一、环—磷酸腺苷在心血管活动调节和一些心血管疾病过程中的作用（论文文献综述）
国家卫生计生委合理用药专家委员会,中国药师协会[1]（2018）在《冠心病合理用药指南（第2版）》文中认为循证医学相关方法说明2018年3月1日,由国家卫生计生委合理用药专家委员会和中国药师协会组成指南修订联合委员会,经3次联合会议讨论后最终确定了指南修订的总体原则及新指南拟回答的核心问题。指南工作组针对这些核心问题制定了具体的文献检索和评价策略,综合评价、筛选出相关文献。修订过程主要
国家卫生计生委合理用药专家委员会,中国药师协会[2]（2016）在《冠心病合理用药指南》文中进行了进一步梳理1冠心病概述1.1定义冠状动脉粥样硬化性心脏病是指由于冠状动脉粥样硬化使管腔狭窄、痉挛或阻塞导致心肌缺血、缺氧或坏死而引发的心脏病,统称为冠状动脉性心脏病或冠状动脉疾病,简称冠心病,归属为缺血性心脏病,是动脉粥样硬化导致器官病变的最常见类型。1.2解剖及病理生理机制冠状动脉分为左、右两支,分别位于主动脉窦的左、右开口。左冠状动
孙欢,于明,赵绮旎,杨萍[3]（2020）在《磷酸二酯酶在心力衰竭治疗中的研究进展》文中研究指明心力衰竭是心血管疾病发展的最终阶段,因而针对心力衰竭的精准治疗策略意义重大。环磷酸腺苷（cAMP）和环磷酸鸟苷（cGMP）是调节信号转导的第二信使,它们在心脏和心肌细胞活动中有着重要意义。磷酸二酯酶（PDEs）是一组分布和功能各具特点的水解酶,它们能够有效调节cAMP和cGMP的浓度进而干预细胞活动。PDE3和PDE5的抑制剂是现在临床常用的针对心血管疾病治疗用药,对于它们的临床和基础研究不断更新。随着人们对这些PDEs功能和药理价值不断深入的探索,我们会对相应的心衰治疗策略有更加深入的认识,与此同时,了解这些研究的进展能够帮助我们洞悉心衰治疗的策略以及正性肌力药的发展方向。
沈智达[4]（2019）在《茶黄素-3,3’-双没食子酸酯（TF3）通过激活AMPK逆转高糖导致的缝隙连接蛋白以及自噬功能的抑制》文中进行了进一步梳理糖尿病目前是导致人类致残的第七大原因,在过去30年糖尿病病人数增长了一倍。跟正常人相比,糖尿病病人有着更高的心律失常发生率。其较高的心律失常发生率同心脏中异常缝隙连接蛋白及自噬有着较强的关系。心脏正常的生理活动需要心肌细胞之间正常的电偶联以及电传导,这与正常分布以及数量的缝隙连接蛋白相关。在心室肌细胞中,缝隙连接蛋白43（Cx43）是心室中的主要缝隙连接蛋白,而Cx40以及Cx37也少量存在于心室肌中。目前认为Cx43是维系心室正常电生理活动最重要的缝隙连接蛋白。既往研究发现高糖环境下,新生乳鼠心肌细胞Cx43表达明显下调,而在Ⅰ型糖尿病模型中,Cx43的表达量随着造模时程而发生变动。在STZ诱导的Ⅰ型糖尿病大鼠模型中,造模成功3周后大鼠Cx43表达量明显降低,然而,造模成功3个月的SD大鼠,其Cx43却因长期高糖导致的代谢产物的影响而明显上调。Cx43的表达量以及分布的变化,在糖尿病的病程发展中受很多因素影响,目前机制尚未完全明了。因此,为避免混杂因素干扰,本实验主要探讨高糖刺激对心肌细胞的影响,并在3周左右的大鼠体内予以证实。而同时,在糖尿病病人中,自噬的异常也是导致糖尿病病人发生心律失常的重要原因之一,诱导造模的2型糖尿病小鼠中,3个月左右可以发现小鼠心脏自噬明显增强,而对其自噬活动调节,可以一定程度上改善小鼠异常的心脏活动。茶黄素（TF）是茶叶在初步发酵产生儿茶素后被多酚氧化酶进一步高度催化的产物,主要包括茶黄素（TF1）,茶黄素3-单没食子酸酯（TF2a）,茶黄素3’-单没食子酸脂（TF2b）,茶黄素-3,3-双没食子酸酯（TF3）,其中,TF3是茶黄素的主要成分。相较于儿茶素,茶黄素有更高的抗氧化活性,其中,TF3有着最强的抗氧化能力。既往研究发现茶黄素有一定的治疗生物体脂毒性以及缺血-再灌注损伤的作用。此外,茶黄素能够减轻血管紧张素Ⅱ,内皮素等对心血管疾病造成的毒副作用。然而,对于茶黄素对糖尿病的作用报道,目前尚不十分充裕。在本研究中,我们首先观察高糖对新生乳鼠心肌细胞自噬和缝隙连接蛋白的影响,然后观察TF3能否逆转高糖对心肌细胞自噬以及缝隙连接蛋白的影响。此外,TF3在心肌细胞中的调控机制也进行了探讨。最后,在STZ诱导的Ⅰ型糖尿病大鼠中,验证TF3在体内的作用。第一部分 茶黄素-3,3’-双没食子酸酯（TF3）对高糖环境下新生乳鼠心肌细胞自噬及缝隙连接功能的影响及机制探讨目的研究高糖环境对乳鼠心肌细胞缝隙连接蛋白（Cx）及自噬的影响,并观察TF3对高糖环境下心肌细胞的保护作用及机制探讨。方法提取出生1-2天新生SD大鼠心肌细胞（NRCM）,将其用高糖（33mM葡萄糖）培养72h,同时,加入TF3共培养,使用Westem blot观察心室相关缝隙连接蛋白（Cx43,Cx37,Cx40）及自噬相关蛋白（LC3-II,Beclin1）表达量的改变。同时,通过荧光素黄/罗丹明红（LY/Rhd）传输实验评估缝隙连接功能。同时,使用mCherry-GFP-LC3腺病毒转染心肌细胞,共聚焦显微镜下进行自噬点计数。此外,通过检测磷酸化一磷酸腺苷活化蛋白激酶（磷酸化AMPK）,AMPK蛋白表达量,观察AMPK活性的变化。为了验证AMPK在TF3对心肌细胞保护中的作用,通过5-氨基咪唑4-氨甲酰核糖核苷（AICAR）激活AMPK,AMPK小千扰RNA（siAMPK）下调AMPK的表达,观察缝隙连接蛋白及自噬相关蛋白的表达。最后,通过3-甲基腺嘌呤（3-MA）,巴佛洛霉素A1（bafA1）抑制自噬,雷帕霉素上调自噬,观察自噬对缝隙连接蛋白的影响;另一方面,通过Cx43小干扰RNA（siCx43）下调缝隙连接蛋白的表达,观察缝隙连接蛋白对自噬的影响。结果高糖环境下NRCM缝隙连接蛋白43以及自噬相关蛋白明显下调,TF3能呈剂量依赖性及时间依赖性的上调Cx43及自噬相关蛋白的表达,而Cx37及Cx40的表达不受明显影响。同时,TF3能够逆转高糖环境对缝隙连接功能的抑制及增加自噬点计数。高糖能够抑制AMPK活性,TF3可以显着逆转心肌细胞内被抑制的AMPK的活性。用AICAR激活AMPK可以取得与TF3治疗类似的效果,而将TF3上调AMPK活性的作用通过siAMPK敲除后,TF3对高糖环境下心肌细胞的保护作用明显减弱。另一方面,自噬激活增加了 Cx43的降解,而在心肌细胞内加入baf A1可以明显增加Cx43的表达。而通过siCx43降低心肌细胞内Cx43的表达却对自噬相关蛋白无明显影响。结论TF3能够逆转高糖环境对乳鼠心肌细胞缝隙连接蛋白及自噬相关蛋白的抑制,这过程同上调AMPK活性部分相关。高糖环境下心肌细胞自噬的抑制可能对缝隙连接蛋白存在一定的保护作用。第二部分 茶黄素对链脲佐菌素（STZ）诱导的1型糖尿病大鼠缝隙连接蛋白功能及机制探讨目的研究茶黄素对链脲佐菌素（STZ）诱导的1型糖尿病SD大鼠缝隙连接蛋白及相关机制。方法用STZ（55mg/kg）尾静脉注射200g雄性SD大鼠构建Ⅰ型糖尿病模型,并予以茶黄素（10mg/kg）连续灌胃3周。大鼠心脏超声观察大鼠心功能变化,免疫印迹观察缝隙连接蛋白43（Cx43）及磷酸化一磷酸腺苷活化蛋白激酶（磷酸化AMPK）和AMPK蛋白表达量变化,免疫组化观察Cx43表达及分布情况。结果STZ诱导1型糖尿病大鼠3周未导致明显大鼠心功能改变。蛋白印迹提示STZ处理3周后Cx43,AMPK活性明显下调,免疫组化提示Cx43在心室中表达及存在明显异常。茶黄素处理可以上调AMPK活性及部分逆转高糖导致的Cx43表达及分布异常。结论茶黄素能够逆转STZ诱导的1型糖尿病大鼠导致的AMPK活性抑制及Cx43表达和分布异常。
周胜男[5]（2020）在《蛋白质亚硝基化修饰在硝酸酯类耐受和血管钙化中的作用及机制研究》文中研究说明论文ⅠPGIS亚硝基化修饰对体内硝酸酯类交叉耐受的影响及机制研究研究背景硝酸酯类药物作为最古老的心血管药物之一,由于其起效快,作用恒定等特点,仍被广泛应用于临床冠心病的治疗。临床上常用的硝酸酯类药物包括硝酸甘油（nitroglycerin,GTN）、硝酸异山梨酯、单硝酸异山梨酯等。硝酸酯类药物通过扩张外周血管,改善心肌血液分布,抑制血小板的聚集和黏附等作用,被应用于各种类型心绞痛的治疗。然而在频繁给药及连续应用的情况下,其抗缺血作用减弱甚至消失,即产生硝酸酯类药物耐受,从而成为其临床应用的一大阻碍。硝酸酯类耐受机制的研究主要有以下学说:血容量扩张学说,巯基耗竭学说,神经激素激活学说,线粒体功能障碍学说等。由此可见,硝酸酯类药物耐受的机制是复杂而尚不明确的,探索其中可能的机理是临床应用硝酸酯类药物中亟待解决的问题。硝酸酯类药物作为外源性一氧化氮（nitricoxide,NO）供体,在体内经过生物转换作用释放NO。NO通过经典的sGC/cGMP/PKG途径介导硝酸酯类药物的扩血管效应。作为体内重要的信号分子,NO除依赖经典的sGC/cGMP/PKG途径外,还可通过参与蛋白质的巯基亚硝基化过程调节细胞功能。蛋白质巯基亚硝基化修饰是NO与蛋白质半胱氨酸残基中的自由巯基（-SH）共价结合形成亚硝基硫醇（S-nitrosothiols,SNOs）的过程。研究表明,蛋白质亚硝基化修饰影响蛋白质的生物活性、稳定性、亚细胞定位以及蛋白质间相互作用,从而导致蛋白质结构和功能的改变,继而影响细胞的多种病理和生理过程。在花生四烯酸代谢通路中,前列腺素H2（Prostaglandin H2,PGH2）分别在前列环素合酶（Prostacyclin synthase,PGIS）和血栓素A2合酶的催化下形成前列环素（Prostacyclin,PGI2）和血栓素 A2（Thromboxane A2,TXA2）。TXA2 通过激活血栓烷素受体（TPr）引起血管收缩,而PGI2通过其特异受体诱导血管舒张,因此PGI2和TXA2共同调节血管舒张和收缩的平衡稳态。PGIS作为PGI2生物合成的限速酶,主要分布于血管内皮细胞和平滑肌细胞。PGIS活性下降或PGI2生成减少均可导致血管平滑肌细胞舒张反应减弱而收缩反应增强,使血管扩张效应降低。有研究报道,PGIS的功能缺失是导致硝酸酯类药物耐受的机制之一。研究表明,sGC亚硝基化是主动脉平滑肌细胞对NO脱敏的机制之一,证明蛋白质亚硝基化可能是硝酸酯类交叉耐受的重要原因。我们通过蛋白质氨基酸序列对比发现,不同物种PGIS蛋白在231位和441位氨基酸位点上均存在两个半胱氨酸,使得PGIS可能成为亚硝基化修饰的可能靶点。那么,PGIS是否可被NO巯基亚硝基化修饰?PGIS亚硝基化修饰对PGIS的功能产生怎样的影响?PGIS亚硝基化修饰是否为硝酸酯类药物交叉耐受的可能原因?基于以上分析,本研究拟从体外和体内水平探究各NO供体与PGIS的巯基亚硝基化反应,观察其对血管舒张功能的影响,并进一步探究PGIS发生亚硝基化修饰的半胱氨酸位点,为临床上硝酸酯类药物耐受的研究及预防提供相应实验依据。研究目的1.研究GTN是否诱导内皮细胞中PGIS亚硝基化修饰;2.研究PGIS亚硝基化修饰是否介导血管硝酸酯类耐受3.探究预防GTN耐受的方法。研究方法1.细胞刺激和转染（1）将 0.1 μM,1 μM,10 μM,50 μM,100 μM 浓度梯度的 GTN 与 HUVECs反应8小时,观察细胞中PGIS亚硝基化修饰水平和PGIS活性及PGI2、TXA2的生成;山东大学博士学位论文（2）预先用0.3 mM的NO清除剂Carboxy-PTIO或2.5 mM亚硝基化拮抗剂NAC处理细胞0.5小时,再向细胞加入10 μMGTN刺激8小时。观察各组细胞内PGIS亚硝基化水平和活性及PGI2、TXA2的生成;（3）合成野生型 PGIS（WT-PGIS）和突变型 PGIS（MT-PGIS-C231A、C441A、C231/441A）cDNA腺病毒并感染HUVECs。细胞转染腺病毒48小时后,加入10μMGTN反应8小时。观察细胞内PGIS亚硝基化水平及Cys231和Cys441突变对PGIS活性的影响。2.重组蛋白的体外实验构建及表达野生型和突变型PGIS（WT、C23IA、C441A、C231/441A）纯化蛋白。（1）将重组人PGIS蛋白与10μM的NO供体（GTN,GSNO,SNAP,SNP和SPNO）孵育两小时;（2）将野生型或突变型人PGIS蛋白与10 μM的GTN孵育两小时,检测各组PGIS蛋白亚硝基化修饰水平和PGIS蛋白活性。3.动物棋型建立（1）取40只8周龄SD雄鼠,随机分为以下4组:对照组,GTN组,NAC组,GTN+NAC组（每组10只）。预先给予NAC（50mg/kg/天）灌胃7天,7天后将含有GTN（100 mg/kg/天）的Alzet泵置入皮下间隙。3天后将大鼠处死;（2）选取60只8周龄ApoE-/-雄鼠并随机分为4组:WT-PGIS组,MT-PGIS组,WT-PGIS+GTN 组,MT-PGIS+GTN 组（每组 15 只）。尾静脉注射 WT-PGIS或MT-PGIS cDNA腺病毒,2周后,将含有GTN（100 mg/kg/天）的Alzet泵置入皮下间隙。3天后,将小鼠处死;（3）选取60只8周龄SD雄鼠并分为以下4组:空白对照组,GTN组,GTN+阿司匹林组,GTN+贝前列素组（每组15只）。阿司匹林（10mg/kg/天）或贝前列素（200μg/kg/天）灌胃两周,而后将含有GTN（100 mg/kg/天）的Alzet泵置入皮下间隙。3天后,将大鼠处死;（4）取40只8周龄SD雄鼠,取出主动脉并制备主动脉环,将主动脉环在生理盐水或1 mM的Tranylcypromine中孵育30分钟。通过离体血管环实验观察血管对GTN和SNP的张力变化。4.免疫沉淀反应（IP）提取细胞或组织蛋白,加入PGIS抗体与蛋白裂解液4℃旋转过夜。加入Protein A/G Agarose孵育4小时后离心取上清,经过Western blot检测细胞或组织中PGIS蛋白亚硝基化水平。5.蛋白免疫印迹分析（Western blot）细胞或组织蛋白经过凝胶电泳、转膜、一抗孵育、二抗结合、ECL等步骤观察PGIS蛋白表达及其亚硝基化修饰水平。6.组织免疫荧光染色（IF）免疫荧光染色检测主动脉血管中PGIS亚硝基化修饰水平。7.大鼠离体血管张力检测分离大鼠主动脉并制备5mm的环形血管环,通过离体血管环实验检测主动脉对硝酸酯类的舒张反应性。8.PGIS活性及PGI2,TXA2含量测定PGI2含量的测定由其稳定的代谢产物6-酮-PGF1α的测定替代。用ELISA试剂盒测定细胞或组织裂解液或血清中6-酮-PGF1α的水平。由于TXA2的不稳定性,通过测定其稳定的代谢产物TXB2代表TXA2的产生。取组织或细胞裂解液,使用ELISA试剂盒进行测量。研究结果1.GTN诱导PGIS巯基亚硝基化修饰体外实验中,NO供体（GTN,GSNO,SNAP,SNP,SPNO）均可与重组人PGIS蛋白发生巯基亚硝基化修饰;GTN使HUVECs中PGIS的巯基亚硝基化水平呈现浓度依懒性增加。体内实验中,Western blot及组织免疫荧光实验显示,GTN使主动脉组织中PGIS巯基亚硝基化水平显着升高。山东大学博士学位论文2.GTN抑制PGIS活性及PG12的合成体内实验与体外实验结果均显示:GTN使PGIS活性明显降低,使前列腺素代谢向PGI2方向转化减少,PGI2代谢产物6-酮-PGF1α生成减少。3.PTIO和NAG阻断GTN诱导的PGIS亚硝基化及对PG IS活性的抑制PTIO及NAC均可显着降低HUVECs和主动脉中由GTN所诱导的PGIS巯基亚硝基化水平。PTIO及NAC均可阻断GTN对PGIS活性的抑制,使6-酮-PGF1α和PGI2的生成增加,证明PGIS活性的降低可能为PGIS亚硝基化修饰所介导。4.蛋白质巯基亚硝基化导致GTN耐受体内实验中,NAC干预组的大鼠血管环恢复对GTN的舒张反应,抑制了GTN耐受,证明蛋白质的巯基亚硝基化是GTN耐药的重要影响因素。5.GTN诱导的PGIS巯基亚硝基化位于231及441号半胱氨酸位点体外实验中,分别突变Cys231或Cys441后PGIS亚硝基化反应减弱,而Cys231及Cys441均突变后PGIS亚硝基化水平明显减弱。体内试验中,尾静脉注射野生型及突变型PGIS cDNA腺病毒,结果显示突变C231/C441显着抑制了GTN对主动脉组织中PGIS的亚硝基化修饰。6.Cys231/Cys441突变抑制了 GTN诱导的PGIS活性下降及PG 12合成减少与GTN+WT-PGIS组中6-酮-PGF1α生成明显下降相比,GTN+MT-PGIS组中6-酮-PGF1α生成增加,且前列腺素代谢向PGI2方向转化增加,向TXA2方向转化减少。7.PGIS的231及441号半胱氨酸位点突变改善硝酸酯类交叉耐受离体血管环实验显示,Cys231/Cys441突变可明显改善血管环对于GTN、SNP和SNAP的舒张反应。8.阿司匹林和贝前列素对硝酸酯类交叉耐受的影响离体血管环实验显示,贝前列素和阿司匹林可明显改善主动脉环对GTN、SNP和SNAP的浓度依赖性舒张反应。9.Tranylcypromine 对 GTN 耐受的影响离体血管环实验显示,Tranylcypromine可使血管对GTN和SNP的浓度依赖性舒张反应显着减弱。结论1.GTN诱导PGIS的Cys231和Cys441位点亚硝基化修饰;2.GTN通过PGIS亚硝基化修饰使PGIS活性下降,PGI2生成减少;3.PGIS亚硝基化修饰介导体内硝酸酯类交叉耐受;4.应用阿司匹林和贝前列素可改善硝酸酯类交叉耐受。论文Ⅱ AMPKβ1亚硝基化修饰在高糖促进VSMCs钙化中的作用及机制研究研究背景糖尿病（diabetesmellitus,DM）是血管动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）的重要危险因素之一。钙化作为糖尿病动脉粥样硬化（diabetic atherosclerosis,DA）最常见的并发症之一,一度被认为是不良心血管事件的独立预测因子,与斑块进展和不稳定性有密切关系。血管钙化是受血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）表型转换驱动的一个主动调节过程,VSMCs向成骨细胞表型转化以及VSMCs中骨矿物羟基磷灰石和基质囊泡的形成是血管钙化的核心事件。研究发现高糖可通过诱导成骨细胞结合因子和成骨细胞转录因子的表达,促进VSMCs转化为成骨样细胞,从而加速DA斑块内膜钙化的发生发展。尽管高糖促进VSMCs钙化的作用己被普遍认可,而其中的相关机制并不十分明确。腺苷酸活化的蛋白激酶（AMP-activatedproteinkinase,AMPK）是一种异源三聚体丝/苏氨酸蛋白激酶,由α（α1,α2）催化亚基与β（β1,β2）和γ（γ1,γ2,γ3）调节亚基组成,负责调节代谢和能量的平衡。β亚基C-端区域同源性较高,为连接α与γ亚基的桥梁。β亚基的CBM区域为糖原结合结构域,可能参与糖原对AMPK的调节作用。此外,β亚基还含有豆蔻酰化和磷酸化位点,参与调节AMPK活性和亚细胞定位。β1在肝脏中高表达,在骨骼肌中低表达;β2则相反。而在大部分细胞中主要以α1、β1、γ1异构体为主。本课题组前期实验显示,在高糖刺激下,VSMCs中AMPKβ1蛋白表达显着下降。多项研究表明,AMPK可负向调节斑块钙化进程,AMPK激活剂AICAR和二甲双胍均可抑制体外VSMCs钙化。那么AMPKβ1是否在高糖诱导的VSMCs钙化中发挥调节作用?而高糖刺激下AMPKβ1蛋白表达降低是通过什么机制导致?两者是否存在关联?这些问题尚未被研究者重视及探究。蛋白质巯基亚硝基化修饰是指游离的一氧化氮（nitricoxide,NO）与蛋白质内的半胱氨酸自由巯基共价结合形成亚硝基硫醇（S-nitrosothiols,SNOs）的过程。蛋白质亚硝基化修饰可影响蛋白质稳定性、活性、亚细胞定位和蛋白质间的相互作用,进而参与多种病理和生理过程。有研究表明,Western blot和PCR实验均证实在糖尿病模型大鼠中诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase,iNOS）表达显着增加,NO产生增加。那么高糖诱导下AMPKβ1的降低是否由增加的NO与AMPKβ1的亚硝基化修饰导致?综上分析,本研究拟通过高糖和β-甘油磷酸诱导人主动脉平滑肌细胞（human aortic smooth muscle cells,HAMSCs）钙化,研究高糖诱导下AMPKβ 1蛋白表达降低的相关机制及AMPKβ1对高糖促进的VSMCs钙化的影响,为临床上预防和治疗血管钙化提供实验依据。研究目的1.研究高糖刺激是否诱导AMPKβ1亚硝基化修饰;2.构建并转染野生型及突变型AMPKβ1腺病毒,研究AMPKβ1亚硝基化修饰对高糖促进VSMCs钙化的影响及相关机制。研究方法1.细胞刺激与转染取6-8代HASMCs进行细胞实验,分别将5.5 mM及30 mM的葡萄糖溶液作为正常糖（NG）和高糖（HG）刺激。（1）将HG溶液分别按照0,6,12,24,48,72小时的时间梯度加入六孔板内,Western blot及RT-PCR分别检测AMPKβ1和iNOS的蛋白和mRNA表达水平;在10ng/ml白细胞介素-1β（IL-1β）孵育下,分别于0,6,12,24,48,72小时的时间梯度下加入HG,用一氧化氮检测试剂盒测定细胞内NO的生成;（2）分别将终浓度为0.2mM的Carboxy-PTIO,100 μM的 1400W或0.4μM的MG132预处理HASMCs2小时,而后加入高糖刺激。24小时后收集细胞,检测AMPKβ1的蛋白表达及亚硝基化水平;（3）研究高糖刺激对HASMCs钙化的影响。向培养基中加入10 mmol/的β-甘油磷酸（β-GP）以诱导细胞钙化。将实验分为以下四组:NG,NG+β-GP,HG,HG+β-GP,检测各组细胞的钙化水平;（4）将AMPKβ1过表达腺病毒转染HASMCs中,实验分四组:正常糖+空载体组（NG+Vector）,正常糖+AMPKβ1过表达组（NG+AMPKβ1）,高糖+空载体组（HG+Vector）,高糖+AMPKβ1过表达组（HG+AMPKβ1）,各组均加入10 mM β-GP诱导钙化,反应结束后收集细胞并检测各组细胞的钙化水平;（5）将野生型AMPKβ1 和突变型AMPKβ1（MT-AMPKβ1-C173A、MT-AMPKβ1-C223A及MT-AMPKβ1-C173/223A）转染HASMCs,转染成功后加入HG和10 mM β-GP诱导钙化,检测AMPKβ1亚硝基化水平及细胞钙化水平。（6）野生型AMPKβ1和突变型AMPKβ1（MT-AMPKβ1-C173/223A）转染HASMCs,24小时高糖刺激后检测细胞中AMPKβ1蛋白泛素化水平。2.生物素转化法（Biotin switch）用蛋白裂解液提取细胞蛋白,通过封闭游离巯基、Biotin标记、纯化Biotin标记蛋白等步骤获得纯化的亚硝基化蛋白,Western blot实验检测AMPKβ1的亚硝基化水平。3.免疫沉淀反应（IP）提取细胞蛋白,加入AMPKβ1抗体（1:50稀释度）与蛋白裂解液4度旋转过夜。加入Protein A/GAgorose并孵育4小时,离心取上清即得到AMPKβ1蛋白-抗体-珠子复合体。Western blot检测AMPKβ1的泛素化水平。4.蛋白免疫印迹检测（Western blot）提取HASMCs中的总蛋白,检测iNOS、AMPKβ1和Runx2的蛋白表达水平。5.实时荧光定量PCR（qRT-PGR）收集高糖刺激后的HASMCs并提取细胞内总RNA,检测AMPKβ1和iNOS的mRNA水平。6.茜素红染色4%的多聚甲醛固定细胞后,用茜素红染色液将六孔板内的细胞进行染色30分钟,PBS洗涤3次后置于显微镜下观察。7.钙含量测定用裂解液（PBS+1%TritonX-100）裂解细胞后,离心取上清并按照试剂盒说明测定细胞中的钙含量。8.碱性磷酸酶活性测定根据碱性磷酸酶试剂盒说明测定细胞中碱性磷酸酶活性。9.一扬化氮含量测定用一氧化氮检测试剂盒测定细胞中一氧化氮的含量。研究结果1.高糖刺激使HASMCs中AMPK β 1表达降低而i N0S表达增加HASMCs与HG溶液按时间梯度孵育,Western blot及qRT-PCR结果显示,随着时间递增,HASMCs中AMPKβ1蛋白表达逐渐下降,mRNA水平无显着变化;iNOS蛋白及mRNA水平均逐渐增加,细胞裂解液中NO含量逐渐增加。2.离糖诱导AMPK β 1中Cys173和Cys223位点亚硝基化修饰与放线菌酮刺激下的AMPKβ1降解速率相比,HG可明显增加HASMCs中AMPKβ1的降解速率,证明高糖诱导下AMPKβ1表达下降是由蛋白质降解增加所致。Biotinswitch实验显示,HG刺激下AMPKβ1的亚硝基化水平明显升高,并可被PTIO和1400W抑制。Cys173和（或）Cys223位点突变后,可明显减弱高糖诱导的AMPKβ1的亚硝基化水平。3.AMPKβ1亚硝基化通过泛素-蛋白酶体系统促使AMPK β1降解Cys173及Cys223的突变显着抑制高糖诱导的AMPKβ1泛素化水平的升高。MG132可逆转高糖刺激下AMPKβ1蛋白表达水平的下降。4.高糖促进HASMCs钙化与对照组相比,高糖刺激可明显提高HASMCs中Runx2表达,碱性磷酸酶（ALP）活性及钙含量。5.AMPKβ1与HASMCs钙化呈负相关AMPKβ1过表达可显着降低HASMCs中钙含量、Runx2的表达及ALP活性,证明AMPKβ1参与高糖刺激下HASMCs钙化进程且负向调节高糖刺激的HASMCs 钙化。6.AMPKβ 1亚硝基化对HASMCs钙化的影响与对照组相比,PTIO及NAC均可抑制高糖诱导的HASMCs钙化水平的升高。在HG刺激HASMCs的钙化中,与WT-AMPKβ1转染组相比,Cys173和（或）Cys223的突变可使细胞Runx2表达水平、钙含量测定和茜素红染色明显降低。7.亚硝基化通过降低AMPK β 1稳定性影响HASMCs钙化与对照组相比,MG132可明显下调HG诱导下HASMCs内Runx2蛋白表达。结论1.高糖通过促进iNOS/NO产生介导AMPKβ1中Cys173和Cys223位点发生疏基亚硝基化修饰;2.AMPKβ1亚硝基化通过泛素-蛋白酶体系统介导高糖刺激下AMPKβ1蛋白表达水平的下降;3.AMPK|β1亚硝基化促进高糖刺激下HASMCs的钙化。论文Ⅲ AMPKβ 1亚硝基化修饰对糖尿病动脉粥样硬化斑块钙化的影响及机制研究研究背景血管钙化（vascularcalcification,VC）是动脉粥样硬化和糖尿病血管病变的并发症,是不良心血管事件的独立预测因子。血管钙化是血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMC）在钙化调节因子的诱导下分化为成骨样细胞,并伴随磷酸钙羟基磷灰石晶体沉积在细胞外基质的过程。根据位置不同,血管钙化主要分为两种类型:动脉粥样硬化性内膜钙化和与糖尿病、慢性肾病等相关的中膜钙化。动脉粥样硬化钙化主要位于在血管内膜,随着病变进展可累及中膜。研究表明血管钙化的形成是一个涉及多因素、多系统控制的主动调节过程,包括炎症反应、氧化应激、细胞凋亡、脂质代谢紊乱、高血糖等。多项研究证实,高血糖是促进VC发生发展的重要因素之一,然而其中的具体机制尚不清楚。我们研究表明,AMPKβl亚硝基化修饰促进高糖诱导下HASMCs钙化,然而AMPKβ1亚硝基化修饰在体内水平对糖尿病动脉粥样硬化斑块钙化的影响及相关机制尚未被研究。本研究拟通过构建糖尿病动脉粥样硬化ApoE-/-小鼠模型研究AMPKβ1亚硝基化修饰对斑块内膜钙化的影响,为临床上预防和治疗糖尿病动脉粥样硬化提供实验依据。研究目的1.研究AMPKβ1亚硝基化修饰促进高糖刺激下HASMCs钙化的机制;2.建立糖尿病动脉粥样硬化ApoE-/-小鼠模型,通过转染野生型及突变型AMPKβ1腺病毒研究AMPKβ1亚硝基化对斑块内膜钙化的影响及其机制。研究方法1.细胞模型（1）将野生型AMPKβ1和突变型AMPKβ1 cDNA腺病毒转染HASMCs,加入高糖和10 mM β-甘油磷酸刺激,Western blot检测p-AKT及AKT蛋白表达;（2）HASMCs与10nmol/L胰岛素孵育2小时后,转染AMPKβ1过表达和对照病毒并加入高糖和10 mM β-甘油磷酸诱导钙化,Western blot检测p-AKT、AKT和Runx2蛋白表达。2.动物模型的建立（1）糖尿病小鼠模型的建立:将链脲佐菌素（Streptozocin,STZ）按60mg/kg的量连续5天腹腔注射打入小鼠体内。血糖≥16.7mmol/L视为造模成功。（2）构建并转染 WT-AMPKβ1 和 MT-AMPK-C173/223A cDNA 腺病毒。建立2型糖尿病ApoE-/-小鼠模型并给与高脂喂养。2月后尾静脉注射WT-AMPKβ1或MT-AMPKβ1 cDNA腺病毒,继续饲养1个月后取材。3.体重及血液学指标的检测测量实验前后小鼠体重并用酶学法检测血清标本中血糖及血脂水平。4.组织学检测留取实验小鼠主动脉和心脏标本并制备成组织匀浆,一部分检测AMPKβ1亚硝基化水平和Runx2、p-AKT及AMPKβ1的蛋白表达,一部分检测主动脉中钙含量。制备主动脉根部冰冻切片,免疫组织化学染色方法检测斑块中Runx2和p-AKT的表达水平。5.生物素转化法（Biotin switch）提取主动脉组织蛋白,通过封闭游离巯基、biotin标记和纯化biotin标记蛋白等步骤获得纯化的亚硝基化蛋白,Western blot检测AMPKβ1的亚硝基化水平。6.蛋白免疫印迹检测（Western blot）提取细胞或主动脉组织中的总蛋白并检测AMPKβ1、Runx2和p-AKT的蛋白表达水平。7.钙含量测定用裂解液（PBS+1%TritonX-100）裂解主动脉组织,离心取上清后并按照试剂盒说明测定组织的钙含量。8.免疫组织化学染色将主动脉根部冰冻切片进行免疫组织化学染色以测定其中Runx2和p-AKT的表达水平。研究结果1.实验小鼠基本情况各组小鼠间体重及血脂水平无显着性差异。糖尿病组小鼠空腹血糖水平与对照组间有显着差异。2.AKT激活剂-胰岛素对AMPK β 1调节的HASMCs钙化的影响HASMCs钙化中,高糖刺激可显着提高AKT活性。与AMPKβ1过表达组中p-AKT和Runx2的低水平相比,胰岛素可显着提高AMPKβ1过表达HASMCs中p-AKT和Runx2的表达水平,证明AMPKβ1通过AKT/Runx2通路调节HASMCs 钙化。3.AMPK β 1亚硝基化修饰通过调节AKT活性影响HASMCs钙化Cys173和Cys223的突变可显着降低高糖诱导HASMCs钙化中AKT活性。4.AMPKβ 1亚硝基化修饰对糖尿病动脉粥样硬化ApoE-/-小鼠斑块钙化的影响Western blot、组织切片免疫组化及主动脉钙含量检测显示,Cys173和Cys223突变可显着降低主动脉组织中p-AKT和Runx2蛋白表达及斑块中钙化水平。结论1.AMPKβ1亚硝基化修饰通过上调AKT/Runx2通路活性促进高糖诱导的HASMCs 钙化;2.糖尿病动脉粥样硬化ApoE-/-小鼠中,AMPKβ1亚硝基化修饰通过上调AKT活性促使斑块内膜钙化水平升高。
汪杰[6]（2020）在《基于网络药理学的“瓜蒌薤白半夏汤”治疗冠心病的作用机制研究》文中研究表明目的筛选瓜蒌薤白半夏汤中治疗冠心病的主要活性成分,预测其活性成分的作用靶点,建立药物-成分-靶点-疾病网络,探讨瓜蒌薤白半夏汤治疗冠心病的作用机制。方法在TCMSP数据库中筛选出药物的活性成分和靶点。利Uniprot数据库筛除药物的非人类靶点并校正为官方名称。通过TTD数据、Gene Cards数据库、Dis Ge NET数据库获取瓜蒌薤白半夏汤治疗冠心病的潜在靶点。利用Cytoscape构建瓜蒌薤白半夏汤治疗冠心病的化合物-靶点-疾病网络。使用Cytoscape软件的Cyto NCA插件对网络进行拓扑学分析,筛选出瓜蒌薤白半夏汤治疗冠心病的核心活性成分。在String数据库获取交集靶点蛋白的高置信度交互作用关系,在Cytoscape软件中构建交集靶点蛋白的相互作用网络。使用Cyto NCA插件对网络进行拓扑学分析,筛选出瓜蒌薤白半夏汤治疗冠心病的核心靶点。从PDB数据库获取靶点蛋白的结构,利用Autodock软件进行分子对接模拟验证,并将结果可视化。利用David数据库对潜在作用靶点进行GO功能、KEGG通路Up＿Tissue组织分布的富集分析,并在Cytoscape软件中构建化合物-靶点-通路网络。结果1 瓜蒌薤白半夏汤的活性成分和作用靶点:利用TCMSP平台共筛选到满足OB>30%、DL>0.18同时有预测靶点的活性成分33种。瓜蒌含有10种活性成分,薤白含有11种活性成分,半夏含有13种活性成分,其中β-谷甾醇（MOL000358）在薤白和半夏中均有分布。在TCMSP平台上共收集到活性成分的预测靶点137个,瓜蒌的活性成分有30个作用靶点,薤白的活性成分有119个作用靶点,半夏的活性成分有83个作用靶点。2 冠心病相关靶点和交集靶点:基于TTD数据库、Gene Cards数据库和Dis Ge NET数据库筛选冠心病的相关靶点共1221个。药物与疾病的交集靶点共有68个。3 瓜蒌薤白半夏汤治疗冠心病的化合物-靶点-疾病网络:基于Cytoscape软件构建瓜蒌薤白半夏汤治疗冠心病的化合物-靶点-疾病网络。网络共含有105个节点和390条边,包括了1个疾病节点,3个药物节点,33个活性成分节点,68个靶点节点。Cyto NCA插件的拓扑学分析结果显示,度值Degree中位数为6,介度中心数BC中位数为24.706522,紧密中心数CC中位数为0.37313432,共有6个活性成分满足核心活性成分的筛选条件,分别为槲皮素（MOL000098）、β-谷甾醇（MOL000358）、胞嘧啶核苷（MOL002670）、豆甾醇（MOL000449）、柚皮素（MOL004328）、黄芩苷（MOL002714）。4 靶点蛋白PPI网络:基于String数据库反馈的交集靶点蛋白的高置信度交互作用信息,在Cytoscape软件中构建瓜蒌薤白半夏汤治疗冠心病的靶点蛋白PPI网络。去除与其他靶点蛋白没有相互作用的靶点后,网络共有67个节点、244条边。节点的直径越大、颜色越深代表节点Degree值越高、与之相互作用的靶点蛋白越多,边越粗、颜色越深代表两靶点蛋白间的相互作用越强。Cyto NCA插件的拓扑学分析结果如表3所示,度值Degree中位数为5,介度中心数BC中位数为17.139444,紧密中心数CC中位数为0.15456675,共有16个靶点满足核心靶点的筛选条件,IL6、MAPK1、VEGFA、TP53、IL1B、PTGS2、CCL2、EGF、EGFR、HMOX1、NOS3、MAPK14、ESR1、MMP2、CAT、AR。5 分子对接模拟验证:从PDB数据库获取靶点蛋白的信息。利用Autodock＿vina软件计算的靶点蛋白与活性成分间的最低结合能,所有的最低结合能结果均小于-5k J?mol-1,说明受体蛋白与活性成分具有结合活性,能够形成较为稳定的构象。核心活性成分与受体蛋白的最低结合能大部分大于阿司匹林分子与受体蛋白的最低结合能,验证了靶点蛋白受体及配体选择的合理性。分子对接模拟验证显示,活性成分分子与周围分子通过氢键等分子间作用力形成较为稳定的构象。6 富集分析结果:通过David数据库获取部分富集分析结果。GO生物学富集分析共富集到307个GO条目,包括219个生物过程（Biological Processes,BP）条目、36个细胞组分（Cellular Component,CC）条目和52个分子功能（Molecular Function,MF）条目,涉及一氧化氮生物合成过程的正调控（positive regulation of nitric oxide biosynthetic process）、对缺氧的反应（response to hypoxia）、MAPK活性的激活（activation of MAPK activity）等。KEGG通路富集分析共富集到30条通路,涉及低氧诱导因子-1信号通路（HIF-1 signaling pathway）、肿瘤坏死因子信号通路（TNF signaling pathway）、雌激素信号通路（Estrogen signaling pathway）、PI3K-Akt信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）等通路。组织分布富集分析共富集到10个条目,主要涉及纤维母细胞、肝、血小板、心、外周血、白细胞、血等部位。7 化合物-靶点-通路网络:在Cytoscape软件中构建瓜蒌薤白半夏汤治疗冠心病的化合物-靶点-通路网络。化合物-靶点-通路网络共有122个节点和437条边,涉及3种药物、33种活性成分、56个潜在靶点、30条KEGG通路,体现了瓜蒌薤白半夏汤对冠心病的治疗作用有着多成分、多靶点、多途径的特点。结论:（1）通过数据库检索发现瓜蒌薤白半夏汤具有多种化合物成分,瓜蒌薤白半夏汤治疗冠心病是多种活性成分共同发挥作用,其中槲皮素、柚皮素、黄芩素、黄芩苷等可能为瓜蒌薤白半夏汤治疗冠心病的核心成分（2）通过活性成分的靶点预测筛选发现瓜蒌薤白半夏汤的活性成分可作用于多个靶点,瓜蒌薤白半夏汤主要通过IL6（白细胞介素-6）、MAPK1（丝裂原活化蛋白激酶1）、TP53（细胞肿瘤抗原p53）、VEGFA（血管内皮生长因子）、IL-1β（白细胞介素-1β）、PTGS2（前列腺素G/H合酶2）、CCL2（C-C基序趋化因子2）、EGF（表皮生长因子）、HMOX1（血红素加氧酶1）、NOS3（内皮型一氧化氮合酶）等靶点作为瓜蒌薤白半夏汤治疗冠心病的核心靶点（3）通过GO分析和KEGG分析发现瓜蒌薤白半夏汤主要通过调节一氧化氮生物合成过程（positive regulation of nitric oxide biosynthetic process）、抗缺氧（response to hypoxia）、血红素结合（heme binding）、血管生成（angiogenesis）、血管舒张阳性调节（positive regulation of vasodilation）等生物过程和分子功能发挥治疗冠心病的作用。涉及的信号通路包括了低氧诱导因子-1信号通路（HIF-1 signaling pathway）、雌激素信号通路（Estrogen signaling pathway）、PI3K-Akt信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）、钙信号通路（Calcium signaling pathway）、血管内皮生长因子信号通路（VEGF signaling pathway）等通路。
王瑞红[7]（2020）在《过表达SmPsbD对丹参光合作用和酚类化合物生物合成的影响作用研究》文中进行了进一步梳理丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge）作为我国的传统大宗药材之一,主要用于治疗心脑血管等疾病。丹参亲水性成分的亲水性特性更加符合我国传统中药水煎剂的用药特点而深受关注。植物PsbD基因对稳定类囊体膜上PSII复合体发挥重要作用而影响植物的光合作用。植物通过光合作用产生的光合产物为次生代谢物提供能量和前体物质,次生代谢从几个主要分支点与初生代谢相连接,因此,光合作用产物的多少直接影响下游的次生代谢。本研究以丹参无菌苗为试验材料,研究了过表达SmPsbD对丹参光合作用及其产物合成的影响,分析了引起产物合成量变化的原因,进一步探讨了光合作用产物对丹参中酚类化合物生物合成的影响及其机理。取得的主要结果如下:1.明确了丹参SmPsbD的进化关系及其组织特异性。利用MEGA7.0对丹参SmPsbD的氨基酸序列进行进化树分析,结果表明,目的基因基本遵循由低等藻类植物到高等双子叶植物的进化关系。利用RT-qPCR技术检测了丹参SmPsbD在开花期丹参的根、茎、嫩叶、成熟叶以及花中的转录水平表达,发现该基因在根中不表达,只在地上组织中表达,表达水平依次为:成熟叶>嫩叶>茎>花。2.成功获得了丹参SmPsbD过表达转基因植株。构建丹参SmPsbD过表达重组质粒,利用根癌农杆菌GV3101介导的植物遗传转化体系获得了阳性转基因植株。p CAMBIA1304载体和过表达SmPsbD转基因植株相应的遗传转化效率分别为18.3%和15.0%。利用RT-qPCR技术分析过表达转基因植株中SmPsbD的相对表达量,结果显示,农杆菌介导的遗传转化提高了SmPsbD的转录水平。3.分析了丹参SmPsbD过表达转基因植株的转录水平变化。比较丹参SmPsbD过表达转基因植株与野生型丹参的转录组发现,共产生11354个差异表达基因（DEGs）（FC≥2和FDR≤0.001）,其中5084个DEGs上调,6270个DEGs下调。对DEGs进行KEGG富集分析（P-value≤0.05）发现,DEGs主要富集在以下几类相关代谢途径中:与光合作用相关的代谢通路,如“光合作用”、“光合作用-天线蛋白”以及“卟啉和叶绿素代谢”;与信号转导相关的代谢通路,如“植物MAPK信号通路”;与光合作用产物相关的代谢通路,如“淀粉和蔗糖代谢”;与次生代谢相关的代谢通路,如“苯丙氨酸代谢”、“苯丙烷生物合成”、“酪氨酸代谢”、“类黄酮生物合成”等代谢途径。进一步利用Map Man软件对DEGs进行代谢途径可视化分析,其结果与转录组KEGG富集分析一致,即与光合作用及其光合产物相关的途径有光合作用光反应、蔗糖-淀粉代谢、氨基酸代谢、脂代谢以及TCA循环等,与次生代谢相关的途径有类黄酮代谢、萜类代谢以及苯丙氨酸和酚类代谢等。利用RT-qPCR技术对转录组数据中与光反应相关的基因表达进行验证,发现RT-qPCR与RNA-seq的分析结果趋势一致,说明转录组数据可靠。4.明确了过表达SmPsbD引起了丹参代谢物合成的差异。比较SmPsbD过表达转基因植株与野生型丹参的代谢组差异（VIP≥1且FC≥1.2或FC≤0.83）,发现有404个差异代谢物,其中278个代谢物含量增加,126个代谢物含量降低。利用metaboanalyst3.0软件对差异代谢物进行KEGG富集分析,发现显着富集的代谢途径归为2类:与初生代谢相关的代谢途径,包括“氨基酸生物合成”、“磷酸戊糖途径”、“泛酸和Co A生物合成”以及“糖类生物合成”;与次生代谢相关的代谢途径,包括“酪氨酸代谢”、“苯丙烷生物合成”、“苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成”、“芥子油苷生物合成”、“植物次生代谢生物合成”、“植物激素生物合成”、“来源于莽草酸途径的生物碱生物合成”以及“抗坏血酸和醛酸代谢”等。5.揭示了SmPsbD对丹参光合作用及其产物的调节作用。与野生型相比,丹参SmPsbD过表达转基因植株中叶绿体数目、叶绿素含量、光合作用参数以及叶绿素荧光参数均显着增加,光合作用能力增强,光合作用产物含量提高。结合转录组DEGs发现,叶绿素生物合成过程中相关酶基因的表达量上调可能是叶绿素含量增加的原因。叶绿体数目增加、叶绿素含量增加、植株光合作用能力增强,以及初生代谢相关途径（如TCA循环、蔗糖-淀粉代谢以及莽草酸和分支酸代谢途径）关键酶基因的表达上调可能是光合作用产物含量提高的原因。6.揭示了SmPsbD对丹参酚类化合物生物合成的调节作用。与野生型相比,过表达丹参SmPsbD促进了丹酚酸B、迷迭香酸、总酚和总黄酮等酚类化合物的生物合成与积累。过表达SmPsbD转基因植株中丹酚酸B、迷迭香酸、总酚和总黄酮化合物的含量分别是野生型的1.95～2.43倍、6.57～9.38倍、2.20～3.67倍和1.87～3.39倍。酚类化合物生物合成量增加的主要原因为:一方面是莽草酸和分支酸代谢途径中初生代谢物（莽草酸、苯丙氨酸、酪氨酸等）的生物合成积累增加为次生代谢提供了足够的底物,另一方面是过表达SmPsbD上调了酚类化合物生物合成过程中关键酶（PAL、4CL、RAS、CYP98A14、CHS、FLS、DFR以及LAR等）基因的表达。本研究从生理水平、转录水平和代谢水平揭示了SmPsbD对丹参光合作用及其产物的影响,以及光合作用产物对酚类次生代谢物生物合成的正向调节作用,为通过分子手段提高丹参产量提供了理论依据,也为丹参活性成分的代谢调控奠定了基础。
邢小卫[8]（2020）在《miR-26a-5p通过调控PTEN/PI3K/AKT信号通路对心肌缺血再灌注损伤的作用研究》文中研究指明研究背景心血管疾病是世界上无论是发展中国家还是发达国家中最常见的死亡原因之一,而这其中急性ST段抬高型心肌梗死（ST-segment elevation myocardial infarction,STEMI）首当其冲成为最为凶险、致死致残率最高的一类。虽然我国心血管疾病的预防和救治工作有了很大的改善,但急性心肌梗死的发病率及死亡率仍然在不断上升。再灌注治疗是STEMI患者最有效的治疗措施,可以向缺血区域提供及时有效的能量,从而减少梗死范围、维持心脏收缩功能。但是越来越多的基础和临床研究表明,缺血心肌在恢复血液再次灌注后会导致额外的心肌损伤,如心肌顿抑、心律失常、无复流、心肌坏死等的发生,这种现象称之为心肌缺血/再灌注损伤（myocardialischemia/reperfusion injury,MIRI）,MIRI 已成为影响再灌注治疗效果和STEMI患者预后的主要因素。既往研究MIRI的机制包括氧自由基学说、钙超载学说、心肌能量代谢障碍学说、细胞凋亡学说等;治疗策略包括非药物干预的方法如缺血预适应、缺血后适应和远程缺血预适应,药物干预方法包括腺苷、心房钠肽、环孢素A、极化液、胰高血糖素样肽-1等。虽然许多细胞实验、动物实验证实上述治疗措施有效,但转化成临床试验的结局确是令人失望的。单一的心脏保护策略对改善缺血再灌注损伤效果不佳,联合多种保护策略或者协同多靶点治疗却很有希望治疗缺血再灌注损伤,因此我们非常有必要进一步深入研究MIRI的分子机制,为我们探索新的诊断、治疗靶点提供依据。越来越多的证据表明缺血再灌注损伤的一种重要病理生理机制是细胞凋亡,细胞调亡是一个需要能量的过程,虽然冉灌注过程给缺血心肌提供赖以生存的氧气和能量,但同时也为细胞凋亡提供了能量。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase家族）在凋亡的执行阶段起主要作用,凋亡是多种Caspase共同完成的,Caspase-3被认为是各种凋亡刺激因子促进凋亡过程中的终末剪切酶,有研究表明Caspsase-3在缺血再灌注导致的心肌细胞凋亡过程中发挥重要作用。微小RNA（miRNA）是近年来发现的内源性非编码单链小分子RNA,通过结合靶mRNA的3’ UTR区从而降解靶mRNA或抑制其翻译,达到调控基因表达的目的。miRNA在各种细胞功能调控中具有重要作用,例如胚胎发育、细胞凋亡、细胞生长和分化以及肿瘤发生等。研究表明在心血管系统方面,miRNA与心肌梗死、心脏肥大、心肌重塑、心力衰竭和心律不齐等各种心脏病的发病机制有密切关系。miRNA具有细胞和组织特异性,有快速释放的动力学特点,在血清当中相对稳定存在,因此循环miRNA有望用于心血管疾病的早期诊断、危险分层、判断预后甚至治疗。目前miRNA研究颇多,一些研究表明miRNA在心肌细胞凋亡中发挥着重要的调控作用,但在心肌缺血再灌注损伤中的研究仍不成熟。miR-26a-5p作为新近发现的一种miRNA,在多种心血管疾病中存在差异表达。如有研究显示经过miR-26a-5p抑制剂转染的冠心病小鼠模型,分离出的内皮细胞生存力明显下降而凋亡率明显升高。另一项研究表明miR-26a-5p的过表达可以减轻冠状动脉微循环栓塞引起的无复流和心肌坏死。鉴于心肌缺血再灌注损伤与心肌细胞凋亡、冠脉微循环栓塞有着密切的关系,我们推测miR-26a-5p可能通过调节细胞凋亡参与心肌缺血再灌注损伤。目前,miR-26a-5p在心肌缺血再灌注损伤中的作用尚未见报道。我们通过心肌细胞缺氧/复氧模型、小鼠缺血再灌注模型分别在体外、体内模拟了心肌缺血再灌注损伤模型。然后,利用生物实验结合生物信息学方法来探索miR-26a-5p在心肌缺血再灌注损伤中的表达和调控作用,并进一步探讨miR-26a-5p影响缺血再灌注损伤可能的通路和机制,从而为更好的解释心肌缺血再灌注损伤的机制和提供可能的治疗策略奠定实验基础。第一章miR-26a-5p在缺氧/复氧心肌细胞中的表达及其调控作用目的关于心肌缺血再灌注损伤的分子机制仍未明确阐明,而关于miR-26a-5p在心肌缺血再灌注损伤当中的作用尚不清楚。第一章研究的目的是明确miR-26a-5p在细胞缺氧/复氧损伤中的表达水平,分析miR-26a-5p的过表达或抑制对缺血再灌注损伤程度的影响。方法1.生物信息学分析:从GEO数据库中搜索与心肌缺血再灌注相关的miRNAs的大数据,比较分析差异表达的miRNA。2.原代心肌细胞的分离和培养:取2日龄的C57BL/6乳鼠,消毒后开胸取心脏,分离出左心室后剪碎并胰酶消化,应用差速贴壁离心方法纯化心肌细胞,加入DMEM培养基,在37℃培养箱中培养。3.细胞转染:miR-26a-5p模拟物、miR-26a-5p抑制剂及相应对照物利用Lipofectamine█ RNAiMAX Reagent转染至原代心肌细胞中。4.建立心肌细胞缺氧/复氧模型:心肌细胞培养液置换为不含血清、不含糖的DMEM培养基,放置在37℃含5%C02、95%N2的低氧培养箱中缺氧培养4小时,之后置换上含糖、FBS的DMEM培养基并放置在37℃含95%空气和5%C02的培养箱中继续培养心肌细胞2小时,自此,缺氧/复氧（H/R）模型成功建立。5.细胞实验分组5.1实验一分组:1.对照组（Control group）;2.缺氧/复氧组（H/R group）。5.2 实验二分组:1.miRNA control+H/R 组;2.miR-26a-5p mimic+H/R组;3.inhibitor control+H/R 组;4.miR-26a-5p inhibitor+H/R 组。6.MTT法检测心肌细胞活力:各组心肌细胞培养孔中加入MTT、二甲基亚砜后测定心肌细胞存活率。7.流式细胞学技术测定细胞实验中心肌细胞凋亡率。8.实时萤光定量PCR检测各组心肌细胞中miR-26a-5p含量。9.Western Blot实验检测促凋亡蛋白cleaved caspase-3的表达。结果1.GEO网站为https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/,识别出心肌缺血再灌注相关的miRNAs生物芯片数据,与正常组织对比,做差异分析。发现miR-26a-5p在心肌缺血再灌注组织中表达下调,差异明显（P=0.0004）。2.流式细胞学技术来检测H/R心肌细胞的凋亡率是12.65%,对照组心肌细胞凋亡率为0.71%,差异明显。Western Blot技术检测结果显示H/R心肌细胞中凋亡蛋白cleaved caspase-3的表达量明显高于对照组（P=0.0003）。3.qRT-PCR检测结果显示H/R心肌细胞中miR-26a-5p的含量明显低于对照组（P=0.0003）。4.转染miR-26a-5pmimic后心肌细胞中miR-26a-5p的水平明显升高;而转染 miR-26a-5pinhibitor 后心肌细胞中 miR-26a-5p 含量明显降低（P<0.0001）。MTT检测结果显示与对照组相比,过表达miR-26a-5p显着增加了心肌细胞在缺氧/复氧后的细胞活力;miR-26a-5p表达受抑制后显着降低心肌细胞在缺氧/复氧后的细胞活力（P<0.01）。5.流式细胞学技术检测结果显示:过表达miR-26a-5p组H/R心肌细胞凋亡率显着低于对照组,miR-26a-5p mimic组的细胞凋亡率为7.54%,mimic control组的细胞凋亡率为20.86%,差异明显;受抑制miR-26a-5p组H/R心肌细胞凋亡率显着高于对照组,miR-26a-5p inhibitor组的细胞凋亡率为35.89%,inhibitor control组的细胞凋亡率为23.25%,差异明显。Western Blot结果显示:过表达miR-26a-5p组H/R心肌细胞中cleaved caspase-3的含量显着低于对照组;受抑制miR-26a-5p组H/R心肌细胞中cleaved caspase-3的含量显着高于对照组（P<0.001）。结论及意义1.与正常对照组相比,miR-26a-5p在缺氧/复氧细胞中的表达明显下降;心肌细胞凋亡率明显升高。2.在缺氧/复氧心肌细胞模型中,miR-26a-5p的过表达可以通过降低心肌细胞凋亡率来减轻心肌缺血再灌注损伤;而miR-26a-5p低表达可以通过增加心肌细胞凋亡来加重心肌缺血再灌注损伤。3.我们的研究结果可能有助于发现心肌缺血再灌注损伤中发生、进展的新机制,有助于开发心肌缺血再灌注损伤新的早期诊断生物标志物或新的治疗手段。第二章miR-26a-5p调控PTEN/PI3K/AKT通路改善心肌缺血再灌注损伤目的miRNA是一类内源性非编码的单链小分子RNA,它通过结合靶基因mRNA的3’非翻译区,降解靶基因或抑制其翻译。miRNA具有功能多样性的特点,研究miRNA的靶基因功能较为复杂,近些年随着TargetScan、miRBase等大型miRNA分析数据库的发展,方便了科学家进行miRNA靶基因预测。我们在第一章的研究结果表明,miR-26a-5p在心肌缺血再灌注细胞中表达下调,且过表达miR-26a-5p可以减轻心肌缺血再灌注损伤,但具体机制尚不明确。本章目的是对miR-26a-5p的靶基因进行预测,研究miR-26a-5p调控心肌缺血再灌注损伤可能的通路机制并进一步验证。方法1.生物信息学分析:利用Targetscan数据库对miR-26a-5p的靶基因进行预测（http://www.targetscan.org/vert72）。2.利用双萤光素酶报告基因检测验证miR-26a-5p与PTEN的3’UTR是否存在互补结合关系。我们构建PTEN野生型和突变型的双萤光报告载体pMIR-REPORTTM-PTEN-WT和pMIR-REPORTTM-PTEN-Mut,分别与 miR-26a-5p 模拟物（miR-26a-5pmimcs）以及阴性对照共同转染心肌细胞,观察各组萤光素酶活性的变化,从而验证PTEN是否是miR-26a-5p的靶基因。3.细胞培养、转染miRNA以及模拟缺氧/复氧模型（H/R）:同第一章。4.细胞实验分组:4.1实验一分组:萤光素酶报告基因检测1.转染 pMIR-REPORTTM-PTEN-WT+miR-26a-5p mimics 组。2.转染 pMIR-REPORTTM-PTEN-WT+miRNA control 组。3.转染 pMIR-REPORTTM-PTEN-Mut+miR-26a-5p mimics 组。4.转染 pMIR-REPORTTM-PTEN-Mut+miRNA control 组4.2实验二分组:1.对照组（Control group）;2.缺氧/复氧组（H/R group）。4.3 实验三分组:1.miRNA control+H/R 组;2.miR-26a-5p mimic+H/R组;3.inhibitor control+H/R 组;4.miR-26a-5p inhibitor+H/R 组。5.qRT-PCR技术检测PTEN基因含量;Western Blot技术检测PTEN/PI3K/AKT蛋白表达量,方法类同第一章。结果1.Targetscan 预测 PTEN 是 miR-26a-5p 的靶基因。2.双萤光素酶报告实验显示与对照组相比,转染了野生型PTEN-3’UTR和miR-26a-5pmimics的萤光素酶活性显着降低（P=0.0003）;而共转染突变型PTEN-3’ UTR和miR-26a-5p mimics组与对照组相比萤光素酶活性无显着性差异（P>0.9999）。结果表明miR-26a-5p可直接与PTEN的3’ UTR作用。3.qRT-PCR检测H/R心肌细胞中PTEN基因含量,结果显示H/R组PTEN基因含量明显高于正常对照组（P=0.0038）。Western Blot检测H/R心肌细胞中PTEN蛋白表达含量,结果显示H/R组PTEN蛋白表达含量明显高于对照组（P=0.0001）。4.通过心肌细胞转染,分别构建过表达miR-26a-5p组、敲低miR-26a-5p组以及相应对照组,Western Blot检测显示过表达miR-26a-5p显着下调了 PTEN的蛋白表达水平,同时显着提高了 PI3K和AKT的表达水平;相反的,敲低miR-26a-5p显着上调了 PTEN的蛋白表达水平,同时显着降低了 PI3K和AKT的表达水平（P<0.001）。结论及意义1.在心肌缺血再灌注过程中,PTEN是miR-26a-5p的靶基因。2.过表达miR-26a-5p可以通过与PTEN的3’UTR结合而负性调控PTEN蛋白表达,PTEN受抑制后反向激活PI3K/AKT通路,达到抗心肌细胞凋亡目的,从而改善心肌缺血再灌注损伤。3.通过研究miR-26a-5p具体调控机制有助于我们更深入的理解缺血再灌注损伤的机制,有助于开发心肌缺血再灌注损伤新的药物或非药物治疗手段。第三章miR-26a-5p在缺血再灌注小鼠心肌组织中的表达及其调控机制目的在之前的研究中,我们通过体外实验建立心肌细胞缺氧/复氧（H/R）模型,发现H/R组心肌细胞凋亡率增高,miR-26a-5p在H/R组心肌细胞中表达下降,过表达miR-26a-5p减轻了心肌细胞缺血再灌注损伤。同时发现PTEN是miR-26a-5p的靶基因,miR-26a-5p通过PTEN/PI3K/AKT通路改善心肌缺血再灌注损伤。在这一章中,在小鼠体内心脏实验中,我们进一步验证miR-26a-5p对心肌缺血再灌注损伤是否会有相同的影响。方法1.缺血再灌注损伤小鼠模型的建立:C57BL/6小鼠麻醉后取仰卧位,气管插管后连接动物呼吸机,小鼠四肢通过电极连接到心电图仪。碘伏消毒胸前区后,第三和第四肋间行开胸手术。在左冠状动脉前降支距离左心耳下缘1-2mm处对冠状动脉左前降支进行结扎,发现明显的ST段抬高时表示结扎成功,阻断血流后30分钟,缝合线被释放,冠状动脉重新恢复血流,小鼠心肌缺血再灌注模型建立成功。在假手术组中,缝线只穿过小鼠的心脏,不进行结扎。2.小鼠心肌转染:构建腺相关病毒AAV9-miRNA载体,8周龄C57BL/6小鼠随机分组后,通过尾静脉注射AAV9-miRNA-26a-5p或AAV9-control构建转染模型。3.动物实验分组3.1实验一分组:1.假手术组（Shamgroup）;2.缺血再灌注损伤组（I/R group）。3.2 实验二分组:1.miRNA control+I/R 组;2.miR-26a-5pmimic+I/R组;3.inhibitor control+I/R 组;4.miR-26a-5p inhibitor+I/R 组。4.TTC-Evans blue双染法检测各组小鼠心肌梗死面积。5.流式细胞学技术测定动物实验中各组小鼠心肌细胞凋亡率。6.实时萤光定量PCR检测各组小鼠心肌组织中miR-26a-5p、PTEN含量。7.Western Blot 实验检测 cleaved caspase-3、PTEN、PI3K、AKT 的表达。结果1.Evans blue/TTC染色观察I/R组小鼠的心肌梗死面积大于对照组（P=0.0058）。流式细胞学技术显示I/R组小鼠心肌组织中心肌细胞凋亡率明显高于对照组,I/R组小鼠心肌细胞的凋亡率是40.24%,对照组心肌细胞凋亡率为8.83%,差异明显。Wesetern Blot检测显示I/R组小鼠心肌cleaved caspase-3蛋白含量明显高于对照组（P=0.0015）。2.qRT-PCR方法检测结果显示I/R组小鼠心肌细胞中miR-26a-5p的表达量显着低于正常对照组（P<0.0001）。3.qRT-PCR的方法检测各组转染小鼠心肌中miR-26a-5p的表达,结果显示转染miR-26a-5p mimic小鼠心肌中miR-26a-5p的水平明显升高;而转染miR-26a-5p inhibitor 小鼠心肌中 miR-26a-5p 含量明显降低（P<0.01）。Evans blue/TTC染色观察发现过表达miR-26a-5p显着减少了小鼠心肌I/R后梗死面积,受抑制miR-26a-5p组小鼠心肌I/R后梗死面积显着大于对照组（P<0.05）。4.qRT-PCR检测发现I/R组小鼠心肌PTEN基因含量明显高于正常对照组（P=0.0080）。Western Blot检测结果显示I/R组心肌组织中PTEN蛋白表达含量明显高于对照组（P<0.0001）。5.Western Blot检测显示在小鼠I/R损伤模型中,与对照组相比,过表达miR-26a-5p显着下调了 PTEN的蛋白表达水平,同时显着提高了 PI3K和AKT的蛋白表达水平;相反的,抑制miR-26a-5p组显着上调了 PTEN的蛋白表达水平,同时显着降低了 PI3K和AKT的蛋白表达水平,组间差异具有统计学意义（P<0.001）。结论及意义1.与正常对照相比,缺血再灌注小鼠模型中,心肌细胞凋亡和cleaved caspase-3表达量升高,缺血再灌注组织中miR-26a-5p的表达明显下降;miR-26a-5p的过表达减轻了心肌缺血再灌注损伤;而miR-26a-5p低表达可以增加心肌凋亡来加重心肌缺血再灌注损伤。2.体内实验进一步验证了缺血再灌注组织中PTEN基因及蛋白表达量明显升高,PTEN 是 miR-26a-5p 的靶基因;miR-26a-5p 可以通过 PTEN/PI3K/AKT 通路调控心肌缺血再灌注损伤。3.我们体内实验的研究结果进一步验证miR-26a-5p对心肌缺血再灌注损伤的调控作用和机制,为开发心肌缺血再灌注损伤新的早期诊断生物标志物或新的治疗手段提供实验基础。
陈玲玲,冯珊珊,范祖森,龚畅,刘本宇,刘子豪,李传伟,宋尔卫,孙树汉,吴庚泽,吴煌,吴缅,许光,袁继行,曾春雨,朱友明[9]（2019）在《非编码RNA研究进展》文中研究指明非编码RNA是指不具备蛋白质编码能力的RNA,包括转运RNA、核糖体RNA、小核仁RNA（small nucleolar RNA, snoRNA）以及长非编码RNA（long noncoding RNA, lncRNA）等.非编码RNA广泛参与生命活动中重要的生物功能,如生物个体的发育与分化、生殖、细胞凋亡和细胞重编程等,并且与人类疾病密切相关.近年来,随着我国经济的发展和人口老龄化,心血管疾病、肿瘤、代谢性疾病等疾病已成为威胁中国居民健康的重大慢性非传染性疾病,一些罕见病,例如小胖威利综合征（Prader-Willi syndrome, PWS）也随着人口基数的不断增大逐渐影响我国居民的身体健康.随着对这些慢性疾病及罕见疾病发生发展的相关机制研究,我国科学家发现非编码RNA与这些疾病密切相关.非编码RNA参与调控一系列的心血管疾病、肿瘤、代谢性疾病、感染免疫性疾病和PWS等疾病过程.本文对我国学者在非编码RNA领域的贡献进行综述,详细阐述了非编码RNA的加工形成和功能研究等主要进展,并对探究这些非编码RNA与PWS、心血管疾病、肿瘤、代谢性疾病和感染免疫性疾病等发生发展中的重要调控作用,以及我国科学家对该领域的贡献进行了详细的综述和总结.
马健勇[10]（2017）在《孕酮调控心肌细胞钙循环及抵抗双酚A致心律失常的机制研究》文中提出第一部分孕激素膜受体mPRs在孕酮调控心肌细胞钙循环中的作用与机理研究研究背景心血管疾病是当今威胁女性健康和死亡的主要疾病,是导致中国女性死亡的主要原因之一。近年来研究显示,性激素在女性心血管疾病发生、发展以及预后中起着重要作用。尽管内源性雌激素的潜在心血管保护作用己被众多研究所证实,如舒张血管等,然而对于天然孕激素-孕酮（progesterone,P4）及其受体在心血管系统中作用的认识多基于一些雌激素相关联的研究。迄今为止,P4与心血管系统直接关联的研究甚少。有研究显示,P4对心血管系统具有潜在的保护作用,包括扩张血管,降低血压,保护心肌缺血再灌住损伤等。然而P4作用于心血管系统的具体机制尚还不清楚。因此,直接阐明P4对心血管系统的潜在影响及作用机制将有益于充分理解女性激素在心血管疾病发生及发展过程中的作用,同时有望为绝经期女性心血管疾病防治提供一定的理论依据。传统观点认为,P4通过与孕激素核受体（nuclear progesterone receptor,nPR）结合,募集相关转录因子与孕激素反应原件相结合启动靶细胞内基因转录,从而发挥其生物学效应。区别于这一经典的基因机制,近年来,P4的另一种作用途径“非基因组机制”引起了广泛关注,这一机制不依赖于基因转录或蛋白合成,而是通过激活膜表面信号转导途径实现。越来越多的证据显示,非基因组机制在P4介导的效应中扮演重要的角色。然而介导P4非基因组作用的受体及机制尚不完全清楚。孕激素膜受体（membrane progesterone receptors,mPRs）是近些年发现并确立的一类新型孕激素受体。越来越多的研究表明,mPRs广泛存在于包括人在内的许多脊椎动物中,且能独立介导P4的快速非基因组作用。研究显示,P4通过mPRs促进人类血管内皮细胞NO生成。然而mPRs在P4调节心脏生理功能中的作用目前尚不清楚。众所周知,心肌细胞钙循环的稳定是心脏发挥正常生理功能的基础。近期文献报道,慢性P4暴露能明显缩短兔子心肌细胞钙离子重吸收时程及衰减时间。提示P4对心肌细胞钙循环具有重要的调节作用。因此,深入研究mPRs在心肌细胞钙循环中的作用具有重要科学意义。目的本研究试图探索孕激素膜受体mPRs亚型在心脏组织中的表达情况,同时明确mPRs在心肌细胞中的定位。揭示mPRs在P4调控心肌细胞钙循环中的作用,同时深入探究可能的分子信号机制。方法本研究以成年雌性SD大鼠为研究对象:1.利用RT-PCR和Western blot检测雌性大鼠心脏组织mPRs mRNA和蛋白的表达水平;2.应用免疫荧光技术观察mPRs在雌性大鼠心肌细胞上的定位;3.以离体雌性大鼠心肌细胞为模型,分为以下各组:正常对照组,P4组,mPRs激动剂（Org-OD）组,P4+mPRs抑制剂（PTX）组,Org-OD+PTX组,以及其他干预组进行如下研究:（1）利用钙离子成像、共聚焦显微成像、膜片钳及ELISA等技术对各组心肌细胞的钙瞬变、肌浆网（sarcoplasmic reticulum,SR）钙火花和钙负荷、L型钙电流、以及环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate,cAMP）等指标进行检测与比较,探究mPRs在P4调控心肌细胞钙循环中的作用。（2）运用Western-blot技术对各组心肌细胞兰尼碱受体（ryanodine receptor,RyR）及受磷蛋白（phospholamban,PLN）磷酸位点、钙调蛋白依赖蛋白激酶Ⅱ（calcium/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ,CAMKⅡ）、内皮型一氧化氮合成酶（endothelial nitric oxide synthase,eNOS）以及Akt等的磷酸化水平进行检测,进一步揭示mPRs介导P4作用的分子信号机制。结果1.mPRs mRNA和蛋白在雌性大鼠心脏组织中的表达:以大鼠卵巢组织为阳性对照,雌性大鼠左心室心肌组织中mPRα、mPRβ及mPRγ的mRNA和蛋白均呈阳性表达。与左心室相比,左右心房的mPRs mRNA水平均显着增加。2.mPRs蛋白在雌性大鼠心肌细胞中的定位:各mPRs抗体孵育的心肌细胞膜上均可观察到明显的绿色荧光信号。加入特异性mPRs阻断多肽共孵育后心肌细胞膜原有的绿色荧光信号消失。提示三种mPRs亚型均定位于雌性大鼠心肌细胞膜。3.mPRs介导P4增加雌性大鼠心肌细胞钙瞬变水平:10 nM P4急性处理15min后不仅心肌细胞钙瞬变幅度显着增加,而且钙瞬变衰减时程明显缩短。这些P4效应均被非透膜性偶联牛血清蛋白孕酮（membrane-impermeable BSA conjugated progesterone,P4-BSA）和 mPRs 特异性激动剂 Org-OD 完全模拟。同时,P4与Org-OD的钙瞬变效应均被抑制性G蛋白（Gi）抑制剂PTX阻断,但不能被核受体（nPR）特异性拮抗剂RU486阻断。4.mPRs介导P4增加雌性大鼠心肌细胞SR钙负荷水平:与正常对照组相比,P4组和Org-OD组咖啡因诱导的钙瞬变峰值显着升高,而P4与Org-OD的这一效应均能被PTX阻断。各组心肌细胞咖啡因诱导的钙瞬变衰减时程比较无统计学意义。5.mPRs介导P4促进雌性大鼠心肌细胞SR钙释放:与正常对照组相比,P4组和Org-OD组心肌细胞的钙火花频率均显着增加。PTX预处理后,P4与Org-OD诱导的上述效应均消失。各组心肌细胞钙火花振幅比较无显着差异。6.P4暴不影响雌性大鼠心肌细胞的L型钙电流:与正常对照组比较,P4组心肌细胞L型钙电流强度无明显改变。7.mPRs介导P4增加雌性大鼠心肌细胞SR钙转运蛋白RyR和PLN磷酸位点的磷酸化水平:与正常对照组比较,P4组和Org-OD组CAMKⅡ位点RyR2814及PLN17的磷酸化水平均显着增加。而它们的PKA位点RyR2808及PLN16的磷酸化水平与正常对照组相比均无明显差异。P4与Org-OD诱导的CAMKⅡ磷酸位点的磷酸化效应均能被PTX阻断。进一步实验显示,RyR2814及PLN17的磷酸化水平均随着Org-OD暴露时间延长呈现先升高后回到基线水平改变,于暴露15min后达到峰值。8.P4和Org-OD对雌性大鼠心肌细胞内cAMP水平的影响:与正常对照组比较,P4组心肌细胞cAMP水平无统计差异。相反,Org-OD组心肌细胞cAMP水平显着降低,且这一效应被PTX有效阻断。9.P4诱导的雌性大鼠心肌细胞钙循环改变依赖于CAMKⅡ活化:相比正常对照组,P4和Org-OD引起的R2814及PLN17磷酸化增加均被CAMKⅡ抑制剂AIP明显抑制。同样,P4和Org-OD诱导的钙瞬变增强效应及钙火花频率增加均被AIP所逆转。10.IP3/IP3R信号通路不参与mPRs诱导的CAMKⅡ活化:P4诱导的RyR2814及PLN17磷酸化增加不能被IP3R特异性阻断剂Xestospongin C抑制。11.PI3K/Akt/eNOS信号通路参与mPRs介导的信号转导:eNOS抑制剂L-NAME及PI3K阻断剂Wortmannin均明显抑制P4与Org-OD诱导的心肌细胞RyR2814及PLN17磷酸化增加。进一步实验显示,P4与Org-OD均明显增加心肌细胞CAMKⅡ及eNOS的磷酸化水平,而二者诱导的CAMKⅡ磷酸化增加均被L-NAME和Wortmannin阻断。同时它们诱导的eNOS磷酸化增加均被Wortmannin阻断。此外,P4与Org-OD暴露后心肌细胞Akt磷酸化水平均明显增加,而二者诱导的这一效应均能被PTX阻断。12.PI3K/Akt/eNOS信号通路介导mPRs诱导的雌性大鼠心肌细胞钙循环改变:与正常对照组比较,Wortmannin与L-NAME不仅完全阻断P4及Org-OD诱导的心肌细胞钙瞬变幅度升高,而且明显抑制它们诱导的钙火花频率增加。结论1.首次证实mPRs三种亚型mPRα、mPRβ以及mPRγ均在雌性大鼠心脏组织中表达,且均定位于心肌细胞膜。2.首次报道mPRs参与介导P4对雌性大鼠心肌细胞钙循环的快速调节作用。3.P4通过mPRs激活下游PI3K/Akt/eNOS信号通路,诱导CAMKⅡ位点RyR2814和PLN17磷酸化,导致SR钙重吸收及钙释放增加,从而增强雌性大鼠心肌细胞的钙瞬变水平。第二部分孕酮对双酚A促雌性大鼠心律失常发生的影响及其机制探讨研究背景双酚A（bisphenol A,BPA）是一种典型的环境雌激素干扰化合物,主要用于制作聚碳酸酯、环氧树脂等高分子材料。近年来,由于BPA制品在人们日常生活中的广泛使用,其安全性引起了国内外专家学者们的高度关注。大量研究表明,BPA通过其雌激素干扰效应对机体产生多种毒性作用,包括大脑发育和行为异常,胎儿生长发育不良,以及生殖和免疫系统紊乱等。值得注意的是,越来越多的研究发现,BPA对心血管系统也具有毒性作用。我们最近的研究表明,BPA急性暴露具有促雌性大鼠心律失常发生作用。可见,BPA对心脏的潜在危害不容忽视。研究发现,内源性类固醇激素能影响外源性雌激素干扰物的生物学效应。在多种细胞类型/系统中的研究显示,内源性雌二醇能加强或减轻BPA诱导的效应。我们前期研究也发现,生理浓度雌二醇能增强BPA的促雌性大鼠心律失常发生作用。鉴于此,许多学者认为评估外源性雌激素干扰物对机体的真实生物效应应该置于机体内源性激素背景下进行研究。众所周知,P4能协同/拮抗雌激素的效应参与调节生殖系统许多重要过程。事实上,P4与内源性雌激素的相互作用也普遍存在于其他的生理系统包括心血管系统。然而,P4与外源性雌激素干扰物BPA的相互作用尚未见相关报道。是否P4能阻断BPA的心脏毒性特别是其促心律失常发生作用尚有待于进一步研究。目的我们前期研究发现,BPA急性暴露具有促雌性大鼠心律失常发生作用。本研究进一步探究P4对BPA致雌性大鼠心律失常作用的潜在影响及其可能机制。方法本研究以离体成年雌性大鼠心肌细胞为研究对象:1.利用视频边缘检测技术和共聚焦显微成像技术分别检测心肌细胞触发活动指标after-contraction和after-transient发生率,观察P4对BPA诱导的心肌细胞触发活动的影响。2.应用钙离子成像技术和共聚焦显微成像技术分别检测心肌细胞咖啡因诱导的钙瞬变和肌浆网（sarcoplasmic reticulum,SR）钙火花水平,同时通过Western blot技术检测SR钙转运蛋白RyR及PLN磷酸位点,以及Akt的磷酸化与总蛋白水平,探讨P4作用的可能机制。结果1.1 nMP4快速抑制BPA诱导的雌性大鼠心肌细胞触发活动:环境相关剂量（1 nM）BPA暴露后显着增加心肌细胞after-contraction及after-transient发生率。联合P4处理后,BPA诱导的这些心肌细胞触发活动被显着抑制。P4的这一抑制作用被特异性nPR阻断剂RU486阻断。2.P4抑制BPA诱导的雌性大鼠心肌细胞钙循环紊乱:（1）P4抑制BPA诱导的雌性大鼠心肌细胞SR钙负荷增加:BPA暴露后心肌细胞咖啡因诱导的钙瞬变峰值显着增加,而联合P4处理后,BPA引起的心肌细胞咖啡因诱导的钙瞬变峰值增加被显着抑制。P4的这一抑制作用被RU486阻断。（2）P4抑制BPA诱导的雌性大鼠心肌细胞SR钙离子漏:BPA暴露后心肌细胞钙火花频率显着增加,而联合P4处理后,BPA诱导的钙火花频率增加被明显抑制。P4的这一抑制作用也被RU486阻断。3.P4抑制BPA增加的PLN17磷酸化水平:BPA暴露显着增加心肌细胞RyR2808和PLN17的磷酸化水平,联合P4处理后,BPA诱导的PLN17磷酸化被明显抑制,而其诱导的RyR2808磷酸化未受影响。RU486阻断了 P4的这一抑制作用。4.P4对BPA的快速抑制作用通过依赖nPR的膜表面信号介导:与P4的抑制效应一致,非透膜性偶联牛血清蛋白孕酮（P4-BSA）明显抑制BPA诱导的心肌细胞触发活动、钙火花频率增加、以及PLN17磷酸化。P4-BSA的这些抑制效应均被RU486阻断。5.P4对BPA的抑制作用不依赖于cSrc激活:以PLN17磷酸化水平及心肌细胞after-contraction发生率作为评价指标,cSrc抑制剂PP2预处理不能阻断P4对BPA诱导的PLN17磷酸化及触发活动的抑制作用。6.抑制性G蛋白（inhibitory G protein,Gi）参与P4对BPA的抑制作用:以PLN17磷酸化水平及心肌细胞after-contraction发生率作为评价指标,Gi蛋白抑制剂PTX预处理完全解除P4对BPA诱导的PLN17磷酸化及触发活动的抑制作用。7.nPR-Gi-PI3K信号通路参与介导P4对BPA促雌性大鼠心律失常发生的抑制作用:以PLN17磷酸化水平及心肌细胞after-contraction发生率作为评价指标,PI3K抑制剂Wortmannin预处理完全阻断P4对BPA诱导的PLN17磷酸化及触发活动的抑制作用。进一步利用检测Akt的磷酸化水平显示,与正常对照组比较,P4组心肌细胞Akt磷酸化水平显着增加,而P4的这一效应能被RU486或PTX阻断。结论1.在离体雌性大鼠心肌细胞模型下,首次报道生理相关剂量P4对BPA促雌性大鼠心律失常发生具有保护作用。2.P4通过激活nPR-Gi-PI3K膜信号通路,阻断BPA诱导的PLN17磷酸化及SR钙转运紊乱,从而抑制BPA诱导的心肌细胞自发性触发活动。
二、环—磷酸腺苷在心血管活动调节和一些心血管疾病过程中的作用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、环—磷酸腺苷在心血管活动调节和一些心血管疾病过程中的作用（论文提纲范文）
（1）冠心病合理用药指南（第2版）（论文提纲范文）
| 循证医学相关方法说明 |
| 1 冠心病概述 |
| 1.1 冠心病的定义 |
| 1.2 冠心病的解剖及病理生理学机制 |
| 1.3 冠心病的临床分型 |
| 1.3.1慢性心肌缺血综合征 |
| 1.3.1.1隐匿型冠心病 |
| 1.3.1.2稳定型心绞痛 |
| 1.3.1.3缺血性心肌病 |
| 1.3.2 急性冠状动脉综合征 |
| 1.3.2. 1 ST段抬高型心肌梗死 |
| 1.3.2. 2 不稳定型心绞痛 |
| 1.3.2. 3 非ST段抬高型心肌梗死 |
| 1.4 冠心病的流行病学 |
| 1.4.1 国际冠心病流行情况 |
| 1.4.2 我国冠心病流行情况 |
| 1.5 冠心病危险因素及预防 |
| 2 冠心病用药分类 |
| 2.1 改善缺血、减轻症状的药物 |
| 2.1.1 β受体阻滞剂 |
| 2.1.2 硝酸酯类药物 |
| 2.1.3 钙通道阻滞剂 |
| 2.1.4 其他治疗药物 |
| 2.1.5 减轻症状、改善缺血的药物治疗建议 |
| 2.2 预防心肌梗死, 改善预后的药物 |
| 2.2.1 阿司匹林 |
| 2.2.2 氯吡格雷 |
| 2.2.3 替格瑞洛 |
| 2.2.4抗凝药物 |
| 2.2.5 β受体阻滞剂 |
| 2.2.6 他汀类药物 |
| 2.2.7 血管紧张素转化酶抑制剂或血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂 |
| 2.2.8 改善预后的药物治疗建议 |
| 2.3 用于冠心病的相关中成药 |
| 3 急性冠状动脉综合征 |
| 3.1 急性冠状动脉综合征的概念 |
| 3.2 急性冠状动脉综合征的诊断和鉴别诊断 |
| 3.2.1 诊断 |
| 3.2.2 鉴别诊断 |
| 3.3 急性冠状动脉综合征的危险分层 |
| 3.3.1 低危患者 |
| 3.3.2 中危患者 |
| 3.3.3 高危患者 |
| 3.4 急性冠状动脉综合征的治疗策略 |
| 3.4.1 治疗原则和目标 |
| 3.4.2 ST段抬高型心肌梗死的治疗 |
| 3.4.2. 1 住院后初始处理 |
| 3.4.2. 2 溶栓治疗 |
| 3.4.2. 3 抗栓治疗 |
| 3.5 调脂治疗 |
| 3.6 其他治疗 (表3-5) |
| 3.7不稳定型心绞痛及非ST段抬高型急性冠状动脉综合征的治疗 |
| 3.7.1 一般治疗 |
| 3.7.2 抗缺血治疗 (表3-7) |
| 3.7.3 抗血小板治疗 (图3-8) |
| 3.7.4 抗凝治疗 (表3-11, 表3-12, 表3-13) |
| 4 稳定型冠状动脉疾病 |
| 4.1 概述 |
| 4.2 慢性稳定型心绞痛的诊断与鉴别诊断 |
| 4.3 慢性稳定型心绞痛的病情评估 |
| 4.3.1 临床评估 |
| 4.3.2 负荷试验 |
| 4.3.3 左心室功能 |
| 4.3.4 单电子发射CT成像 |
| 4.3.5 冠状动脉CT血管造影 |
| 4.3.6 冠状动脉造影 |
| 4.4 慢性稳定型心绞痛的治疗原则 |
| 4.4.1 建议健康的生活方式 |
| 4.4.2 循证药物治疗 |
| 4.4.3 血运重建 |
| 4.5 药物的选择和合理使用 |
| 4.5.1缓解心绞痛/心肌缺血治疗的药物 |
| 4.5.2 预防危险事件治疗的药物 |
| 5 微血管性心绞痛 |
| 5.1 微血管性心绞痛的定义 |
| 5.2 微血管性心绞痛的病因与机制 |
| 5.2.1内皮功能不全及冠状动脉微循环障碍 |
| 5.2.2 炎性因子 |
| 5.2.3 心脏自主神经系统失调 |
| 5.2.4 雌激素水平紊乱 |
| 5.2.5冠状动脉慢血流综合征 |
| 5.2.6 神经内分泌及代谢因素 |
| 5.3微血管性心绞痛的临床表现 |
| 5.4 微血管性心绞痛的诊断及鉴别诊断 |
| 5.5 微血管性心绞痛的药物治疗 |
| 5.5.1 β受体阻滞剂 |
| 5.5.2 硝酸酯类药物 |
| 5.5.3 血管紧张素转化酶抑制剂 |
| 5.5.4他汀类药物 |
| 5.5.5 尼可地尔 |
| 5.5.6 钙通道阻滞剂 |
| 5.5.7 其他药物 |
| 5.5.8 中成药 |
| 5.6微血管性心绞痛的非药物治疗手段 |
| 6 无症状性心肌缺血 |
| 6.1 无症状性心肌缺血的定义 |
| 6.1.1完全无症状性心肌缺血 |
| 6.1.2 心肌梗死后的无症状性心肌缺血 |
| 6.1.3心绞痛伴无症状性心肌缺血 |
| 6.2 无症状性心肌缺血的可能机制 |
| 6.2.1 血浆内啡肽升高 |
| 6.2.2 致痛物质未达到痛阈 |
| 6.2.3 疼痛信号神经的改变对心绞痛的影响 |
| 6.3 无症状性心肌缺血的诊断 |
| 6.3.1 动态心电图 |
| 6.3.2心电图运动试验 |
| 6.3.3 负荷超声心动图 |
| 6.3.4 核素心肌灌注显像 |
| 6.4 无症状性心肌缺血的预防及治疗 |
| 6.4.1 预防 |
| 6.4.2 治疗 |
| 7 冠心病特殊合并症 |
| 7.1 冠心病合并高血压 |
| 7.1.1 概述 |
| 7.1.2 降压治疗原则 |
| 7.1.3 降压治疗的启动 |
| 7.1.4 血压目标管理 |
| 7.1.5 药物推荐 |
| 7.1.6 药物使用注意事项 |
| 7.2 冠心病合并心力衰竭 |
| 7.2.1 概述 |
| 7.2.2 冠心病合并急性心力衰竭 |
| 7.2.2. 1 发病机制 |
| 7.2.2. 2 诊断及评估 |
| 7.2.2. 3 药物治疗 |
| 7.2.3 冠心病合并慢性心力衰竭 |
| 7.2.3. 1 发病机制 |
| 7.2.3. 2 诊断及评估 |
| 7.2.3. 3 药物治疗 |
| 7.3 冠心病合并心房颤动 |
| 7.3.1 风险评估是平衡冠心病合并心房颤动患者血栓和出血风险的前提 |
| 7.3.2 规范抗栓是平衡冠心病合并心房颤动患者血栓和出血风险的关键 |
| 7.3.2. 1《2014年欧洲非瓣膜性心房颤动合并急性冠状动脉综合征和 (或) 接受经皮冠脉/瓣膜介入治疗联合共识》相关推荐 (表7-14) 。 |
| 7.3.2. 2《2016年ESC心房颤动管理指南》相关推荐 (表7-15, 图7-2, 图7-3) |
| 7.3.2. 3《老年人非瓣膜性心房颤动诊治中国专家建议 (2016) 》相关推荐 |
| 7.3.2. 4 华法林及新型口服抗凝药的应用 |
| 7.3.2. 5 双联抗血小板治疗联合口服抗凝药物出血管理 |
| 7.4 冠心病合并瓣膜性心脏病 |
| 7.4.1 概述 |
| 7.4.2 一般药物治疗 |
| 7.4.2. 1 主动脉瓣反流 |
| 7.4.2. 2 主动脉瓣狭窄 |
| 7.4.2. 3 二尖瓣反流 |
| 7.4.2. 4 二尖瓣狭窄 |
| 7.4.2. 5 三尖瓣反流 |
| 7.4.2. 6 三尖瓣狭窄 |
| 7.4.3 抗凝治疗 |
| 7.4.3. 1 瓣膜病合并心房颤动 |
| 7.4.3. 2 瓣膜置换术后 |
| 7.5 冠心病与脑卒中 |
| 7.5.1 概述 |
| 7.5.2 冠心病合并脑卒中的抗栓治疗原则 |
| 7.5.2. 1 冠心病合并出血性脑卒中 |
| 7.5.2. 1. 1 抗栓药物致颅内出血的机制:颅内出血 |
| 7.5.2. 1. 2 抗栓治疗的出血风险评估:对于ACS患 |
| 7.5.2. 1. 4 冠心病患者缺血相关评估及意义:当颅 |
| 7.5.2. 2 冠心病合并缺血性脑卒中/短暂性脑缺血发作 |
| 7.5.3 具体治疗方案 |
| 7.5.3. 1 抗血小板治疗抗血小板治疗是冠心病和缺血性脑卒中治疗的基石。 |
| 7.5.3. 3 他汀类药物调脂治疗 |
| 7.5.3. 4 其他 |
| 7.6 冠心病合并肺栓塞 |
| 7.6.1 概述 |
| 7.6.2 稳定性冠心病合并急性肺栓塞 |
| 7.6.2. 1 抗凝治疗 |
| 7.6.2. 2 溶栓治疗 |
| 7.6.2. 3 临床常用溶栓药物及用法 |
| 7.6.3 急性冠状动脉综合征合并急性肺栓塞 |
| 7.7 冠心病合并慢性阻塞性肺疾病 |
| 7.7.1 概述 |
| 7.7.2 慢性阻塞性肺疾病影响冠心病的发病机制 |
| 7.7.3 冠心病合并慢性阻塞性肺疾病的药物治疗 |
| 7.7.3. 1 β2受体激动剂 |
| 7.7.3. 2 β受体阻滞剂 |
| 7.8 冠心病合并消化道出血 |
| 7.8.1 概述 |
| 7.8.2 抗血小板药物与质子泵抑制剂联用 |
| 7.8.2. 1 抗血小板药物损伤消化道机制 |
| 7.8.2. 2 质子泵抑制剂 |
| 7.8.3 消化道出血风险评估与预防策略 |
| 7.8.4 消化道出血的处理 |
| 7.8.4. 1 停用抗血小板药物 |
| 7.8.4. 3 内镜止血治疗 |
| 7.8.5 止血后治疗药物选择 |
| 7.9 冠心病合并肝功能障碍 |
| 7.9.1 概述 |
| 7.9.2 常用的肝功能评价指标 |
| 7.9.3 肝功能障碍患者的药物代谢动力学改变 |
| 7.9.4 肝功能障碍患者的用药原则 |
| 7.9.6 他汀类药物在合并肝功能障碍患者中的应用 |
| 7.9.7 他汀类药物所致肝功能异常的预防 |
| 7.9.8 他汀类药物所致肝损害的治疗 |
| 7.1 0 冠心病合并慢性肾脏疾病 |
| 7.1 0. 1 概述 |
| 7.1 0. 2 慢性肾脏病的定义和分期 |
| 7.1 0.2.1 定义 |
| 7.1 0.2.2 分期 |
| 7.1 0. 3 合并冠心病患者的合理药物治疗 |
| 7.1 0.3.1 抗栓药物治疗 |
| 7.1 0.3.1. 1 溶栓治疗:尽管直接PCI是STEMI患 |
| 7.1 0.3.1. 2 抗凝治疗 |
| 7.1 0.3.1. 3 抗血小板治疗 |
| 7.1 0.3.2 他汀类药物 |
| 7.1 0.3.3 抗缺血治疗 |
| 7.1 1 冠心病合并糖尿病 |
| 7.1 1. 1 概述 |
| 7.1 1. 4 诊断 |
| 7.1 1. 5 治疗 |
| 7.1 1.5.1 一般治疗 |
| 7.1 1.5.2 抗缺血治疗 |
| 7.1 1.5.3 调脂治疗 |
| 7.1 1.5.4 β受体阻滞剂 |
| 7.1 1.5.5 硝酸酯类药物 |
| 7.1 1.5.6 血管紧张素转化酶抑制剂和血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂 |
| 7.1 2 冠心病合并甲状腺疾病 |
| 7.1 2. 1 概述 |
| 7.1 2. 2 冠心病合并临床和亚临床甲状腺功能亢进7.1 2.2.1 |
| 7.1 2.2.2 诊断 |
| 7.1 2.2.3 治疗 |
| 7.1 2. 3 冠心病合并临床和亚临床甲状腺功能减退7.1 2.3.1 |
| 7.1 2.3.2 诊断 |
| 7.1 2.3.3 治疗 |
| 7.1 2.3.4 特殊情况管理推荐 |
| 7.1 3 冠心病合并风湿免疫疾病 |
| 7.1 3. 1 概述 |
| 7.1 4 冠心病合并外科手术 |
| 7.1 4. 1 概述 |
| 7.1 4. 2 药物选择 |
| 7.1 4.2.1 β受体阻滞剂 |
| 7.1 4.2.2 他汀类药物 |
| 7.1 4.2.3 血管紧张素转化酶抑制剂或血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂 |
| 7.1 4.2.4 硝酸酯类药物 |
| 7.1 4.2.5 抗血小板药物 |
| 7.1 4.2.6 抗凝药物 |
| 7.1 4.2.7 钙通道阻滞剂 |
| 7.1 4.2.8 α2受体激动剂 |
| 7.1 4. 3 注意事项 |
| 7.1 4.3.1 β受体阻滞剂 |
| 7.1 4.3.2 他汀类药物 |
| 7.1 4.3.3 血管紧张素转化酶抑制剂 |
| 7.1 4.3.4 硝酸酯类药物 |
| 7.1 4.3.5 抗血小板、抗凝药物 |
| 7.1 5 冠心病合并外周动脉粥样硬化疾病 |
| 7.1 5. 1 概述 |
| 7.1 5. 1 诊断与鉴别诊断 |
| 7.1 5.1.1 冠心病诊断方法见本书相关章节。 |
| 7.1 5.1.2 外周动脉疾病诊断方法 (图7-11) |
| 7.1 5. 3 冠心病合并外周动脉疾病患者治疗 |
| 7.1 5.3.1 降低心血管风险的治疗 (表7-40) |
| 7.1 5.3.2 缓解症状的治疗 (表7-41) |
| 8 冠心病特殊类型 |
| 8.1 川崎病所致冠状动脉病变 |
| 8.1.1 概述 |
| 8.1.2 临床诊断 |
| 8.1.2. 1 川崎病合并冠状动脉损害的诊断 |
| 8.1.2. 2 美国心脏协会制定的冠状动脉瘤分类 |
| 8.1.3. 1 阿司匹林 |
| 8.1.3. 2 大剂量静脉注射用丙种球蛋白 |
| 8.1.3. 3 冠状动脉瘤的治疗主要采用抗凝及溶栓治疗。 |
| 8.1.3. 4 冠状动脉狭窄的治疗 |
| 8.1.3. 5 其他药物 |
| 8.1.4 预后及随访 |
| 8.2 家族性高胆固醇血症所致冠心病 |
| 8.2.1 概述 |
| 8.2.2 筛查 |
| 8.2.3 诊断 |
| 8.2.4 调脂药物治疗 |
| 8.2.4. 1 调脂治疗原则FH目前尚不能在精准诊 |
| 8.2.4. 3 调脂药物治疗目标 |
| 8.2.4. 4 调脂药物种类及选择 (表8-2) |
| 8.2.4. 5 联合治疗 |
| 8.3 非粥样硬化性冠心病 |
| 8.3.1 冠状动脉痉挛 |
| 8.3.1. 1 概述 |
| 8.3.1. 2 药物治疗策略 |
| 8.3.2 冠状动脉肌桥 |
| 8.3.2. 1 概述 |
| 8.3.2. 2 药物治疗策略 |
| 8.3.3 自发性冠状动脉夹层 |
| 8.3.3. 1 概述 |
| 8.3.3. 2 药物治疗策略 |
| 9 冠心病相关中成药治疗 |
| 9.1 中医分型及用药 |
| 9.1.1 心血瘀阻 |
| 9.1.2 痰浊内阻 |
| 9.1.3 气滞血瘀 |
| 9.1.4 气虚血瘀 |
| 9.1.5 寒凝血瘀 |
| 9.1.6 瘀热互结 |
| 9.1.7 气阴两虚 |
| 9.1.8 心肾阳虚 |
| 9.1.9 心肾阴虚 |
| 9.2 中药的现代医学作用机制 |
| 9.2.1 抗血小板作用 |
| 9.2.3 改善冠状动脉血管内皮功能、改善微循环的作用 |
| 9.2.4 抗氧化及炎性反应作用 |
| 9.2.5 改善冠心病患者精神焦虑及抑郁状态的作用 |
| 9.2.6 改善缺血性心律失常作用 |
| 1 0 冠心病常用药物用药小结 |
| 1 0.2 冠心病二级预防常用药物 |
| 1 0.3 冠心病介入围术期抗凝及溶栓治疗常用药物 |
| 1 0.4 冠心病合并其他疾病的用药 |
（2）冠心病合理用药指南（论文提纲范文）
| 1 冠心病概述 |
| 1.1 定义 |
| 1.2 解剖及病理生理机制 |
| 1.3 临床分型 |
| 1.4.1 国际冠心病流行情况 |
| 1.4.2 我国冠心病流行情况 |
| 1.5 危险因素及预防 |
| 2 冠心病用药分类 |
| 2.1 减轻症状、改善缺血的药物 |
| 2.1.1 β受体阻滞剂 |
| 2.1.2 硝酸酯类药物 |
| 2.1.3 CCB |
| 2.1.4 其他治疗药物 |
| 2.1.5 减轻症状、改善缺血的药物治疗建议 |
| 2.2 预防心肌梗死、改善预后的药物 |
| 2.2.1 阿司匹林 |
| 2.2.2 氯吡格雷 |
| 2.2.3替格瑞洛 |
| 2.2.4 β受体阻滞剂 |
| 2.2.5 他汀类药物 |
| 2.2.6 ACEI或ARB |
| 2.2.7 改善预后的药物治疗建议 |
| 3 急性冠状动脉综合征合理用药指南 |
| 3.1 定义 |
| 3.2 危险分层 |
| 3.3 诊断和鉴别诊断 |
| 3.3.1 诊断 |
| 3.3.2 鉴别诊断 |
| 3.4 治疗策略 |
| 3.4.1 治疗原则和目标 |
| 3.4.2 STEMI的治疗 |
| 3.4.2. 1 住院后初始处理 |
| 3.4.2.2溶栓治疗 |
| 3.4.2. 3 抗栓治疗 |
| 3.4.2. 4 抗心肌缺血 |
| 3.4.2. 5 调脂治疗 |
| 3.4.2. 6 其他治疗 |
| 3.4.3 UA及非ST段抬高急性冠状动脉综合征(NSTE-ACS)的治疗 |
| 3.4.3. 1 一般治疗 |
| 3.4.3. 2 抗缺血治疗(具体推荐见表1) |
| 3.4.3. 3 抗血小板治疗(表2) |
| 3.4.3. 4 抗凝治疗 |
| 4 慢性稳定型心绞痛合理用药指南 |
| 4.1 诊断与鉴别诊断 |
| 4.2 病情评估 |
| 4.2.1 临床评估 |
| 4.2.2 负荷试验 |
| 4.2.3 左心室功能 |
| 4.2.4 心肌缺血成像(SPECT) |
| 4.2.5 冠状动脉CTA |
| 4.2.6 冠状动脉造影 |
| 4.3 治疗原则 |
| 4.3.1 建议健康的生活方式 |
| 4.3.2 循证药物治疗 |
| 4.3.3 血运重建 |
| 4.4 药物的选择和合理使用 |
| 4.4.1 缓解心绞痛/心肌缺血治疗的药物 |
| 4.4.2 预防危险事件治疗的药物 |
| 5 微血管性心绞痛 |
| 5.1 定义 |
| 5.2 病因与机制 |
| 5.2.1 内皮功能不全及MCD |
| 5.2.2 炎性反应 |
| 5.2.3 心脏自主神经系统失调 |
| 5.2.4 雌激素水平紊乱 |
| 5.2.5 冠状动脉慢血流综合征 |
| 5.2.6 神经内分泌及代谢因素 |
| 5.3临床表现 |
| 5.4 诊断及鉴别诊断 |
| 5.5 药物治疗 |
| 5.5.1 β受体阻滞剂 |
| 5.5.2 CCB |
| 5.5.3 硝酸酯类药物 |
| 5.5.4 ACEI |
| 5.5.5 他汀类药物 |
| 5.5.6 其他药物 |
| 5.6 非药物治疗 |
| 6 无症状性心肌缺血 |
| 6.1 定义及分型 |
| 6.1.1 完全SMI |
| 6.1.2心肌梗死后的SMI |
| 6.1.3 心绞痛伴SMI |
| 6.2 可能机制 |
| 6.3 诊断 |
| 6.3.1 动态心电图 |
| 6.3.2 心电图运动试验 |
| 6.3.3 负荷超声心动图 |
| 6.3.4核素心肌灌注显像 |
| 6.4 预防及治疗 |
| 6.4.1 预防 |
| 6.4.2 治疗 |
| 7 冠心病特殊合并症的用药治疗原则 |
| 7.1 冠心病合并高血压 |
| 7.1.1 概述 |
| 7.1.2 药物选择 |
| 7.1.2. 1 降压治疗的启动 |
| 7.1.2. 2 目标管理 |
| 7.1.2. 3 药物推荐 |
| 7.1.3 药物使用注意事项 |
| 7.2 冠心病合并心力衰竭 |
| 7.2.1 概述 |
| 7.2.2 冠心病合并急性心力衰竭 |
| 7.2.2. 1 发病机制 |
| 7.2.2. 2 诊断及评估 |
| 7.2.2. 3 药物治疗 |
| 7.2.3 冠心病合并慢性心力衰竭 |
| 7.2.3. 1 发病机制 |
| 7.2.3. 2 诊断及评估 |
| 7.2.3. 3 药物治疗 |
| 7.3 冠心病合并心房颤动 |
| 7.3.1 概述 |
| 7.3.2 冠心病合并心房颤动患者血栓和出血风险评估 |
| 7.3.3 规范抗栓治疗是平衡冠心病合并心房颤动患者血栓和出血风险的关键 |
| 7.3.3. 1 稳定性冠心病合并心房颤动患者的抗栓治疗 |
| 7.3.3. 2 NSTE-ACS合并心房颤动的抗栓治疗 |
| 7.3.3. 3 STEMI合并心房颤动行直接PCI患者的抗栓治疗 |
| 7.3.4 NOAC |
| 7.3.4. 1 直接凝血酶抑制剂——达比加群酯 |
| 7.3.4. 2 直接因子Ⅹa抑制剂 |
| 7.3.5 注意事项 |
| 7.4 冠心病合并心脏瓣膜疾病 |
| 7.4.1 概述 |
| 7.4.2 一般药物治疗 |
| 7.4.2. 1 主动脉瓣反流 |
| 7.4.2. 2 主动脉瓣狭窄 |
| 7.4.2. 3 二尖瓣反流 |
| 7.4.2.4二尖瓣狭窄 |
| 7.4.2. 5 三尖瓣反流 |
| 7.4.2. 6 三尖瓣狭窄 |
| 7.4.3 抗凝治疗 |
| 7.4.3. 1 心脏瓣膜疾病合并心房颤动 |
| 7.4.3. 2 瓣膜置换术后 |
| 7.5 冠心病合并脑卒中 |
| 7.5.1 概述 |
| 7.5.2 流行病学 |
| 7.5.3 冠心病合并脑卒中的抗栓治疗原则 |
| 7.5.3. 1 冠心病合并出血性脑卒中是否需进行抗血小板治疗 |
| 7.5.3. 2 冠心病合并缺血性脑卒中/TIA抗血小板、抗凝治疗 |
| 7.5.4 一般治疗 |
| 7.5.4. 1 抗血小板治疗 |
| 7.5.4.2降压治疗 |
| 7.5.4. 3 他汀类药物治疗 |
| 7.5.4.4其他 |
| 7.6 冠心病合并肺栓塞 |
| 7.6.1 概述 |
| 7.6.2 稳定性冠心病合并急性肺栓塞 |
| 7.6.2. 1 初始抗凝治疗 |
| 7.6.2. 2 溶栓治疗 |
| 7.6.2.3长期抗凝治疗 |
| 7.6.3 ACS合并急性肺栓塞 |
| 7.6.4 PCI合并急性肺栓塞 |
| 7.7 冠心病合并慢性阻塞性肺疾病 |
| 7.7.1 概述 |
| 7.7.2 COPD影响冠心病的发病机制 |
| 7.7.3 冠心病合并COPD的药物治疗 |
| 7.7.3. 1 β2受体激动剂 |
| 7.7.3. 2 β受体阻滞剂 |
| 7.7.3. 3 他汀类药物 |
| 7.8 冠心病合并消化道出血 |
| 7.8.1 概述 |
| 7.8.2 抗血小板药物与PPI联用 |
| 7.8.2. 1 抗血小板药物损伤消化道机制 |
| 7.8.2. 2 PPI |
| 7.8.3 消化道出血风险评估与预防策略 |
| 7.8.4 消化道出血的处理 |
| 7.8.4. 1 停用抗血小板药物 |
| 7.8.4. 2 药物治疗 |
| 7.8.4. 3 内镜止血治疗 |
| 7.8.5 止血后治疗药物选择 |
| 7.9 冠心病合并肝功能异常 |
| 7.9.1 概述 |
| 7.9.2 常用的肝功能评价指标 |
| 7.9.3 肝功能障碍患者的药物代谢动力学改变 |
| 7.9.4 肝功能异常患者的用药原则 |
| 7.9.5他汀类药物对肝功能的影响 |
| 7.9.6 他汀类药物在合并肝功能异常患者中的应用 |
| 7.9.8 他汀类药物所致肝损害的治疗 |
| (1)非特异性抗炎药:代表药物为复方甘草酸二铵、复方甘草酸苷、异甘草酸镁等。 |
| (2)解毒类药物:代表药物为谷胱甘肽、硫普罗宁。 |
| (3)肝细胞膜修复保护剂:代表药物为多烯磷脂酰胆碱。 |
| (4)抗氧化类药物:代表药物为水飞蓟宾。 |
| (5)利胆类药物:代表药物为腺苷蛋氨酸、熊去氧胆酸。 |
| 7.9.9 其他冠心病常用药物对肝功能异常患者的影响 |
| 7.1 0 冠心病合并慢性肾脏病 |
| 7.1 0. 1 CKD的定义和分期 |
| 7.1 0.1.1 CKD的定义 |
| 7.1 0.1.2 CKD的分期 |
| 7.1 0. 2 冠心病合并CKD患者的药物治疗 |
| 7.1 0.2.1 抗栓治疗 |
| 7.1 0.2.2 他汀类药物 |
| 7.1 0.2.3 抗缺血治疗 |
| 7.1 1 冠心病合并糖尿病 |
| 7.1 1. 1 概述及流行病学 |
| 7.1 1. 2 冠心病合并糖尿病的病理生理 |
| 7.1 1. 3 临床特点 |
| 7.1 1. 4 诊断 |
| 7.1 1. 5 治疗 |
| 7.1 2 冠心病合并甲状腺疾病 |
| 7.1 2. 1 概述 |
| 7.1 2. 2 冠心病合并临床和亚临床甲状腺功能亢进(甲亢) |
| 7.1 2.2.1 流行病学 |
| 7.1 2.2.2 一般治疗 |
| 7.1 2.2.3 特殊治疗推荐 |
| 7.1 2. 3 冠心病合并临床和亚临床甲状腺功能减退(甲减) |
| 7.1 2.3.1 流行病学 |
| 7.1 2.3.2 一般治疗 |
| 7.1 2.3.3 特殊治疗推荐 |
| 7.1 3 冠心病合并风湿免疫疾病 |
| 7.1 3. 1 概述 |
| 7.13.2药物治疗推荐 |
| 7.1 4 冠心病合并外科手术 |
| 7.1 4. 1 概述 |
| 7.1 4. 2 药物选择 |
| 7.1 4.2.1 β受体阻滞剂 |
| 7.1 4.2.2 他汀类药物 |
| 7.1 4.2.3 ACEI或ARB |
| 7.1 4.2.4 硝酸酯类药物 |
| 7.1 4.2.5 抗血小板药物 |
| 7.1 4.2.6 抗凝药物 |
| 7.1 4.2.7 CCB |
| 7.14.2.8α2受体激动剂 |
| 7.1 4. 3 注意事项 |
| 7.1 4.3.1 β受体阻滞剂 |
| 7.1 4.3.2 他汀类药物 |
| 7.1 4.3.3 ACEI |
| 7.1 4.3.4 硝酸酯类药物 |
| 7.1 4.3.5 抗血小板、抗凝药物 |
| 8 冠心病特殊类型的用药治疗原则 |
| 8.1 川崎病所致冠状动脉病变 |
| 8.1.1 概述 |
| 8.1.2 临床诊断 |
| 8.1.2. 1 KD合并CAL的诊断 |
| 8.1.2. 2 AHA制定的CAA分类 |
| 8.1.3 药物治疗 |
| 8.1.3. 2 大剂量IVIG |
| 8.1.3. 3 CAA治疗 |
| 8.1.3. 4 冠状动脉狭窄治疗 |
| 8.1.3. 5 其他药物 |
| 8.1.4 预后及随访 |
| 8.2 家族性高胆固醇血症所致冠心病 |
| 8.2.1 概述 |
| 8.2.2 诊断 |
| 8.2.3 调脂药物治疗 |
| 8.2.3. 1 调脂治疗原则 |
| 8.2.3. 2 调脂药物开始时间 |
| 8.2.3. 3 调脂药物治疗目标 |
| 8.2.3. 4 调脂药物种类及选择 |
| 8.3 非粥样硬化性冠心病 |
| 8.3.1 冠状动脉痉挛(coronary artery spasm,CAS) |
| 8.3.1.1疾病概述 |
| 8.3.1. 2 药物治疗策略 |
| 8.3.2 冠状动脉肌桥 |
| 8.3.2. 1 疾病概述 |
| 8.3.2. 2 药物治疗策略 |
| 8.3.3 自发性冠状动脉夹层 |
| 8.3.3. 1 疾病概述 |
| 8.3.3. 2 药物治疗策略 |
| 9 冠心病常用药物用药小结 |
| 9.1 冠心病一级预防常用药物 |
| 9.1.1 冠心病合并高血压病的常用药物 |
| 9.1.2 调脂治疗的常用他汀类药物 |
| 9.2 冠心病二级预防常用药物 |
| 9.3 冠心病介入治疗围术期抗凝及溶栓治疗常用药物 |
| 9.4 冠心病合并其他疾病的用药 |
（3）磷酸二酯酶在心力衰竭治疗中的研究进展（论文提纲范文）
| 1 环磷酸腺苷与环磷酸鸟苷 |
| 2 磷酸二酯酶家族(PDEs) |
| 3 PDE3和PDE5在心血管系统中的作用及其抑制剂在心衰中的应用研究 |
（4）茶黄素-3,3’-双没食子酸酯（TF3）通过激活AMPK逆转高糖导致的缝隙连接蛋白以及自噬功能的抑制（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 主要缩略词 |
| 第一部分 茶黄素-3,3'-双没食子酸酯(TF3)对高糖环境下新生乳鼠心肌细胞自噬及缝隙连接功能的影响及机制探讨 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 茶黄素类对早期糖尿病大鼠心脏中AMPK通路以及缝隙连接蛋白43的影响 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
（5）蛋白质亚硝基化修饰在硝酸酯类耐受和血管钙化中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 论文Ⅰ PGIS亚硝基化修饰对体内硝酸酯类交叉耐受的影响及机制研究 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略语说明 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 论文Ⅱ AMPKβ1亚硝基化修饰在高糖促进VSMCs钙化中的作用及机制研究 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略语说明 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 附表 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 论文Ⅲ AMPKβ1亚硝基化修饰对糖尿病动脉粥样硬化斑块钙化的影响及机制研究 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略语说明 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 附表 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| SCI论文Ⅰ |
| SCI论文Ⅱ |
（6）基于网络药理学的“瓜蒌薤白半夏汤”治疗冠心病的作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一章理论研究 |
| 1.1 冠状动脉粥样硬化性心脏病的中医研究进展 |
| 1.1.1 疾病的命名和历史沿革 |
| 1.1.2 病因病机 |
| 1.1.3 治疗 |
| 1.1.4 小结 |
| 1.2 冠状动脉粥样硬化性心脏病的现代医学研究进展 |
| 1.2.1 病因 |
| 1.2.2 病理生理 |
| 1.2.3 发病机制 |
| 1.2.4 诊断标准 |
| 1.2.5 治疗 |
| 1.2.6 小结 |
| 1.3 瓜蒌薤白半夏汤的药理作用研究进展 |
| 1.3.1 单味药研究 |
| 1.3.2 瓜蒌薤白半夏汤的复方研究 |
| 1.3.3 小结 |
| 第二章瓜蒌薤白半夏汤治疗冠心病的作用机制的网络药理学研究 |
| 2.1 研究一瓜蒌薤白半夏汤的活性成分筛选及靶点预测 |
| 2.1.1 材料与方法 |
| 2.1.2 结果 |
| 2.1.3 小结 |
| 2.2 研究二冠心病靶点的筛选和化合物-靶点-疾病网络的构建与分析 |
| 2.2.1 材料与方法 |
| 2.2.2 结果 |
| 2.2.2.1 冠心病靶点 |
| 2.2.2.2 Venn 图及潜在作用靶点 |
| 2.2.2.3 瓜蒌薤白半夏汤治疗冠心病的化合物-靶点-疾病网络 |
| 2.2.3 小结 |
| 2.3 研究三潜在作用靶点PPI网络的构建与分析 |
| 2.3.1 材料与方法 |
| 2.3.2 结果 |
| 2.3.3 小结 |
| 2.4 研究四潜在作用靶点的分子对接模拟验证 |
| 2.4.1 材料与方法 |
| 2.4.2 结果 |
| 2.4.3 小结 |
| 2.5 研究五潜在作用靶点的生物功能富集分析 |
| 2.5.1 数据库和软件 |
| 2.5.2 方法 |
| 2.5.3 结果 |
| 2.5.4 小结 |
| 2.6 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 PI3K/AKT 信号通路在冠心病中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间公开发表的学术论文、专着及科研成果 |
（7）过表达SmPsbD对丹参光合作用和酚类化合物生物合成的影响作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 丹参及其在心血管治疗方面的研究进展 |
| 1.1.1 丹参简介 |
| 1.1.2 丹参在心血管疾病治疗方面的研究进展 |
| 1.2 丹参酚酸类成分的生源合成及调控研究进展 |
| 1.2.1 酚酸类成分生源途径研究进展 |
| 1.2.2 丹参酚酸类成分合成及调控研究进展 |
| 1.3 类黄酮的生源合成及调控研究进展 |
| 1.3.1 类黄酮的生源途径研究进展 |
| 1.3.2 类黄酮成分合成及调控研究进展 |
| 1.4 植物PsbD基因研究进展 |
| 1.4.1 PsbD基因的表达调控 |
| 1.4.2 PsbD基因与其他光合蛋白之间的关系 |
| 1.4.3 PsbD基因启动子研究进展 |
| 1.4.4 PsbD基因参与植物对非生物胁迫的应答 |
| 1.5 本研究的目的意义 |
| 1.6 研究内容与技术路线 |
| 1.6.1 研究内容 |
| 1.6.2 研究技术路线 |
| 第二章 丹参SmPsbD生物信息学分析及过表达转基因植株获得 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料、试剂与仪器 |
| 2.2.1 丹参材料及无菌苗的获得与培养 |
| 2.2.2 菌株与载体 |
| 2.2.3 试剂及试剂盒 |
| 2.2.4 主要仪器与设备 |
| 2.2.5 引物设计、合成及测序 |
| 2.3 研究方法 |
| 2.3.1 生物信息学分析 |
| 2.3.2 基因表达分析 |
| 2.3.3 丹参SmPsbD基因c DNA全长序列的克隆 |
| 2.3.4 丹参SmPsbD过表达载体的构建 |
| 2.3.5 农杆菌介导的植物遗传转化及抗性丹参幼苗的获得 |
| 2.3.6 转基因植株的PCR鉴定及阳性植株筛选 |
| 2.3.7 数据分析 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 丹参SmPsbD的 c DNA序列分析 |
| 2.4.2 丹参SmPsbD系统进化分析 |
| 2.4.3 丹参SmPsbD启动子顺式作用元件分析 |
| 2.4.4 丹参总RNA的提取与检测 |
| 2.4.5 丹参SmPsbD的组织特异性表达分析 |
| 2.4.6 丹参SmPsbD过表达载体重组质粒的获得 |
| 2.4.7 转基因植株的PCR鉴定 |
| 2.4.8 转基因植株的转化效率 |
| 2.4.9 丹参SmPsbD过表达转基因植株中目的基因的表达量分析 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 基于转录组分析过表达SmPsbD对丹参转录水平的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料、试剂与仪器 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 试剂 |
| 3.2.3 主要仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 转录组表达谱分析 |
| 3.3.2 生物信息学分析 |
| 3.3.3 数据处理 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 转录组测序数据及质量控制 |
| 3.4.2 转录组测序数据过滤前后统计分析 |
| 3.4.3 RNA-seq数据与丹参参考基因组序列比对率分析 |
| 3.4.4 总体样本重复性分析 |
| 3.4.5 差异表达分析及筛选 |
| 3.4.6 差异表达基因的聚类分析热图 |
| 3.4.7 差异表达基因的GO功能注释和富集分析 |
| 3.4.8 差异表达基因KEGG功能注释和富集分析 |
| 3.4.9 基于Map Man软件分析代谢通路 |
| 3.4.10 差异表达基因的RT-qPCR验证 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 基于代谢组分析过表达SmPsbD对丹参代谢水平的影响 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料、试剂与仪器 |
| 4.2.1 材料 |
| 4.2.2 试剂 |
| 4.2.3 主要仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 样品预处理及提取 |
| 4.3.2 超高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)联用色谱采集条件 |
| 4.3.3 代谢物的定性与定量原理 |
| 4.3.4 数据处理 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 总体样本主成分分析 |
| 4.4.2 总体样本聚类分析 |
| 4.4.3 重复相关性评估 |
| 4.4.4 差异代谢物筛选 |
| 4.4.5 差异代谢物KEGG功能注释及富集分析 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第五章 过表达SmPsbD对丹参光合作用的影响 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料、试剂与仪器 |
| 5.2.1 材料 |
| 5.2.2 试剂 |
| 5.2.3 主要仪器与设备 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 相对含水量的测定 |
| 5.3.2 透射电子显微镜(TEM) |
| 5.3.3 叶绿素含量测定 |
| 5.3.4 光合作用测定 |
| 5.3.5 叶绿素荧光参数的测定 |
| 5.3.6 光合作用产物含量测定 |
| 5.3.7 转录组学和代谢组学联合分析 |
| 5.3.8 数据处理 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 过表达SmPsbD对丹参植株生长的影响 |
| 5.4.2 过表达SmPsbD对丹参植株相对含水量的影响 |
| 5.4.3 过表达SmPsbD对丹参叶片叶绿素含量的影响 |
| 5.4.4 过表达SmPsbD对丹参光合作用的影响 |
| 5.4.5 过表达SmPsbD对丹参叶绿素荧光参数的影响 |
| 5.4.6 过表达SmPsbD对丹参叶绿体数目的影响 |
| 5.4.7 过表达SmPsbD对丹参光反应过程的调控 |
| 5.4.8 过表达SmPsbD转基因植株转录组与代谢组联合分析 |
| 5.4.9 过表达SmPsbD对丹参光合作用产物合成量的影响 |
| 5.4.10 过表达SmPsbD对丹参光合作用产物相关生物合成途径的调控 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 第六章 过表达SmPsbD对丹参酚类化合物生物合成的影响 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料、试剂与仪器 |
| 6.2.1 材料 |
| 6.2.2 试剂 |
| 6.2.3 主要仪器与设备 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 丹酚酸B及迷迭香酸含量测定 |
| 6.3.2 总黄酮的含量测定 |
| 6.3.3 总酚的含量测定 |
| 6.3.4 数据处理 |
| 6.4 结果与分析 |
| 6.4.1 过表达SmPsbD对丹参丹酚酸B合成积累的影响 |
| 6.4.2 过表达SmPsbD对迷迭香酸成分积累的影响 |
| 6.4.3 过表达SmPsbD对总酚与总黄酮成分积累的影响 |
| 6.4.4 过表达SmPsbD对酚类化合物生物合成途径的影响分析 |
| 6.5 讨论 |
| 6.6 小结 |
| 第七章 结论与展望 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 创新点 |
| 7.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录A 常用仪器型号和培养基配方 |
| 附录B 实验附表和附图 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）miR-26a-5p通过调控PTEN/PI3K/AKT信号通路对心肌缺血再灌注损伤的作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一章 miR-26a-5p在缺氧/复氧心肌细胞中的表达及其调控作用 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 第二章 miR-26a-5p调控PTEN/PI3K/AKT通路改善心肌缺血再灌注损伤 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 第三章 miR-26a-5p在缺血再灌注小鼠心肌组织中的表达及其调控机制 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 创新性与局限性 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况 |
| 英文全文 |
（9）非编码RNA研究进展（论文提纲范文）
| 1 非编码RNA与小胖威利综合征 |
| 1.1 Box C/D类型snoRNA snoRD116s的加工机制及功能研究 |
| 1.2 两端以snoRNA结尾的长非编码sno-lncRNA的加工机制 |
| 1.3 5′端为snoRNA、3′端为poly(A)尾巴的长非编码SPA的加工机制 |
| 1.4 转录自PWS最小缺失区域非编码RNAs的功能研究进展 |
| 1.5 PWS最小缺失区域的非编码RNA的保守性分析及功能研究进展 |
| 1.6 sno-lncRNA与小胖威利综合征总结 |
| 2 非编码RNA与心血管疾病 |
| 2.1 非编码RNA的生物信息学进展 |
| 2.2 非编码RNA在心血管疾病危险因素中的作用 |
| 2.3 非编码RNA作为心血管疾病的分子标志物 |
| 2.4 非编码RNA作为心血管疾病的治疗靶点 |
| 3 非编码RNA与感染免疫性疾病 |
| 3.1 小RNA与感染免疫性疾病 |
| 3.2 长非编码RNA与感染免疫性疾病 |
| 3.3 环状RNA与感染免疫性疾病 |
| 4 非编码RNA与代谢性疾病 |
| 4.1 非编码RNA与肿瘤代谢 |
| 4.2 非编码RNA与糖尿病 |
| 4.3 非编码RNA与肥胖症 |
| 4.4 非编码RNA与其他代谢疾病 |
| 5 非编码RNA与肿瘤 |
| 5.1 非编码RNA在肿瘤中的差异表达 |
| 5.2 非编码RNA在肿瘤发生发展过程中的作用及分子机制 |
| 5.3 非编码RNA对肿瘤的诊断、预后、预测药物敏感性的临床意义 |
| 6 长链非编码RNA、环状RNA与疾病 |
| 6.1 长链非编码RNA概述 |
| 6.2 环状RNA概述 |
| 6.3 长链非编码RNA及环状RNA与疾病 |
| 7 总结与展望 |
（10）孕酮调控心肌细胞钙循环及抵抗双酚A致心律失常的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第1章 前言 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 孕酮及其受体与心血管系统 |
| 1.3 双酚A与心血管系统 |
| 1.4 BPA与类固醇激素相互作用 |
| 第2章 孕激素膜受体mPRs在孕酮调控心肌细胞钙循环中的作用与机理研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要实验设备及仪器 |
| 2.1.3 主要试剂及其配置 |
| 2.1.3.1 主要试剂 |
| 2.1.3.2 主要试剂配制 |
| 2.1.4 实验方法 |
| 2.1.4.1 组织总RNA提取 |
| 2.1.4.2 逆转录PCR |
| 2.1.4.3 实时荧光PCR |
| 2.1.4.4 细胞免疫荧光 |
| 2.1.4.5 成年大鼠心肌细胞的分离与培养 |
| 2.1.4.6 层粘连蛋白覆盖玻片的制作 |
| 2.1.4.7 Fluo-4 AM溶液的配制 |
| 2.1.4.8 心肌细胞钙瞬变的测量 |
| 2.1.4.9 心肌细胞咖啡因诱导钙瞬变的测量 |
| 2.1.4.10 心肌细胞钙火花的测量 |
| 2.1.4.11 心肌细胞总蛋白提取 |
| 2.1.4.12 心肌组织蛋白提取 |
| 2.1.4.13 蛋白浓度的测定 |
| 2.1.4.14 SDS-PAGE蛋白凝胶电泳与转印 |
| 2.1.4.15 蛋白质印记抗体标记与显色 |
| 2.1.4.16 心肌细胞L型钙通道电流的测量 |
| 2.1.4.17 心肌细胞内c AMP浓度的测量 |
| 2.1.4.18 心肌细胞的药物处理 |
| 2.1.5 统计学分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 mPRs mRNA在雌性大鼠心脏组织中的表达 |
| 2.2.2 mPRs蛋白在雌性大鼠心脏组织中的表达 |
| 2.2.3 mPRs蛋白在雌性大鼠心肌细胞中的定位 |
| 2.2.4 mPRs介导P4 增强雌性大鼠心肌细胞钙瞬变水平 |
| 2.2.5 mPRs介导P4 诱导雌性大鼠心肌细胞SR钙转运改变 |
| 2.2.5.1 mPRs介导P4 增加雌性大鼠心肌细胞SR钙负荷水平 |
| 2.2.5.2 mPRs介导P4 促进雌性大鼠心肌细胞SR钙释放 |
| 2.2.6 P4 对雌性大鼠心肌细胞L型钙电流的影响 |
| 2.2.7 mPRs介导P4 增加雌性大鼠心肌细胞SR钙转运蛋白Ry R和 PLN的磷酸化水平 |
| 2.2.8 P4 对雌性大鼠心肌细胞c AMP水平的影响 |
| 2.2.9 mPRs诱导的心肌细胞Ry R与 PLN磷酸化及钙循环改变依赖于CAMKII活化 |
| 2.2.10 IP3/IP3R信号通路不参与mPR诱导的CAMKII活化 |
| 2.2.11 PI3K/Akt/eNOS信号通路参与mPRs诱导的CAMKII活化 |
| 2.2.12 PI3K/Akt/eNOS信号通路介导P4 诱导的雌性大鼠心肌细胞钙循环改变 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 结论 |
| 第3章 孕酮对双酚A促雌性大鼠心律失常发生的影响及其机制探讨 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 主要设备及仪器 |
| 3.1.3 主要试剂及其配置 |
| 3.1.3.1 主要试剂 |
| 3.1.3.2 主要试剂配制 |
| 3.1.4 实验方法 |
| 3.1.4.1 成年大鼠心肌细胞的分离与培养 |
| 3.1.4.2 层粘连蛋白覆盖玻片的制作 |
| 3.1.4.3 心肌细胞after-contraction的测量 |
| 3.1.4.4 Fluo-4 AM溶液的配制 |
| 3.1.4.5 心肌细胞咖啡因诱导钙瞬变的测量 |
| 3.1.4.6 心肌细胞after-transient的测量 |
| 3.1.4.7 心肌细胞钙火花的测量 |
| 3.1.4.8 心肌细胞总蛋白提取 |
| 3.1.4.9 蛋白浓度的测定 |
| 3.1.4.10 SDS-PAGE蛋白凝胶电泳与转印 |
| 3.1.4.11 蛋白质印记抗体标记与显色 |
| 3.1.4.12 心肌细胞的药物处理 |
| 3.1.5 统计学分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 P4 快速抑制BPA诱导的雌性大鼠心肌细胞自发性触发活动 |
| 3.2.2 P4 抑制BPA诱导的雌性大鼠心肌细胞钙循环紊乱 |
| 3.2.2.1 P4 抑制BPA诱导的雌性大鼠心肌细胞SR钙负荷增加 |
| 3.2.2.2 P4 抑制BPA诱导的雌性大鼠心肌细胞SR钙离子漏 |
| 3.2.3 P4 抑制BPA诱导的PLN17 磷酸化 |
| 3.2.4 P4对BPA的快速抑制作用通过膜表面信号介导 |
| 3.2.5 P4 抑制BPA诱导的雌性大鼠心肌细胞触发活动不依赖于cSrc激活 |
| 3.2.6 G_i蛋白参与P4 抑制BPA诱导的雌性大鼠心肌细胞触发活动 |
| 3.2.7 nPR-G_i-PI3K信号通路介导P4 抑制BPA诱导的雌性大鼠心肌细胞触发活动 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 结论 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 |
| 参考文献 |
四、环—磷酸腺苷在心血管活动调节和一些心血管疾病过程中的作用（论文参考文献）
- [1]冠心病合理用药指南（第2版）[J]. 国家卫生计生委合理用药专家委员会,中国药师协会. 中国医学前沿杂志(电子版), 2018(06)
- [2]冠心病合理用药指南[J]. 国家卫生计生委合理用药专家委员会,中国药师协会. 中国医学前沿杂志(电子版), 2016(06)
- [3]磷酸二酯酶在心力衰竭治疗中的研究进展[J]. 孙欢,于明,赵绮旎,杨萍. 中国比较医学杂志, 2020(03)
- [4]茶黄素-3,3’-双没食子酸酯（TF3）通过激活AMPK逆转高糖导致的缝隙连接蛋白以及自噬功能的抑制[D]. 沈智达. 浙江大学, 2019(03)
- [5]蛋白质亚硝基化修饰在硝酸酯类耐受和血管钙化中的作用及机制研究[D]. 周胜男. 山东大学, 2020(10)
- [6]基于网络药理学的“瓜蒌薤白半夏汤”治疗冠心病的作用机制研究[D]. 汪杰. 成都中医药大学, 2020(02)
- [7]过表达SmPsbD对丹参光合作用和酚类化合物生物合成的影响作用研究[D]. 王瑞红. 西北农林科技大学, 2020(02)
- [8]miR-26a-5p通过调控PTEN/PI3K/AKT信号通路对心肌缺血再灌注损伤的作用研究[D]. 邢小卫. 山东大学, 2020(08)
- [9]非编码RNA研究进展[J]. 陈玲玲,冯珊珊,范祖森,龚畅,刘本宇,刘子豪,李传伟,宋尔卫,孙树汉,吴庚泽,吴煌,吴缅,许光,袁继行,曾春雨,朱友明. 中国科学:生命科学, 2019(12)
- [10]孕酮调控心肌细胞钙循环及抵抗双酚A致心律失常的机制研究[D]. 马健勇. 南昌大学, 2017(05)