一、对不同条件下保存的新城疫弱毒株滴度变化的观察（论文文献综述）
王文彬[1]（2019）在《鸡CARD11蛋白对新城疫病毒的抑制作用》文中研究指明新城疫（Newcastle disease,ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）引起的一种严重危害禽类健康的高度接触性传染病。NDV作为一种嗜神经病毒能够导致禽类病毒性脑炎及神经紊乱,表现为头震颤、扭颈、翅爪瘫痪的临床症状及脑部血管充血、胶质细胞聚集、血管周围淋巴细胞侵润（血管套）等病理变化,其神经致病机制至今未明。本实验室前期通过基因芯片技术对NDV感染鸡脑部的差异表达基因（DEGs）进行了初步分析。本研究以基因芯片数据为基础,筛选到宿主免疫相关基因CARD11呈现上调表达,而该基因在已有的NDV感染的禽类其他组织及细胞的转录组数据中未发现差异表达。实验发现CARD11具有脑部特异性上调表达的特性,并能有效抑制NDV复制和病毒引起的细胞病理变化（CPEs）。本研究旨在解析宿主因子CARD11抑制病毒的作用机制,为揭示NDV与宿主的相互作用及其神经致病机制提供有价值的线索。具体研究内容及结果包括以下几个方面。1.鸡原代神经元细胞中CARD11对NDV复制的影响NDV强毒株F48E9可以造成在鸡原代神经元细胞（chPNCs）严重的CPEs,如轻微合胞体形成、轴突断裂、胞体分离、细胞迅速死亡,而弱毒株LaSota不能引起明显的CPEs;强弱毒株均可以在chPNCs中复制。将本实验室前期获得的NDV感染鸡脑的基因芯片数据以变化倍数大于2（FC>2）及P<0.05为标准,统计分析出强毒株F48E9感染鸡脑后特有的14个免疫相关的DEGs,qPCR验证5个DEGs的表达变化与基因芯片结果一致;在强毒株F48E9感染鸡体的13个组织中,只有CARD11在脑组织中特异性上调表达;由于CARD11蛋白在chPNCs中表达量很低,通过免疫沉淀富集（IPE）方法检测证实强毒株F48E9感染的chPNCs中CARD11蛋白同样上调表达;利用重组腺病毒实现CARD11在chPNCs中超表达,发现可抑制NDV的复制,CARD11在chPNCs中敲低后,可增加病毒的复制。结果表明CARD11能够抑制NDV在chPNCs中的复制。2.鸡原代神经元细胞中CARD11抑制NDV复制的机制CARD11激活后招募Bcl10和MALT1分子共同形成CBM信号体,继而MALT1激活下游NF-κB、JNK、mTOR信号通路。采用MALT1及NF-κB抑制剂阻断信号通路,发现NDV的复制没有变化,表明CARD11并非通过CBM信号体抑制NDV复制。那么,CARD11与病毒蛋白是否存在直接相互作用而影响病毒的复制?我们发现CARD11与NDV的P蛋白能够免疫共沉淀,且CARD11的CC1结构域与P蛋白的X结构域相互结合;进一步研究发现P蛋白X结构域也介导病毒RNP复合体中L蛋白与P蛋白的结合,而P蛋白X结构域不能介导P与NP蛋白的结合作用,故CARD11、L蛋白与P蛋白的共同结合过程中存在竞争关系;采用微型基因组（Minigenome）系统证实,该竞争性结合作用导致病毒RNA聚合酶活性受到抑制,进而降低了病毒的复制;通过对雏鸡脑内注射超表达CARD11蛋白的重组腺病毒,强毒株F48E9攻毒后发现CARD11能够减缓脑部的病理变化及抑制病毒在脑内的复制。3.鸡胚成纤维细胞中CARD11对NDV膜融合活性的影响CARD11在鸡体各组织中均有表达,那么,CARD11在鸡成纤维细胞中是否也能够被NDV诱导表达并抑制病毒复制?本部分研究以鸡胚成纤维细胞（DF-1）为模型,NDV强弱毒株的感染对DF-1细胞中CARD11 mRNA及蛋白水平的诱导上调表达不显着;DF-1细胞中CARD11可以与病毒P蛋白共定位于细胞核周围;通过慢病毒技术建立CARD11超表达及干扰的DF-1细胞系,发现CARD11能够抑制NDV的复制及合胞体的形成,甚至可抑制HN和F蛋白共转染引起的膜融合活性。CARD11如何抑制NDV诱导的膜融合活性?CARD11抑制furin蛋白酶的表达受到,进而影响F蛋白的裂解效率;利用MALT1及NF-κB抑制剂阻断信号通路,发现病毒的膜融合活性增强,细胞内furin蛋白酶的表达增加。结果表明CARD11通过激活CBM-NF-κB信号通路来抑制病毒的细胞膜融合活性。4.其他禽嗜神经病毒诱导CARD11脑特异性的上调表达禽嗜神经病毒除NDV之外还包括禽脑脊髓炎病毒（AEV）等,是否嗜神经病毒诱导CARD11脑特异性上调表达具有普遍性?本部分以嗜神经病毒AEV毒株XY/Q?1410及非神经嗜性病毒IBV分离株H09和FAdV-4分离株SXD15进行感染实验,发现CARD11只在嗜神经病毒NDV及AEV感染的鸡大脑和小脑中上调表达,而在IBV、FAdV-4感染的各组织中均为下调,并且各组织中CARD11的表达变化与各病毒载量没有必然联系。结果初步表明CARD11可以作为潜在的禽病毒性脑炎的标记分子。综上所述,本研究首次发现宿主因子CARD11可有效地抑制NDV复制和CPEs形成,其对NDV的抑制作用可能存在两种机制:（1）在神经细胞中,主要通过CARD11与病毒L蛋白竞争性结合病毒P蛋白抑制病毒RNA聚合酶活性,进而抑制病毒的复制;（2）在成纤维细胞中,主要通过CARD11参与的CBM-NF-κB信号通路降低细胞furin蛋白酶的表达,从而降低F蛋白的裂解效率抑制病毒诱导的膜融合活性,而CARD11与病毒P蛋白的相互作用同时降低了病毒的复制。本研究进一步发现其它禽嗜神经病毒也可诱导CARD11的脑部特异性上调表达,初步预示CARD11可以作为嗜神经病毒致神经损伤的标记分子。本研究为探索嗜神经病毒与中枢神经系统之间的相互作用及潜在的抗病毒靶标提供了基础依据。
陈银[2]（2019）在《耐热新城疫病毒载体的构建及其在H9N2亚型禽流感疫苗研制中的应用》文中指出禽流感（Avian Influenza,AI）和新城疫（Newcastle Disease,ND）是两类严重危害养禽业的动物重要传染病,它们的病原分别是禽流感病毒（Avian Influenza Virus,AIV）和新城疫病毒（Newcastle Disease Virus,NDV）。对这两种疫病的预防和控制,疫苗接种仍是主要手段。H9N2亚型AIV属于低致病型病毒,在感染鸡群后,仅引起轻微的呼吸道症状和产蛋率下降,但与其它病原混合感染时会产生致病协同作用,从而造成较高的死亡率。H9N2亚型AI在我国流行的20多年期间,给我国养禽业造成了巨大的危害。NDV是单股负链RNA病毒,在反向遗传学技术的推动下,用其作为外源基因表达载体的研究迅速发展,研究证明,NDV作为外源基因表达载体构建的活载体疫苗,可以诱导动物的体液免疫和细胞免疫,可以在动物体内增殖并长期表达抗原基因,也不与宿主基因组整合,安全高效。本研究在实验室前期建立的新型耐热NDV弱毒株反向遗传学平台NDV-rAHR09的基础上,构建一种热稳定的基因VIII型NDV弱毒株外源基因表达载体,进一步利用该载体表达H9亚型AIV的血凝素（Hemagglutinin,HA）基因,创制热稳定的H9亚型AIV重组疫苗候选株,并对其免疫效力进行评价。1.热稳定的基因VIII型新城疫弱毒株外源基因表达载体的构建以热稳定的NDV-rAHR09反向遗传平台为基础,在已构建的全长重组质粒P和M基因间隔区引入酶切位点PmeI,作为外源基因插入位点,构建了 rAHR09-P表达载体。通过无缝克隆的方法插入EGFP报告基因,构建了 p-rAHR09-EGFP-l转录载体,经拯救获得能够稳定表达EGFP基因的重组病毒NDV-rAHR09-EGFP-l。经测定,该重组病毒生长特性、热稳定性和毒力等与亲本弱毒株相比均无显着变化。2.表达H9亚型禽流感病毒HA基因的耐热重组新城疫病毒的构建本研究构建了三种形式的重组病毒,分别为rAHR09-H9HA-O、rAHR09-H9HA-Q、rAHR09-H9HA-T。重组病毒 rAHR09-H9HA-O 表达了 H9N2 亚型 AIV 毒株 YZ1406 的 HA蛋白,重组病毒rAHR09-H9HA-Q表达的HA蛋白缺失了跨膜区,重组病毒rAHR09-H9H A-T表达的HA蛋白替换了 NDVF蛋白的跨膜区。3株重组病毒在鸡胚上均能够稳定生长,血凝滴度能达到28以上。在鸡胚上连续传15代后,对其耐热性进行测定,结果显示:3株重组病毒均有较好的热稳定性,经56℃处理90 min以上仍有血凝活性。3株获救的重组病毒MDT值均大于120h,ICPI指数均小于亲本病毒,经与原NDV弱毒株比较,证I明外源基因的插入没有影响重组病毒的毒力。3.3种重组病毒疫苗候选株免疫效力评价75只7日龄SPF鸡随机平均分成5组,分别为3个重组病毒免疫组、新城疫-禽流感二联灭活苗免疫组和非免疫对照组。重组病毒免疫采用滴鼻点眼的方式,免疫剂量为106 EID50;灭活苗免疫采用肌肉注射的方式,免疫剂量为0.2 mL。免疫21天后,以滴鼻点眼的方式进行攻毒,攻毒毒株为H9亚型AIV（YZ1406株）,剂量为108EID50。免疫后第7、14、21、28天测定各组实验鸡血清中H9的抗体效价。结果表明,重组病毒组在接种后抗体水平持续上升且始终高于灭活疫苗组,其中重组病毒rAHR09-H9HA-T免疫后21 d产生的抗体效价最高达到24。攻毒后3、6、9天采集喉头和泄殖腔拭子,用荧光定量PCR的方法测定其病毒含量。结果表明,重组病毒rAHR09-H9HA-O、rAHR09-H9HA-T与灭活苗均能有效降低排毒量,重组病毒rAHR09-H9HA-T组排毒量最低。综上所述,本研究构建了能够稳定表达外源基因的新型耐热NDV载体rAHR09-P,并在此基础上构建了 3株表达H9亚型AIV HA蛋白的重组病毒,其中重组病毒rAHR09-H9HA-T在动物实验中展现了良好的免疫保护效果,具有作为防控H9亚型禽流感重组活疫苗的潜力。
董炳梅[3]（2019）在《鸡新城疫病毒增殖培养细胞系的筛选与稳定表达唾液酸转移酶（ST6Gal）细胞株的构建及其应用》文中提出鸡新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）可在多种原代或传代细胞系上复制增殖,但不同毒株或亚型对宿主细胞均存在偏嗜性。为了筛选适于鸡新城疫（Newcastle disease,ND）疫苗生产的传代细胞系,本研究将我国ND疫苗株NDVⅠ系与Lasota株分别接种BHK-21、Vero、Hela、鸡肝癌细胞（LMH细胞）与DF-1细胞,通过对细胞病变的观察,结合对细胞培养物细胞半数感染量(Median cell culture infective dose,TCID50)和HA效价的测定,对比确定适于NDVⅠ系与Lasota株生长的传代细胞系。结果显示,NDVⅠ系与Lasota株在Vero、BHK-21、DF-1、Hela与LMH细胞上均可增殖,并引起典型的细胞病变,但不同毒株适应细胞的能力不同。较适于NDVⅠ系增殖的细胞系依次为Hela、BHK-21与DF-1细胞;较适于NDV Lasota株增殖的细胞系依次为Hela、LMH与BHK-21细胞。本研究证明了NDVⅠ系与Lasota株均可在LMH细胞上增殖,并产生典型的细胞病变,且LMH细胞更适于NDVⅠ系的增殖培养。NDV侵染细胞的第一步是病毒与细胞膜表面的唾液酸受体结合,NDV的唾液酸受体主要包括Neu5Ac-α-2,3Gal-β-1,4Glc（SAα2,3Gal）和Neu5Ac-2-S-α-2,6Gal10Me（SAα2,6Gal）,两种受体在宿主组织器官中的分布及表达丰度的不同对病毒的宿主范围和毒力等方面具有重要影响。为了在分子水平解释NDVⅠ系与Lasota株对不同细胞系的偏嗜性,本研究首先应用激光共聚焦显微镜对2种唾液酸受体在BHK-21等5种细胞上的分布进行了观察,结果显示,BHK-21、LMH、DF-1、Hela与Vero细胞内均存在TSA-R SAα2,6Gal与SAα2,3Gal,且主要分布于细胞膜与细胞质中;在细胞核部分,BHK-21细胞核有SAα2,3Gal受体分布,而DF-1细胞核中两种受体均有分布。其次,本研究应用流式细胞仪对5种细胞膜表面的两种唾液酸受体进行了定量分析,结果显示5种细胞表面SAα2,3Gal受体的含量显着高于SAα2,6Gal受体,提示5种细胞主要以SAα2,3Gal受体为主;按由多到少排列,SAα2,3Gal在5种细胞膜上的含量依次为Hela、BHK-21、DF-1、LMH与Vero细胞;SAα2,6Gal在5种细胞膜上的含量依次为Hela、LMH、BHK-21、Vero与DF-1细胞。结合NDVⅠ系与Lasota株在不同细胞上的增殖特性的比较,可判断NDVⅠ系更易与SAα2,3Gal受体结合,NDV Lasota株更易与SAα2,6Gal受体结合。NDV虽然可在多种细胞上增殖培养,但效价普遍较低,不能达到生产要求。NDV的两种唾液酸受体分别为SAα2,3Gal和SAα2,6Gal,而介导两种唾液酸受体形成的酶类分别是ST3Gal转移酶和ST6Gal转移酶,因此唾液酸转移酶对唾液酸受体在细胞表面的表达具有重要作用,而细胞表面受体表达丰度的高低对病毒入侵与增殖具有决定性作用。因此,为了提高NDV细胞培养效价及进一步确定不同唾液酸受体对NDV细胞培养的影响,本研究以PCI-neo为载体,在成功构建唾液酸转移酶PCI-neo-ST3与PCI-neo-ST6质粒的基础上,应用脂质体转染的方法将其分别转染BHK-21细胞,共获得22株BHK-ST3细胞与17株BHK-ST6细胞;进而将NDV Lasota株分别接种以上细胞,通过HA效价及TCID50的测定,分别获得了较适于NDV Lasota株增殖的BHK-ST3-22细胞与BHK-ST6-15细胞克隆株。流式细胞仪检测发现,BHK-ST3-22细胞与BHK-ST6-15细胞表面相应的唾液酸受体表达丰度均有显着提高,且BHK-ST6-15细胞较BHK-ST3-22细胞更适合于NDV Lasota株的增殖。为了提高NDV在BHK-ST6-15细胞株的增殖效价,本研究在对应用BHK-ST6-15贴壁细胞增殖培养NDV Lasota株的条件进行优化的基础上,一方面将BHK-ST6-15细胞进行低血清悬浮培养的驯化;另一方面对NDV Lasota株在悬浮培养的BHK-ST6-15细胞上增殖条件进行了优化。结果显示,成功实现了BHK-ST6-15细胞的低血清悬浮培养,应用该细胞增殖培养NDV Lasota株,其细胞培养液效价可达108.375 TCID50/0.1 mL,显着高于BHK-ST6-15贴壁细胞,从而为实现NDV Lasota株细胞悬浮培养产业化生产奠定了良好基础。我国家禽活疫苗的生产主要依靠接种SPF鸡胚制备而成,该工艺主要存在批次间稳定性差、家禽外源病毒污染的风险和鸡胚废弃物无害化处理等问题,因此,影响着家禽活疫苗的生产。为替代传统鸡胚生产工艺、提升产品质量与效益,本研究应用全悬浮细胞培养技术生产NDV Lasota株活疫苗,并根据《中华人民共和国兽药典》2015年版三部的要求对其进行检测。结果显示,NDV Lasota株活疫苗各项指标均符合要求,可完全替代传统鸡胚生产工艺。同时,该技术具有技术成熟、自动化程度高、安全性强、产品质量稳定等优点,且显着降低了生产成本、提高了经济效益,从而为全悬浮细胞培养技术生产NDV Lasota株活疫苗奠定了良好基础。
孟春春[4]（2012）在《ClassⅠ新城疫弱毒的毒力演化及自噬在新城疫病毒感染肿瘤细胞中的作用》文中提出由新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）引起的新城疫（Newcastle disease, ND）是一种可导致多种禽类发病死亡的烈性传染病，被国际兽疫局（OIE）列为必须报告的疾病之一。NDV在分类上属于副粘病毒科（Paramyxoviridae）腮腺炎病毒属（Avulavirus），是一种单股、负链、不分节段有囊膜的RNA病毒。虽然NDV目前只有一个血清型，但根据基因组结构和遗传距离可将所有的毒株划分为Class Ⅰ和Class Ⅱ两大分支。Class Ⅱ分支由11个（I～XI）基因型组成，自1926年ND首次爆发以来，造成四次世界大流行的强毒株和现阶段常用弱毒疫苗株均属于Class Ⅱ分支。Class Ⅰ分支有9个（1-9）基因型，2006年被首次报道存在，目前所有的自然分离株均为弱毒株，但尚未见有关Class Ⅰ弱毒株的免疫原性，毒力进化趋势和病毒拯救等相关报道。为了更好地研究Class Ⅰ NDV的生物学特性，我们开展了如下研究：1)一株鸭源Class Ⅰ NDV Duck/JS/10的分离及全基因组测序。参照GenBank上公布的ClassI NDV的全基因组序列，寻找各毒株间同源性比较高的区域这设计12对引物，使相邻引物对扩增的片段之间有部分核酸序列重叠区，通过反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）扩增出覆盖除基因组末端序列之外的全部基因组内部序列；使用本实验室自行建立的简化RACE法获得基因组两端序列，将获取的序列用DNAstar软件拼接和分析。Duck/JS/10株的全基因组核酸序列由15198个核苷酸组成,较Class Ⅱ毒株在P基因编码区多出12个碱基；根据F基因绘制的遗传发生树显示Duck/JS/10属于北美流行的基因4型，这是我国首次分离到该型毒株其F蛋白裂解位点的序列为112EQQERL117，HN蛋白的长度为585个aa。将Duck/JS/10与21株NDV不同基因型的代表毒株进行同源性比较，结果显示其与DE-R49/99株遗传距离最近，与Gamefowl/US株遗传距离最近；全基因组和各基因序列同源性基本相同，这表明NDV的进化是由多基因共同决定的结果。已将Duck/JS/10的全基因序列上传至Genbank，登陆号为：HQ008337。2)Duck/JS/10与常用疫苗株La Sota的免疫原性比较。为了比较两者的免疫原性差异，我们首先制备了Duck/JS/10和La Sota的高免血清并对不同基因型的NDV毒株对进行交叉血凝抑制试验。比较后发现，Duck/JS/10的抗血清对所选的强毒株的HI效价均高于La Sota的抗血清。随后选取了5株强毒与两种血清分别进行细胞交叉中和试验，鸡胚交叉中和试验；结果显示Duck/JS/10的抗血清对所有强毒株的中和效价均高于La Sota抗血清3-5倍。最后我们将Duck/JS/10和La Sota分别免疫SPF鸡，然后用Class Ⅱ基因VⅡ型强毒株ZJ1攻毒，比较两者的免疫效果。结果显示上述两者均能提供100%的保护，但Duck/JS/10能显着降低免疫鸡群攻毒后的排毒率。上述试验表明Duck/JS/10有望成为新的弱毒疫苗候选株。3)Class Ⅰ弱毒株与Class Ⅱ弱毒株的毒力进化研究。选择2株Class Ⅰ弱毒株，Duck/JS/10和ZJ/3/10/Ch株，两株Class Ⅱ弱毒株La Sota株和I2株，分别通过气囊连续传10代和鸡胚连续传20代来比较亲本株和传代株的生物学特性差异。Duck/JS/10株经气囊传第三代后F裂解位点开始有突变，传至第10代其F裂解位点已由弱毒特征的112ERQERL117完全突变为强毒特征的112KRQKRF117；Duck/JS/10-A10的MDT为48.4h，ICPI为1.91，IVPI为2.08符合强毒标准。其余三株病毒经气囊传代10次后毒力未发生变化，而且所有病毒经鸡胚传代20次后毒力均未发生变化。为了比较Duck/JS/10经气囊和鸡胚传代后与亲本株之间各基因的突变位点，我们对Duck/JS/10-A10和Duck/JS/10-E20进行了全基因组测序。结果：经比对Duck/JS/10-A10与Duck/JS/10共有47个碱基发生变化，其中有25个为有义突变；Duck/JS/10-E20与Duck/JS/10共有21个碱基发生变化，有义突变12个但巧合的是其中11个在Duck/JS/10-A10亦存在；这表明这11个位点在传代过程中容易突变，或许是病毒不稳定的遗传标记。随后进行了亲本株与传代株在体内增殖和同居感染实验，结果：Duck/JS/10-E20在体内的增殖水平及同居感染能力均较Duck/JS/10有所下降，而Duck/JS/10-A10在体内的增殖能力以及同居感染能力均较Duck/JS/10有所上升。这表明Duck/JS/10经气囊传代是毒力强化过程，而经鸡胚传代则是毒力弱化过程。4)Duck/JS/10感染性克隆的初步建立。参照Duck/JS/10株的全序列，设计7对引物，经RT-PCR法从Duck/JS/10株感染的尿囊液中扩增得到目的片段后，分别克隆进T-easy载体中。将基因组3’和5’两段序列，先连入转录载体TVT7R中，得到TVT-35；然后将扩增片段依次亚克隆到T载体中，构建了中间质粒T-AA，该质粒经AflⅡ酶切后，回收大片段与经同样酶切的TVT-35相连，进而构建了含有病毒全长cDNA的转录载体TVT-Duck/JS/10。将NP和P的扩增片段直接克隆至PCI-neo上，构建成PCI-NP和PCI-P；先将L1和L2扩增后先克隆进T-easy载体再克隆至表达载体PCI-neo中构建成PCI-L。将三个辅助质粒同NDV9a5b株微型基因组（TGL）共转染能稳定表达T7RNA聚合酶的BSR-T7/5细胞，转染后48h在细胞中出现了明显的绿色荧光，表明三个辅助质粒具备了启动基因组复制和转录的功能，这为后续开展拯救病毒打下了坚实基础。另本论文还开展了细胞自噬在NDV感染肿瘤细胞后对病毒增殖的相关研究。首先构建了用于检测细胞自噬GFP-LC3Ⅱ的真核表达质粒并对其功能进行验证；然后分别通过电镜，免疫印迹和GFP-LC3B的转染证实了NDV感染肿瘤细胞后可以引起自噬，而且有剂量依赖性；接着我们将NDV热灭活后与肿瘤细胞共孵育但没有检测到自噬，因此推测NDV诱导的自噬与病毒受体无关。此外我们首通过WB验证了NDV感染后I型和ⅡI型PI3K通路的活化情况，证实了在NDV诱导的细胞自噬中，ⅡI型PI3K通路被激活。然后分别使用体外药物抑制自噬和siRNA干扰自噬关键基因，结果均证实刺激自噬能够促进病毒复制，抑制自噬能降低病毒的滴度。由此我们提出结论：NDV感染后引起的自噬有助于病毒复制。
姬阿美[5]（2020）在《BHK-21细胞无血清悬浮培养生产新城疫病毒》文中研究表明新城疫（Newcastle disease,ND）因其高发病率和高死亡率给世界各地的家禽养殖业造成了巨大威胁,接种疫苗是防控ND最有效的措施。采用传统的鸡胚工艺生产新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）疫苗,存在SPF鸡胚供应不足、质量控制困难及规模放大受限等问题;基于细胞的贴壁培养工艺存在成本高、操作复杂和过程控制困难等缺点;而应用无血清悬浮培养工艺虽可克服上述缺陷,但存在缺乏对NDV敏感的悬浮细胞系、适于NDV扩增的无血清维持培养基及工艺不成熟等问题。针对上述问题,亟需开发基于动物细胞的NDV悬浮培养工艺及适于NDV增殖的无血清维持培养基。本文首先以实验室自主研发的无血清培养基SF201为生长及维持培养基,通过敏感细胞株筛选、病毒适应及细胞毒种制备、病毒接种条件优化,建立了无血清悬浮培养生产NDV工艺。当BHK-v002细胞生长至约9.0×106cells/mL时,用新鲜培养基将活细胞密度稀释至6.0×106 cells/mL,在MOI为0.005、TPCK-胰酶浓度为5 μg/mL条件下接种病毒,继续培养96 h后收获病毒,收获病毒液的血凝效价（HA效价）为8.5 log2HAU/25 μL,单细胞产毒量（Svy）达到1685.9virions/cell。为进一步优化培养过程,提高病毒产量,应用Design Expert软件对6种无血清培养基进行混料设计,成功筛选出无血清维持培养基BMM11,培养后收获的病毒上清液中HA效价和Svy分别达到9.5 log2HAU/25μL和3185.1 virions/cell。以8 g/L浓度的F水解物添加至BMM11培养基（BMM11-F）,HA效价和Svy分别达到10.4 log2HAU/25μL和6981.5 virions/cell。为指导成分明确的无血清维持培养基的研制,考察了维持培养基BMM11及关键组分葡萄糖和谷氨酰胺对细胞生长、代谢和病毒增殖的影响。在维持培养基BMM11中病毒增殖后期葡萄糖和Gln耗竭不利于病毒的增殖和细胞活性的维持;高浓度葡萄糖所致的酸性pH环境降低病毒滴度,故应控制葡萄糖补加量;当Gln添加量为4.088 g/L时,病毒HA效价和Svy分别为 10.5 log2HAU/25 μL 和 6704.4 virions/cell,与 BMM11-F 培养基相当。本研究建立了 BHK-21细胞无血清悬浮培养生产NDV的工艺,并成功开发出适于NDV高效扩增的无血清维持培养基,为建立基于动物细胞无血清规模化悬浮培养技术的NDV生产工艺、替代目前鸡胚生产工艺提供了方案。
苏奇[6]（2019）在《新城疫弱毒疫苗中禽腺病毒和鸡传染性贫血病毒混合污染的鉴定及人工模拟致病性分析》文中研究说明19世纪50年代以来,新城疫弱毒疫苗在世界范围内广泛应用,为新城疫（Newcastle disease,ND）预防和控制取得了辉煌的成就。但研究显示弱毒疫苗中可能存在外源病毒的污染,进而导致多种疫病在被免疫鸡群中的发生。本研究在对禽用弱毒疫苗进行外源病毒检测时通过PCR结合斑点杂交方法也发现在同一批新城疫弱毒疫苗中存在4型禽腺病毒（fowl adenovirus type 4,FAdV-4）和鸡传染性贫血病毒（chicken infectious anemia virus,CIAV）的混合污染,随后本研究通过血清中和及鸡胚培养的方式对上述两种病毒进行了分离纯化并测定了CIAV的全基因组以及FAdV的部分hexon基因。序列比较和遗传进化分析显示其与目前中国流行株具有较高的同源性。为评估NDV弱毒疫苗中FAdV-4和CIAV混合污染的致病性,本研究通过制备人工模拟污染疫苗并分别免疫SPF和FAdV母源抗体阳性鸡群进行了系统的动物实验。结果显示,使用单独污染CIAV或无污染的疫苗并不会引发SPF鸡死亡,而使用混合污染疫苗能引发明显的心包积液-包涵体肝炎综合征（inclusion body hepatitis-hydropericardium syndrome,IBH-HPS）并导致高达75.0%的死亡率,显着高于使用单独污染FAdV疫苗后所引发的死亡率（3.70%7.40%）。同时,通过疫苗污染而感染的外源病毒可在鸡体能持续增殖,引发生长迟缓和胸腺萎缩,进而造成免疫抑制并显着降低NDV抗体水平。另一方面,NDV弱毒疫苗本身在外源病毒致病过程中发挥重要作用,FAdV-4和CIAV通过疫苗污染方式感染鸡群的致病性要显着高于其直接感染,且同等剂量FAdV-4和CIAV经口服感染SPF鸡群后并不会导致死亡。同时,外源病毒与疫苗毒株LaSota的相互作用促进了彼此在多种器官中的增殖并能有效降低宿主免疫系统产生的中和抗体水平,而多种器官中过高的LaSota病毒载量以及外源病毒的存在激发了疫苗毒株的致病性导致被免疫鸡群发生典型的淋巴滤泡出血以及腺胃点状出血等ND示病症状,最终进一步加重病情。母源抗体是保护雏鸡早期免受病毒侵袭的重要屏障,但本研究显示雏鸡孵化后母源抗体水平于三日龄到达高峰,随后迅速下降,至7日龄疫苗接种时已降至较低水平,但其与免疫系统的双重作用仍能有效抑制通过人工模拟污染疫苗单独感染的FAdV-4,而混合污染疫苗中CIAV的存在能抑制免疫反应进而辅助FAdV突破母源抗体的保护,并最终引发明显的IBH-HPS以及15%左右的死亡率。临床数据显示,部分养殖场在使用了无外源病毒污染的NDV弱毒疫苗后同样爆发了IBH-HPS,而同批未免疫鸡群发病率较低。研究发现,免疫NDV弱毒疫苗能促进FAdV和CIAV在宿主体内的复制,进而显着提升其经垂直传播感染的致病性并加速病程,引发明显的贫血症状并导致IBH-HPS在低日龄雏鸡中发生。
王建忠[7]（2015）在《基于CMV启动子NDV基因Ⅶ型NA-1株活载体构建及免疫特性评价》文中研究说明新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）也被称为禽副黏病毒1型（avianparamyxovirus serotype-1，APMV-1），广泛分布于世界各地，严重危害全球家禽养殖业健康发展。NDV只有单一血清型，但存在多种基因型，当前NDV在世界范围内呈现以class II中基因VII型为主，其他基因型散发的流行态势。然而在NDV的免疫预防上，半个多世纪以来国内外一直沿用经典基因II型弱毒疫苗株，由于基因型与抗原性的不匹配，当前广泛应用的弱毒疫苗株不能完全阻止病毒感染，并且受到强毒攻击后排毒现象严重，即使在免疫家禽群体中依然有强毒株不断被分离的报道。反向遗传操作技术的发展，尤其是理想的病毒拯救系统，为深入研究NDV结构与功能关系、致病机制提供了有力工具，为研发与流行毒株相一致的基因VII型NDV弱毒疫苗候选株及候选疫苗载体提供了新的思路。本研究以鹅源基因VII型NDV NA-1株为研究对象，建立以CMV为启动子利用真核细胞广泛存在的RNA聚合酶Ⅱ的反向遗传操作系统，该系统不依赖传统T7RNA聚合酶，操作简便高效。在此基础上，将NDV NA-1株F蛋白裂解序列从强毒株特征基序突变为弱毒特征基序，从而获得基因VII型NDV致弱疫苗候选株及候选载体rmNA-1。为探索重组NDV表达两个甚至多个外源蛋白的可能性，本研究以红色荧光蛋白基因和绿色荧光蛋白基因为报告基因，构建同时表达双外源基因重组新城疫病毒rmNA-mCh-GFP，结果表明以NDV为载体具有构建重组多联、多价疫苗或开发可携带多种免疫分子的肿瘤治疗载体的潜力；以此鹅源NDV致弱株为活病毒载体，构建表达鹅细小病毒VP3保护性抗原蛋白重组新城疫病毒rmNA-VP3，并对其生物学特性及雏鹅免疫特性进行了评价，主要内容如下：I．基于CMV启动子NDV NA-1株反向遗传操作系统的建立根据本实验室分离并保存的鹅源基因VII型NDV NA-1株基因组序列，将全基因组分为7个末端部分重叠的基因片段进行分段克隆，利用邻近片段重叠部分的限制性酶切位点通过体外拼接组装成完整基因组cDNA，并分别在5’端和3’端引入锤头状核酶（HamRz）序列和丁型肝炎病毒核酶（HdvRz）序列，以产生精确的病毒基因3’末端和5’末端，克隆于真核表达质粒pCI-neo中CMV启动子的下游，构成NDV NA-1全基因组cDNA克隆pCI-NA-1。同时分别将NP、P和L基因ORF，克隆至真核表达载体pcDNA3.1中CMV启动子的下游，构成三个辅助质粒pcDNA-NP、pcDNA-P和pcDNA-L。共转染全长质粒pCI-NA-1与三个辅助质粒于BHK-21细胞拯救获得具有感染性的子代病毒。同时以eGFP为报告基因，构建了表达绿色荧光蛋白重组新城疫病毒，为今后制备新型基因VII型新城疫病毒活载体研发双价或多价疫苗奠定了基础。II．鹅源基因VII型新城疫病毒NA-1致弱株的构建为构建与当前流行毒株基因型抗原性相匹配的基因VII型新城疫病毒弱毒疫苗候选株及疫苗载体，在已建立的NDV NA-1株简便高效的反向遗传操作系统基础上，将NDV NA-1株天然典型强毒株特征的F蛋白裂解位点112RRQKR↓F117替换为弱毒疫苗株LaSota F裂解位点相应基序112GRQGR↓L117，拯救获得突变修饰株rmNA-1，致病性分析结果显示突变株rmNA-1致病力显着降低，致病类型从强毒株变为弱毒株，成功实现对病毒的致弱，而且突变致弱株rmNA-1具有和亲本株rNA-1相似的生长动力学曲线，并且连续传代10次，突变碱基仍然具有稳定性，不发生回复突变或其他突变，为制备新型基因VII型新城疫病毒弱毒疫苗候选株及候选载体奠定了基础。III.表达双荧光蛋白重组新城疫病毒的构建及其生物学特性评价为探索重组NDV表达两个外源保护性抗原蛋白构建重组多联或多价疫苗或研制可携带多种免疫分子的肿瘤靶向性治疗制剂的可能性，本研究以绿色荧光蛋白GFP和红色荧光蛋白mCherry为外源蛋白，将两者编码序列以内部核糖体进入位点（IRES）相连构成单独转录单位，插入到新城疫病毒基因组中，构建同时表达双荧光蛋白重组新城疫病毒rmNA-mCh-GFP，红色荧光蛋白mCherry和绿色荧光蛋白GFP在重组病毒感染细胞同时获得了正确表达，且不影响病毒其他蛋白的表达。表达双荧光蛋白重组病毒rmNA-mCh-GFP具有与母本株rmNA-1相似的体外生长曲线，尽管在最高生长滴度上与母本株相差约25倍，但rmNA-mCh-GFP仍具有较高的生长滴度。表明重组NDV具有同时表达两个甚至多个外源蛋白的潜力。VI.表达GPV VP3蛋白重组新城疫病毒的构建及其免疫原性分析克隆鹅细小病毒VP3基因ORF构成完整NDV基因表达盒，插入上述NDV突变致弱株rmNA-1基因组P和M之间，构成表达鹅细小病毒VP3蛋白重组新城疫病毒rmNA-VP3。通过免疫荧光染色、Western blot检测证实外源蛋白VP3可获得正确有效的表达，与母本株rmNA-1相比，rmNA-VP3拥有更低的致病力，并保持母本株良好的遗传稳定性，将rmNA-VP3分别在鸡胚中连续传代10次，外源基因VP3稳定遗传且F裂解位点修饰碱基仍然具有稳定性，不发生回复突变或其他突变。在鸡胚生长特性上，重组病毒rmNA-VP3具有与rmNA-1及野生型rNA-1相似的生长趋势，但由于外源基因的插入病毒滴度达到高峰的时间略晚，滴度峰值低于母本毒约20倍左右，以此表达鹅细小病毒VP3蛋白重组新城疫病毒免疫雏鹅显示出良好的免疫原性，整个免疫观察期无疫苗相关临床症状出现，且可同时诱导产生坚实的鹅细小病毒和新城疫病毒中和抗体，表明重组病毒rmNA-VP3具有免疫预防鹅细小病毒和新城疫病毒感染的潜力，同时，rmNA-1可作为病毒活载体表达外源蛋白而不影响其本身免疫原性。
陈慧婧[8]（2017）在《鸡新城疫、禽流感（H9亚型）二联灭活疫苗（LaSota株+HP株）制备技术的研究》文中提出本研究以鸡新城疫、禽流感（H9亚型）二联灭活疫苗（LaSota株+HP株）生产过程中的关键环节,如病毒繁殖、抗原浓缩、灭活、乳化等为研究对象,探讨上述生产过程中的质量控制要点,为完善该二联苗生产提供数据借鉴和科学依据。1、病毒繁殖:新城疫病毒（La Sota株）及禽流感病毒（H9亚型HP株）分别接毒鸡胚后,检测不同培养时间段病毒的的效价。结果表明新城疫的最佳培养时间为96h,-15℃保存不宜超过3个月,流感的最佳培养时间为96h,-15℃保存不宜超过2个月。2、超滤浓缩:新城疫、禽流感两种抗原浓缩不同倍数后,对比病毒含量、血凝价以及免疫效果,根据试验数据并结合生产实际,筛选出了新城疫、禽流感最适的浓缩倍数均为2倍3、灭活剂浓度与灭活时间:对比了不同浓度甲醛、不同灭活时间对新城疫和禽流感病毒灭活效果,结果表明上述两种抗原用甲醛溶液最适灭活浓度均为0.1%,最佳灭活时间分别为16h和18h。4、乳化试验:通过乳化时间、乳化速度进行对比,筛选出稳定性最好的条件是3000r/min乳化45～75min。对新城疫抗原、禽流感抗原以及油相不同比例乳化的样品进行免疫效果对比试验,筛选出水相油相最佳比例为1:3。
曹永忠,张小荣,黄国胜,刘倩,吴艳涛,刘秀梵[9]（2017）在《耐热新城疫弱毒株及其热稳定机制研究进展》文中指出新城疫严重危害养禽业发展,筛选和创制耐热的新城疫弱毒疫苗株具有重要的经济意义。综述国内外耐热新城疫弱毒株的筛选培育研究进展,概述目前作为疫苗株或疫苗候选株的生物学特性、免疫学特性及其应用情况,讨论国内外关于新城疫耐热株的热稳定机制主要研究结果,对开展新城疫病毒耐热分子机制解析和新型耐热疫苗株创制进行了展望。
秦卓明[10]（2006）在《新城疫病毒流行株致病性和抗原性及其与F和HN基因变异的相关性》文中指出鸡新城疫（Newcastle disease,ND）是由一种Ⅰ型副黏病毒-鸡新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）引发的一种急性传染病。未经免疫的鸡群,传播性极强,发病和死亡率都非常高。即使一些已经多次免疫的鸡群,由NDV引发的急性和亚急性死亡仍不断零星发生,而由新城疫引起的呼吸道感染、亚临床感染及产蛋下降则更为普遍。六十年来,NDV一直是对鸡群危害最大的疫病。近十年中,国内禽病界一直试图在分子遗传水平阐明NDV毒株的变异趋势,在分子流行病学上已积累了大量毒株的资料和信息。但是,这些研究对信息的比较分析的深度不够,缺乏系统的对病毒的生物学性状与基因变异相关性的研究,特别是还没有在疫病控制方面最为关心的对不同基因变异的相关性及其与抗原性变异的相关性方面开展深入的研究。本研究测定和比较了三十株NDV野毒株的融合蛋白（F）基因和血凝素-神经氨酸酶（HN）基因的全基因序列,首次对大量NDV毒株的F基因、HN基因,从致病性和抗原性变异两个方面及其与基因变异的相互关系进行系统的比较研究,获得了以下进展:一、NDV的分离鉴定和蚀斑纯化所用30个毒株均是1996～2005年期间从山东、江苏等不同地区的鸡、鸭、鹅、鸽等不同家禽分离,经用已知对NDV、禽流感（H5和H9型）等单因子阳性血清作血凝抑制试验（HI）证明均为NDV。同时对其中20株在细胞培养上完成了蚀斑纯化。二、NDV的致病性比较研究经MDT（鸡胚平均死亡时间）、ICPI（1日龄鸡脑内接种致病指数）及IVPI（6周龄雏鸡静脉致病指数）测定试验,30株NDV野毒有28株为强毒,1株为中等毒力,另一株尚未确定。对20个已蚀斑克隆纯化的病毒株的致病性作了重复实验,各毒株克隆纯化前后的毒力水平基本一致,表明分离物中的病毒组成是同源的。但有2个未能适应细胞的毒株例外,在经鸡胚连续传代后,与原代毒相比,一株的致病指数显着降低（SBZ02）,而另一株（SY03）从第5代则显着升高。这表明,有一部分原始毒可能存在着致病性不同的病毒混合物。三、NDV流行毒株的抗原性变异选择了17个克隆化毒株和3个参考株（La Sota、Clone30和F48E9）,利用SPF鸡分别制备了单因子阳性血清,分别用HI和病毒中和反应比较了它们与我国最广泛应用的Ⅱ型疫苗毒La Sota株和中国经典强毒F48E9间的抗原性交叉反应。结果表明:在我国鸡群中已
二、对不同条件下保存的新城疫弱毒株滴度变化的观察（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、对不同条件下保存的新城疫弱毒株滴度变化的观察（论文提纲范文）
（1）鸡CARD11蛋白对新城疫病毒的抑制作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 新城疫病毒的研究进展 |
| 1.1.1 NDV概述 |
| 1.1.2 NDV结构及病毒的转录与复制 |
| 1.1.3 新城疫病毒致病性 |
| 1.2 CARD11 蛋白研究进展 |
| 1.2.1 CARD11 蛋白概述 |
| 1.2.2 CBM信号体通路 |
| 1.2.3 CARD11 蛋白与疾病 |
| 1.3 本研究的目的与意义 |
| 第二章 鸡原代神经元细胞中CARD11对NDV复制的影响 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 SPF鸡胚、细胞、病毒、载体 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器及常用试剂配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 引物、shRNA设计 |
| 2.2.2 RT-qPCR |
| 2.2.3 CARD11 相关表达载体的构建 |
| 2.2.4 CARD11 多克隆抗体的制备 |
| 2.2.5 CARD11 免疫沉淀富集实验 |
| 2.2.6 重组腺病毒包装及纯化 |
| 2.2.7 病毒感染实验 |
| 2.2.8 细胞免疫荧光实验 |
| 2.2.9 数据统计分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 CARD11在NDV感染鸡脑中特异性显着上调表达 |
| 2.3.2 NDV在 chPNCs中的感染与复制 |
| 2.3.3 CARD11 真核表达载体的构建 |
| 2.3.4 CARD11 多克隆抗体的制备 |
| 2.3.5 NDV诱导chPNCs中 CARD11 的上调表达 |
| 2.3.6 chPNCs中实现外源蛋白表达的方法筛选 |
| 2.3.7 rAdVs的制备 |
| 2.3.8 rAdVs在 chPNCs中的感染效率 |
| 2.3.9 CARD11 抑制NDV的复制 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 鸡原代神经细胞中CARD11 抑制NDV复制机制的研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 动物、细胞、病毒、质粒 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器及常用试剂配制 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 引物设计 |
| 3.2.2 真核表达载体的构建 |
| 3.2.3 抑制剂处理实验 |
| 3.2.4 鸡NF-κB双萤光素报告基因检测系统的建立 |
| 3.2.5 病毒感染实验 |
| 3.2.6 免疫共沉淀实验 |
| 3.2.7 IFA实验 |
| 3.2.8 NDV微基因组检测 |
| 3.2.9 动物实验 |
| 3.2.10 数据统计分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 各真核表达载体的鉴定 |
| 3.3.2 CBM信号体对NDV复制的影响 |
| 3.3.3 chPNCs内源性CARD11与NDV蛋白相互作用 |
| 3.3.4 CARD11的CC1 结构域与NDV P蛋白的X结构域相互作用 |
| 3.3.5 NDV NP、L蛋白与P蛋白的相互作用 |
| 3.3.6 CARD11 蛋白与NDV L蛋白竞争性结合NDV P蛋白 |
| 3.3.7 CARD11 抑制病毒RNA聚合酶活性 |
| 3.3.8 脑内过表达CARD11对NDV在脑内复制的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 鸡胚成纤维细胞中CARD11对NDV膜融合活性的影响 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 细胞、质粒、病毒 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器及常用试剂配制 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 引物设计 |
| 4.2.2 NDV感染实验 |
| 4.2.3 RT-qPCR |
| 4.2.4 重组慢病毒的获得 |
| 4.2.5 细胞系的建立 |
| 4.2.6 Western blot |
| 4.2.7 IFA实验 |
| 4.2.8 抑制剂处理实验 |
| 4.2.9 细胞凋亡检测 |
| 4.2.10 细胞膜融合活性的定性及定量分析 |
| 4.2.11 蚀斑实验 |
| 4.2.12 数据统计分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 F48E9 NP基因标准曲线的建立 |
| 4.3.2 NDV诱导DF-1中CARD11 的上调表达不显着 |
| 4.3.3 HN蛋白诱导DF-1 细胞中CARD11 的上调表达 |
| 4.3.4 DF-1 细胞中CARD11 抑制NDV的复制 |
| 4.3.5 DF-1 细胞中CARD11 蛋白可与NDV P蛋白共定位 |
| 4.3.6 CARD11 降低NDV的细胞膜融合活性 |
| 4.3.7 CARD11 抑制细胞内furin蛋白酶的表达 |
| 4.3.8 CBM-NF-κB信号通路的活化抑制了NDV膜融合活性 |
| 4.3.9 CBM-NF-κB信号通路的活化抑制胞内furin的表达 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 其他禽嗜神经病毒对CARD11 表达的影响 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 动物、细胞、病毒 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要仪器及常用试剂配制 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 引物设计 |
| 5.2.2 组织总RNA提取及c DNA合成 |
| 5.2.3 绝对荧光定量CARD11 基因标准曲线的建立 |
| 5.2.4 正常鸡体中不同组织CARD11 基因的表达量测定 |
| 5.2.5 动物攻毒实验 |
| 5.2.6 病毒感染鸡体中CARD11 mRNA的相对表达变化 |
| 5.2.7 NDV滴度测定 |
| 5.2.8 NDV、AEV、IBV、FAdV-4 病毒基因组拷贝数测定 |
| 5.2.9 数据统计分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 CARD11 基因标准曲线的建立 |
| 5.3.2 正常鸡不同组织中CARD11 基因含量 |
| 5.3.3 NDV组织病毒载量与CARD11 mRNA表达变化的关系 |
| 5.3.4 AEV组织病毒载量与CARD11 mRNA表达变化的关系 |
| 5.3.5 IBV组织病毒载量与CARD11 mRNA表达变化的关系 |
| 5.3.6 FAdV-4 组织病毒载量与CARD11 mRNA表达变化的关系 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 全文总结 |
| 本研究创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）耐热新城疫病毒载体的构建及其在H9N2亚型禽流感疫苗研制中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 文献综述 |
| 1 NDV的病原学特性 |
| 1.1 NDV的分类 |
| 1.2 NDV的基因组特征 |
| 1.3 NDV转录特点 |
| 2 NDV耐热性及其分子基础 |
| 3 新城疫病毒反向遗传操作系统 |
| 3.1 NDV反向遗传操作系统建立 |
| 3.2 反向遗传技术与NDV毒力研究 |
| 4 NDV作为外源基因表达载体的研究 |
| 4.1 NDV作为外源基因表达载体插入位点、方式及容载量的研究 |
| 4.2 新城疫病毒作为外源基因表达载体的应用 |
| 4.2.1 在动物疫苗研究中的应用 |
| 4.2.2 在人类疾病相关疫苗研究方面的应用 |
| 4.3 以新城疫病毒为载体表达多个外源基因的研究 |
| 5 本研究的目的与意义 |
| 第一章 一种热稳定的基因Ⅷ型新城疫弱毒株外源基因表达载体的构建 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞及鸡胚 |
| 1.2 菌株及质粒 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.3.1 分子生物学试剂 |
| 1.3.2 化学试剂 |
| 1.4 主要仪器设备 |
| 1.5 分子生物学软件 |
| 2 方法 |
| 2.1 外源基因插入位点的引入 |
| 2.1.1 突变引物设计 |
| 2.1.2 PCR扩增 |
| 2.1.3 PCR产物的转化及鉴定 |
| 2.2 表达载体RAHR09-P的构建 |
| 2.2.1 中间质粒T2-R123的构建 |
| 2.2.2 含Pme Ⅰ酶切位点片段的替换 |
| 3 表达EGFP蛋白的重组新城疫病毒的构建 |
| 3.1 EGFP基因的克隆与鉴定 |
| 3.1.1 引物设计与合成 |
| 3.1.2 EGFP基因的扩增 |
| 3.2 全长重组质粒P-RAHR09-EGFP-1的构建及鉴定 |
| 3.2.1 全长重组质粒p-rAHR09-EGFP-1的构建 |
| 3.2.2 全长重组质粒p-rAHR09-EGFP-1的鉴定 |
| 3.3 重组病毒的拯救与鉴定 |
| 3.3.1 细胞和转染用质粒提取 |
| 3.3.2 重组质粒和辅助质粒共转染 |
| 3.3.3 重组病毒的鉴定 |
| 3.3.4 重组病毒耐热性测定 |
| 3.3.5 重组病毒NDV-rAHR09-EGFP-1生物学特性的测定 |
| 4 结果 |
| 4.1 EGFP基因PCR扩增结果 |
| 4.2 全长质粒P-RAHR09-EGFP-1 PCR鉴定结果 |
| 4.3 全长质粒P-RAHR09-EGFP-1酶切鉴定结果 |
| 4.4 辅助质粒鉴定结果 |
| 4.5 获救重组病毒HA和HI测定结果 |
| 4.6 获救重组病毒测序验证结果 |
| 4.7 获救重组病毒EGFP基因表达的鉴定结果 |
| 4.8 获救重组病毒耐热性测定结果 |
| 4.9 获救重组病毒生物学特性的测定结果 |
| 5 讨论 |
| 第二章 以耐热新城疫弱毒为载体的H9N2亚型禽流感活疫苗的研制 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株 |
| 1.2 菌株及质粒 |
| 1.3 细胞、鸡胚及实验室动物 |
| 1.4 主要试剂 |
| 1.5 分子生物学软件 |
| 1.6 主要仪器设备 |
| 1.7 配制试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 HA基因的克隆 |
| 2.1.1 HA基因ORF扩增引物的设计 |
| 2.1.2 缺失跨膜区序列的HA基因扩增引物的设计 |
| 2.1.3 包含NDV F蛋白跨膜区序列的HA基因扩增引物的设计 |
| 2.2 全长重组质粒P-RAHR09-H9HA-O、P-RAHR09-H9HA-T、P-RAHR09-H9-Q的构建及鉴定 |
| 2.2.1 全长重组质粒的构建 |
| 2.2.2 全长重组质粒的酶切鉴定 |
| 2.3 重组病毒的拯救及鉴定 |
| 2.3.1 重组病毒的拯救 |
| 2.3.2 3株获救重组病毒的鉴定 |
| 2.4 重组病毒生物学特性的研究 |
| 2.4.1 重组病毒的鸡胚半数感染量(EID_(50))的测定 |
| 2.4.2 重组病毒生长曲线的测定 |
| 2.4.3 ICPI的测定 |
| 2.4.4 MDT的测定 |
| 2.4.5 重组病毒耐热性测定 |
| 3 重组病毒免疫效力评价 |
| 3.1 重组病毒免疫保护试验 |
| 3.2 HI抗体水平监测 |
| 3.3 攻毒后排毒率的检测 |
| 4 结果 |
| 4.1 全长重组质粒酶切鉴定结果 |
| 4.2 重组病毒拯救鉴定结果 |
| 4.3 IFA鉴定结果 |
| 4.4 WESTERN-BLOT鉴定结果 |
| 4.5 3株重组病毒生物学特性鉴定结果 |
| 4.5.1 重组病毒的生长曲线 |
| 4.5.2 重组病毒EID50、MDT及ICPI测定结果 |
| 4.6 重组病毒耐热性测定结果 |
| 4.7 HI抗体效价测定结果 |
| 4.8 攻毒后排毒情况 |
| 5 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间取得的学术成果 |
（3）鸡新城疫病毒增殖培养细胞系的筛选与稳定表达唾液酸转移酶（ST6Gal）细胞株的构建及其应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写词表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 鸡新城疫病毒研究进展 |
| 1.1 副黏病毒概述 |
| 1.2 NDV的病原学概述 |
| 1.3 NDV分子生物学特性 |
| 1.4 NDV在宿主细胞内的复制增殖 |
| 第二章 新城疫病毒受体研究进展 |
| 2.1 病毒受体特性 |
| 2.2 NDV的唾液酸受体 |
| 2.3 与唾液酸受体相关的酶类 |
| 2.4 影响NDV与受体结合的因素 |
| 2.5 NDV唾液酸受体的分布 |
| 2.6 NDV培养特性 |
| 第三章 新城疫疫苗研究概况 |
| 3.1 常规疫苗 |
| 3.2 新型疫苗--基因工程疫苗 |
| 第二篇 实验研究部分 |
| 第一章 不同细胞系培养NDV特性的研究 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果与分析 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 唾液酸受体SAα2,3Gal和 SAα2,6Gal在不同细胞系表达的比较 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 表达唾液酸转移酶细胞株的建立与筛选 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 NDV Lasota株在BHK-ST6-15 细胞上培养条件的优化 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 基于BHK-ST6-15 全悬浮细胞培养的NDV Lasota株活疫苗的试验研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 发表的学术论文 |
| 致谢 |
（4）ClassⅠ新城疫弱毒的毒力演化及自噬在新城疫病毒感染肿瘤细胞中的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1. 细胞自噬概述 |
| 1.1 概念及分类 |
| 1.2 细胞自噬的发生及调控机制 |
| 2. 病毒感染引起细胞自噬的发生机制 |
| 2.1 病毒受体介导的细胞自噬 |
| 2.2 内质网应激介导的细胞自噬 |
| 3. 细胞自噬能抗病毒感染 |
| 3.1 自噬是细胞抵抗病毒感染的固有防线 |
| 3.2 细胞自噬可以改变病毒抗原的递呈方式 |
| 4. 细胞自噬能促进病毒感染 |
| 4.1 自噬泡可以成为病毒的复制场所 |
| 4.2 细胞自噬有助于病毒基因的复制和表达 |
| 5. 结语 |
| 第二章 Duck/JS/10 的分离及全因组测序 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病毒分离鉴定及扩增保存 |
| 2.2.2 分离株的毒力鉴定 |
| 2.2.3 分离株全基因组序列的扩增及测定 |
| 2.2.4 分离株的基因组序列拼接及分析 |
| 3. 结果 |
| 3.1 Duck/JS/10 的生物学特性鉴定 |
| 3.2 Duck/JS/10 全基因组测序与拼接 |
| 3.3 Duck/JS/10 全基因组遗传进化分析及基因型确定 |
| 3.4 Duck/JS/10 内部基因分析 |
| 3.5 Duck/JS/10 外部基因分析 |
| 3.6 Duck/JS/10 非编码区分析 |
| 4. 讨论 |
| 第三章 Duck/JS/10 株与 La Sota 株的免疫原性比较 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病毒扩增保存 |
| 2.2.2 病毒 EID50测定 |
| 2.2.3 病毒 TCID50测定 |
| 2.2.4 兔抗新城疫高免血清制备 |
| 2.2.5 交叉血凝抑制试验 |
| 2.2.6 交叉中和试验 |
| 2.2.7 交叉保护试验 |
| 2.2.8 统计分析 |
| 3. 结果 |
| 3.1 病毒扩增及特性鉴定 |
| 3.2 交叉血凝抑制结果 |
| 3.3 交叉中和结果 |
| 3.4 交叉保护结果 |
| 4. 讨论 |
| 第四章 新城疫病毒弱毒株的毒力进化 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 鸡胚连续传代 |
| 2.2.2 气囊连续传代 |
| 2.2.3 传代株的序列测定及分析 |
| 2.2.4 传代株的毒力测定 |
| 2.2.5 Duck/JS/10 系列传代株在不同攻途径下的致病力差异 |
| 2.2.6 Duck/JS/10 系列传代株在体内增殖情况比较 |
| 2.2.7 Duck/JS/10 系列传代株在体内组织分布情况比较 |
| 3. 结果 |
| 3.1 气囊传代测序结果 |
| 3.2 鸡胚传代测序结果 |
| 3.4 Duck/JS/10-A10 和 Duck/JS/10-E20 的全基因组测序及比较 |
| 3.5 Duck/JS/10 系列传代株的体内增殖比较 |
| 3.6 Duck/JS/10 系列传代株的组织嗜性差异 |
| 3.7 不同攻毒途径下 Duck/JS/10- A10 的致病力差异 |
| 4. 讨论 |
| 第五章 Duck/JS/10 株反向遗传平台的初步建立 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 引物设计与合成 |
| 2.2.2 目的片段扩增及鉴定 |
| 2.2.3 Duck/JS/10 全长转录载体的构建 |
| 2.2.4 Duck/JS/10 辅助质粒的构建 |
| 2.2.5 Duck/JS/10 辅助质粒功能的鉴定 |
| 2.2.6 Duck/JS/10 的拯救 |
| 3. 结果 |
| 3.1 Duck/JS/10 各片段 RT-PCR 扩增结果 |
| 3.2 含 Duck/JS/10 全长 cDNA 转录载体的鉴定 |
| 3.3 Duck/JS/10 辅助质粒的构建 |
| 3.4 Duck/JS/10 辅助质粒的功能鉴定 |
| 4. 讨论 |
| 第六章 新城疫病毒诱导肿瘤细胞发生自噬 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 GFPLC3-Ⅱ 重组质粒的构建 |
| 2.2.2 GFPLC3-Ⅱ 重组质粒在细胞内表达和检测 |
| 2.2.3 病毒感染及病毒滴度测定 |
| 2.2.4 间接免疫荧光(Indirect fluorescence assay，IFA) |
| 2.2.5 蛋白免疫印迹（Western blot） |
| 2.2.6 透射电镜观察细胞内的超微结构 |
| 2.2.7 数据统计与分析 |
| 3. 结果 |
| 3.1 GFPLC3-Ⅱ 质粒的构建及鉴定 |
| 3.2 GFPLC3-Ⅱ 质粒功能的鉴定 |
| 3.3 NDV 感染肿瘤细胞可以诱导自噬发生 |
| 4. 讨论 |
| 第七章 细胞自噬促进新城疫病毒复制 |
| 1. 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 细胞活性测定 |
| 2.2.2 siRNA 基因沉默 |
| 2.2.3 western blot |
| 2.2.4 病毒滴度测定 |
| 3 结果 |
| 3.1 NDV 诱导自噬的相关细胞信号通路检测 |
| 3.2 自噬药物对细胞毒性的影响 |
| 3.3 自噬药物对自噬的影响测定 |
| 3.4 自噬水平对病毒的影响 |
| 3.5 siRNA 干扰对自噬相关基因的沉默 |
| 3.6 siRNA 干扰对细胞毒性的影响 |
| 3.7 自噬基因沉默后对病毒复制的影响 |
| 4 讨论 |
| 第八章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（5）BHK-21细胞无血清悬浮培养生产新城疫病毒（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩写说明 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 新城疫概述 |
| 1.1.1 新城疫及其危害 |
| 1.1.2 新城疫流行状况 |
| 1.2 新城疫病毒概述 |
| 1.2.1 新城疫病毒分类 |
| 1.2.2 新城疫病毒结构 |
| 1.2.3 新城疫病毒增殖过程 |
| 1.3 新城疫病毒疫苗及生产 |
| 1.3.1 鸡胚工艺生产病毒疫苗 |
| 1.3.2 细胞工艺生产病毒疫苗 |
| 1.4 BHK-21细胞在病毒疫苗生产上的应用 |
| 1.5 无血清维持培养基 |
| 1.5.1 无血清生长培养基和维持培养基 |
| 1.5.2 无血清维持培养基中各组分的作用 |
| 1.5.3 无血清维持培养基的开发方法 |
| 1.6 基于动物细胞培养技术生产NDV的关键环节 |
| 1.6.1 细胞株筛选 |
| 1.6.2 细胞毒种获得 |
| 1.6.3 病毒接种过程的参数控制 |
| 1.7 本文的研究内容、目的与意义 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞株 |
| 2.1.2 病毒株 |
| 2.1.3 培养基 |
| 2.1.4 实验器材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 悬浮BHK-21细胞复苏与培养 |
| 2.2.2 贴壁BHK-21细胞复苏与传代培养 |
| 2.2.3 病毒感染 |
| 2.3 分析方法 |
| 2.3.1 活细胞密度和活率检测 |
| 2.3.2 病毒HA效价检测 |
| 2.3.3 病毒TCID_(50)效价检测 |
| 2.3.4 细胞营养物和代谢物浓度检测 |
| 2.4 数据处理 |
| 2.4.1 比生长速率计算 |
| 2.4.2 MOI计算 |
| 2.4.3 Svy计算 |
| 2.4.4 IVCC计算 |
| 2.4.5 代谢速率计算 |
| 2.4.6 统计学分析 |
| 第3章 基于BHK-21细胞无血清悬浮培养生产NDV的工艺优化 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验方案 |
| 3.2.1 BHK-21单克隆细胞株筛选 |
| 3.2.2 鸡胚毒种在细胞中传代适应 |
| 3.2.3 病毒接种过程的参数优化 |
| 3.2.4 无血清悬浮培养生产NDV工艺建立 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 高产NDV的BHK-21单克隆细胞株筛选 |
| 3.3.2 BHK-v002细胞无血清悬浮培养 |
| 3.3.3 细胞适应的种毒制备 |
| 3.3.4 病毒接种过程的参数优化 |
| 3.3.5 无血清悬浮培养生产NDV工艺建立 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章总结 |
| 第4章 BHK-21细胞悬浮培养生产NDV的无血清维持培养基的开发 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验方案 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 Mixture-Simplex Lattic实验设计及维持培养基筛选 |
| 4.3.2 BMM11维持培养基对病毒产量的影响 |
| 4.3.3 蛋白水解物对细胞增殖和病毒产量的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章总结 |
| 第5章 维持培养基BMM11中葡萄糖和谷氨酰胺对NDV扩增的影响 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验方案 |
| 5.2.1 维持培养基BMM11中NDV增殖 |
| 5.2.2 缺失葡萄糖和谷氨酰胺对细胞生长和病毒增殖的影响 |
| 5.2.3 葡萄糖和谷氨酰胺浓度对细胞生长和病毒增殖的影响 |
| 5.2.4 pH对病毒HA效价影响的冷模实验 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 维持培养基BMM11中细胞生长和NDV增殖 |
| 5.3.2 产毒期细胞的葡萄糖代谢 |
| 5.3.3 产毒期细胞的氨基酸代谢 |
| 5.3.4 缺失葡萄糖和谷氨酰胺对细胞生长和病毒增殖的影响 |
| 5.3.5 葡萄糖浓度对细胞生长和NDV增殖的影响 |
| 5.3.6 谷氨酰胺浓度对细胞生长和NDV增殖的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章总结 |
| 第6章 全文总结与展望 |
| 6.1 全文总结 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 硕士在读期间发表论文 |
（6）新城疫弱毒疫苗中禽腺病毒和鸡传染性贫血病毒混合污染的鉴定及人工模拟致病性分析（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 新城疫(Newcastle disease,ND) |
| 1.1.1 发现与命名 |
| 1.1.2 化学组成与结构学特点 |
| 1.1.3 生物学特性 |
| 1.1.4 病毒复制周期与培养特性 |
| 1.1.5 理化性质 |
| 1.1.6 毒株分类 |
| 1.1.7 流行病学 |
| 1.1.8 致病性 |
| 1.1.9 诊断 |
| 1.1.10 免疫与综合防治 |
| 1.2 鸡传染性贫血病毒(Chicken Infectious Anemia Virus,CIAV) |
| 1.2.1 发现与命名 |
| 1.2.2 化学组成与结构特点 |
| 1.2.3 生物学特性 |
| 1.2.4 病毒复制周期与培养特性 |
| 1.2.5 理化性质 |
| 1.2.6 毒株分类 |
| 1.2.7 流行病学 |
| 1.2.8 致病性 |
| 1.2.9 诊断 |
| 1.2.10 免疫与综合防治 |
| 1.3 禽腺病毒(Fowl adenovirus,FAdV) |
| 1.3.1 发现与命名 |
| 1.3.2 化学组成和结构特点 |
| 1.3.3 生物学特性 |
| 1.3.4 病毒复制周期和培养特性 |
| 1.3.5 理化性质 |
| 1.3.6 毒株分类 |
| 1.3.7 流行病学 |
| 1.3.8 致病性 |
| 1.3.9 诊断 |
| 1.3.10 免疫与综合防治 |
| 1.4 疫苗外源病毒污染研究现状 |
| 1.4.1 产生原因 |
| 1.4.2 研究进展 |
| 1.5 研究目的和意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 疫苗来源 |
| 2.1.2 单因子血清 |
| 2.1.3 实验动物与SPF动物饲养设备 |
| 2.1.4 主要试剂与仪器 |
| 2.1.5 其他试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 疫苗中外源病毒污染的检测 |
| 2.2.2 疫苗中外源病毒的分离和鉴定 |
| 2.2.3 疫苗中外源病毒部分基因扩增和测序分析 |
| 2.2.4 FAdV和 CIAV混合污染疫苗危害分析 |
| 2.2.5 NDV弱毒疫苗对外源病毒感染宿主过程的影响 |
| 2.2.6 混合污染疫苗突破母源抗体保护 |
| 2.2.7 新城疫弱毒疫苗免疫对先天感染FAdV和 CIAV致病性的影响 |
| 2.2.8 数据处理与分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 发病场所用弱毒疫苗外源病毒检测及分析 |
| 3.1.1 新城疫弱毒疫苗中存在FAdV和 CIAV的混合污染 |
| 3.1.2 疫苗中污染的FAdV和 CIAV的分离和鉴定 |
| 3.1.3 疫苗中FAdV和 CIAV的分离鉴定与序列分析 |
| 3.2 FAdV和 CIAV混合污染疫苗危害分析 |
| 3.2.1 混合污染疫苗使用引发鸡群心包积液综合征及大幅死亡 |
| 3.2.2 混合污染疫苗使用引发严重的生长迟缓 |
| 3.2.3 混合污染疫苗使用影响免疫器官发育 |
| 3.2.4 混合污染疫苗使用后NDV抗体水平明显降低 |
| 3.2.5 混合污染疫苗使用后FAdV和 CIAV复制动态 |
| 3.2.6 混合污染疫苗使用后FAdV和 CIAV在不同器官中的分布 |
| 3.3 NDV弱毒疫苗对外源病毒感染宿主过程的影响 |
| 3.3.1 LaSota的存在是诱发鸡死亡的必要因素 |
| 3.3.2 LaSota加重了FAdV和 CIAV混合感染对体重增长的抑制作用 |
| 3.3.3 LaSota加剧了FAdV和 CIAV混合感染对免疫器官的损伤 |
| 3.3.4 LaSota明显影响FAdV和 CIAV在不同器官中的分布 |
| 3.3.5 LaSota能显着提升FAdV和 CIAV病毒血症水平 |
| 3.3.6 LaSota能显着降低FAdV和 CIAV抗体水平 |
| 3.3.7 FAdV和 CIAV混合感染激活增强了LaSota的致病性 |
| 3.4 母源抗体与污染疫苗中外源病毒的 |
| 3.4.1 混合感染能突破母源抗体保护引发心包积液综合征 |
| 3.4.2 混合污染疫苗造成海兰褐鸡体重降低 |
| 3.4.3 混合污染疫苗影响海兰褐鸡免疫器官发育 |
| 3.4.4 混合污染疫苗影响NDV抗体水平 |
| 3.4.5 混合污染疫苗使用后FAdV和 CIAV抗体动态 |
| 3.4.6 混合污染疫苗使用后FAdV和 CIAV复制动态 |
| 3.5 NDV弱毒疫苗免疫对垂直感染FAdV和 CIAV致病性的影响 |
| 3.5.1 NDV弱毒疫苗免疫激发经垂直传播感染FAdV和 CIAV的致病性 |
| 3.5.2 LaSota影响了感染FAdV和 CIAV鸡多个血液指标 |
| 4 讨论 |
| 4.1 混合污染FAdV和 CIAV新城疫弱毒疫苗的使用是造成鸡群心包积液-包涵体肝炎爆发的重要原因 |
| 4.2 LaSota弱毒疫苗是外源病毒致病性的关键因素 |
| 4.3 母源抗体无法保护鸡群不受混合污染疫苗中外源病毒的影响 |
| 4.4 NDV弱毒疫苗免疫能激发FAdV和 CIAV感染的致病性 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文 |
（7）基于CMV启动子NDV基因Ⅶ型NA-1株活载体构建及免疫特性评价（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 新城疫病毒 |
| 1.1 新城疫病毒分子生物学 |
| 1.1.1 新城疫病毒分类地位与形态特征 |
| 1.1.2 新城疫病毒基因组 |
| 1.1.3 新城疫病毒主要结构和功能蛋白 |
| 1.2 新城疫病毒基因分型及分子流行病学 |
| 1.3 新城疫病毒致病力及分子基础 |
| 第2章 新城疫病毒反向遗传学研究进展 |
| 2.1 NDV 反向遗传操作技术的进展 |
| 2.1.1 NDV 反向遗传操作技术的建立 |
| 2.1.2 NDV 反向遗传操作系统 |
| 2.2 NDV 反向遗传操作技术的应用 |
| 2.2.1 活病毒载体 |
| 2.2.2 重组疫苗载体 |
| 第3章 鹅细小病毒研究进展 |
| 3.1 鹅细小病毒概述 |
| 3.2 鹅细小病毒分子生物学 |
| 3.2.1 形态结构与分类地位 |
| 3.2.2 基因组结构 |
| 3.2.3 结构蛋白 |
| 3.2.4 非结构蛋白 |
| 3.2.5 病毒分子检测技术 |
| 3.2.6 抗体检测技术 |
| 3.2.7 GPV 疫苗研究进展 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 基于CMV 启动子NDVNA-1 株反向遗传操作系统的建立 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 病毒、细胞与载体 |
| 1.1.2 SPF 鸡和 SPF 鸡胚 |
| 1.1.3 主要试剂与仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 引物设计与合成 |
| 1.2.2 NDV 全基因组 cDNA 克隆及辅助质粒的构建 |
| 1.2.3 表达 eGFP 重组 NDV 基因组全长 cDNA 克隆的构建 |
| 1.2.4 病毒的拯救 |
| 1.2.5 重组病毒的 RT-PCR 鉴定 |
| 1.2.6 重组病毒的间接免疫荧光鉴定 |
| 1.2.7 重组病毒的电镜观察 |
| 1.2.8 rNA-eGFP 复制特性与外源蛋白表达的鉴定 |
| 1.2.9 重组病毒生物学特性测定 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 NDV 全基因组 cDNA 克隆及辅助质粒的构建 |
| 1.3.2 表达 eGFP 重组 NDV 基因组全长 cDNA 克隆的构建 |
| 1.3.3 重组病毒基因水平鉴定 |
| 1.3.4 重组病毒的间接免疫荧光鉴定 |
| 1.3.5 重组病毒形态观察 |
| 1.3.6 rNA-eGFP 外源蛋白表达与复制特性的鉴定 |
| 1.3.7 重组病毒体外生长特性测定 |
| 1.3.8 重组病毒致病性测定 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 鹅源基因 VII 型新城疫病毒 NA-1 致弱株的构建 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 细胞和质粒 |
| 2.1.2 SPF 鸡和 SPF 鸡胚 |
| 2.1.3 主要试剂与仪器 |
| 2.1.4 引物设计与合成 |
| 2.1.5 NDV NA-1 株 F 裂解位点突变全长 cDNA 克隆构建 |
| 2.1.6 NDV NA-1 株 F 蛋白裂解位点突变病毒拯救 |
| 2.1.7 突变株 rmNA-1 的 RT-PCR 鉴定与电镜观察 |
| 2.1.8 突变株 rmNA-1 细胞培养特性检测 |
| 2.1.9 突变株 rmNA-1 致病力检测 |
| 2.1.10 突变株 rmNA-1 体外生长动力学曲线 |
| 2.1.11 突变株 rmNA-1 遗传稳定性检测 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 NDV NA-1 株 F 裂解位点突变全长 cDNA 克隆构建 |
| 2.2.2 突变株 rmNA-1 的 RT-PCR 鉴定与电镜观察 |
| 2.2.3 突变株 rmNA-1 细胞培养特性 |
| 2.2.4 突变株 rmNA-1 致病力检测结果 |
| 2.2.5 突变株 rmNA-1 体外生长动力学曲线 |
| 2.2.6 突变株 rmNA-1 遗传稳定性检测 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 表达双荧光蛋白重组 NDV 的构建及其生物学特性评价 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 细胞和质粒 |
| 3.1.2 SPF 鸡和 SPF 鸡胚 |
| 3.1.3 主要试剂与仪器 |
| 3.1.4 引物设计与合成 |
| 3.1.5 双外源基因重组 NDV 全长 cDNA 克隆的构建 |
| 3.1.6 病毒的拯救 |
| 3.1.7 拯救病毒 RT-PCR 鉴定 |
| 3.1.8 重组病毒的荧光鉴定 |
| 3.1.9 重组病毒的 Western bloting 检测 |
| 3.1.10 病毒滴定及致病力检测 |
| 3.1.11 生长曲线 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 双外源基因重组 NDV 全长 cDNA 克隆的构建 |
| 3.2.2 拯救病毒 RT-PCR 鉴定 |
| 3.2.3 重组病毒的荧光鉴定 |
| 3.2.4 重组病毒的 Western bloting 鉴定 |
| 3.2.5 病毒滴定及致病力检测 |
| 3.2.6 重组病毒生长曲线 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 表达 GPV VP3 蛋白重组 NDV 的构建及其免疫原性分析 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 病毒、细胞和质粒 |
| 4.1.2 SPF 鸡、SPF 鸡胚及鹅胚与雏鹅 |
| 4.1.3 主要试剂与仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 引物设计与合成 |
| 4.2.2 表达 VP3 基因重组 NDV 全长 cDNA 克隆的构建 |
| 4.2.3 病毒的拯救 |
| 4.2.4 重组病毒的 RT-PCR 鉴定 |
| 4.2.5 重组病毒的电镜观察 |
| 4.2.6 重组病毒的激光共聚焦检测 |
| 4.2.7 重组病毒的 Western bloting 检测 |
| 4.2.8 重组病毒致病性及遗传稳定性检测 |
| 4.2.9 重组病毒体外生长动力学曲线 |
| 4.2.10 重组病毒对雏鹅免疫研究 |
| 4.2.11 血清抗体水平测定 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 表达 VP3 蛋白重组新城疫病毒的构建 |
| 4.3.2 重组病毒的 RT-PCR 鉴定 |
| 4.3.3 重组病毒的电镜观察 |
| 4.3.4 重组病毒的激光共聚焦检测 |
| 4.3.5 重组病毒的 Western bloting 检测 |
| 4.3.6 重组病毒致病性及遗传稳定检测 |
| 4.3.7 重组病毒体外生长特性 |
| 4.3.8 重组病毒在雏鹅上免疫效力 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 攻读学位期间的科研成果 |
| 致谢 |
（8）鸡新城疫、禽流感（H9亚型）二联灭活疫苗（LaSota株+HP株）制备技术的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 鸡新城疫病毒、H9N2亚型禽流感病毒病原学概况 |
| 1.1 鸡新城疫病毒病原学概况 |
| 1.2 H9N2亚型禽流感病毒病原学概况 |
| 2 鸡新城疫病毒、H9N2亚型禽流感流行病学概况 |
| 2.1 鸡新城疫的流行病学 |
| 2.2 H9N2亚型禽流感的流行病学 |
| 3 国内外鸡新城疫病毒、H9N2亚型禽流感疫苗研究现状 |
| 3.1 鸡新城疫疫苗的研究现状 |
| 3.2 H9N2亚型禽流感疫苗的研究现状 |
| 4 本研究的目的与意义 |
| 第二章 病毒繁殖及保存期试验 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 病毒繁殖 |
| 2.2 保存期试验 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 超滤浓缩效果评价 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 病毒含量的测定 |
| 2.2 红细胞凝集价的测定 |
| 2.3 浓缩免疫效果评定 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 灭活试验 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 灭活检验 |
| 2.2 不同浓度甲醛对血凝活性影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 乳化试验 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 选择佐剂 |
| 2.2 剪切速度和乳化时间对疫苗稳定性和黏度的影响 |
| 2.3 水相油相不同比例的乳化试验结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 佐剂的选择 |
| 3.2 剪切速度和时间对疫苗稳定性和黏度的影响 |
| 3.3 不同比例的乳化试验效果评定 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（9）耐热新城疫弱毒株及其热稳定机制研究进展（论文提纲范文）
| 1 耐热NDV弱毒株研究进展 |
| 2 耐热株热稳定机制研究进展 |
| 3 研究展望 |
（10）新城疫病毒流行株致病性和抗原性及其与F和HN基因变异的相关性（论文提纲范文）
| 本研究克隆测序的新城疫毒株及其序列 |
| 本研究从GenBank 下载的NDV 的HN 和F 基因序列 |
| 英文缩写注释 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 新城疫文献综述 |
| 第一章 我国部分地区不同宿主NDV 的分离鉴定 |
| 第二章 NDV 分离株的蚀斑纯化及生物学毒力比较 |
| 第三章 新城疫病毒分离株抗原性的比较 |
| 第四章 新城疫病毒F 基因的克隆与序列分析 |
| 第五章 新城疫病毒HN 基因的克隆与分子特性分析 |
| 第六章 新城疫病毒 HN 和F 基因分型、遗传变异和时空分布相关性的比较 |
| 第七章 新城疫病毒抗原性与F 和HN 基因氨基酸的相关性 |
| 第八章 基因Ⅱ型NDV 强毒的分离鉴定和分子特性分析 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 博士期间论文发表情况 |
| 致 谢 |
四、对不同条件下保存的新城疫弱毒株滴度变化的观察（论文参考文献）
- [1]鸡CARD11蛋白对新城疫病毒的抑制作用[D]. 王文彬. 西北农林科技大学, 2019(02)
- [2]耐热新城疫病毒载体的构建及其在H9N2亚型禽流感疫苗研制中的应用[D]. 陈银. 扬州大学, 2019
- [3]鸡新城疫病毒增殖培养细胞系的筛选与稳定表达唾液酸转移酶（ST6Gal）细胞株的构建及其应用[D]. 董炳梅. 吉林大学, 2019
- [4]ClassⅠ新城疫弱毒的毒力演化及自噬在新城疫病毒感染肿瘤细胞中的作用[D]. 孟春春. 中国农业科学院, 2012(10)
- [5]BHK-21细胞无血清悬浮培养生产新城疫病毒[D]. 姬阿美. 华东理工大学, 2020(01)
- [6]新城疫弱毒疫苗中禽腺病毒和鸡传染性贫血病毒混合污染的鉴定及人工模拟致病性分析[D]. 苏奇. 山东农业大学, 2019(01)
- [7]基于CMV启动子NDV基因Ⅶ型NA-1株活载体构建及免疫特性评价[D]. 王建忠. 吉林大学, 2015(08)
- [8]鸡新城疫、禽流感（H9亚型）二联灭活疫苗（LaSota株+HP株）制备技术的研究[D]. 陈慧婧. 福建农林大学, 2017(01)
- [9]耐热新城疫弱毒株及其热稳定机制研究进展[J]. 曹永忠,张小荣,黄国胜,刘倩,吴艳涛,刘秀梵. 扬州大学学报(农业与生命科学版), 2017(01)
- [10]新城疫病毒流行株致病性和抗原性及其与F和HN基因变异的相关性[D]. 秦卓明. 山东农业大学, 2006(12)