一、间接ELISA检测鸭病毒性肝炎抗体的研究（论文文献综述）
宁扬,陈晓雯,侯玉凤,宋翔,陈甜甜,谢全喜[1]（2021）在《鸭甲型肝炎病毒1型的鉴定及防治研究进展》文中研究说明鸭病毒性肝炎（duck viral hepatitis,DVH）是一种具有高度接触性和高致死率的传染病,主要病原为鸭甲型肝炎病毒（duck hepatitis A viral,DHAV）。其特点是肝空泡增多、肝坏死和出血。幼雏鸭感染后的病死率可达95%以上。鸭甲型肝炎病毒可分为DHAV-1、DHAV-2和DHAV-3共3种血清型,其中DHAV-1最广泛且毒性最强。为准确、高效、特异地鉴定DHAV,建立一系列检测方法。目前较为常用的是间接酶联免疫吸附试验（I-ELISA）。对DHAV-1的防治早期多使用灭活苗和弱毒苗,但是并未达到理想的免疫效果。近年来,很多研究集中于基因工程疫苗及中药的应用,对于防治DHAV-1具有很好的前景。
赫晓霞,马洁琼,任雅楠,王俊,邢文革[2]（2021）在《基层实验室HCV抗体检测能力验证评估》文中进行了进一步梳理目的为了了解县级以上检测实验室HCV抗体检测能力,研发制备HCV抗体能力验证质控品,开展基层实验室HCV抗体检测能力的室间比对与评估工作。方法研发制备均一稳定的HCV抗体检测质控样品,组织全国县级以上75家HCV抗体检测实验室开展能力验证,各实验室按照要求在规定时间内完成质控品检测并按时回报结果,以全部回馈结果确定质控品预期结果,以检测水平评价标准差系数（SDI）评估各实验室检测能力。结果质控品190906～190910均一性与稳定性检验均符合要求;完成能力验证结果回报的70家实验室中,30家（42.86%）得分100分,39家（55.71%）得分80分,1家（1.43%）得分20分;使用间接ELISA法和化学发光法检测质控品的结果在不同实验室间差异较大[变异系数（CV）分别为33.92%、117.65%、125.77%、125.00%、32.09%和67.56%、129.15%、35.53%、133.72%、73.80%];间接ELISA法、化学发光法和胶体金法对弱阳性190908的检测准确性偏低（分别为47.50%、50.00%、27.27%）;SDI值显示部分实验室可能存在系统误差和随机误差。结论本研究制备的HCV抗体能力验证质控品能够在能力验证工作中稳定有效地发挥作用,参加此次能力验证的实验室普遍具有HCV抗体检测能力,部分实验室可能存在系统误差和随机误差问题。
刘燕,汤承,岳华,王远微[3]（2021）在《交叉中和血清1型和血清3型鸭甲肝病毒单克隆抗体的制备与鉴定》文中研究表明鸭甲型肝炎（duck hepatitis A, DHA）是危害养鸭业的主要疾病之一,是一种雏鸭的急性、高度致死性传染病。本研究旨在研制一种对我国流行的鸭甲型肝炎血清1型（DHAV-1）和血清3型（DHAV-3）病毒具有交叉中和作用的单克隆抗体（monoclonal antibody, McAb）。人工合成12条DHAV-1和DHAV-3的VP1蛋白共有的抗原表位肽,分别与钥孔血蓝蛋白（keyhole limpet hemocyanin, KLH）载体偶联作为免疫抗原,免疫BALB/c小鼠制备McAb。通过检测McAb与DHAV-1和DHAV-3的交叉反应性,测定McAb对病毒增殖的抑制效率、中和效价以及攻毒保护率等来筛选McAb。本研究共获得了12株稳定分泌McAb的杂交瘤细胞株,其中6株（C1、C4、C7、C12、C13、C16）分泌的McAb同时与DHAV-1和DHAV-3发生特异性交叉反应;C1、C4、C7、C16可以抑制DHAV-1和DHAV-3在鸭胚中的增殖,抑制率在75.34%～100.00%不等;对DHAV-1和DHAV-3的中和效价:C1（1∶3&1∶5）、C4（1∶3&1∶3）、C7（1∶10&1∶11）和C16（1∶9&1∶9）;C7和C16对DHAV-1和DHAV-3攻毒雏鸭的保护率较高,分别为"70%、80%"和"100%、60%"。本研究成功研制出对DHAV-1和DHAV-3具有交叉中和活性的McAb 4株,其中2株对病毒的感染具有良好的预防效果,为DHA的防控提供了新材料和新思路。
张富友[4]（2021）在《我国部分地区禽星状病毒分子流行病学调查及其基因组特性研究》文中指出禽星状病毒（Avian astrovirus,AAstV）属于星状病毒科,是危害家禽养殖业的重要病原。AAstV主要包括禽肾炎病毒（Avian nephritis virus,ANV）、鸭星状病毒（Duck astrovirus,DAstV）、鸡星状病毒（Chicken astrovirus,CAstV）、鹅星状病毒（Goose astrovirus,Go AstV）等,可以感染多种禽类,引发雏鸡肾炎、鸭病毒性肝炎、腹泻、发育迟缓和痛风等症状。近年来,禽星状病毒在世界范围内感染普遍,在我国也时有发生,如2017年在山东、江苏等地爆发的新型鹅星状病毒引起的雏鹅内脏型痛风病。此外,CAstV、DAstV等新流行株的出现,也给该病的防控带来较大挑战。为了解禽星状病毒在我国的流行情况,本研究对从8个省份采集的家禽样品进行了分子流行病学调查,对分离到的禽星状病毒代表株进行全基因组测序和致病性分析,为禽星状病毒防控提供科学依据。1.禽星状病毒分子流行病学调查本研究针对禽星状病毒RNA依赖的RNA聚合酶基因（RNA-dependent RNA polymerase,RdRP）设计通用引物,从江苏等8省区家禽批发市场、零售市场、养殖场和屠宰场等场点采集1210份咽肛拭子样品,通过逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）进行禽星状病毒测序,并根据序列测定结果构建系统发育树。结果共检测到17株禽星状病毒,样品总体阳性率为1.4%,其中包括7株鸡星状病毒（CAstV）、5株禽肾炎病毒（ANV）、2株鸭星状病毒（DAstV）、2株新型鹅星状病毒（Go AstV）和1株新型禽星状病毒（AAstV-3）。值得注意的是,从养殖、屠宰到销售各个环节中,都证实存在禽星状病毒感染。表明禽星状病毒在整个家禽产业链污染较为严重,各个环节之间产品的流通促进了禽星状病毒传播,这也提示我们要加强对禽星状病毒监测。本研究证实了我国禽星状病毒具有遗传多样性,进一步丰富我国家禽星状病毒流行病学资料。2.禽星状病毒分离与鉴定对检测到的禽星状病毒分别通过接种鸡胚、鸭胚和鹅胚进行病毒分离。结果显示,利用鸡胚可以从鸡源样品分离到ANV和CAstV,利用鸭胚可以从鸭源样品中分离到DAstV,鹅胚可以分离到Go AstV。此外,两株新型鹅星状病毒也可从鸭胚中分离到。这表明分离到的新型鹅星状病毒可以跨宿主传播。对分离株进行外源病毒检测,并挑选可以稳定增殖的鸡星状病毒分离株N-2P株进行纯化定量,然后接种1日龄SPF鸡进行致病性试验,结果显示,在观察的15 d内,攻毒组的小鸡状态稳定,未出现死亡,剖检无明显病变。攻毒组7只小鸡中,有3只小鸡的肝脏、脾脏和肾脏中均检测到鸡星状病毒核酸阳性,阳性率为42.86%。结果表明,该鸡星状病毒分离株可以感染SPF鸡,但是未引起明显的病变,这说明本研究分离到的鸡星状病毒致病性较弱。由此可见,我国存在致病性较弱的禽星状病毒,其危害性不大,这也是尚未引起足够重视的主要原因。已有研究表明,禽星状病毒和其他病原的混合感染或继发感染会造成更强的致病性,因此要加强对禽星状病毒病预防和控制。3.禽星状病毒基因组特性分析利用二代测序技术对分离到的17株禽星状病毒进行全基因组测序,将其与Gen Bank的参考毒株进行全基因组和3个开放阅读框序列的同源性和进化树分析,并对分离株的抗原表位、跨膜区结构和疏水性进行预测分析。遗传进化分析显示,17株禽星状病毒分布在6个分支,分别为7株鸡星状病毒、2株新型鹅星状病毒、5株禽肾炎病毒、1株新型星状病毒、1株2型鸭星状病毒和1株1型鸭星状病毒。其中分离株G1272只有ORF2区域可以匹配到同源性较高的参考株序列,ORF1a和ORF1b区域与已知序列同源性较低,与DAstV-1、CAstV和DAstV-2等参考株相比,其核苷酸和氨基酸同源性均小于50%。其余分离株在全基因组序列和3个ORF区域的核苷酸和氨基酸同源性分析结果一致,均与其对应的Go AstV、DAstV-1、CAstV、DAstV-2和ANV等参考株存在较高的同源性。疏水性、抗原表位和跨膜区预测结果显示,全部分离株的3个ORF区域所编码蛋白具有良好的抗原性,且全部为亲水性蛋白,只有ORF1a区域预测到4-6个跨膜区结构,在ORF1b和ORF2中未预测到相关结构。本研究对分离到的禽星状病毒进行全基因组测序分析和对亲水性等结构的预测分析,不仅证实我国家禽中流行的禽星状病毒具有遗传多样性,而且丰富了禽星状病毒流行病学资料库,为禽星状病毒后续研究提供了技术支持。
刘志艺[5]（2021）在《抗鹅星状病毒和鹅细小病毒精制卵黄抗体的制备及应用》文中认为星状病毒科包括主要感染人、牛、猪、狗、绵羊、猫等的哺乳动物星状病毒属和主要感染鸡、鸭、鹅、火鸡等的禽星状病毒属。自2015年起,中国养鹅地区不断出现一种5-20日龄以腿关节及肾脏尿酸盐沉积为特征的疫情,研究表明鹅星状病毒（Goose Astrovirus,GoAstV）是造成此疫情的主要病原因子。4-20日龄的雏鹅最易受到鹅细小病毒的感染,该病原具有高致病性,当10日龄内的雏鹅被感染,严重者可达到100%的死亡。针对感染雏鹅的两种重要病原,建立快速、准确的诊断方法,研究有效的预防及治疗手段,以减轻鹅星状病毒及鹅细小病毒给养殖业发展带来的危害,是当前兽医工作者迫切需要解决的问题之一。鉴于此,本文通过昆虫细胞-杆状病毒表达系统,分别构建并表达GPV-VP2和GoAstV-Cap蛋白,免疫开产前蛋鸡以制备卵黄抗体,通过体内外实验评价卵黄抗体的抗病毒效果。主要内容包括以下几个方面:（1）GPV-VP2和GoAstV-Cap蛋白的表达:将GPV VP2基因和GoAstV Cap基因分别插入p Fast-Bac-HTA载体,质粒构建成功转化DH5α抽提质粒测序正确后,阳性质粒转化DH10Bac,蓝白斑筛选后于SF9昆虫细胞中进行转染,连续传代三次,通过Western blot和IFA方法检测重组病毒,结果表明,GPV VP2蛋白和GoAstV Cap蛋白得以表达,目的条带大小分别为65 k Da和70 k Da。（2）抗鹅星状病毒和细小病毒卵黄抗体的制备及效力评价:将重组杆状病毒表达的蛋白,GoAstV在LMH细胞上扩增的细胞毒以及GPV在鹅胚中扩繁的胚毒灭活后,添加佐剂进行乳化,免疫开产前蛋鸡,收集卵黄并通过聚乙二醇法进行抗体的纯化,分离纯化的卵黄抗体通过Western blot检测其特异性后,评价所制备的卵黄抗体体内及体外效力:体外效力试验——BCA浓度测定Ig Y-GoAstV浓度为40.76 mg/ml,Ig Y-GPV浓度为17.50mg/ml,Ig Y-Bac-VP2+Bac-Cap浓度为16.96 mg/ml,Ig Y-GPV+GoAstV浓度42.68 mg/ml,当与105拷贝/ml的GoAstV和TCID50为104/0.2m L的GPV1:1感作后,Western blot未检出蛋白条带,提示Ig Y-GoAstV,Ig Y-GPV,Ig Y-Bac-VP2+Bac-Cap和Ig Y-GPV+GoAstV,能阻止GoAstV在LMH细胞上的增殖以及GPV在GEF细胞上的增殖。体内效力试验——将1日龄雏鹅分为攻毒组、治疗组、预防组和空白组,其中预防组于1日龄肌肉注射卵黄抗体,待雏鹅5日龄后,进行攻毒实验同时对预防组加强免疫,雏鹅8日龄时,对治疗组注射卵黄抗体进行治疗;用多聚甲醛固定各组织脏器,进行HE及IHC分析,IHC实验结果可见预防组和治疗组与攻毒组相比均无抗原检出,提示制备的卵黄抗体抑制相应抗原增殖,HE显示预防组和治疗组无明显病理变化;建立Taq Man双重荧光定量检测方法并检测攻毒组、预防组、治疗组和空白组靶器官5 d、15 d、20 d、25 d、30 d时的病毒载量,结果显示,所制备的卵黄抗体抑制病毒在体内增殖。综上所述,本实验研究GoAstV在LMH细胞上的增殖特性,确定后续GoAstV扩繁的收毒时间,通过杆状病毒载体表达系统成功表达了GPV VP2蛋白和GoAstV的Cap蛋白,将GoAstV在LMH上增殖的细胞毒和GPV在鹅胚上增殖胚毒,作为免疫开产蛋鸡的免疫原备用。制备并分离纯化卵抗,通过体外细胞实验评价卵黄抗体的中和效力,通过雏鹅的感染和治疗评价制备的卵黄抗体的体内中和效力,结果表明,所制备的卵黄抗体具有中和病毒能力,能在抑制鹅星状病毒和鹅细小病毒在宿主细胞和易感动物中的增殖。
张旭杰[6]（2021）在《新型鸭呼肠孤病毒卵黄抗体的制备及应用》文中进行了进一步梳理近几年来,我国多个省份广泛流行由新型鸭呼肠孤病毒（Novel duck reovirus,NDRV）感染引起的以脾脏坏死为主要特征的传染性疾病。NDRV感染会对雏鸭脾脏和其他免疫器官造成损害,抑制免疫系统,导致雏鸭对其他病原体易感性增强,诱发混合感染。该病毒可感染多个品种的雏鸭,日龄越小,发病率和死亡率越高。患病雏鸭临床常表现为精神倦怠、喜卧、拉稀、发育受阻、生长缓慢,饲料返还率大幅降低。本研究使用鸡胚肝细胞对实验室保存的新型鸭呼肠孤病毒SDYC株进行病毒扩增,获得大量抗原液后制备灭活疫苗免疫开产蛋鸡,收集卵黄样品制备新型鸭呼肠孤病毒卵黄抗体,为NDRV的预防和治疗提供支持和保障。新型鸭呼肠孤病毒SDYC株接种鸡胚肝细胞,病毒感染36h后收取细胞病毒液,离心后取上清液作为制备灭活疫苗的抗原液。对抗原液进行毒力效价、纯净度检测和动物回归试验,均符合疫苗制备要求。选择终浓度为0.2%甲醛溶液37°C灭活抗原液24h,灭活后与Tween-80按94:6的比例混合配制疫苗水相。无菌操作加入2份水相、3份油相乳化疫苗,制成油乳剂灭活疫苗。对疫苗的安全性、剂型、物理性状、储存条件进行检测,疫苗剂型为油包水型,物理性状稳定,未检测到细菌以及支原体等微生物,可在4°C保存12个月。灭活疫苗免疫开产蛋鸡,连续免疫4次,每次免疫间隔14d,4次免疫后每隔1周收集蛋黄样品进行ELISA抗体效价检测。结果显示免疫蛋卵黄抗体水平不断升高,至第三周达到最大值后抗体水平逐渐下降。收取免疫蛋经蛋壳消毒、蛋黄分离、一次灭活、醋酸酸化、辛酸萃取、二次灭活、粗滤、除菌细滤、超滤浓缩、三次灭活、除菌细滤后制备成防治新型鸭呼肠孤病毒的卵黄抗体。对卵黄抗体的物理性状、p H值、安全性、抗体效价进行检测,均符合抗体生产标准。进行动物免疫保护试验检验新型鸭呼肠孤病毒卵黄抗体对雏鸭的保护效力,结果显示雏鸭注射抗体后机体抗体水平迅速升高,第4d左右机体抗体水平达到最高峰。雏鸭注射1.0 m L卵黄抗体后第21d检测血清抗体效价仍呈阳性,卵黄抗体持续保护时间完全覆盖雏鸭整个易感期,可大大降低新型鸭呼肠孤病毒对雏鸭的感染率。健康雏鸭人工感染新型鸭呼肠孤病毒后当天开始排毒,临床表现反应迟缓、喜卧、扎堆、饮食量下降。剖检发病雏鸭,脾脏坏死、肝脏出血症状明显。患病雏鸭注射卵黄抗体后,排毒雏鸭数量不断减少直至患病雏鸭不再排毒,精神状态良好,采食量、饮水量恢复正常。剖检雏鸭发现肝脏出血和脾脏坏死症状明显减轻,部分雏鸭恢复正常。综上所述,新型鸭呼肠孤病毒卵黄抗体制作流程简单、成本较低、安全性好、保护效果明显、治愈率高,可以有效用于预防和治疗鸭群爆发的以脾脏坏死为主要症状的新型鸭呼肠孤病毒感染,对新型鸭呼肠孤病毒感染的预防及治疗极具应用价值。
罗煜杭[7]（2021）在《戊型肝炎病毒ORF3蛋白单克隆抗体的制备及其应用》文中研究说明戊型肝炎（Hepatitis E）是一种由戊型肝炎病毒（HEV）引起的自限性疾病。大多数个体感染后若干周内能够自行康复,但在器官移植患者、血液肿瘤患者和HIV感染者中,HEV感染后将会引起慢性肝炎,并迅速发展为肝纤维化和肝硬化,同时伴有病毒性脑炎、后循环缺血、周围神经病变等肝外症状。在我国,HEV-1和HEV-4是造成戊型肝炎的主要病原体。其中,HEV ORF3蛋白在病毒感染早期表达且会引起体内抗体的产生,因此抗ORF3蛋白抗体的滴度检测可以作为早期急性感染、慢性感染或准包膜状态的辅助诊断指标。目前市面上HEV商品化检测试剂盒主要利用间接ELISA方法进行检测,其灵敏性和特异性较高,可以同时检测HEV-1到4型,但该方法对包被抗原的纯度要求较高,且无法进行不同基因型鉴别诊断。基于此,本研究选取基因1型HEV的代表株SAR55,利用原核表达系统表达可溶性HEV-1 ORF3SAR55重组蛋白,并利用该蛋白免疫小鼠,通过杂交瘤融合技术筛选制备了抗HEV-1的ORF3蛋白的单克隆抗体,并通过与HEV-3和HEV-4 ORF3抗原交叉反应筛选得到1株抗HEV-1 ORF3蛋白特异性的单抗,并进行HRP标记,利用标记的HRP蛋白建立了检测人血清中抗HEV抗体的竞争ELISA,为HEV感染的临床诊断提供了新方法。本研究的主要内容和结果如下:1.成功构建了pET-21b-ORF3SAR55重组质粒,将其导入表达菌BL21（DE3）进行诱导表达,SDS-PAGE分析表明成功表达出与预期大小一致14 k Da的可溶性ORF3SAR55重组蛋白;利用Ni柱亲和层析法进行纯化,得到了纯度较高的ORF3SAR55重组蛋白,产量约为32 mg/L。2.利用ORF3SAR55重组蛋白免疫Balb/c小鼠,冲击免疫一周后采集脾脏进行细胞融合,并通过i ELISA及亚克隆筛选,获得3株稳定分泌ORF3SAR55抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为3C11,1D2和8H8。将杂交瘤细胞腹腔注射给小鼠10天后收集腹水,利用Protein G beads纯化后成功获得了单克隆抗体,同时对单抗亚型进行鉴定,结果显示3C11属于Ig G2b,1D2和8H8均属于Ig G2a,且与HEV-3和HEV-4 ORF3蛋白交叉反应显示,单抗1D2与HEV-1 ORF3蛋白特异反应,不同其它基因型的反应。3.将单抗1D2与HRP进行体外标记,然后利用HRP-1D2为竞争试剂,ORF3SAR55蛋白为包被抗原,建立了HEV抗体检测的竞争ELISA。该方法的抗原最佳包被量为50μg/孔,HRP-1D2（1 mg/m L）最佳稀释度为1:1000,血清最佳稀释比为1:10,反应时间为37℃1 h;其敏感性为100%,特异性为99.2%;板内板间变异系数为1.38%～7.13%。并且与基因3型HEV抗体阳性兔血清和4型阳性猪血清无竞争性。综上所述,本研究成功筛选和制备了抗基因1型HEV ORF3蛋白的单抗,并成功偶联HRP,利用该HRP标记单抗建立了检测人血清中HEV抗体的竞争ELISA方法,为临床中HEV感染的检测提供了新的方法。
孙佳卉,刘志艺,黄聪,李传峰,刘光清,陈宗艳[8]（2021）在《抗鹅星状病毒Cap蛋白单克隆抗体的制备及鉴定》文中指出自2016年以来,鹅星状病毒（GoAstV）已成为当前危害鹅养殖业生产的重要病原体之一,雏鹅均易感,主要引起9～19日龄雏鹅死亡,以雏鹅腿关节肿胀及肾脏尿酸盐沉积导致肾炎为主要病征。建立相应的病原学与血清学检测方法对于防控该病至关重要。为建立基于病毒Cap蛋白的诊断技术,本研究构建了鹅星状病毒去核定位信号肽的Cap基因原核表达质粒pET-30a-Cap,转化BL21（DE3）后用IPTG诱导表达,并通过SDS-PAGE和Western blot检测Cap蛋白的表达。大量表达并纯化重组蛋白后,将其免疫BALB/c小鼠,采用间接ELISA检测免疫小鼠抗体效价,制备单克隆抗体,并对其进行鉴定。结果显示:获得的重组蛋白分子量约为28 kDa;通过3次亚克隆筛选最终获得5株杂交瘤细胞株1A5G10、1C11B11、5B7G8、9A12B12、9C3E11,抗体效价均可达1:51～200以上;1A5G10、5B7G8、9C3E11重链为IgG1型,1C11B11、9A12B12重链为IgG2b型,轻链均为κ型;制备的单克隆抗体均可与重组蛋白反应或GoAstV发生反应;其中5B7G8株与GoAstV发生反应,1C11B11、9A12B12株与GoAstV发生反应。本研究结果为GoAstV诊断方法的建立以及GoAstV Cap蛋白功能的进一步研究奠定了坚实基础。
管飘萍[9]（2020）在《2017～2019年山东省部分地区鸭甲肝病毒的分子特征分析和VP1基因的表达》文中认为鸭病毒性肝炎（Duck viral hepatitis,DVH）,是由鸭肝炎病毒（Duck hepatitis virus,DHV）引起的雏鸭的一种高度致死,传播迅速的传染病,是危害养鸭业最严重的疫病之一。鸭肝炎病毒可分为3个血清型:血清1型鸭肝炎病毒(（鸭甲肝病毒（Duck hepatitis A virus,DHAV）,DHAV 又分为 DHAV-A、B、C 或（称 DHAV-1、2、3）3 个基因型）、血清2型鸭肝炎病毒（又称为鸭星状病毒1型（Duck astrovirus 1,DAstV-1））、血清3型鸭肝炎病毒（又称为鸭星状病毒2型（Duck astrovirus 2,DAstV-2））。目前我国的鸭病毒性肝炎主要是由DHAV-1和DHAV-3引起的,且常出现两种亚型的混合感染,DHAV-3已代替DHAV-1成为优势血清型,这也许是许多鸭场已经接种了传统DHAV-1疫苗,却仍暴发鸭肝炎的原因之一。目前市面上还未出现针对DHAV-3的商品化疫苗,研发出能针对DHAV-3的诊断和防治的生物制剂具有重要意义。VP1蛋白作为DHAV的主要衣壳蛋白,含有主要保护性抗原位点,能刺激产生特异性保护受体,且VP1基因也是DHAV基因组的高变区,具有最大遗传多样性,决定了不同毒株的分子特征。因此,为进一步了解鸭甲肝病毒的病原学特征,研制出诊断和防治DHAV-3的生物制品,本研究分离鉴定了 8株DHAV-1和14株DHAV-3病毒,对其VP1基因序列进行测定和分析,并以DHAV-3分离株的VP1基因为模板分别进行了真核和原核表达,以纯化的原核表达蛋白为抗原,初步建立了检测DHAV-3抗体的ELISA方法,对真核表达作为DNA疫苗候选生物材料的可能性进行了初步评价。本研究主要分为三部分:1、22株鸭甲肝病毒的分离鉴定及VP1基因的分子特征分析对2017～2019年从山东省采集的27份疑似感染鸭肝炎病毒的病料进行了分离、鉴定,并对分离株的VP1基因进行了序列测定以及遗传变异分析。结果表明,27份疑似病料接种鸡胚进行病毒分离,共分离出了 22株病毒,8株为DHAV-1,14株为DHAV-3。VP1基因序列比对结果显示:8株DHAV-1分离株与15株参考株的核苷酸同源性为91.7%～98.6%,氨基酸同源性为93.7%～97.5%。8株DHAV-1分离株之间的核苷酸同源性为97.2%～1 00%,氨基酸同源性为97.9%～100%;14株DHAV-3分离株与17株参考株的核苷酸同源性为89.4%～98.9%,氨基酸同源性为92.1%～100%。14株DHAV-3分离株之间的核苷酸同源性为93.9%～100%,氨基酸同源性为96.7%～100%,属于Ⅰ型（GI型）。2、鸭甲肝病毒3型VP1基因的真核表达设计了三对引物（其中一对引物含有Kozak序列）分别RT-PCR扩增DHAV-3分离株的VP1基因,插入不同的真核载体,构建出了重组质粒pcDNA3.1-3-VP1,KpcDNA3.1-3-VP1和pCAGGS-3-VP1,并将其转染Vero细胞,表达产物经间接免疫荧光和WB鉴定。结果表明:VP1基因在pcDNA3.1和pCAGGS中均获得表达,表达的重组蛋白大小为27kDa,与预期相符。进一步将重组质粒作为DNA疫苗免疫小鼠,每种质粒免疫5只BALB/c小鼠,并用空载体设置阴性对照,每只100 μg,2周免疫一次,共免疫3次。三免后14天取血清采用间接ELISA方法检测小鼠体内抗体水平,结果显示:小鼠三免后14天能够检测到抗体,而对照组未检测到特异性抗体,表明本实验构建的真核重组质粒能够诱导小鼠产生特异性抗体。3、鸭甲肝病毒3型VP1基因的原核表达以及抗体检测ELISA方法的初步建立RT-PCR扩增DHAV-3分离株的VP1基因,插入原核表达载体,构建了带有His标签的重组质粒PET-32a-3-VP1,并将其转化至大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）中,经IPTG诱导表达,经SDS-PAGE电泳鉴定,出现了 40.8kDa大小的表达产物条带,与预期相符。结果表明:重组质粒PET-32a-3-VP1构建成功,能在大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）中表达。随后利用His-标签蛋白纯化柱对原核表达的VP1重组蛋白进行纯化,将其作为检测抗原,建立ELISA方法,优化了反应条件:最佳抗原包被浓度为4.28μg/mL,最佳血清浓度为1:20,最佳酶标二抗浓度为1:400,最佳包被条件为4℃过夜,最佳封闭时间为90min,最佳酶标二抗时间为90min,最佳显色时间为15min,该方法具有较高的重复性和特异性,这些结果为和DHAV-3抗体的检测奠定了基础。
李静[10]（2020）在《新型鸭呼肠孤病毒的分离鉴定及油乳剂灭活疫苗的制备》文中提出新型鸭呼肠孤病毒（Novel duck reovirus,NDRV）病是一种以脾脏肿大、出血、坏死为主要特征的疾病,自2017年以来,发病率和死亡率相对较高,给我国养鸭业造成了严重的经济损失。本研究从临床疑似样品中分离到NDRV,对分离株进行分离鉴定,构建病毒感染模型,制备油乳剂灭活疫苗,为NDRV的防控提供技术支持。本实验室在2017年2019年对来自山东、安徽等地送检的30份疑似患病样品进行RT-PCR检测,结果显示10份样品为阳性。对这10份阳性样品进行病毒分离,接种SPF鸡胚胚体明显出血,接种鸡胚肝细胞产生合胞体病变。分离株测序后对其进行同源性比对分析并绘制遗传进化树,同源性比对结果显示:10株分离株的同源性在97.4%99.4%之间,分离株与DRV经典毒株的同源性在94.6%96.5%之间,说明NDRV较DRV发生明显的变异。遗传进化树结果显示:分离株与水禽源呼肠孤病毒位于同一分支,说明NDRV与水禽源呼肠孤病毒的遗传关系相对较近。通过对分离株进行同源性比对及遗传进化树分析,SDYC株与DRV的同源性差异最大,并根据其致病性及免疫原性的分析,筛选出SDYC株作为疫苗株,对筛选株进行动物回归试验,通过腿部肌肉接种1日龄雏鸭,结果表明,接种0.2mL(TCD50为10-7.2)病毒液后雏鸭出现精神沉郁,食欲减退等临床症状,剖检可见脾脏出血、坏死,肝脏有坏死点等特征性病理变化。将SDYC株病毒液接种鸡胚肝细胞,病毒感染后48h72h收取细胞病毒液。本研究选用转瓶培养方式进行细胞培养和病毒增殖,该方法可快速扩增出大量的抗原液。选用甲醛将抗原液灭活后与吐温-80以94:6的比例混合制备疫苗水相。按照3:2的油水相比进行乳化,制备NDRV油乳剂灭活疫苗。对该疫苗的理化性状,最佳免疫剂量,免疫保护效果及免疫后雏鸭血清中抗体水平变化进行检测。结果表明,最佳灭活条件为0.2%的甲醛溶液37°C灭活24h。疫苗的理化性状及安全性检测结果显示,疫苗剂型为油包水型,物理性状稳定,未检测到细菌以及支原体等微生物,可在4°C保存12个月。对5日龄雏鸭颈部皮下注射1.0mL该灭活疫苗,未出现局部炎性反应及全身性不良反应,表明该疫苗安全性良好。免疫保护试验的结果显示该疫苗的最佳剂量为0.3mL/羽。ELISA OD450值达到0.508时,中和抗体水平达到24时,即可有效抵御NDRV的感染。攻毒保护试验中,非免疫组大部分样品检测结果为阳性,21d以内均检测到样品阳性,说明非免疫组雏鸭长期带毒且排毒。0.1mL免疫组也检测出部分阳性样品。0.3mL1.0mL免疫组仅检测出一个阳性样品,保护率在96%以上。综上所述,本研究制备的NDRV油乳剂灭活苗具有良好的免疫保护效果,能够有效抵抗NDRV的感染。
二、间接ELISA检测鸭病毒性肝炎抗体的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、间接ELISA检测鸭病毒性肝炎抗体的研究（论文提纲范文）
（1）鸭甲型肝炎病毒1型的鉴定及防治研究进展（论文提纲范文）
| 1 临床症状 |
| 2 诊断方法 |
| 3 鸭病毒性肝炎的防治 |
| 4 结论 |
（2）基层实验室HCV抗体检测能力验证评估（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 能力验证质控品的制备 |
| 1.2 实验室检测能力验证方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 能力验证质控品评价 |
| 2.2 实验室检测能力验证结果 |
| 2.3 实验室ELISA检测能力评价 |
| 3 讨论 |
（3）交叉中和血清1型和血清3型鸭甲肝病毒单克隆抗体的制备与鉴定（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 病毒株及血清 |
| 1.1.2 实验动物与细胞株 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 抗原表位肽的设计合成和偶联 |
| 1.2.2 动物免疫 |
| 1.2.3 阳性杂交瘤细胞的筛选与克隆 |
| 1.2.4 小鼠腹水的制备及效价测定 |
| 1.2.5 腹水中单抗交叉反应活性的鉴定 |
| 1.2.6 McAb特异性鉴定 |
| 1.2.7 McAb体亚型鉴定 |
| 1.2.8 McAb对DHAV-1和DHAV-3抑制率的测定 |
| 1.2.9 McAb中和效价的测定 |
| 1.2.10 McAb对DHAV-1和DHAV-3的攻毒保护率测定 |
| 2 结 果 |
| 2.1 设计合成的抗原肽 |
| 2.2 杂交瘤细胞株的筛选 |
| 2.3 小鼠腹水效价 |
| 2.4 McAb交叉反应性鉴定以及亚型鉴定 |
| 2.5 McAb的特异性 |
| 2.6 McAb对DHAV在鸭胚中增殖的影响 |
| 2.6.1 McAb对DHAV-1增殖的影响 |
| 2.6.2 McAb对DHAV-3增殖的影响 |
| 2.6.3 McAb对DHAV-1和DHAV-3的交叉中和活性 |
| 2.7 McAb的中和效价 |
| 2.8 McAb攻毒保护率 |
| 3 讨 论 |
| 4 结 论 |
（4）我国部分地区禽星状病毒分子流行病学调查及其基因组特性研究（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 病原学 |
| 1.1.1 病毒分类 |
| 1.1.2 病毒基因组结构 |
| 1.1.3 病毒结构蛋白 |
| 1.2 流行病学 |
| 1.3 临床症状及致病机理 |
| 1.4 检测方法 |
| 1.4.1 电镜检测 |
| 1.4.2 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 1.4.3 病毒分离和细胞培养 |
| 1.4.4 分子学检测方法 |
| 1.4.5 高通量测序 |
| 1.5 预防和控制 |
| 1.6 本研究的目的与意义 |
| 2 材料方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 样品来源 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 引物设计与合成 |
| 2.1.4 主要试剂及配制 |
| 2.1.5 主要仪器及设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 禽星状病毒的分子流行病学调查 |
| 2.2.2 病毒的分离鉴定 |
| 2.2.3 禽星状病毒的基因组特性 |
| 3 结果 |
| 3.1 禽星状病毒的分子流行病学调查 |
| 3.1.1 禽星状病毒流行病学调查结果 |
| 3.1.2 基于RdRp序列的遗传进化分析 |
| 3.1.3 禽星状病毒的分布情况 |
| 3.2 病毒的分离鉴定 |
| 3.2.1 病毒的分离 |
| 3.2.2 外源病毒检测结果 |
| 3.2.3 半数感染量(EID_(50))测定结果 |
| 3.2.4 致病性试验 |
| 3.3 禽星状病毒的基因组特性 |
| 3.3.1 核苷酸同源性分析 |
| 3.3.2 氨基酸同源性分析 |
| 3.3.3 禽星状病毒基因组的遗传进化分析 |
| 3.3.4 蛋白的抗原表位预测分析 |
| 3.3.5 蛋白的跨膜区结构预测分析 |
| 3.3.6 蛋白疏水性预测分析 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间论文及研究成果 |
（5）抗鹅星状病毒和鹅细小病毒精制卵黄抗体的制备及应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 禽星状病毒概述 |
| 1.2 禽星状病毒的分子生物学特征 |
| 1.3 鹅星状病毒病的防治措施 |
| 1.4 鹅细小病毒概述 |
| 1.5 鹅细小病毒病防治措施 |
| 1.6 常用的病毒样颗粒(Virus Like Particles,VLPs)表达系统 |
| 1.6.1 细菌表达系统 |
| 1.6.2 酵母表达系统 |
| 1.6.3 杆状病毒载体表达系统 |
| 1.6.4 杆状病毒载体表达系统在禽病毒病中的应用 |
| 第二章 GoAstV Cap和 GPV VP2 重组杆状病毒的表达 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞和毒株 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 重组质粒构建 |
| 2.2.2 重组穿梭质粒的制备 |
| 2.2.3 拯救重组杆状病毒 |
| 2.2.4 Western blot检测GoAstV Cap和 GPV VP2 的表达 |
| 2.2.5 间接免疫荧光(IFA)检测GoAstV Cap和 GPV VP2 表达 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 重组穿梭质粒鉴定结果 |
| 2.3.2 Western blot检测GoAstV Cap和 GPV VP2 的表达 |
| 2.3.3 IFA检测GoAstV Cap和 GPV VP2 的表达 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 抗鹅星状病毒和细小病毒卵黄抗体的制备与纯化 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 GPV胚毒免疫原的制备 |
| 3.2.2 LMH细胞的培养 |
| 3.2.3 GoAstV免疫原的制备及增殖特性研究 |
| 3.2.4 RT-PCR检测GoAstV CH16 株在LMH细胞上的增殖 |
| 3.2.5 间接免疫荧光检测(IFA)检测GoAstV Cap蛋白的表达 |
| 3.2.6 Western-blot检测GoAstV Cap蛋白在LMH细胞上的表达 |
| 3.2.7 Taq Man Real-time PCR绝对定量检测GoAstV在 LMH细胞上的增殖 |
| 3.2.8 蛋鸡的饲养与免疫 |
| 3.2.9 卵黄抗体的提取与纯化 |
| 3.2.10 BCA法测定卵黄抗体浓度 |
| 3.2.11 卵黄抗体的纯度分析 |
| 3.2.12 Western blot检测卵黄抗体的特异性 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 GoAstV CH16 株在LMH细胞上的适应过程 |
| 3.3.2 绝对定量检测GoAstV株在LMH细胞上适应拷贝数情况 |
| 3.3.3 Western blot检测GoAstV Cap蛋白的表达 |
| 3.3.4 IFA检测GoAstV CH16 株在LMH细胞上的增殖 |
| 3.3.5 通过BCA法测定抗鹅星状病毒-鹅细小病毒卵黄抗体浓度 |
| 3.3.6 SDS-PAGE检测纯化的卵黄抗体 |
| 3.3.7 Western blot检测卵黄抗体的特异性 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 GoAstV和 GPV双重荧光定量PCR及间接ELISA检测方法的建立 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 主要试剂 |
| 4.1.2 主要仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 引物、探针的设计与合成 |
| 4.2.2 阳性标准品制备及标准曲线的绘制 |
| 4.2.3 敏感性实验 |
| 4.2.4 特异性实验 |
| 4.2.5 间接ELISA方法的建立 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 阳性标准品制备 |
| 4.3.2 双重荧光定量PCR标准曲线的绘制 |
| 4.3.3 双重荧光定量PCR方法的敏感性试验 |
| 4.3.4 双重荧光定量PCR方法的特异性试验 |
| 4.3.5 双重荧光定量PCR方法的重复性试验 |
| 4.3.6 ELISA检测方法的建立 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 抗鹅星状病毒和细小病毒卵黄抗体效果评价 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 生物试剂 |
| 5.1.2 主要仪器 |
| 5.1.3 实验动物 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 卵黄抗体的效价检测 |
| 5.2.3 病理组织学检测 |
| 5.2.4 免疫组化检测 |
| 5.2.5 双重荧光定量PCR检测攻毒保护试验组织病毒载量 |
| 5.2.6 GEF细胞的制备 |
| 5.2.7 双重荧光定量PCR检测卵黄抗体细胞中和试验病毒载量 |
| 5.2.8 Western blot检测卵黄抗体细胞中和效果 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.2 ELISA评价特异性卵黄抗体效价 |
| 5.3.3 病理切片和免疫组化评价卵黄抗体的体内中和效果 |
| 5.3.4 双重荧光定量PCR评价卵黄抗体体内中和效果 |
| 5.3.5 Western Blot评价卵黄抗体体外中和效果 |
| 5.3.6 双重荧光定量PCR评价卵黄抗体体外中和效果 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（6）新型鸭呼肠孤病毒卵黄抗体的制备及应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 病原学 |
| 1.1.1 呼肠孤病毒历史及分类 |
| 1.1.2 病毒形态学和理化特性 |
| 1.1.3 病毒培养特性 |
| 1.2 鸭呼肠孤病毒的基因组及主要蛋白 |
| 1.3 流行病学及病理变化 |
| 1.3.1 流行病学 |
| 1.3.2 临床特征 |
| 1.3.3 病理学变化 |
| 1.4 诊断方法 |
| 1.4.1 血清学诊断 |
| 1.4.2 分子生物学诊断 |
| 1.5 鸭呼肠孤病毒灭活疫苗 |
| 1.6 禽蛋的一般特性 |
| 1.6.1 卵黄的结构和组成 |
| 1.6.2 卵黄的乳化性 |
| 1.7 卵黄抗体 |
| 1.7.1 卵黄抗体技术发展简史 |
| 1.7.2 新型鸭呼肠孤病毒卵黄抗体的优势 |
| 1.8 研究目的及意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验用毒株 |
| 2.1.2 细胞及雏鸭 |
| 2.1.3 种毒 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.1.5 主要试剂 |
| 2.1.6 溶液的配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 新型鸭呼肠孤病毒的扩增与检测 |
| 2.2.2 油乳剂灭活苗的研制 |
| 2.2.2.1 新型鸭呼肠孤病毒灭活条件研究 |
| 2.2.2.2 油相的制备 |
| 2.2.2.3 水相的制备 |
| 2.2.2.4 乳化 |
| 2.2.3 灭活疫苗的质量检验 |
| 2.2.3.1 剂型检验 |
| 2.2.3.2 离心稳定性检验 |
| 2.2.3.3 无菌检验 |
| 2.2.3.4 粘度检验 |
| 2.2.3.5 保存期检验 |
| 2.2.3.6 疫苗安全性检验 |
| 2.2.3.7 灭活疫苗对蛋鸡的免疫程序 |
| 2.2.3.8 ELISA抗体测定 |
| 2.3 新型鸭呼肠孤病毒卵黄抗体的制备 |
| 2.3.1 卵黄抗体制造 |
| 2.3.2 卵黄抗体效价测定 |
| 2.3.3 卵黄抗体性状检验 |
| 2.3.4 卵黄抗体pH值检测 |
| 2.3.5 无菌检验和安全实验 |
| 2.3.5.1 无菌检验 |
| 2.3.5.2 安全检验 |
| 2.4 雏鸭免疫保护试验 |
| 2.4.1 雏鸭卵黄抗体保护试验 |
| 2.4.2 雏鸭卵黄抗体治疗试验 |
| 2.4.3 卵黄抗体消长规律试验 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 新型鸭呼肠孤病毒扩增与检测结果 |
| 3.1.1 病毒扩增结果 |
| 3.1.2 扩增病毒纯净度检测结果 |
| 3.1.3 病毒细胞半数感染量(TCID_(50))测定结果 |
| 3.1.4 新型鸭呼肠孤病毒动物回归试验 |
| 3.2 油乳剂灭活疫苗的研制结果 |
| 3.2.1 确定抗原液最佳灭活条件 |
| 3.2.2 灭活疫苗的理化性状检验结果 |
| 3.2.2.1 灭活疫苗的剂型 |
| 3.2.2.2 灭活疫苗的稳定性 |
| 3.2.2.3 灭活疫苗的粘度 |
| 3.2.2.4 灭活疫苗无菌检验 |
| 3.2.2.5 保存期检验 |
| 3.2.2.6 灭活疫苗安全性检验 |
| 3.2.2.7 免疫蛋卵黄抗体效价测定 |
| 3.2.2.8 卵黄抗体效价测定 |
| 3.2.2.9 卵黄抗体物理性状检验结果 |
| 3.2.2.10 卵黄抗体p H值检测结果 |
| 3.2.2.11 卵黄抗体无菌检验结果 |
| 3.2.2.12 卵黄抗体安全性检验结果 |
| 3.2.2.13 雏鸭卵黄抗体保护效果 |
| 3.2.2.14 雏鸭卵黄抗体治疗试验结果 |
| 3.2.2.15 抗体消长规律结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 新型鸭呼肠孤病毒 |
| 4.2 灭活疫苗的制备 |
| 4.3 卵黄抗体的制备 |
| 4.4 新型鸭呼肠孤卵黄抗体的保护效力检验 |
| 4.5 新型鸭呼肠孤病毒卵黄抗体应用前景 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（7）戊型肝炎病毒ORF3蛋白单克隆抗体的制备及其应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 戊型肝炎研究进展 |
| 1.1.1 戊型肝炎的分类 |
| 1.1.2 戊型肝炎的危害 |
| 1.1.3 病毒形态及理化特性 |
| 1.1.4 病毒的基因组结构 |
| 1.1.5 戊型肝炎病毒的检测方法 |
| 1.2 单克隆抗体技术 |
| 1.3 目的和意义 |
| 第二章 HEV-1 ORF3 蛋白的表达与纯化 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 质粒和菌株 |
| 2.1.2 主要试剂耗材 |
| 2.1.3 主要仪器和设备 |
| 2.1.4 基础试剂配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 重组表达载体的构建 |
| 2.2.2 ORF3~(SAR55)重组蛋白在大肠杆菌中的表达 |
| 2.2.3 ORF3~(SAR55)重组蛋白的纯化 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 ORF3~(SAR55)重组表达载体的构建 |
| 2.3.2 SDS-PAGE分析HEV-ORF3~(SAR55)重组蛋白在大肠杆菌中的表达 |
| 2.3.3 SDS-PAGE分析ORF3~(SAR55)重组蛋白的纯化情况 |
| 2.3.4 BCA蛋白浓度测定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 抗HEV-1 ORF3 蛋白单克隆抗体的筛选与鉴定 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 试验相关蛋白和细胞 |
| 3.1.2 试验相关试剂耗材 |
| 3.1.3 试验相关仪器设备 |
| 3.1.4 主要试剂配制 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 Balb/c小鼠的免疫与血清抗体效价检测 |
| 3.2.2 细胞融合 |
| 3.2.3 间接ELISA法筛选阳性克隆 |
| 3.2.4 细胞亚克隆 |
| 3.2.5 腹水的制备与纯化 |
| 3.2.6 单克隆抗体的亚型鉴定 |
| 3.2.7 间接ELISA检测单抗与免疫原的反应性 |
| 3.2.8 Western Blot检测单抗与免疫原的反应性 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 免疫后小鼠血清效价 |
| 3.3.2 腹水纯化单克隆抗体 |
| 3.3.3 单克隆抗体的亚型鉴定 |
| 3.3.4 间接ELISA检测单抗与抗原反应性 |
| 3.3.5 单克隆抗体的免疫印迹分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 抗HEV-1 ORF3 单克隆抗体竞争ELISA方法的建立与评价 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 相关血清 |
| 4.1.2 试验相关试剂耗材 |
| 4.1.3 试验相关仪器设备 |
| 4.1.4 主要试剂配置 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 人HEV阳性血清筛选 |
| 4.2.2 单克隆抗体的HRP标记 |
| 4.2.3 HRP标记的单克隆抗体与抗原的反应性 |
| 4.2.4 HRP标记的单克隆抗体与其他基因型HEV ORF3 蛋白的交叉反应性 |
| 4.2.5 基于HRP-IgG抗体的竞争ELISA方法的建立 |
| 4.2.6 竞争ELISA方法评价 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 人HEV阳性血清筛选 |
| 4.3.2 HRP标记的单克隆抗体效果检测 |
| 4.3.3 HRP标记的单克隆抗体与ORF3 抗原的反应性 |
| 4.3.4 基于ORF3~(SAR55)单克隆抗体的竞争ELISA方法的建立 |
| 4.3.5 竞争ELISA方法评价 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）抗鹅星状病毒Cap蛋白单克隆抗体的制备及鉴定（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细胞、病毒和载体 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 质粒的构建 |
| 1.4 重组Cap蛋白(rCap)的表达、纯化及鉴定 |
| 1.5 小鼠免疫实验 |
| 1.6 mAbs的制备及分析 |
| 1.7 单克隆抗体的鉴定 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组表达质粒构建 |
| 2.2 重组蛋白rCap的表达及鉴定 |
| 2.3 间接ELISA检测免疫小鼠的效价 |
| 2.4 单克隆抗体分析及鉴定 |
| 3 讨论 |
（9）2017～2019年山东省部分地区鸭甲肝病毒的分子特征分析和VP1基因的表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第1章 综述 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 鸭病毒性肝炎的流行情况 |
| 1.3 鸭甲肝病毒的病原学 |
| 1.3.1 分类 |
| 1.3.2 理化特性 |
| 1.3.3 培养特性 |
| 1.3.4 纯化 |
| 1.3.5 分子生物学特性 |
| 1.3.6 VP1蛋白 |
| 1.4 鸭甲型病毒性肝炎的临床症状和病理变化 |
| 1.5 鸭甲型病毒性肝炎的诊断 |
| 1.5.1 电镜检测 |
| 1.5.2 血清学检测 |
| 1.5.3 分子生物学诊断 |
| 1.6 鸭甲型病毒性肝炎的防治 |
| 1.6.1 灭活疫苗 |
| 1.6.2 弱毒疫苗 |
| 1.6.3 基因工程疫苗 |
| 1.6.4 中药治疗 |
| 1.7 本研究的目的和意义 |
| 第2章 22株鸭甲肝病毒的分离鉴定及VP1基因的分子特征分析 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 病料来源 |
| 1.1.2 试剂与仪器 |
| 1.1.3 引物设计 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 病料处理 |
| 1.2.2 病毒分离 |
| 1.2.3 病毒的RNA提取 |
| 1.2.4 RT-PCR鉴定 |
| 1.2.5 病原的电镜检测 |
| 1.2.6 雏鸭的致病性实验 |
| 1.2.7 VP1扩增 |
| 1.2.8 VP1序列分析 |
| 1.3 结果与分析 |
| 1.3.1 病毒分离结果 |
| 1.3.2 RT-PCR鉴定结果 |
| 1.3.3 电镜结果 |
| 1.3.4 雏鸭的致病性结果 |
| 1.3.5 VP1序列分析 |
| 1.4 讨论 |
| 第3章 鸭甲肝病毒3型VP1基因的真核表达 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 质粒与毒株 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要试剂配制 |
| 1.1.4 主要仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 引物设计 |
| 1.2.2 目的基因的获取 |
| 1.2.3 目的基因的克隆 |
| 1.2.4 重组质粒的构建和鉴定 |
| 1.2.5 重组质粒的表达 |
| 1.2.6 小鼠免疫实验 |
| 1.3 结果与分析 |
| 1.3.1 目的基因的克隆 |
| 1.3.2 重组质粒的酶切鉴定 |
| 1.3.3 IFA分析VP1蛋白在Vero细胞中的表达 |
| 1.3.4 WB分析VP1蛋白在Vero细胞中的表达 |
| 1.3.5 小鼠体内抗体检测结果 |
| 1.4 讨论 |
| 第4章 鸭甲肝病毒3型VP1基因的原核表达以及抗体检测ELISA方法的初步建立 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 质粒与毒株 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要试剂配制 |
| 1.1.4 主要仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 引物设计 |
| 1.2.2 目的基因的获取 |
| 1.2.3 目的基因的亚克隆 |
| 1.2.4 重组质粒的构建和鉴定 |
| 1.2.5 重组质粒的表达 |
| 1.2.6 基于重组VP1蛋白的间接ELISA方法的初步建立 |
| 1.3 结果与分析 |
| 1.3.1 目的基因的扩增 |
| 1.3.2 重组质粒的酶切鉴定 |
| 1.3.3 重组蛋白的诱导表达及纯化 |
| 1.3.4 VP1-ELISA方法的初步建立 |
| 1.4 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文 |
| 致谢 |
（10）新型鸭呼肠孤病毒的分离鉴定及油乳剂灭活疫苗的制备（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 病原学 |
| 1.1.1 鸭呼肠孤病毒历史及分类 |
| 1.1.2 病毒形态学和理化特性 |
| 1.1.3 病毒培养特性 |
| 1.2 鸭呼肠孤病毒的基因组及主要蛋白 |
| 1.3 流行病学及病理变化 |
| 1.3.1 流行病学 |
| 1.3.2 临床特征 |
| 1.3.3 病理学变化 |
| 1.4 诊断方法 |
| 1.4.1 血清学诊断 |
| 1.4.1.1 琼脂扩散试验 |
| 1.4.1.2 中和试验 |
| 1.4.1.3 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 1.4.2 分子生物学诊断 |
| 1.4.2.1 核酸探针技术 |
| 1.4.2.2 PCR技术 |
| 1.4.2.3 荧光定量RT-PCR技术 |
| 1.4.2.4 环介导等温扩增技术(LAMP) |
| 1.5 鸭呼肠孤病毒疫苗的研究进展 |
| 1.5.1 弱毒疫苗的研究 |
| 1.5.2 灭活疫苗的研究 |
| 1.5.3 基因工程疫苗的研究 |
| 1.6 预防与治疗 |
| 1.7 研究目的及意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病料 |
| 2.1.2 用胚及动物 |
| 2.1.3 种毒 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.1.5 主要试剂 |
| 2.1.6 溶液的配制 |
| 2.1.6.1 电泳试剂 |
| 2.1.6.2 ELISA试剂 |
| 2.1.6.3 其他试剂 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 鸭新型呼肠孤病毒的分离鉴定 |
| 2.2.1.1 引物的设计合成 |
| 2.2.1.2 病毒的分离与传代 |
| 2.2.1.3 血凝试验 |
| 2.2.1.4 病毒RNA的提取 |
| 2.2.1.5 RT-PCR反应 |
| 2.2.1.6 目的片段的琼脂糖凝胶回收与纯化 |
| 2.2.1.7 连接与转化 |
| 2.2.1.8 阳性克隆鉴定与测序 |
| 2.2.1.9 病毒纯净度检测 |
| 2.2.1.10 病毒细胞半数感染量(TCID50)测定 |
| 2.2.1.11 动物回归试验 |
| 2.3 油乳剂灭活苗的研制 |
| 2.3.1 细胞在转瓶中的培养 |
| 2.3.2 转瓶的清洗及消毒 |
| 2.3.3 种毒增殖 |
| 2.3.4 鸭呼肠孤病毒灭活工艺的研究 |
| 2.3.4.1 抗原液最佳灭活条件的筛选 |
| 2.3.5 疫苗制备 |
| 2.3.5.1 油相的制备 |
| 2.3.5.2 水相的制备 |
| 2.3.5.3 乳化 |
| 2.3.6 灭活疫苗的质量检验 |
| 2.3.6.1 剂型检验 |
| 2.3.6.2 离心稳定性检验 |
| 2.3.6.3 粘度检验 |
| 2.3.6.4 无菌检验 |
| 2.3.6.5 保存期检验 |
| 2.3.6.6 疫苗安全性检验 |
| 2.3.7 最佳免疫剂量研究 |
| 2.3.8 免疫后抗体水平的监测 |
| 2.3.8.1 ELISA抗体测定 |
| 2.3.8.2 中和抗体测定 |
| 2.3.9 攻毒保护试验 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 病毒的分离鉴定结果 |
| 3.1.1 病毒的分离与传代 |
| 3.1.2 血凝性结果 |
| 3.1.3 RT-PCR的检测结果 |
| 3.1.4 测序结果与分析 |
| 3.1.5 病毒的纯净性检测 |
| 3.1.6 病毒细胞半数感染量(TCID50)测定 |
| 3.1.7 动物回归试验 |
| 3.2 油乳剂灭活疫苗的研制 |
| 3.2.1 抗原液最佳灭活条件筛选 |
| 3.2.2 疫苗的理化性状检验结果 |
| 3.2.2.1 疫苗的剂型 |
| 3.2.2.2 疫苗的稳定性 |
| 3.2.2.3 疫苗的粘度 |
| 3.2.2.4 无菌检验 |
| 3.2.2.5 保存期检验 |
| 3.2.2.6 安全性检验 |
| 3.2.3 最佳免疫剂量的确定 |
| 3.2.3.1 间接ELISA抗体检测结果 |
| 3.2.3.2 中和抗体的检测结果 |
| 3.2.4 攻毒保护试验 |
| 3.2.4.1 免疫保护性试验结果 |
| 3.2.4.2 攻毒后排毒检测结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 鸭呼肠孤病毒的分离与鉴定 |
| 4.2 灭活疫苗的制备 |
| 4.3 疫苗的保护效力检验 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
四、间接ELISA检测鸭病毒性肝炎抗体的研究（论文参考文献）
- [1]鸭甲型肝炎病毒1型的鉴定及防治研究进展[J]. 宁扬,陈晓雯,侯玉凤,宋翔,陈甜甜,谢全喜. 现代畜牧兽医, 2021(11)
- [2]基层实验室HCV抗体检测能力验证评估[J]. 赫晓霞,马洁琼,任雅楠,王俊,邢文革. 中国艾滋病性病, 2021(09)
- [3]交叉中和血清1型和血清3型鸭甲肝病毒单克隆抗体的制备与鉴定[J]. 刘燕,汤承,岳华,王远微. 畜牧兽医学报, 2021(07)
- [4]我国部分地区禽星状病毒分子流行病学调查及其基因组特性研究[D]. 张富友. 山东农业大学, 2021(01)
- [5]抗鹅星状病毒和鹅细小病毒精制卵黄抗体的制备及应用[D]. 刘志艺. 中国农业科学院, 2021(09)
- [6]新型鸭呼肠孤病毒卵黄抗体的制备及应用[D]. 张旭杰. 山东农业大学, 2021(01)
- [7]戊型肝炎病毒ORF3蛋白单克隆抗体的制备及其应用[D]. 罗煜杭. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [8]抗鹅星状病毒Cap蛋白单克隆抗体的制备及鉴定[J]. 孙佳卉,刘志艺,黄聪,李传峰,刘光清,陈宗艳. 中国动物传染病学报, 2021(01)
- [9]2017～2019年山东省部分地区鸭甲肝病毒的分子特征分析和VP1基因的表达[D]. 管飘萍. 扬州大学, 2020(01)
- [10]新型鸭呼肠孤病毒的分离鉴定及油乳剂灭活疫苗的制备[D]. 李静. 山东农业大学, 2020(12)