570/768）和0.78%（6/768）,沙门氏菌平均检出率为5.60%（43/768）,鸭疫里默氏杆菌平均检出率为2.73%（21/768）,产单核细胞李氏杆菌平均检出率为7.42%（57/768）。表明江苏地区水禽细菌性疾病中大肠杆菌的发病率最高,产单核细胞李氏杆菌感染也不容忽视,该结果为水禽源细菌病的防控提供一定参考数据。大肠杆菌在水禽细菌病中极为重要,因此为了揭示大肠杆菌各个毒力基因的分布情况,对以上检出大肠杆菌阳性的355份肛拭子样品和213份组织样品,运用PCR方法检测其中所含有的大肠杆菌主要毒力因子的基因（温度敏感性血凝素基因Tsh、溶血素E基因hlyE）和大肠杆菌毒力岛基因（ETT2毒力岛ECs3703和ECs3737基因、HPI毒力岛irp2基因和LEE毒力岛eaeA基因）。通过大肠杆菌的分离纯化和鉴定,从肛拭子样品获得342株大肠杆菌,共有12种毒力基因组合,表型分别为F1+（217株）,F1+ETT2+（56株）,F1+HlyE+（3 株）,ETT2+HPI+（15 株）,F1+ETT2+HPI+（13 株）,F1+HPI+Tsh+（1 株）,F1+ETT2+HPI+Tsh+（7 株）,F1+E-TT2+LEE+Tsh+（8 株）,F1+P+ETT2+Tsh+（2 株）,F1+ETT2+LEE+Tsh+HlyE+（3 株）,ETT2+（6株）,F1+HPI+（11株）,从临床发病组织样品共获得206株大肠杆菌,共有13种毒力基因组合,分别为 F1+（13 株）,F1+ETT2+（39 株）,F1+HlyE+（2 株）,F1+E-TT2+HPI+（100 株）,F1+HPI+Tsh+（7 株）,F1+ETT-2+HPI+Tsh+（7 株）,F1+ETT2+LEE+Tsh+（5株）,F1+P+ETT2+Tsh+（4 株）F1+ETT2+LEE+Tsh+HlyE+（3 株）,ETT2+Tsh+（2 株）,Tsh+（7 株）,ETT2+HPI+（4株）,通过比较发现临床健康水禽和发病水禽分离株的基因组合共有15种,上面前10种基因组合是相同的,但比率不同,临床健康水禽致病性大肠杆菌肛拭子分离株中仅单一基因F1+菌株高达63.45%,其次是F1+ETT2+占比16.37%,而发病水禽致病性大肠杆菌组织分离株中占比率最高的基因组合为F1+ETT2+HPI+占比率高达48.54%,其次为 F1+ETT2+占比 1 8.93%。为分析水禽源大肠杆菌的药物敏感性,选取13种抗生素对以上地区获得的大肠杆菌进行药敏实验。结果显示,总体上临床健康与发病水禽源分离株对13种药物的敏感度差异不大,超过70%以上的水禽大肠杆菌分离株对强力霉素和四环素耐药,超过70%以上的水禽大肠杆菌分离株对磷霉素、多黏菌素B敏感。进一步分析发现,99.7%大肠杆菌分离株为多重耐药,最常见的耐药组合为强力霉素+四环素+新霉素+复方新诺明,不同地区、不同养殖场对药物的敏感度呈现一定的差异,但对强力霉素、四环素的耐药性具有普遍性。为了研究带有不同毒力因子的大肠杆菌的致病性差异,将分离已知毒力因子的大肠杆菌（F1+菌株、F1+ETT2+菌株和F1+ETT2+HPI+菌株）各一株,分别测定其对一周龄雏鸭的半数致死量（LD50）,结果表明,毒力基因为F1+ETT2+HPI+的致病性大肠杆菌分离株毒力最强（LD50 为 2.88×108 CFU/0.5 mL）,其次是F1+ETT2+菌株（LD50 为 6.92×108 CFU/0.5 mL）,F1+菌株毒力相对最弱（LD50为4.28×109 CFU/0.5mL）,测定结果表明,水禽源致病性大肠杆菌毒力强弱与其所含的毒力基因数量呈正相关,其含有的毒力基因越多,毒力就相对越强。
孙瑶[8]（2020）在《以诺如病毒P颗粒为载体的pTau31表位疫苗对阿尔茨海默症的治疗研究》文中提出阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是一种进行性发展的神经退行性疾病,是当代社会中老年人口中最常见的痴呆形式。AD的神经病理学特征包括由淀粉样蛋白（Aβ）形成的细胞外斑块、过度磷酸化微管相关蛋白（tau）积累形成的细胞内神经纤维缠结（neurofibrillary tangles,NFT）和广泛的神经元丢失。长久以来,“淀粉样蛋白级联假说”认为Aβ肽的异常积累是AD发病的关键。然而,迄今为止,集中于减少Aβ沉积的Aβ免疫疗法均未产生临床上有意义的结果。因此,单纯通过消除Aβ病理学不足以达到治愈AD的效果,而开发靶向tau病理学的治疗手段也成为了一种非常有潜力的治疗策略之一。Tau蛋白是哺乳动物神经系统中的一种主要的微管相关蛋白（由microtubule-associated protein（MAPT）基因编码）,在生理条件下调节微管的组装和稳定性以及轴突运输。然而,在病理生理条件下,在AD和相关的病理性疾病（包括皮质基底变性（CBD）,进行性核上麻痹（PSP）,Pick病（PD）和额颞叶痴呆（FTLD））中,大量毒性表位的tau出现了异常高水平的磷酸化,如Ser202、Thr205、Ser238、Ser404等。MATP基因编码缺陷和tau蛋白过度磷酸化引起的疾病统称为tau蛋白病。迄今为止,散发性tau病中tau蛋白过度磷酸化的主要原因仍不确定。在家族性tau蛋白病患者中,已经鉴定出的包括G272V,P301L,P301S,V337M和R406W在内的遗传突变,易使tau蛋白过度磷酸化,从而损害了tau促进微管组装的能力。这些突变促进tau的聚集,形成成对的螺旋丝（PHF）和神经原纤维缠结（NFT）。为了研究tau病理在体内的病理过程和开发基于tau病理的药物,科学家们开发了一系列表达人突变tau基因的模型动物。这些tau转基因小鼠模型具有一些重要的AD病理特征,包括突触病理学、NFT形成和神经元丢失,已经成为探索tau功能障碍的机制和开发神经退行性疾病疗法的重要工具。其中TauP301S（PS19系）就是一种被广泛使用的阿尔茨海默tau病理小鼠模型。P301S转基因小鼠脑内人源tau蛋白表达水平比内源性tau小鼠高约5倍,从而导致P301S小鼠在脑内快速产生较为严重的tau病。P301S转基因小鼠在6月龄时产生tau纤维并逐渐发育,其在9-12月龄是逐渐富集并伴有明显的神经元死亡和脑萎缩。除此之外,tau转基因小鼠也存在肌肉萎缩和运动功能失调等行为学异常。然而,虽然目前P301S小鼠被广泛应用于AD药物的临床前评价中,普遍采用行为学和病理学等实验对药物的有效性进行评价,但对该小鼠模型的行为学、病理学、血清学等指标随年龄变化的趋势以及他们之间的关系知之甚少。另外,在老年痴呆疾病的流行病学研究中发现,男性和女性人群的AD发病率、发病症状、生存期等方面存在明显差异,但性别差异在以P301S小鼠为模型的药物研究中并未受到关注。在本研究中,我们首先系统地考察了不同性别和年龄的Tau P301S转基因小鼠在行为学、tau病理学、以及血浆和脑生物标志物方面的差异,并探究了tau蛋白病进程中这些因素之间的相关性,也筛选到了一些可以指示P301S小鼠tau病理发展的潜在的生物标记物指标。结果表明,与野生型同窝小鼠相比,雄性P301S转基因小鼠在体重、存活率、后肢夹紧评分、脊柱后凸评分、复合表型评分总分、筑巢能力、脑中pTau（S202/T205）和胶质细胞水平方面表现出显着变化。相比之下,雌性P301S转基因小鼠仅对水迷宫实验和实验开放旷场实验敏感。此外,我们发现了血浆中巨噬细胞炎症蛋白（MIP-3α）缺乏和干扰素（IFN-γ）、白介素-5（IL-5）、IL-6上调,这些因子可以作为潜在的AD生物标志物。目前靶向磷酸化tau的主动免疫疗法是新型的AD治疗方法。然而现在处于临床前或临床阶段的Tau表位疫苗最多携带两个磷酸化位点,治疗效果有限。主动疫苗如何在体内维持高水平、长时程的抗体也有待探究。另外,疫苗的作用机制也未得到深入研讨。为解决这些问题,我们研发了一种以诺如病毒P颗粒为载体的靶向磷酸化tau病理位点的主动疫苗,并在P301S小鼠中进行免疫原性、安全性和有效性的评估。为了筛选出最优的tau疫苗的磷酸化表位,我们对AD患者中最易出现高度磷酸化tau位点的附近的截短的多肽进行组合,并筛选出了具有Ser202、Thr205、Ser396、Ser404磷酸化靶点的pTau31多肽抗原表位,该多肽可在在体内诱导产生针对四种磷酸化表位的特异性抗体,且不会产生针对磷酸化和非磷酸化tau蛋白的T细胞免疫反应。随后,我们将合成的pTau31多肽通过半胱氨酸/空气氧化法偶联到诺如病毒P颗粒蛋白载体上,成功获得以诺如病毒P颗粒为载体的磷酸化tau表位疫苗,PP-pTau31。我们在几种候选佐剂中筛选了能引起高抗体水平的、诱导的抗体持续时间长且无T细胞免疫反应风险的CpG和AS02佐剂组合用于主动疫苗的免疫。我们在P301S转基因小鼠中对PP-pTau31疫苗的免疫原性、安全性和有效性等方面进行考察。结果显示,PP-pTau31疫苗可成功降低P301S小鼠脑内磷酸化tau蓄积、降低脑内胶质细胞增生、缓解tau相关的运动功能障碍及改善认知水平,且不会诱发针对磷酸化和非磷酸化tau的T细胞免疫反应、无体内炎症因子和趋化因子异常,无脏器毒性。另外,我们还对PP-pTau31疫苗诱导的抗体的作用机制进行了探讨。结果表明,pTau31特异性抗体可能通过多种途径降低tau病理的影响:（1）血液中抗体通过结合血中游离的pTau造成血/脑中pTau浓度差,促进脑内病理tau蛋白外排入血,从而降低脑中磷酸化tau蛋白含量;（2）部分血液中的抗体跨越血脑屏障,结合脑中游离的病理tau蛋白,抑制其对神经元的毒性作用;（3）部分血液中的抗体跨越血脑屏障,与脑中的NFT结合形成抗体-抗原复合物,使其降解从而降低tau病理。综上,我们成功完成对TauP301S转基因鼠的行为学、病理学、血清学等方面的研究,掌握了各指标与发病进程的相关性,并发现了MIP-3α等潜在的生物标志物。在此基础上,我们也完成了一种以诺如病毒P颗粒为载体的Tau表位疫苗的开发,PP-pTau31。结果表明该疫苗可在TauP301S模型小鼠中产生高水平、长时间存在的pTau特异性抗体,在行为学、病理学等方面降低发病特征,并无T细胞免疫反应、细胞因子异常及脏器损伤等安全风险。
焦敬波[9]（2020）在《具核梭杆菌荧光标记滚环扩增检测方法》文中指出具核梭杆菌具核亚种普遍存在于人和动物的口腔中,但在一定条件会引发疾病,特别是与结肠癌密切相关。传统的检测方法,如细菌培养与鉴定技术,虽然被认为是细菌检测的金标准,但是费时费力,不能满足快速检测的需求。而聚合酶链反应、色谱法等新型检测方法依赖于昂贵的专业仪器,不利于现场的实时检测。以具核梭杆菌具核亚种的nusG基因为模板设计特异性锁式探针和捕获探针,结合分子信标技术,建立了具核梭杆菌具核亚种荧光标记滚环扩增检测方法。通过对滚环扩增反应和荧光检测体系的优化,获得了滚环扩增的最佳条件:锁式探针最佳连接温度为67℃,Taq DNA连接酶用量为0.15μL,锁式探针浓度为0.4 μM,消化产物用量为10 μL,捕获探针杂交温度为57℃,捕获探针用量为1.5 μL,phi29 DNA聚合酶用量为1μL;荧光检测体系的最佳条件:Tris溶液浓度为0.1 M,Tris-HCl缓冲液pH为9.0,检测探针浓度为0.1μM,检测探针杂交温度为72.6℃,杂交时间为40 min。特异性实验结果显示锁式探针的特异性强,不与具核梭杆菌多形亚种、文森特亚种,脆弱拟杆菌等14株其他菌株产生交叉反应;检测探针能够区分目标序列和一至三个碱基差异的序列。全基因组检测浓度在0.7 ng/L-0.7 mg/L范围内,荧光强度随着全基因组浓度的增加呈现线性增加,线性回归方程为F=624.93+31.501g C,相关系数为0.991,荧光标记滚环扩增检测方法的检出限为0.7 ng/L。粪便样品加标实验表明荧光标记滚环扩增检测方法可以明显区分具核梭杆菌具核亚种微量、少量、大量存在的不同情况。而食物样品的检测结果表明:在复杂环境下,荧光标记滚环扩增检测方法的灵敏度和特异性更出色。所建立的具核梭杆菌具核亚种荧光标记滚环扩增检测方法,具有特异性高、检出限低等优点,可以用于现场快速检测,对于具核梭杆菌具核亚种的检测具有重要的意义。
王盛琳[10]（2020）在《重组酶聚合酶扩增（RPA）技术检测日本血吸虫核酸方法的建立与初步评价》文中提出目的:系统评价各种日本血吸虫核酸检测技术的诊断价值,并采用综合评价较高的重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification,RPA）技术,建立一种特异、敏感、快捷的日本血吸虫核酸检测方法,并初步评价其应用于感染早期检测的潜在价值。方法:计算机检索1990年1月-2019年6月中国知网、万方、ScienceDirect和PubMed数据库中公开发表的与日本血吸虫核酸检测相关的文献,并结合手工检索和参考文献追溯法以最大程度地保证文章的查全。严格按照纳入与排除标准对文献进行筛选,纳入符合条件的文献并提取其中相关数据,采用Meta分析法对各种核酸检测技术的诊断价值进行综合评价。选择日本血吸虫Sj28S基因片段为靶序列,应用手工筛选法并辅以Primer Premier 5软件设计引物,进行温度、时间的优化以确定最佳反应条件,构建基于基础反应体系的RPA检测方法。提取日本血吸虫及其他寄生虫基因组DNA评价所建立方法的特异性。评价方法的敏感性,并与PCR和LAMP法的敏感性进行比较。此外,评价方法对血吸虫不同虫期基因组DNA的检出性能。制备血吸虫阳性钉螺及阴性钉螺不同混合比例的DNA样本,评价RPA方法的最低检出混合度和稳定性。建立5条、10条、20条、40条尾蚴梯度感染小鼠的动物模型（不同组别分别简称为“5尾组”、“10尾组”、“20尾组”、“40尾组”）,并于感染后第3d、lw、2 w、3 w、4 w、5 w、6 w收集小鼠粪便及血清样本,编号后进行冷冻保存。毛蚴攻击感染钉螺,于感染后第1 d、3 d、5 d、1 w、2w、3w、4w、5w、6w、7w、8w、9w、10 w、11 w分别收集10只钉螺样本,解剖镜检后进行冷冻保存。提取小鼠和钉螺样本的DNA,进行PRA与PCR两种方法的平行检测,综合评价RPA方法检出血吸虫早期感染的效能。结果:Meta分析共纳入19篇文献,其中中文文献5篇、英文文献14篇;共24组研究,其中17组研究涉及变温扩增技术与金标准的比较、7组研究涉及等温扩增技术与金标准的比较。文献质量评价结果表明,所纳入文献总体偏倚较小;Deek漏斗图提示变温扩增技术相关文献可能存在发表偏倚。变温扩增技术各研究之间存在非阂值效应引起的异质性,采用随机效应模型对合并效应量进行分析,结果显示:检测日本血吸虫病的综合灵敏度为0.81（95%CI:0.79-0.83）、特异度为0.73（95%CI:0.7]-0.74）、SROC曲线下面积为0.944 3。等温扩增技术各研究之间不存在异质性,采用固定效应模型对合并效应量进行分析,结果显示:检测日本血吸虫病的综合灵敏度为 0.96（95%CI:0.94-0.98）、特异度为 0.95（95%CI:0.94-0.97）、SROC 曲线下面积为0.989 9。构建的RPA方法可成功地扩增出日本血吸虫216 bp大小的目的基因片段。RPA的最佳反应条件最终选择为390C、20 min。该方法与曼氏血吸虫、埃及血吸虫、单尾尾蚴感染钉螺、华支睾吸虫、大片吸虫、卫氏并殖吸虫和牛带绦虫及阴性钉螺基因组DNA均无交叉反应。RPA法对于日本血吸虫成虫基因组的最低检出限为100 fg/μl,针对重组质粒的最低检出限为100拷贝/μl,且敏感性高于普通PCR和LAMP法。RPA法对日本血吸虫不同发育阶段的基因组DNA样本进行检测,各虫期均能被准确检出。应用建立的RPA方法检测阳性钉螺及阴性钉螺不同混合比例的DNA样本,结果显示,最低检出比例为1:1000。重复性试验结果显示,该方法重复性好且准确性高。动物模型结果显示,RPA法对20尾组小鼠可在第4 w检出粪便DNA阳性,10尾组和40尾组均可在第5 w检出粪便DNA 阳性,5尾组的低感染组仅在第6 w检出阳性。PCR方法对10尾组、20尾组、40尾组小鼠均可在第5 w检出粪便DNA阳性,5尾组仅可在第6 w检出粪便DNA阳性。针对小鼠血清样本的检测结果如下,RPA方法检测5尾组小鼠血清时于第5 w、6 w检出阳性结果,10尾小鼠血清于第2w、4w、6w检出阳性结果,20尾组小鼠血清于第3w、4w、5w、6w检出阳性结果,40尾组小鼠血清于第3d、lw、2 w、4 w、5 w、6 w均检出阳性结果。PCR法检测5尾组、10尾组小鼠血清时未检出阳性结果,20尾组小鼠血清于第4 w检出阳性结果,40尾组于第6 w检出阳性结果。钉螺的试验结果显示,压碎镜检法在感染第6w及之前均未观察到阳性结果,于感染第7w开始观察到血吸虫的子胞蚴结构。压碎镜检法对钉螺每个时间点检出的阳性率分别为:0%、0%、0%、0%、0%、0%、0%、0%、0%、10%、30%、20%、40%、30%;RPA 法的阳性率分别为:80%、60%、50%、60%、40%、60%、60%、50%、20%、20%、80%、50%、50%、50%;PCR 法的阳性率分别为:60%、70%、60%、50%、20%、0%、30%、0%、20%、0%、10%、30%、50%、50%。其中,压碎镜检阳性的钉螺共有13只,经RPA检测结果均为阳性,PCR方法仅将其中9只（69%）检出阳性,未能将镜检阳性钉螺全部检出。结论:变温扩增技术和等温扩增技术均对日本血吸虫病有较高诊断价值,其中等温扩增技术诊断准确性相对更高。本研究应用等温扩增RPA技术构建了一种日本血吸虫核酸检测方法,该方法敏感性高、特异性好、简便快速,有望用于血吸虫感染的快速检测及风险监测,具有较好的应用前景。
二、用PCR方法对虎DNA进行特异性检测（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、用PCR方法对虎DNA进行特异性检测（论文提纲范文）
（1）鉴定鸡球虫种类的多重PCR方法的建立与应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述: 鸡球虫病研究概述与进展 |
| 1 鸡球虫病的病原生物学 |
| 2 鸡球虫病的临床症状与眼观病变 |
| 3 鸡球虫病的防控 |
| 4 鸡球虫种类的鉴定方法 |
| 5 本研究目的与意义 |
| 参考文献 |
| 第一章 鸡球虫种类鉴定的单重PCR方法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 鸡球虫种类鉴定的多重PCR方法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 鸡球虫ITS-1序列重组质粒的构建及其在PCR检测中应用 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 多重PCR方法在鸡球虫流行病学调查中的初步应用 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（2）水貂圆环病毒RPA检测方法的建立及亚单位疫苗研制（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 MiCV感染的流行病学调查 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 试剂耗材 |
| 1.1.2 仪器设备 |
| 1.1.3 试剂配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 现场调查 |
| 1.2.2 实验室检测 |
| 1.2.3 数据统计 |
| 1.2.4 剖检与组织病理学检测 |
| 1.2.5 不同组织脏器内MiCV的检测 |
| 1.2.6 Cap基因突变情况分析 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 同一地区(辽宁庄河)不同年份MRD流行情况 |
| 1.3.2 不同地区同一年份(2020)MRD流行情况 |
| 1.3.3 不同性别水貂发病率、病死率和感染率比较 |
| 1.3.4 当年新貂与多年貂发病率、病死率和感染率比较 |
| 1.3.5 红痢、黄痢、白痢占比 |
| 1.3.6 剖检和组织病理学检测结果 |
| 1.3.7 不同组织脏器内MiCV检出情况 |
| 1.3.8 2020年MiCV Cap基因序列相比于2013年变化情况 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 MiCV基础RPA检测方法的建立 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试剂耗材 |
| 2.1.2 仪器设备 |
| 2.1.3 试剂配制 |
| 2.1.4 临床样品 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 质粒标准品的制备 |
| 2.2.2 MiCV基础RPA方法引物的设计与筛选 |
| 2.2.3 MiCV基础RPA方法的灵敏性试验 |
| 2.2.4 MiCV基础RPA方法的特异性试验 |
| 2.2.5 MiCV基础RPA方法的重复性试验 |
| 2.2.6 MiCV基础RPA方法的反应条件优化 |
| 2.2.7 MiCV基础RPA方法检测临床样品 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 质粒标准品拷贝数计算 |
| 2.3.2 MiCV基础RPA方法引物的筛选结果 |
| 2.3.3 MiCV基础RPA方法的灵敏性试验结果 |
| 2.3.4 MiCV基础RPA方法的特异性试验结果 |
| 2.3.5 MiCV基础RPA方法的重复性试验结果 |
| 2.3.6 MiCV基础RPA方法的反应条件优化结果 |
| 2.3.7 MiCV基础RPA方法检测临床样品结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 MiCV实时荧光RPA检测方法的建立 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 试剂耗材 |
| 3.1.2 仪器设备 |
| 3.1.3 试剂配制 |
| 3.1.4 临床样品 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 MiCV实时荧光RPA方法引物及探针的设计与筛选 |
| 3.2.2 MiCV实时荧光RPA方法的灵敏性试验 |
| 3.2.3 MiCV实时荧光RPA方法的特异性试验 |
| 3.2.4 MiCV实时荧光RPA方法的重复性试验 |
| 3.2.5 MiCV实时荧光RPA方法的反应条件优化 |
| 3.2.6 MiCV实时荧光RPA方法检测临床样品 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 MiCV实时荧光RPA方法引物及探针的筛选结果 |
| 3.3.2 MiCV实时荧光RPA方法的灵敏性试验结果 |
| 3.3.3 MiCV实时荧光RPA方法的特异性试验结果 |
| 3.3.4 MiCV实时荧光RPA方法的重复性试验结果 |
| 3.3.5 MiCV实时荧光RPA方法的反应条件优化结果 |
| 3.3.6 MiCV实时荧光RPA方法检测临床样品结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 MiCV亚单位疫苗的研制与免疫评价 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 细胞质粒 |
| 4.1.2 试剂耗材 |
| 4.1.3 仪器设备 |
| 4.1.4 试剂配制 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 引物设计 |
| 4.2.2 重组转移载体的构建 |
| 4.2.3 重组杆粒的构建 |
| 4.2.4 重组杆状病毒的构建 |
| 4.2.5 Cap蛋白的鉴定 |
| 4.2.6 重组杆状病毒在High Five细胞中的表达分析 |
| 4.2.7 田间免疫试验 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 重组转移载体的构建结果 |
| 4.3.2 重组杆粒构建结果 |
| 4.3.3 重组杆状病毒免疫荧光鉴定结果 |
| 4.3.4 SDS-PAGE和Western blotting鉴定结果 |
| 4.3.5 不同代次杆状病毒的稳定性 |
| 4.3.6 不同感染量及不同时间Cap蛋白的表达 |
| 4.3.7 粪便形态观察和PCR检测结果 |
| 4.3.8 平均每窝产仔数比较 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 作者在学期间取得的学术成果 |
| 主要简历 |
| 致谢 |
（3）RNA表观遗传修饰生物传感检测新方法研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1 研究背景 |
| 2 电化学生物传感技术 |
| 3 PCR技术 |
| 4 CRISPR/Cas技术 |
| 5 纳米材料在生物医学检测中的应用 |
| 6 类核酸 |
| 7 本课题的提出及主要内容 |
| 参考文献 |
| 第二章 基于类修饰纳米探针的电化学生物传感策略检测RNA中的m6A修饰 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果与讨论 |
| 4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 类核酸探针介导甲基化特异性RT-qPCR用于RNA特定位点m6A单碱基分辨检测研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果与讨论 |
| 4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 MsRT-PCR整合CRISPR/Cas12a信号放大检测RNA特定位点低m6A修饰 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果与讨论 |
| 4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述 RNA修饰检测研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间取得的科研成果 |
（4）水貂阿留申病流行病学调查及EvaGreen荧光定量PCR方法的建立与应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 AMD概述 |
| 1.2 AMD病原学 |
| 1.2.1 病原分类地位 |
| 1.2.2 AMDV的形态结构和理化特征 |
| 1.3 AMDV分子生物学特征 |
| 1.3.1 AMDV的基因组结构 |
| 1.3.2 AMDV的蛋白及功能 |
| 1.4 AMDV的致病机理 |
| 1.5 AMD的流行病学 |
| 1.5.1 流行情况 |
| 1.5.2 传播途径和宿主范围 |
| 1.5.3 临床症状和发病机理 |
| 1.6 AMD诊断方法的研究进展 |
| 1.6.1 AMD的血清学检测方法 |
| 1.6.2 AMD的病原学检测方法 |
| 1.7 AMD的预防和控制 |
| 1.8 水貂进境的检疫监管流程 |
| 1.9 研究目的和意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 水貂场的选择 |
| 2.1.2 血清、病毒、质粒 |
| 2.1.3 细胞与实验动物 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.1.5 主要仪器 |
| 2.1.6 主要试剂的配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 2015~2017年四个水貂场AMDV的流行病学调查 |
| 2.2.2 AMDV的分离鉴定与序列分析 |
| 2.2.3 EvaGreen荧光定量PCR检测方法的建立 |
| 2.2.4 EvaGreen荧光定量PCR在水貂中的应用 |
| 3 结果 |
| 3.1 2015~2017年四个水貂场AMD的流行病学调查 |
| 3.1.1 各水貂场AMDV的感染率 |
| 3.1.2 各水貂场的平均产仔数 |
| 3.1.3 CIEP、GICT、PCR的结果比较 |
| 3.2 AMDV的分离鉴定与序列分析 |
| 3.2.1 病毒分离与电镜观察结果 |
| 3.2.2 AMDV对小鼠的感染性试验 |
| 3.2.3 基因的扩增与测序 |
| 3.2.4 AMDV全基因序列的比对分析 |
| 3.2.5 AMDV NS1基因序列的比对分析 |
| 3.2.6 AMDV VP2基因序列的比对分析 |
| 3.2.7 不同毒株AMDV VP2蛋白抗原性分析 |
| 3.3 EvaGreen荧光定量PCR检测方法的建立 |
| 3.3.1 全血作为检测样品的确定 |
| 3.3.2 最优引物的选择 |
| 3.3.3 两种荧光定量PCR的标准曲线 |
| 3.3.4 EvaGreen荧光定量PCR的特异性 |
| 3.3.5 两种荧光定量PCR的敏感性 |
| 3.3.6 EvaGreen荧光定量PCR的重复性 |
| 3.3.7 不同核酸检测方法结果的分析 |
| 3.4 EvaGreen荧光定量PCR在水貂场中的应用 |
| 3.4.1 环境中AMDV的监测 |
| 3.4.2 检疫后不同时期水貂场AMDV的感染率 |
| 4 讨论 |
| 4.1 2015~2017年四个水貂场AMD的流行病学调查 |
| 4.2 AMDV的分离鉴定及基因组序列分析 |
| 4.3 EvaGreen荧光定量PCR方法的建立 |
| 4.4 EvaGreen荧光定量PCR在水貂场中的应用 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（5）河北省PCV2和PCV3分子流行病学调查及双重纳米PCR检测方法的建立（论文提纲范文）
| 缩略词 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 PCV的流行情况 |
| 1.2 PCV的理化特性 |
| 1.3 PCV的基因及编码功能 |
| 1.4 PCV的致病机制 |
| 1.5 PCV的诊断方法 |
| 1.5.1 病毒分离鉴定 |
| 1.5.2 免疫荧光法(IF) |
| 1.5.3 免疫组化(IHC) |
| 1.5.4 免疫电镜(IEM) |
| 1.5.5 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 1.5.6 常规RT-PCR、实时定量PCR及纳米PCR |
| 1.5.7 原位杂交 |
| 1.6 PCV的预防与治疗 |
| 1.7 研究的目的与意义 |
| 第二章 PCV2和PCV3 遗传演化分析 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 样品来源 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 主要耗材 |
| 2.1.4 试剂配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 引物设计 |
| 2.2.2 样品处理 |
| 2.2.3 DNA提取 |
| 2.2.4 PCV2和PCV3 检测 |
| 2.2.5 PCV2 ORF2 基因片段扩增 |
| 2.2.6 PCV2 ORF2 基因序列比对及遗传演化分析 |
| 2.2.7 PCV2和PCV3 全基因PCR扩增 |
| 2.2.8 PCR产物回收纯化及鉴定 |
| 2.2.9 产物的连接与转化 |
| 2.2.10 重组质粒的提取鉴定 |
| 2.2.11 阳性克隆菌的筛选与扩增 |
| 2.2.12 小量提取重组质粒 |
| 2.2.13 重组质粒PCR鉴定及序列测定 |
| 2.2.14 PCV2和PCV3 全基因组序列分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 临床样品的检测结果 |
| 2.3.2 PCV2 ORF2 序列遗传演化分析 |
| 2.3.3 PCV2 ORF2 核苷酸序列同源性分析 |
| 2.3.4 PCV2 ORF2 氨基酸位点比对分析 |
| 2.3.5 PCV2和PCV3 全基因扩增结果 |
| 2.3.6 PCV2全基因片段克隆及序列拼接 |
| 2.3.7 PCV2全基因组的遗传进化分析 |
| 2.3.8 PCV2全基因组的核苷酸序列同源性分析 |
| 2.3.9 PCV3全基因组的遗传进化分析 |
| 2.3.10 PCV3全基因组的核苷酸序列同源性分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 PCV2和PCV3 双重纳米PCR检测方法的建立 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 试验病料的来源和处理 |
| 3.1.2 所用细胞、毒株及载体 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 主要耗材 |
| 3.1.5 试剂配制 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 引物的设计与合成 |
| 3.2.2 DNA提取 |
| 3.2.3 目的片段扩增 |
| 3.2.4 PCR产物回收纯化 |
| 3.2.5 产物连接与转化 |
| 3.2.6 双重纳米PCR反应条件和反应体系优化 |
| 3.2.7 普通双重RT-PCR反应条件 |
| 3.2.8 特异性检验 |
| 3.2.9 敏感性检验 |
| 3.2.10 重复性试验 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 质粒标准品鉴定结果 |
| 3.3.2 退火温度及引物条件优化结果 |
| 3.3.3 敏感性试验结果 |
| 3.3.4 特异性试验结果 |
| 3.3.5 重复性试验 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 研究结论 |
| 参考文献 |
| 论文受资助情况 |
| 致谢 |
（6）牛源性成分环介导等温扩增检测方法和转基因玉米C0030.2.4基体标准物质研制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 动物源性成分检测及环介导等温扩增技术研究进展 |
| 1.1 动物源性成分鉴定概述 |
| 1.1.1 动物源性制品的定义与现状 |
| 1.1.2 动物源性制品掺假现象与安全管理 |
| 1.1.3 动物源性制品鉴定的意义 |
| 1.2 动物源性成分检测技术研究现状 |
| 1.2.1 基于组织学的动物源性成分检测技术 |
| 1.2.2 基于蛋白质的动物源性成分检测技术 |
| 1.2.3 基于核酸的动物源性成分检测技术 |
| 1.3 环介导等温扩增技术 |
| 1.3.1 环介导等温扩增技术的背景及特点 |
| 1.3.2 环介导等温扩增技术的原理 |
| 1.3.3 环介导等温扩增技术的产物检测方法 |
| 1.3.4 环介导等温扩增技术的在动物源性成分检测中的应用 |
| 1.4 研究内容和意义 |
| 第二章 转基因作物及标准物质研究进展 |
| 2.1 转基因生物的发展现状 |
| 2.1.1 全球转基因作物发展现状 |
| 2.1.2 国内外转基因作物安全管理和标识 |
| 2.1.3 转基因作物及其产品检测方法 |
| 2.2 转基因检测标准物质研究进展 |
| 2.2.1 转基因检测标准物质的定义与分类 |
| 2.2.2 转基因检测标准物质的制备流程 |
| 2.2.3 转基因检测标准物质的研究现状及展望 |
| 2.3 研究内容和意义 |
| 第三章 牛源性成分环介导等温扩增检测方法 |
| 3.1 实验材料、试剂与仪器 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 实验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 动物基因组DNA的提取与质量评估 |
| 3.2.2 物种特异性基因组DNA序列筛选生物信息算法建立 |
| 3.2.3 LAMP引物设计及筛选 |
| 3.2.4 LAMP反应体系建立及优化 |
| 3.2.5 LAMP特异性分析 |
| 3.2.6 LAMP灵敏度分析 |
| 3.2.7 实际样品检测 |
| 3.3 实验结果与讨论 |
| 3.3.1 LAMP引物设计及筛选结果 |
| 3.3.2 LAMP反应体系建立及优化结果 |
| 3.3.3 LAMP特异性分析结果 |
| 3.3.4 LAMP灵敏度分析结果 |
| 3.3.5 实际样品检测结果 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 转基因玉米C0030.2.4 基体标准物质的研制 |
| 4.1 实验材料、试剂与仪器 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 实验仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 原材料的鉴定 |
| 4.2.2 原材料的加工 |
| 4.2.3 植物基因组DNA提取与质量评估 |
| 4.2.4 定量PCR反应体系与反应条件 |
| 4.2.5 均匀性检验 |
| 4.2.6 最小取样量 |
| 4.2.7 稳定性检验 |
| 4.2.8 量值测定 |
| 4.2.9 不确定度评估 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 原材料的鉴定 |
| 4.3.2 原材料的加工 |
| 4.3.3 均匀性检验分析 |
| 4.3.4 最小取样量分析 |
| 4.3.5 稳定性检验分析 |
| 4.3.6 量值测定 |
| 4.3.7 不确定度评估 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间已发表或录用的论文 |
（7）江苏地区水禽源重要病原菌的临床检测及大肠杆菌的分子流行病学和部分特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一篇 文献综述 |
| 1 水禽生产养殖过程中常见的致病菌 |
| 1.1 大肠杆菌 |
| 1.2 鸭疫里默氏杆菌 |
| 1.3 产单核细胞李氏杆菌 |
| 1.4 沙门氏菌 |
| 2、大肠杆菌主要毒力基因 |
| 2.1 大肠杆菌菌毛 |
| 2.2 溶血素 |
| 2.3 温度敏感性血凝素 |
| 2.4 毒素 |
| 2.5 毒力岛 |
| 3. 大肠杆菌耐药性 |
| 3.1 大肠杆菌的耐药机制 |
| 3.2 耐药基因的转移方式 |
| 3.3 多重耐药的产生和对策 |
| 4 研究目的与意义 |
| 第二篇 实验研究 |
| 第一章 水禽源常见致病菌PCR检测与分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 水禽源大肠杆菌菌毛基因PCR检测 |
| 2.2 水禽源沙门氏菌的PCR检测 |
| 2.3 水禽源鸭疫里默氏杆菌的PCR检测方法的建立 |
| 2.4 水禽源产单核细胞李氏杆菌PCR检测方法建立 |
| 2.5 临床样品的PCR快速检测 |
| 3 讨论 |
| 第二章 水禽源大肠杆菌的分离鉴定及其分子流行病学调查 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 致病性大肠杆菌分离鉴定 |
| 2.2 致病性大肠杆菌分离株毒力基因分析 |
| 3 讨论 |
| 第三章 水禽致病性大肠杆菌药物敏感性分析及毒力测定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 药物敏感性试验 |
| 2.2 生长曲线的测定结果 |
| 2.3 半数致死量(LD50)试验结果 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（8）以诺如病毒P颗粒为载体的pTau31表位疫苗对阿尔茨海默症的治疗研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 关键词及缩写 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 阿尔茨海默病 |
| 1.1.1 阿尔茨海默病研究发展进程 |
| 1.1.2 阿尔茨海默病的流行病学 |
| 1.1.3 阿尔茨海默病发病机制研究 |
| 1.1.3.1 Aβ 蛋白级联假说 |
| 1.1.3.2 Tau蛋白致病假说 |
| 1.2 阿尔茨海默病动物模型研究 |
| 1.2.1 转基因啮齿类动物模型 |
| 1.2.1.1 Aβ 病理转基因鼠 |
| 1.2.1.2 Tau病理转基因鼠 |
| 1.2.2 非人灵长类动物模型 |
| 1.3 阿尔茨海默病治疗现状 |
| 1.3.1 阿尔茨海默病治疗策略及分类 |
| 1.3.2 以tau为靶点的阿尔茨海默病疗法 |
| 1.3.2.1 主动免疫疗法 |
| 1.3.2.2 被动免疫疗法 |
| 1.3.2.3 微管稳定剂类 |
| 1.3.2.4 Tau聚集抑制剂类 |
| 1.3.2.5 调节tau磷酸化水平 |
| 1.4 靶向tau的免疫治疗方法的机制 |
| 1.5 诺如病毒P颗粒疫苗载体系统 |
| 1.5.1 诺如病毒 |
| 1.5.2 诺如病毒P颗粒 |
| 1.5.3 基于诺如病毒P颗粒蛋白载体的疫苗研究现状 |
| 1.6 研究意义与实验设计 |
| 1.6.1 研究意义 |
| 1.6.2 实验思路与设计 |
| 1.6.2.1 P301S模型小鼠跟踪部分 |
| 1.6.2.2 AD疫苗部分 |
| 第二章 实验材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 菌种、质粒载体与细胞 |
| 2.1.3 多肽合成 |
| 2.1.4 实验设备 |
| 2.1.5 实验试剂与耗材 |
| 2.1.6 溶液配制 |
| 2.1.6.1 鼠尾消化液 |
| 2.1.6.2 TAE缓冲液 |
| 2.1.6.3 PBS |
| 2.1.6.4 变性电泳缓冲液(SDS-running buffer) |
| 2.1.6.5 非变性电泳缓冲液(native running buffer) |
| 2.1.6.6 电转缓冲液 |
| 2.1.6.7 考马斯亮蓝染色液 |
| 2.1.6.8 脱色液 |
| 2.1.6.9 Basal buffer |
| 2.1.6.10 10×DNA loading buffer |
| 2.1.6.11 5×蛋白loading buffer |
| 2.1.6.12 5×蛋白native loading buffer |
| 2.1.6.13 戊巴比妥钠溶液 |
| 2.1.6.14 4%多聚甲醛溶液 |
| 2.1.6.15 分化液 |
| 2.1.6.16 返蓝液 |
| 2.1.6.17 柠檬酸抗原修复液 |
| 2.1.6.18 TBS与TBST |
| 2.1.6.19 PMSF母液 |
| 2.1.6.20 Na F母液 |
| 2.1.6.21 钒酸钠母液 |
| 2.1.6.22 焦磷酸钠(Na2P2O4)母液 |
| 2.1.6.23 RAB buffer |
| 2.1.6.24 RIPA buffer |
| 2.1.6.25 Urea buffer(脑匀浆用) |
| 2.1.6.26 30%丙烯酰胺溶液 |
| 2.1.6.27 氨苄青霉素溶液 |
| 2.1.6.28 卡那霉素溶液 |
| 2.1.6.29 氯霉素溶液 |
| 2.1.6.30 L-阿拉伯糖溶液 |
| 2.1.6.31 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG) |
| 2.1.6.32 (亲和层析)平衡液 |
| 2.1.6.33 (亲和层析)咪唑洗脱液 |
| 2.1.6.34 抗原包被液 |
| 2.1.6.35 连接反应用碳酸氢铵溶液 |
| 2.1.6.36 R10培养基 |
| 2.1.6.37 ACK(红细胞裂解液) |
| 2.1.6.38 (293T)细胞复苏液 |
| 2.1.6.39 (293T)细胞培养基 |
| 2.1.6.40 胰酶 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 动物饲养及动物伦理 |
| 2.2.2 P301S转基因小鼠基因型鉴定 |
| 2.2.3 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.2.4 小鼠行为学实验 |
| 2.2.4.1 握力实验 |
| 2.2.4.2 加速转棒实验 |
| 2.2.4.3 步幅长度 |
| 2.2.4.4 复合表型评分系统(肢体协调综合评分) |
| 2.2.4.5 筑巢实验 |
| 2.2.4.6 旷场实验 |
| 2.2.4.7 水迷宫实验 |
| 2.2.5 动物血浆及组织样本取材与保存 |
| 2.2.5.1 血浆样本取材与保存 |
| 2.2.5.2 血清样本取材与保存 |
| 2.2.5.3 组织样本取材与保存 |
| 2.2.6 组织切片与染色 |
| 2.2.6.1 石蜡切片的制备 |
| 2.2.6.2 HE染色 |
| 2.2.6.3 甲苯胺蓝染色 |
| 2.2.6.4 免疫组织化学染色(IHC) |
| 2.2.7 脑匀浆制备 |
| 2.2.8 蛋白电泳 |
| 2.2.8.1 SDS-PAGE(变性)电泳 |
| 2.2.8.2 Native PAGE(非变性)电泳 |
| 2.2.9 考马斯亮蓝染色 |
| 2.2.10 免疫印迹实验 |
| 2.2.10.1 Western blot |
| 2.2.10.2 Dot blot |
| 2.2.11 质粒构建 |
| 2.2.11.1 pCold Ⅳ-PP-3C质粒构建 |
| 2.2.11.2 pET20b-Tau质粒构建 |
| 2.2.11.3 pCDNA3.1-YFP /pCDNA3.1-CFP质粒构建 |
| 2.2.11.4 pCDNA3.1-RD(WT)-(HA)质粒构建 |
| 2.2.11.5 pCDNA3.1-LM-(HA)/pCDNA3.1-△K-(HA)质粒构建 |
| 2.2.11.6 pCDNA3.1-△K-YFP /pCDNA3.1-△K-CFP质粒构建 |
| 2.2.12 蛋白原核表达与纯化 |
| 2.2.12.1 PP-3C蛋白纯化 |
| 2.2.12.2 Tau蛋白的纯化 |
| 2.2.13 疫苗制备 |
| 2.2.13.1 多肽疫苗的制备 |
| 2.2.13.2 PP-pTau31疫苗的制备 |
| 2.2.13.3 佐剂使用 |
| 2.2.14 ELISA |
| 2.2.14.1 血浆/脑匀浆tau含量测定 |
| 2.2.14.2 血清抗体含量测定 |
| 2.2.14.3 血清抗体分型实验 |
| 2.2.15 硫酸铵沉淀法纯化血清蛋白 |
| 2.2.16 ELISPOT |
| 2.2.17 细胞培养 |
| 2.2.18 质粒转染 |
| 2.2.19 FRET实验 |
| 2.2.20 统计学方法 |
| 第三章 实验结果与讨论:P301S转基因小鼠行为学、病理学及血清学跟踪研究 |
| 3.1 行为学研究 |
| 3.1.1 体重 |
| 3.1.2 生存期 |
| 3.1.3 握力实验 |
| 3.1.4 加速转棒实验 |
| 3.1.5 步幅长度 |
| 3.1.6 复合表型评分系统(肢体协调综合评分) |
| 3.1.7 水迷宫实验 |
| 3.1.8 旷场实验 |
| 3.1.9 筑巢实验 |
| 3.1.10 小结 |
| 3.2 病理学研究 |
| 3.2.1 免疫印迹实验(western blot) |
| 3.2.2 免疫组织化学染色(IHC) |
| 3.2.3 脏器变化 |
| 3.2.4 小结 |
| 3.3 血清学研究 |
| 3.3.1 血浆中人源tau蛋白变化 |
| 3.3.2 血浆炎症因子和趋化因子变化 |
| 3.3.3 脑匀浆炎症因子和趋化因子变化 |
| 3.3.4 小结 |
| 3.4 检测因子相关性分析 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 结论 |
| 第四章 实验结果与讨论:以诺如病毒P颗粒为载体的磷酸化tau表位疫苗对AD治疗效果和作用机制研究 |
| 4.1 磷酸化tau表位疫苗磷酸化表位筛选 |
| 4.1.1 候选重组磷酸化tau多肽的设计 |
| 4.1.2 候选重组磷酸化tau多肽的免疫原性分析 |
| 4.1.3 优选重组磷酸化tau多肽表位pTau31的安全性分析 |
| 4.1.4 小结 |
| 4.2 以诺如病毒P颗粒为载体的pTau31表位疫苗的制备与表征 |
| 4.2.1 PP-pTau31表位疫苗的设计 |
| 4.2.2 诺如病毒P颗粒蛋白基因突变与构建 |
| 4.2.3 重组诺如病毒P颗粒蛋白PP-3C的表达与纯化 |
| 4.2.4 重组诺如病毒P颗粒蛋白PP-3C理化性质分析 |
| 4.2.4.1 PP-3C蛋白分子量及聚体形式分析 |
| 4.2.4.2 透射电镜(TEM)对重组诺如病毒P蛋白形态分析 |
| 4.2.5 重组诺如病毒P颗粒蛋白与pTau31多肽连接工艺与连接效率研究 |
| 4.2.6 小结 |
| 4.3 磷酸化tau表位疫苗PP-pTau31的免疫原性与优选佐剂研究 |
| 4.3.1 PP-pTau31的免疫原性评价 |
| 4.3.1.1 在C57BL/6 小鼠中的免疫设计 |
| 4.3.1.2 PP-pTau31免疫原性评价 |
| 4.3.2 优选疫苗佐剂筛选 |
| 4.3.2.1 在C57BL/6 小鼠中的免疫设计 |
| 4.3.2.2 免疫原性评价 |
| 4.3.3 PP-pTau31疫苗诱导的T细胞免疫反应分析 |
| 4.3.4 小结 |
| 4.4 PP-pTau31疫苗在P301S转基因鼠中的免疫效果研究 |
| 4.4.1 PP-pTau31疫苗在P301S转基因鼠中的免疫方案设计 |
| 4.4.2 PP-pTau31疫苗在P301S转基因鼠中的免疫原性分析 |
| 4.4.3 P301S转基因鼠在PP-pTau31疫苗免疫后的行为学变化研究 |
| 4.4.3.1 P301S转基因鼠体重变化 |
| 4.4.3.2 P301S转基因鼠生存期变化 |
| 4.4.3.3 P301S转基因鼠运动相关行为学变化 |
| 4.4.3.4 P301S转基因鼠认知行为学变化 |
| 4.4.4 P301S转基因鼠在PP-pTau31疫苗免疫后脑中蛋白水平变化研究 |
| 4.4.4.1 P301S转基因鼠脑匀浆中tau蛋白水平变化 |
| 4.4.4.2 P301S转基因鼠脑海马区tau蛋白水平变化 |
| 4.4.4.3 P301S转基因鼠脑海马区胶质细胞水平变化 |
| 4.4.5 PP-pTau31疫苗在P301S转基因鼠中治疗的安全性分析 |
| 4.4.5.1 PP-pTau31疫苗在P301S转基因鼠中诱导的T细胞免疫反应分析 |
| 4.4.5.2 PP-pTau31疫苗免疫后P301S转基因鼠血清中细胞因子的变化 |
| 4.4.5.3 PP-pTau31疫苗免疫后P301S转基因鼠的脑匀浆细胞因子变化 |
| 4.4.5.4 PP-pTau31疫苗免疫后P301S转基因鼠的组织病理变化 |
| 4.4.6 小结 |
| 4.5 PP-pTau31疫苗的免疫作用机制研究 |
| 4.5.1 免疫治疗后P301S转基因鼠血浆tau蛋白水平变化 |
| 4.5.2 免疫治疗后P301S转基因鼠脑匀浆tau蛋白传播活性分析 |
| 4.5.2.1 FRET检测游离tau蛋白活性方法建立 |
| 4.5.2.1.1 质粒构建 |
| 4.5.2.1.2 质粒表达验证 |
| 4.5.2.1.3 FRET检测方法适用性评估 |
| 4.5.2.3 免疫治疗后P301S转基因鼠脑匀浆tau蛋白传播活性检测 |
| 4.5.3 PP-pTau31疫苗诱导的抗体性质分析 |
| 4.5.3.1 血清抗体结合NFT效果研究 |
| 4.5.3.2 血清抗体对脑匀浆中tau蛋白传播活性的抑制效果研究 |
| 4.5.4 小结 |
| 4.6 讨论 |
| 4.7 结论 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 作者简历及攻读博士学位期间科研成果 |
| 致谢 |
（9）具核梭杆菌荧光标记滚环扩增检测方法（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 前言 |
| 1.1 具核梭杆菌概述 |
| 1.1.1 具核梭杆菌概况 |
| 1.1.2 具核梭杆菌的致病性 |
| 1.2 具核梭杆菌与结肠癌的关系 |
| 1.2.1 具核梭杆菌与结直肠癌相关的证据 |
| 1.2.2 具核梭杆菌促进结直肠癌的机制 |
| 1.3 微生物检测方法的简介 |
| 1.3.1 传统细菌培养鉴定技术 |
| 1.3.2 免疫检测技术 |
| 1.3.3 分子检测技术 |
| 1.4 扩增产物检测方法 |
| 1.4.1 琼脂糖凝胶电泳法 |
| 1.4.2 免疫层析技术 |
| 1.4.3 分子信标技术 |
| 1.5 本课题研究的目的、意义和内容 |
| 1.5.1 研究目的与意义 |
| 1.5.2 主要研究内容 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料、试剂与仪器 |
| 2.1.1 实验菌株 |
| 2.1.2 实验培养基和试剂 |
| 2.1.3 实验仪器和耗材 |
| 2.1.4 实验分析软件和数据库 |
| 2.1.5 培养基和溶液的配置 |
| 2.2 引物设计 |
| 2.2.1 RCA和PCR引物的设计 |
| 2.2.2 检测探针的设计 |
| 2.3 实验菌株的培养与鉴定 |
| 2.3.1 真空冷冻干燥菌种的恢复培养 |
| 2.3.2 细菌基因组的提取 |
| 2.3.3 标准菌株的鉴定 |
| 2.4 实验步骤 |
| 2.4.1 滚环扩增步骤 |
| 2.4.2 琼脂糖凝胶电泳步骤 |
| 2.4.3 荧光检测步骤 |
| 2.5 条件优化和方法建立 |
| 2.5.1 锁式探针的有效性验证 |
| 2.5.2 滚环扩增体系优化 |
| 2.5.3 检测体系条件优化 |
| 2.6 特异性 |
| 2.6.1 RCA特异性检测 |
| 2.6.2 检测探针特异性检测 |
| 2.7 PCR验证实验 |
| 2.8 检出限 |
| 2.9 实际样品检测 |
| 2.9.1 人粪便样品检测 |
| 2.9.2 常见食物样品检测 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 实验原理 |
| 3.2 引物设计 |
| 3.2.1 具核梭杆菌具核亚种保守序列的选择 |
| 3.2.2 锁式探针的设计 |
| 3.2.3 捕获探针的设计 |
| 3.2.4 检测探针的设计 |
| 3.3 锁式探针的有效性 |
| 3.4 滚环扩增条件优化 |
| 3.4.1 锁式探针连接温度优化 |
| 3.4.2 Taq DNA连接酶用量优化 |
| 3.4.3 锁式探针浓度优化 |
| 3.4.4 消化产物用量优化 |
| 3.4.5 捕获探针杂交温度优化 |
| 3.4.6 捕获探针用量优化 |
| 3.4.7 phi29 DNA聚合酶用量优化 |
| 3.5 荧光检测体系条件优化 |
| 3.5.1 Tris溶液浓度的优化 |
| 3.5.2 Tris-HCl缓冲液pH的优化 |
| 3.5.3 检测探针浓度确定 |
| 3.5.4 检测探针杂交温度的优化 |
| 3.5.5 检测探针杂交时间的优化 |
| 3.6 特异性 |
| 3.6.1 RCA特异性检测 |
| 3.6.2 检测探针特异性检测 |
| 3.7 PCR验证实验 |
| 3.8 检出限 |
| 3.9 实际样品检测 |
| 3.9.1 人粪便样品检测 |
| 3.9.2 常见食物样品检测 |
| 4 结论 |
| 4.1 全文总结 |
| 4.2 论文的创新点 |
| 4.3 论文的不足之处 |
| 5 展望 |
| 6 参考文献 |
| 7 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
| 8 致谢 |
（10）重组酶聚合酶扩增（RPA）技术检测日本血吸虫核酸方法的建立与初步评价（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 前言 |
| 1 研究背景 |
| 1.1 血吸虫病流行概况 |
| 1.2 日本血吸虫病诊断技术 |
| 1.3 重组酶聚合酶扩增技术 |
| 2 研究目标 |
| 2.1 总体目标 |
| 2.2 具体目标 |
| 3 研究内容 |
| 3.1 系统评价各种核酸检测技术对日本血吸虫病的诊断价值 |
| 3.2 建立一种快速检测日本血吸虫核酸的RPA方法 |
| 3.3 初步评价RPA方法应用于日本血吸虫早期感染检测的效果 |
| 4 技术路线 |
| 第一部分 不同核酸检测技术对日本血吸虫病诊断价值的Meta分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 文献检索策略 |
| 1.2 纳入与排除标准 |
| 1.3 数据提取 |
| 1.4 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 文献的一般特征 |
| 2.2 文献质量评价 |
| 2.3 文献发表偏倚 |
| 2.4 Meta分析结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二部分 RPA技术检测日本血吸虫核酸方法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料来源 |
| 1.2 样本的采集 |
| 1.3 主要实验试剂与仪器 |
| 1.4 基因组DNA的提取 |
| 1.5 重组质粒的构建及提取 |
| 1.6 RPA方法的建立 |
| 1.7 RPA方法特异性评价 |
| 1.8 RPA方法敏感性评价 |
| 1.9 日本血吸虫不同虫期基因组DNA的检测 |
| 1.10 混合钉螺样本的检测 |
| 1.11 RPA检测重复性评价 |
| 2 结果 |
| 2.1 RPA最佳反应条件的确定 |
| 2.2 RPA方法特异性评价 |
| 2.3 RPA方法敏感性评价 |
| 2.4 RPA方法检测日本血吸虫不同虫期样本 |
| 2.5 钉螺混合样本的检测 |
| 2.6 RPA方法的重复性评价 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第三部分 RPA技术检测日本血吸虫感染样本效果的初步评价 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料来源 |
| 1.2 材料的采集 |
| 1.3 主要试剂及仪器 |
| 1.4 样本DNA的提取 |
| 1.5 RPA方法 |
| 1.6 PCR方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 小鼠样本的检测 |
| 2.2 钉螺样本的检测 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 全文小结 |
| 主要创新点 |
| 不足和展望 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 硕士期间申请专利与发表文章 |
| 致谢 |
| 附录 |
四、用PCR方法对虎DNA进行特异性检测（论文参考文献）
- [1]鉴定鸡球虫种类的多重PCR方法的建立与应用[D]. 徐向东. 扬州大学, 2021
- [2]水貂圆环病毒RPA检测方法的建立及亚单位疫苗研制[D]. 王立冬. 军事科学院, 2021(02)
- [3]RNA表观遗传修饰生物传感检测新方法研究[D]. 蒲勤丽. 重庆医科大学, 2021(01)
- [4]水貂阿留申病流行病学调查及EvaGreen荧光定量PCR方法的建立与应用[D]. 李俚. 东北农业大学, 2020(07)
- [5]河北省PCV2和PCV3分子流行病学调查及双重纳米PCR检测方法的建立[D]. 回卫荣. 河北科技师范学院, 2020(02)
- [6]牛源性成分环介导等温扩增检测方法和转基因玉米C0030.2.4基体标准物质研制[D]. 瞿展. 上海交通大学, 2020(09)
- [7]江苏地区水禽源重要病原菌的临床检测及大肠杆菌的分子流行病学和部分特性研究[D]. 宋海港. 扬州大学, 2020(04)
- [8]以诺如病毒P颗粒为载体的pTau31表位疫苗对阿尔茨海默症的治疗研究[D]. 孙瑶. 吉林大学, 2020(08)
- [9]具核梭杆菌荧光标记滚环扩增检测方法[D]. 焦敬波. 天津科技大学, 2020(08)
- [10]重组酶聚合酶扩增（RPA）技术检测日本血吸虫核酸方法的建立与初步评价[D]. 王盛琳. 中国疾病预防控制中心, 2020
标签：特异性论文; pcr论文; 实时荧光定量pcr仪论文; 基因合成论文; 基因探针论文;