一、我国马流感病毒不同分离株实验感染SPF鸡的研究（论文文献综述）
房敬真,侯玉杰,尹馨,王冬雪,邓国华,崔鹏飞,施建忠,陈化兰[1]（2021）在《两株H9N2亚型禽流感病毒的遗传演化及其致病性分析》文中认为为了解H9N2亚型禽流感病毒（AIV）的分子特征及其对家禽和哺乳动物小鼠的致病性,本研究对2020年分离到的两株H9N2亚型AIV:A/chicken/Jiangsu/S1625/2020（H9N2）（简称CK/JS/S1625/2020）株和A/duck/Sichuan/S1537/2020（H9N2）（简称DK/SC/S1537/2020）株,进行了基因组测序、序列分析及其对SPF鸡、鸭和BALB/c小鼠的致病力评价。同源性分析结果显示,两株病毒HA和NA基因的同源性分别为93.3%和95.8%,其编码氨基酸序列的同源性分别为95.4%和95.9%,同源性较低。且两株病毒HA蛋白裂解位点分别为333PSRSSR↓GLF341、333PSRSNR↓GLF341,均不存在多个连续的碱性氨基酸,符合低致病性禽流感病毒（LPAIV）HA序列特征。两株病毒的HA蛋白均为典型的人源受体结合特征,即155T、183N和226L。遗传演化分析结果显示,两株病毒的HA、NA基因均属于欧亚分支,但二者的亲缘关系较远。鸡感染性试验结果显示,CK/JS/S1625/2020株感染组鸡可通过喉头和泄殖腔向外界环境排毒。虽然在全部鸡的喉头中检测到了DK/SC/S1537/2020株,但仅在部分鸡的泄殖腔检测到了该病毒,且喉头的排毒量明显高于泄殖腔。鸡血清抗体检测结果显示,两株病毒感染鸡血清的HI抗体全部阳转,效价在1.128～1.2 048。表明,鸡源H9N2病毒比鸭源H9N2病毒在鸡体内的适应性和复制能力更强;鸭感染性试验结果显示,两株病毒均只能通过鸭的喉头向外界环境排毒,但病毒滴度均较低,且均不能在鸭体内有效复制;小鼠感染性试验结果显示,两株病毒仅能在小鼠的鼻甲中有效复制,而在小鼠的脑、脾脏和肾脏中均未检测到病毒。以上结果表明两株H9N2亚型AIV对家禽和小鼠均呈低致病力。本研究为进一步了解H9N2 AIV提供了一定的参考数据,有必要对自然界中传播的H9N2流感病毒持续监测和进化分析。
张富友[2]（2021）在《我国部分地区禽星状病毒分子流行病学调查及其基因组特性研究》文中研究指明禽星状病毒（Avian astrovirus,AAstV）属于星状病毒科,是危害家禽养殖业的重要病原。AAstV主要包括禽肾炎病毒（Avian nephritis virus,ANV）、鸭星状病毒（Duck astrovirus,DAstV）、鸡星状病毒（Chicken astrovirus,CAstV）、鹅星状病毒（Goose astrovirus,Go AstV）等,可以感染多种禽类,引发雏鸡肾炎、鸭病毒性肝炎、腹泻、发育迟缓和痛风等症状。近年来,禽星状病毒在世界范围内感染普遍,在我国也时有发生,如2017年在山东、江苏等地爆发的新型鹅星状病毒引起的雏鹅内脏型痛风病。此外,CAstV、DAstV等新流行株的出现,也给该病的防控带来较大挑战。为了解禽星状病毒在我国的流行情况,本研究对从8个省份采集的家禽样品进行了分子流行病学调查,对分离到的禽星状病毒代表株进行全基因组测序和致病性分析,为禽星状病毒防控提供科学依据。1.禽星状病毒分子流行病学调查本研究针对禽星状病毒RNA依赖的RNA聚合酶基因（RNA-dependent RNA polymerase,RdRP）设计通用引物,从江苏等8省区家禽批发市场、零售市场、养殖场和屠宰场等场点采集1210份咽肛拭子样品,通过逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）进行禽星状病毒测序,并根据序列测定结果构建系统发育树。结果共检测到17株禽星状病毒,样品总体阳性率为1.4%,其中包括7株鸡星状病毒（CAstV）、5株禽肾炎病毒（ANV）、2株鸭星状病毒（DAstV）、2株新型鹅星状病毒（Go AstV）和1株新型禽星状病毒（AAstV-3）。值得注意的是,从养殖、屠宰到销售各个环节中,都证实存在禽星状病毒感染。表明禽星状病毒在整个家禽产业链污染较为严重,各个环节之间产品的流通促进了禽星状病毒传播,这也提示我们要加强对禽星状病毒监测。本研究证实了我国禽星状病毒具有遗传多样性,进一步丰富我国家禽星状病毒流行病学资料。2.禽星状病毒分离与鉴定对检测到的禽星状病毒分别通过接种鸡胚、鸭胚和鹅胚进行病毒分离。结果显示,利用鸡胚可以从鸡源样品分离到ANV和CAstV,利用鸭胚可以从鸭源样品中分离到DAstV,鹅胚可以分离到Go AstV。此外,两株新型鹅星状病毒也可从鸭胚中分离到。这表明分离到的新型鹅星状病毒可以跨宿主传播。对分离株进行外源病毒检测,并挑选可以稳定增殖的鸡星状病毒分离株N-2P株进行纯化定量,然后接种1日龄SPF鸡进行致病性试验,结果显示,在观察的15 d内,攻毒组的小鸡状态稳定,未出现死亡,剖检无明显病变。攻毒组7只小鸡中,有3只小鸡的肝脏、脾脏和肾脏中均检测到鸡星状病毒核酸阳性,阳性率为42.86%。结果表明,该鸡星状病毒分离株可以感染SPF鸡,但是未引起明显的病变,这说明本研究分离到的鸡星状病毒致病性较弱。由此可见,我国存在致病性较弱的禽星状病毒,其危害性不大,这也是尚未引起足够重视的主要原因。已有研究表明,禽星状病毒和其他病原的混合感染或继发感染会造成更强的致病性,因此要加强对禽星状病毒病预防和控制。3.禽星状病毒基因组特性分析利用二代测序技术对分离到的17株禽星状病毒进行全基因组测序,将其与Gen Bank的参考毒株进行全基因组和3个开放阅读框序列的同源性和进化树分析,并对分离株的抗原表位、跨膜区结构和疏水性进行预测分析。遗传进化分析显示,17株禽星状病毒分布在6个分支,分别为7株鸡星状病毒、2株新型鹅星状病毒、5株禽肾炎病毒、1株新型星状病毒、1株2型鸭星状病毒和1株1型鸭星状病毒。其中分离株G1272只有ORF2区域可以匹配到同源性较高的参考株序列,ORF1a和ORF1b区域与已知序列同源性较低,与DAstV-1、CAstV和DAstV-2等参考株相比,其核苷酸和氨基酸同源性均小于50%。其余分离株在全基因组序列和3个ORF区域的核苷酸和氨基酸同源性分析结果一致,均与其对应的Go AstV、DAstV-1、CAstV、DAstV-2和ANV等参考株存在较高的同源性。疏水性、抗原表位和跨膜区预测结果显示,全部分离株的3个ORF区域所编码蛋白具有良好的抗原性,且全部为亲水性蛋白,只有ORF1a区域预测到4-6个跨膜区结构,在ORF1b和ORF2中未预测到相关结构。本研究对分离到的禽星状病毒进行全基因组测序分析和对亲水性等结构的预测分析,不仅证实我国家禽中流行的禽星状病毒具有遗传多样性,而且丰富了禽星状病毒流行病学资料库,为禽星状病毒后续研究提供了技术支持。
张醒海[3]（2021）在《候鸟禽流感病毒遗传变异规律分析及在哺乳动物间传播机制研究》文中进行了进一步梳理流感病毒是目前最受关注的人畜共患病原体之一,广泛分布在自然环境、家禽及候鸟等自然宿主中,可感染包括人类在内的多种哺乳动物,对国家生物安全、产业经济有着重要影响。该病毒对人类健康的危害主要表现为引起季节性流感、流感大流行和人感染动物流感等。候鸟是H3N8、H9N2和H5N8等众多亚型禽流感病毒的储存库,且这些病毒持续在我国候鸟中流行传播。近年来它们又出现新的生物表型或基因特性,如水禽不仅呈现无症状携带流感病毒,也出现了感染甚至致死的现象;部分候鸟来源的病毒,可发生水禽-陆禽的传播;出现禽源H9N2、H5N8感染人的现象。这些亚型病毒在中国候鸟中的流行、进化及引发公共卫生风险等问题亟待解决。本研究以监测中国东部候鸟禽流感病毒流行动态为切入点,研究内容包括发现候鸟禽流感病毒的亚洲-北美地区跨洲际传播的证据,揭示候鸟禽流感病毒在自然宿主中的遗传变异规律,提供禽流感病毒家禽-野禽间跨物种感染的证据,评估候鸟源禽流感病毒在哺乳动物间的传播能力以及识别决定禽流感病毒跨物种感染人的分子特征。第一部分:中国东部地区候鸟禽流感流行病学调查。在全球候鸟迁徙背景下,选取途经我国东部的东亚-澳大利亚候鸟迁徙路线上重要候鸟停歇与聚集地（湖南东洞庭湖、环渤海湾湿地、内蒙古图牧吉、上海崇明东滩）开展了2016-2019年为期四年的主动预警监测,分离跨洲际传播或新型重配候鸟源禽流感病毒株,并测定其全基因序列。监测过程中本研究共采集了来自96种不同鸟类的35604份样本,分离得到88株病毒,候鸟禽流感病毒携带率约为0.247%。亚型多样性分析表明分离毒株涵盖12种HA和9种NA组成的23种不同亚型。其中低致病性禽流感病毒H3、H6、H9亚型为优势流行毒株。病原学及血清学数据证明H9N2禽流感病毒在候鸟内广泛流行,H9N2禽流感病毒可以感染包括纵纹腹小鸮、红隼、苍鹰和雉鸡多种野生鸟类,在小型多宿主生态系统中H9N2可以发生有效的种间传播。自2020年10月底以来,H5N8病毒中国中东部候鸟中引发疫情。本研究证实了H5N8对大天鹅、尤鼻天鹅等候鸟的感染,确定2020 HPAIV H5N8为2.3.4.4b谱系。抗原性分析发现,由于抗原漂移,当前家禽H5疫苗株对2020年HPAIV H5N8病毒保护力下降,病毒传入家禽并大面积流行的风险极大,需要及时更新家禽候选疫苗株,并进一步加强监测和实施预防措施。第二部分:候鸟禽流感病毒遗传进化分析。本研究进而对禽流感病毒各基因片段在天然宿主中的进化速率及基因片段溯源分析:基于不同时间点分离的病毒之间遗传差异和时间分布,采用贝叶斯MCMC方法,估算各个基因片段进化变异的总体速率并推断其最近共同祖先（t MRCA）的年代。重点关注亚洲和北美洲之间候鸟禽流感病毒的洲际联系:利用病原基因组序列信息构建系统发育树,结合候鸟迁徙数据,分析病毒基因片段转移的方向性,通过各基因片段的地理溯源来确定亚洲和北美洲之间候鸟禽流感病毒的洲际联系,确定可能的病毒引入途径,解析候鸟在大陆之间和大陆内部的禽流感病毒流通过程中发挥的作用。系统发育分析揭示部分亚型AIVs基因片段存在洲际间的沟通与传播。遗传变异分析发现中国东部候鸟AIVs基因片段遗传多样性丰富、不同亚型及不同鸟种间出现基因节段流通与传播。H3N8亚型禽流感病毒在候鸟中广泛流行,且基因型十分丰富,分离到的8株H3N8禽流感病毒可以分为7个基因型。H13、H3N8亚型内部基因节段存在洲际间的沟通与传播。系统发生及基因型分析研究发现H9N2禽流感病毒存在由家禽向野禽溢出的现象。对2020 HPAIV H5N8进行各基因节段溯源,结合系统发生地理学及候鸟迁徙路线证明了2020年中国候鸟中流行的H5N8禽流感病毒为新型重配毒株,随候鸟迁徙由哈萨克斯坦及俄罗斯引入我国,明确了新型重排H5N8流感病毒各基因片段的进化地位和起源,揭示了H5N8禽流感病毒株在欧亚大陆内的洲内传播及非洲-欧亚大陆的洲际间传播的现象。第三部分:候鸟禽流感病毒公共卫生风险评估。在遗传变异分析的基础上,我们开展候鸟禽流感病毒新型重配病毒受体结合特性及其在非天然宿主中的致病与传播能力评估。针对首次出现感染人的2020 HPAIV H5N8高致病性禽流感病毒,采用哺乳动物模型评估其在不同宿主上的致病性及传播能力,评估其公共卫生风险;针对由家禽溢出到野鸟的H9N2亚型禽流感病毒,我们结合病毒基因组变异分析,受体结合偏好性与哺乳动物致病性及传播能力分析,系统评估其公共卫生风险;针对在候鸟中广泛流行的多个基因型的H3N8亚型禽流感病毒,我们评估其受体结合能力,利用小鼠、豚鼠、雪貂等动物模型检测其在哺乳动物致病性及传播能力,分析研判H3N8亚型人群间传播的潜在风险。生物学特性评估发现H5N8禽流感病毒在人际间传播的风险仍然很低,此判断基于H5N8禽流感病毒偏好与禽类受体结合,而且在豚鼠中不具备传播能力的研究数据。尽管近来首次出现2020 HPAIV H5N8禽流感病毒感染人的状况,本研究证实H5N8禽流感病毒尚不具备在人际间流行的潜力,提示其产生的公共卫生威胁有限。由家禽溢出到候鸟的H9N2毒株结合人样受体后,可以在豚鼠及雪貂模型间通过直接接触及呼吸道飞沫途径进行高效传播,这些结果强调了H9N2亚型禽流感病毒存在能够引发人际间流行的潜在的公共卫生风险。受体结合检测证实H3N8毒株普遍具有结合人样受体的能力,在豚鼠模型中具备高效的接触传播及呼吸道飞沫传播能力。候鸟H3N8亚型禽流感病毒具有感染人类并在人群中传播的潜在风险。第四部分:候鸟源H3N8禽流感病毒在哺乳间传播的分子机制研究。在候鸟源H3N8禽流感病毒的哺乳间传播评估过程中,本研究发现T222毒株不能在雪貂模型中通过呼吸道飞沫传播,而T222豚鼠适应1代毒株可以经呼吸道飞沫传播。因此,我们选择传播能力差异明显但遗传背景相似的以上两株H3N8亚型禽流感病毒毒株,结合反向遗传学技术,构建了PB1-S524G突变质粒并拯救r T222-S524G突变体。采用体外聚合酶活性检测,我们证实PB1-S524G突变增强了病毒聚合酶活性。进一步利用小鼠、豚鼠和雪貂等动物模型,发掘决定H3N8亚型哺乳动物间传播的关键分子标记。本研究证实PB1-S524G突变可以赋予H3N8在雪貂间经呼吸道飞沫传播的能力。PB1-S524G突变增强了病毒体内外复制能力,提高病毒在小鼠及雪貂上呼吸道的病毒复制滴度,加剧了由病毒导致的雪貂肺脏的病理损伤。研究结果表明PB1-S524G是影响候鸟H3N8禽流感病毒在哺乳动物宿主上致病及传播能力的关键分子标记。以上研究结果提示我们应持续加强对候鸟禽流感病毒的监测及对公共卫生安全的威胁进行评估,进一步加强候鸟禽流感病毒跨物种传播的分子机制的研究,为禽流感防控提供理论依据。
栾勇娇[4]（2021）在《血清4型禽腺病毒广西分离株全基因组测序分析、检测方法和致病性研究》文中研究说明血清4型禽腺病毒（FAdV-4）可引起心包积液-肝炎综合征（HHS）等家禽疾病,于1987年在巴基斯坦首次报道。2015年以来,一种新发FAdV-4（FAdV-4变异株）在我国山东、河南、吉林、广东、广西等地鸡群暴发流行,主要感染3～6周龄的肉鸡,且死亡率较高,给我国养禽业造成严重的经济损失。本研究对6株FAdV-4广西分离株全基因组序列测定与遗传进化分析,结果显示基因组全长为43714～43721 bp,包括43个开放阅读框。与之前的FAdV-4毒株（FAdV-4非变异株）相比,6株FAdV-4广西分离株核苷酸序列发生明显变异,主要是基因组右端存在1966 bp大片段缺失。Hexon、Penton和Fiber主要结构蛋白的氨基酸位点均有不同程度变异,其中Fiber-2突变位点最多,与国内近年报道的高致病性FAdV-4分离株的变异相似。目前,尚未有同时鉴别FAdV-4变异株和非变异株的检测方法,本研究从Gen Bank下载FAdV-4变异株和非变异株的核苷酸序列,结合利用Primer Explorer V5和Premier 5.0引物设计软件,设计筛选了两套环介导等温扩增（LAMP）引物和2条分子信标探针,对反应时间、反应温度、引物浓度等进行优化,建立了鉴别诊断FAdV-4变异株和非变异株的二重荧光LAMP检测方法。该法特异性好,在520 nm和670 nm双荧光通道下,对FAdV-4变异株、非变异株的扩增结果分别为绿色和红色,对FAdV-4变异株和非变异株混合感染样品的扩增结果为黄色,而对FAdV其它血清型、新城疫病毒、禽呼肠孤病毒等毒菌株的检测结果均为阴性;灵敏度高,检测下限为100 copies/μL;干扰性小,高浓度模板不影响低浓度模板的扩增。建立的二重荧光LAMP检测方法可区分FAdV-4变异株、非变异株和二者混合感染。为了解FAdV-4广西分离株的致病性,以不同剂量和途径感染SPF鸡。以不同剂量肌肉注射感染4周龄SPF鸡,记录每组发病和死亡情况;以101.5TCID50剂量通过肌肉注射和口服途径感染SPF鸡,剖检观察病变,并采集组织样品和棉拭子样品,通过荧光定量PCR方法检测病毒载量,通过组织切片观察病理学变化。结果显示,剂量为107～103TCID50,可造成鸡100%死亡;剂量为102TCID50、10 TCID50和1 TCID50,死亡率分别为90%、30%和10%。肌肉注射比口服方式更易感,剖检发现明显的心包积液和肝脏肿胀发黄。肝脏出现广泛性的细胞变性坏死和核内包涵体,脾脏、法氏囊和胸腺三个免疫器官出现了广泛的淋巴细胞变性坏死。FAdV-4侵害肝脏、心脏等组织,主要的靶器官是肝脏,感染FAdV-4的鸡可通过咽喉和泄殖腔进行排毒。本研究对6株FAdV-4广西分离株进行了全基因组测序,并与国内外FAdV-4毒株序列进行比较分析,掌握了FAdV-4广西分离株的序列信息和变异情况。通过设计筛选两套LAMP引物,优化反应条件,建立了鉴别诊断FAdV-4变异株和非变异株的二重荧光LAMP检测方法。以不同的剂量和途径感染SPF鸡,结果发现FAdV-4对4周龄SPF鸡致病性强,肌肉注射方式更易感,组织嗜性广泛,主要的靶器官是肝脏,可通过泄殖腔和咽喉排毒。本研究对FAdV-4全基因组测序分析、鉴别诊断变异株的检测方法和致病性进行研究,为我国新发FAdV-4的防控提供理论依据和技术支撑。
吴咪[5]（2021）在《鸡传染性喉气管炎病毒流行株生物学特征及影响其复制相关宿主蛋白作用机制的研究》文中研究表明鸡传染性喉气管炎病毒（Infectious Laryngotracheitis Virus,ILTV）属疱疹病毒科α疱疹病毒亚科,可引起鸡的传染性喉气管炎。早在1925年美国首次报道鸡传染性喉气管炎以来,在上世纪六十年代我国也发现了该病,相继在我国各省均有发生,该病是目前危害养禽业的重要疫病之一。国内外主要使用弱毒疫苗预防该病,但因疫苗株毒力普遍偏强,因此存在潜伏感染的危害以及无法鉴别疫苗株与野毒株的缺点。目前对ILTV基础研究较少,制约了鸡传染性喉气管炎防控技术的发展。本研究针对影响ILTV复制的关键宿主蛋白为切入点,首次鉴定到信号肽酶复合物亚基3（SPCS3）是影响ILTV在细胞中复制的关键宿主蛋白之一,发现SPCS3蛋白可以切割ILTV的gL蛋白。本研究内容及主要试验结果如下:1.分别对三株ILTV:SH2016、SH2017、GD2018的生长特性及致病性进行研究。三株ILTV均可在鸡肝癌细胞（LMH）增殖,感染ILTV后120h,SH2016滴度可达到103.08TCID50,SH2017和GD2018分别可达到103.42TCID50和105.08TCID50,其中GD2018较其它两株更适应LMH细胞生长;经绒毛尿囊膜方式接种9～11日龄SPF鸡胚,接种后168h,收取尿囊膜,SH2016滴度可达到103.25TCID50,SH2017和GD2018分别可达到102.67TCID50和104.33TCID50,GD2018更适应在尿囊膜上生长;收取尿囊液,SH2016滴度可达102.67TCID50,SH2017和GD2018分别可达到100.33TCID50和100.5TCID50,SH2017和GD2018不生长,SH2016可以在尿囊腔中复制。以尿囊腔方式接种9～11日龄SPF鸡胚,接种后168h,收取尿囊膜,SH2016滴度可达103.25TCID50,SH2017和GD2018分别可达到102.58TCID50和101.83TCID50;收取尿囊液,SH2016滴度可达104.58TCID50,SH2017和GD2018分别可达到101.25TCID50和100.67TCID50,即SH2017和GD2018几乎不生长,而SH2016更适应在尿囊腔中增殖。此外,分别用三株ILTV感染8周龄SPF鸡,SH2016临床症状最明显,是唯一引起鸡死亡的毒株,且三株ILTV只能在鸡喉气管组织中复制,其他脏器并未检测到;GD2018在攻毒后第14d,抗体效价最高,SH2016在攻毒后第21d抗体效价最高。2.分别对三株ILTV基因组进行高通量测序,拼接出全基因组序列,根据基因组结构,预测各蛋白序列。三株ILTV基因组长度分别为:SH2016为153.805kb、SH2017为153.024kb、GD2018为153.855kb;GC含量分别为:SH2016为48.16%、SH2017为48.06%、GD2018为48.10%。三株ILTV基因组结构均由UL、US、IRs及TRs四个区域组成。对病毒基因组核酸序列及10个编码蛋白氨基酸序列进行系统进化分析,基因组DNA进化树上,SH2016与俄罗斯分离株Rus/Ck/Tatarstan/1009/1643株亲缘关系最近,而与SH2017、GD2018关系较远;SH2017与美国分离株LT Blen亲缘关系最近;GD2018与俄罗斯分离株Rus/Ck/Penza/2013/2701及意大利分离株4784/80亲缘关系较近。g C及gL蛋白进化树中,三株ILTV在同一分支,该蛋白具有较高的保守性;gD、gE及gG蛋白进化树中,SH2016与GD2018在同一分支,同源性较高,而与SH2017同源性较低;gB、gH、gM、gI及TK蛋白进化树中,SH2017与GD2018同源性较高,而与SH2016同源性较低。对三株ILTV病毒10个蛋白氨基酸突变位点进行比较,发现除三株ILTV的gC蛋白序列完全一致外,其它9个病毒蛋白都有不同程度的氨基酸位点差异,这些蛋白差异疑与三株ILTV复制能力及致病性的差异相关。3.构建鸡全基因组CRISPR/Cas9敲除文库,对LMH细胞全基因组范围进行逐一扫描式敲除,构建基因敲除细胞文库,然后用ILTV感染细胞文库,对存活的细胞进行高通量测序,确定存活细胞中敲除的宿主基因。第一次测序结果发现3个非编码RNA（ncRNA）基因和SPCS3（信号肽酶复合物亚基-3）基因可能与病毒复制相关,随后的三次重复实验结果均显示,SPCS3基因是存活细胞中敲除率最高的基因,因此推测宿主蛋白SPCS3可能是影响ILTV复制的关键蛋白之一。4.比较ILTV在LMH细胞和SPCS3蛋白截短的LMH细胞系（分别命名为1-6和1-14）中的生长,在1-6细胞系中,ILTV的病毒滴度降低102.625倍,在1-14细胞系中,ILTV的病毒滴度降低103.75倍,表明SPCS3蛋白截短确实可以对ILTV的复制起到抑制作用。通过在线生物软件对ILTV中具有信号肽及多个跨膜结构的病毒蛋白进行预测,成功构建9个含有单一信号肽的病毒蛋白及4个含有多个跨膜结构的病毒蛋白真核表达质粒,转染细胞后,其中8个病毒蛋白成功表达,比较各病毒蛋白在LMH细胞及1-14细胞系中表达差异,结果显示,ILTV的衣壳糖蛋白L（gL）蛋白在两种细胞中的蛋白分子量差异明显,表明SPCS3蛋白截短影响了其切割gL蛋白的功能,这可能是影响ILTV复制的主要原因。5.为了解SPCS3蛋白截短对其它α疱疹病毒的影响,分别将鸭肠炎病毒（DEV）和人单纯疱疹病毒1型（HSV-1）两种α疱疹病毒感染LMH细胞和1-14细胞系,比较其生长差异。结果显示,与在LMH细胞上相比,DEV在1-14细胞系中病毒滴度降低102倍,而HSV-1在两种细胞上的生长无差异。进一步构建DEV和HSV-1两种病毒的gL蛋白真核表达质粒,分别转染LMH细胞和1-14细胞系后,两种病毒的gL蛋白在LMH细胞与1-14细胞系中,分子量大小无明显变化,但是DEV的gL蛋白在1-14细胞系中表达量明显低于LMH中的表达量,而HSV-1的gL蛋白在1-14细胞系种表达量没有明显变化,进一步表明截短的SPCS3可能影响gL蛋白的稳定性,从而影响DEV复制。本研究丰富了我国ILTV毒株全基因组序列生物学信息,明确了三株ILTV流行株的生物学特性。通过CRISPR/Cas9高通量筛选技术,筛选到一种与禽疱疹病毒复制相关的宿主蛋白分子,完善了ILTV复制中发挥关键作用的宿主蛋白作用机制,为ILTV致病分子机制研究尝试了新的思路。
展天松[6]（2021）在《鸽源新城疫病毒的进化和宿主偏嗜性分子机制研究》文中研究说明新城疫（Newcastle disease,ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）强毒引起的严重危害全球养殖业的主要疫病之一。鸽源新城疫病毒,也称为鸽Ⅰ型副黏病毒（pigeon paramyxovirus type 1,PPMV-1）,是鸡源NDV在鸽体内适应后形成的变异株,遍布世界各地,给养鸽业带来了巨大的经济损失。PPMV-1自上个世纪80年代传入我国之后,便在我国多个省份和地区长期存在并流行,严重阻碍了我国养鸽业的健康发展。为了解鸽群中PPMV-1的流行情况,本研究对2016～2020年从我国部分地区分离到的19株PPMV-1进行了分子流行病学调查,并测定了其生物学特性。接着进一步对我国PPMV-1进行了进化动力学分析,旨在阐明我国PPMV-1的进化和传播动态,同时也为制定科学的PPMV-1防控措施提供理论依据。已有研究表明,鸽源NDV具有明显的宿主偏嗜性,但是相关的分子机制并不明确,为此,本研究系统地比较了PPMV-1和鸡源NDV的生物学特性、致病性以及传播特性差异,然后利用反向遗传学技术进一步探究了 PPMV-1宿主偏嗜性的分子机制。1.2016～2020我国部分地区鸽源新城疫病毒的分子流行病学2016～2020年从我国部分地区的发病鸽的病料中共分离到19株PPMV-1。F基因遗传进化分析表明所有分离株均属于VI.2.1.1.2.2亚型。19株PPMV-1的F及HN核苷酸序列的同源性分别是96～99.9%和96.4～99.9%,氨基酸序列的同源性分别为96.4～99.8%和 96.5～99.8%,与欧洲毒株 PPMV-1/Belgium/11-09620/201 1 处于同一分支。19株分离株与目前我国广泛使用的疫苗株La Sota遗传距离较远,所有分离株与La Sota的F及HN基因核甘酸同源性分别为83.4～84.2%和81.8～82.6%,氨基酸序列的同源性分别为87.5～88.8%和86.7～87.4%。与VI.2.1.1.2.1亚型PPMV-1的F和HN蛋白进行对比,所有分离株均出现了特异性的氨基酸变化。19株PPMV-1分离株的F蛋白裂解位点基序均为112RRQKRF117,呈典型的强毒特征,但是ICPI测定结果显示,所有的分离株均属于中等毒力株,表明除了 F蛋白裂解位点之外,还有其他基因或者结构域影响了病毒毒力。值得注意的是,本研究发现虽然有些PPMV-1分离株在鸽源细胞和鸽中的复制水平相似,但是在鸡源细胞和鸡中的复制能力却有显着性差异,这提示在鸡源细胞上和鸡中能够高效复制的PPMV-1具有在鸡群中引起大流行的潜在风险。综上所述,本章揭示了当前我国部分地区PPMV-1的流行情况,也为进一步研究我国PPMV-1的进化动力学奠定了基础。2.我国鸽源新城疫病毒的进化动力学为了阐明我国PPMV-1的进化动力学,本研究首先基于427株NDV的F基因编码区绘制最大似然进化树,结果显示来自中国地区的186株PPMV-1均属于基因Ⅵ型,其中大多数毒株属于Ⅵ.2.1.1.2.2亚型。接着对186株PPMV-1的宿主来源进行统计,结果显示186株PPMV-1中有178株来源于鸽,这也进一步说明了 PPMV-1对鸽具有明显的宿主偏嗜性。历史种群大小重建表明我国PPMV-1的种群大小变化共经历了 6个不同的时期。采用贝叶斯方法对我国PPMV-1进行时空动力学分析,结果表明华东和华南地区是我国PPMV-1主要的扩散中心,介导了 PPMV-1八条迁移路线,在我国PPMV-1的传播过程中发挥着至关重要的作用。适应性进化分析表明,我国PPMV-1的6个基因均存在正向选择位点,其中大部分正向选择位点位于NP、P和L基因上面。氨基酸序列分析表明,与鸡源NDV相比,PPMV-1的6个蛋白中均有特异性氨基酸的替代,其中有23个位点位于NP、P和L蛋白上,其余9个位点位于M、F和HN蛋白上。适应性进化分析和氨基酸序列分析结果提示NP、P和L三个基因可能与PPMV-1的宿主偏嗜性有一定的关系。综上所述,本章系统地分析了我国PPMV-1的进化动力学,为了解我国PPMV-1的进化及制定合理的PPMV-1防控措施提供了理论参考,也为进一步深入研究PPMV-1的宿主偏嗜性提供了线索。3.鸽源和鸡源新城疫病毒的致病性和传播特性比较为了找到探究PPMV-1宿主偏嗜性分子机制的关键切入点,本研究系统地比较了PPMV-1（NT-10和JS/09/16/Pi）与鸡源NDV（Kuwait256）的生物学特性、致病性和传播特性差异。毒力指标MDT和ICPI测定结果表明Kuwait256为强毒株,NT-10和JS/09/16/Pi为中等毒力株。膜融合能力、病毒受体结合特性和神经氨酸酶活性分析结果表明Kuwait256的膜融合能力、受体结合能力和神经氨酸酶活性均明显高于NT-10和JS/09/16/Pi。此外,生长曲线测定结果表明Kuwait256在鸡源细胞中的复制能力显着强于NT-10和JS/09/16/Pi,相反Kuwait 256在鸽源细胞中的复制能力却不及NT-10和JS/09/16/Pi,但这3株病毒在哺乳动物细胞中的复制水平并没有显着差异。致病性试验结果表明Kuwait256能导致SPF鸡全部发病死亡,然而NT-10和JS/09/16/Pi并不能使SPF鸡产生明显的临床症状且在鸡体内的复制水平较低。值得注意的是,Kuwait 256,NT-10和JS/09/16/Pi均能导致鸽发病并死亡。鸽子传播试验结果表明NT-10和JS/09/16/Pi均能在鸽中有效传播,然而Kuwait 256却不能在鸽中进行传播。上述结果表明与鸡源NDV相比,鸽源NDV毒株在鸡体内复制能力弱,但在鸽中具有很强的传染能力,这为进一步研究PPMV-1宿主偏嗜性的分子机制提供了重要参考。4.鸽源新城疫病毒宿主偏嗜性的分子机制基于本研究已有结果,继续探讨PPMV-1宿主偏嗜性的分子机制。本研究首先构建了 Kuwait256株和NT-10株的感染性克隆,接着以NT-10株为骨架,利用反向遗传学技术,将Kuwait 256株的内部蛋白NP、P、L或者外部蛋白M、F、HN联合替换至NT-10上,成功构建并拯救了 2株重组病毒（rNT-KMFHN和rNT-KNPPL）。进一步评价了 2株重组病毒及其母本病毒的生物学特性、致病性以及传播特性差异。结果表明,NT-10骨架中同时表达Kuwait 256的NP、P和L基因时,重组病毒rNT-KNPPL的毒力和在鸡源细胞中的复制能力明显增强,与rKuwait256相似。此外,rNT-KNPPL对鸡的致病性以及在鸡中的复制能力也明显强于rNT-KMFHN和rNT-10。然而,与rNT-KMFHN和rNT-10相比,重组病毒rNT-KNPPL丧失了在鸽中的传播能力。综上所述,本研究结果表明NP、P和L基因是决定PPMV-1宿主偏嗜性的关键基因。
罗丹[7]（2021）在《新型鸭呼肠孤病毒流行株生物学特性研究及ELISA抗体检测方法的建立》文中研究说明新型鸭呼肠孤病毒病是由新型鸭呼肠孤病毒（Novel duck reovirus,NDRV）引起的以雏鸭肝脾出血或坏死为主要特征的免疫抑制病。自2017年以来,该病在我国养鸭主产省份及地区相继暴发,其发病率和死亡率迅速上升并持续扩散,给水禽养殖业造成严重经济损失。目前,NDRV分离株较少,关于其分子生物学特性及致病性方面的研究鲜有报道。为了丰富NDRV毒株资源库,本研究利用鸡胚传代方法从病鸭组织内成功分离到9株纯净性良好的NDRV毒株。研究表明,9株分离病毒均能100%致死鸡胚,且在Vero细胞中良好增殖;除SD19/6202外,其余8株分离病毒均能在鸡胚成纤维细胞（Chicken embryo fibroblast,CEF）中产生明显细胞病变（Cytopathic effect,CPE）。进一步σC基因遗传演化分析显示,9株分离病毒与已报道中国NDRVs均位于水禽呼肠孤病毒基因2型分支,该分支可分为2个不同的亚群;其中,SD19/6201和7株分离病毒与其他38株已报道中国流行NDRVs遗传距离较近,位于Ⅰ亚群,具有一定的代表性;而SD19/6202与DE150/China和HN5d/China-HN/2013则位于II亚群,与大多数已报道的中国NDRVs遗传距离较远。σC氨基酸序列比对发现,CEF适应病毒代表株SD19/6201和CEF非适应病毒SD19/6202之间共存在13个氨基酸差异位点。将SD19/6201和SD19/6202感染1日龄雏鸭后,呈现与临床自然发病鸭相似的病症,发病鸭脾脏出血/坏死,病毒载量最高,而其他脏器则无明显病变,病毒载量较低,脾脏出血/坏死可以作为NDRV感染雏鸭的发病指标。为进一步了解NDRV的基因组特征,我们测定了复制特性存在明显差异的两株病毒（SD19/6201和SD19/6202）的全基因组序列,结果显示,2株病毒具有典型NDRV基因组结构特点,均属于水禽呼肠孤病毒基因2型。随后,我们对流行代表毒株SD19/6201的体外增殖特性进行研究,结果显示该毒株在细胞（Vero和CEF）和禽胚（鸡胚和鸭胚）中均可良好增殖,且对鸡胚和鸭胚呈高致死性。同时,我们建立了NDRV在14日龄和21日龄雏鸭上的感染模型,确定了NDRV在14日龄雏鸭上的推荐感染剂量为105.0ELD50/0.1 m L,21日龄雏鸭推荐感染剂量为106.0 ELD50/0.1 m L,推荐剖检时间均为感染后第7 d,此时脾脏病变比率均为80%（8/10）。NDRV流行株增殖特性的明确和动物感染模型的建立,为NDRV疫苗研发及免疫效果评价提供了理论基础。σB蛋白是NDRV外衣壳蛋白的主要成分,其携带群特异型中和抗原决定簇,能够诱导机体产生群特异性中和抗体,可作为靶蛋白制备诊断试剂。鉴于目前国内尚无商品化的NDRV ELISA抗体检测试剂盒,本研究以原核表达系统表达的NDRVσB蛋白作为包被抗原,建立了NDRV ELISA抗体检测方法。该方法与其他外源病毒阳性血清均无交叉反应,特异性良好;与IFA相比,本研究建立的NDRV检测方法具有更高的敏感性;使用该方法与IFA共检测368份临床血清,两者符合率为99.40%;该方法的成功建立,为我国NDRV的流行病学调查以及疫苗的评价提供了有效的技术手段。
吴颖[8]（2021）在《H3亚型犬流感病毒的分离鉴定及其荧光定量RT-PCR方法的建立》文中研究表明犬流感是由犬流感病毒（Canine Influenza Virus,CIV）引起的一种犬的接触性呼吸道传染病,患犬主要表现为发热、咳嗽、流涕等呼吸道症状。目前,犬群中主要流行H3N2和H3N8亚型CIV。犬作为伴侣动物与人类接触密切,流感病毒很有可能通过犬传染给人。因此,加强对犬流感的监测并建立一种快速诊断犬流感的检测方法具有重要的公共卫生学意义。本研究首先对2018-2020年自黑龙江省、江苏省、浙江省、河北省、云南省和宁夏回族自治区的部分地区采集的3758份犬鼻拭子进行鸡胚接种,成功分离到4株H3N2亚型CIV,对分离的病毒进行系统的遗传演化分析、受体结合特性分析和抗原性分析。病毒遗传演化分析结果表明,各分离毒株与早期韩国和中国H3N2亚型CIV位于同一分支,并与2016年后国内H3N2亚型CIV形成独立分支。4株病毒各基因片段核苷酸同源性均在98%以上,且各毒株NA基因头部均出现2个氨基酸缺失。抗原性分析结果显示,本研究各病毒阳性血清之间具有良好的交叉反应,且与3株H3N2亚型禽流感病毒的阳性血清均出现交叉血凝现象,但是与H3N2亚型猪流感病毒和WHO推荐的H3N2亚型人流感疫苗株的阳性血清均不反应。受体结合特性分析结果显示,4株H3N2亚型CIV可以同时结合α-2,6唾液酸受体和α-2,3唾液酸受体,但仍以结合α-2,3唾液酸受体为主。鉴于部分犬感染CIV后症状不明显或排毒量较少,从而对CIV的临床诊断造成困难。本研究根据国内外各亚型CIV的M基因和H3亚型CIV的HA基因核苷酸序列,设计并合成特异性引物和探针。通过优化反应体系和条件,分别建立了通用型和H3亚型CIV荧光定量PCR检测方法。建立的两种方法特异性强、敏感性高、重复性好、操作简便。不仅可以对病毒进行定性分析,还能通过建立标准曲线对病毒进行定量分析。敏感性结果显示,两种方法对质粒标准品的检测限度分别为150copies/μL和19copies/μL;重复性试验结果显示,两种方法的变异系数均小于2%。本研究建立的两种方法与病毒分离结果相比,符合率均在95%以上。综上所述,本研究对分离到的4株H3N2亚型CIV进行了系统的遗传演化分析,并建立了快速检测通用型和H3亚型CIV的荧光定量PCR方法,对有效控制CIV在犬群中的流行,预防人类流感的大流行具有重要意义。
刘开拓[9]（2021）在《HA蛋白受体结合区及邻近区域适应性变异协同PB2-627K增强H9N2亚型禽流感病毒对小鼠致病性的机制研究》文中提出H9N2亚型禽流感病毒（Avianinfluenzavirus,AIV）当前在我国广泛流行,不仅对家禽养殖业造成巨大的经济损失,同时还可跨种间传播感染人,潜在威胁公共卫生安全。活禽市场从业人员中较高的抗体阳性率表明H9N2亚型AIV跨种间感染人的现象非常普遍,但由于对人的致病性较低导致H9N2感染人的报道较少。AIV对哺乳动物的致病性是多基因协同作用的结果,其中影响毒株受体结合特性的HA以及影响AIV在哺乳动物细胞中复制能力的PB2基因起到重要作用。因此探究H9N2 HA和PB2关键氨基酸变异对哺乳动物的致病性以及致病机制对防控未来可能存在的大流行具有重要的指导意义。本实验室在对华东地区活禽市场进行流行病学监测过程中分离到一株H9N2毒株,该毒株在HA和PB2蛋白上天然具有多个哺乳动物标记位点,但对小鼠为低致病性。为了探究可增强该H9N2毒株对小鼠致病性的其它分子标记,我们通过人工适应以及自然毒株基因序列比对分析的方法发现了多个未曾报道的HA蛋白关键位点,同时对这些位点导致H9N2对小鼠致病性增强的机制进行了探究。1 天然携带哺乳动物分子标记的H9N2病毒SDKD1/15株生物学特性测定在对华东地区AIV进行流行病学调查过程中,我们分离到一株天然具有哺乳动物分子标记的禽源H9N2毒株A/chicken/Eastern China/SDKD1/2015（SDKD1/15）。该毒株在HA蛋白上存在可增强AIV对α-2,6-SA结合能力的226L和228S分子标记;同时在PB2蛋白上存在可增强AIV在哺乳动物细胞中复制能力的E627K突变。在体外实验中,SDKD1/15毒株具有双受体结合特性,在哺乳动物源细胞中的复制效率显着高于禽源细胞,表明对哺乳动物的适应性较好。在对小鼠致病性实验中,SDKD1/15虽然天然具有HA（226L和228S）和PB2-627K等哺乳动物分子标记,但仅可在小鼠个别器官中进行短暂的低滴度复制,对小鼠为低致病性（MLD50>107.5 EID50）。另外SDKD1/15可通过气溶胶的方式在鸡群中传播,具备在家禽中大流行的潜力;同时可通过气溶胶传播的方式感染豚鼠,具有较强的跨种间传播能力。综上所述,我们的研究表明虽然SDKD1/15毒株在一定程度上适应了哺乳动物,但还需要基因组其它未知位点的协助才能增强H9N2毒株对哺乳动物的致病性。2 H9N2毒株SDKD1/15在小鼠体内的适应性研究为了探究H9N2在哺乳动物体内的适应机制,我们将SDKD1/15毒株在小鼠肺脏中连续六次传代获得对小鼠致病性显着增强的SDKD1-P6毒株。相比于野生毒株,SDKD1-P6在全基因组中仅在HA蛋白上存在T187P,222-224位缺失（△222-224）和M227L突变,这些位点均位于受体结合区或邻近区域。通过反向遗传学实验发现△222-224单独突变以及T187P+M227L联合突变均可显着增强H9N2毒株在小鼠肺脏和气管中的复制水平和持续时间,以及对肺脏的病理损伤,从而增强对小鼠的致病性。在体外实验中,△222-224单独突变以及T187P+M227L联合突变均可显着增强H9N2毒株在感染哺乳动物细胞初期的复制水平,增强毒株在MDCK细胞中形成噬斑的能力。以上生物学特性的改变是由于HA蛋白突变（△222-224,T187P+M227L）可显着增强H9N2毒株对α2,6-SA受体的结合能力,以及对哺乳动物细胞和小鼠肺脏组织的亲和力。流感病毒的传播性同样和HA蛋白密切相关。△222-224单独突变以及T187P+M227L联合突变均不能使H9N2通过气溶胶的方式在豚鼠间传播,但T187P+M227L可使H9N2毒株具备在豚鼠间接触传播的能力。流感病毒对宿主的致病性是多基因共同作用的结果。我们的研究表明HA蛋白突变（△222-224,T187P+M227L）需和PB2-627K协同作用才能导致H9N2增强对小鼠的致病性,另外这种特性不只在母本毒株SDKD1/15中起作用,在其它H9N2毒株中可获得同样的结论,因此排除毒株特异性。综上所述,我们的研究新发现了 HA受体结合区及邻近区域位点变异协同PB2-627K增强H9N2对小鼠致病性,并阐明了致病机制,为防范H9N2病毒在未来可能存在的大流行提供了有价值的信息。3 HA蛋白受体结合区198位变异影响H9N2亚型AIV对小鼠致病性的机制研究AIV在适应进化的过程中可自然发生氨基酸突变,但需要多个关键突变位点的积累才能使毒株具备跨种间传播和对宿主致病性增强的能力,因此很多重要的突变在毒株生物学特性改变之前不能被及时发现,导致应对大流行的滞后性。在本章的研究中我们发现同样具有PB2-627K分子标记的两株H9N2拯救毒株对小鼠的致病性存在显着差异,其中HA蛋白是导致这种差异的决定性因素。通过反向遗传学技术进行差异氨基酸的正向和反向单点突变,发现198N和198T分别可显着降低和增强H9N2毒株在小鼠肺脏中的复制水平以及对小鼠的致病性。198位氨基酸位于HA蛋白头部区域的190-helix区域,同时N198T突变导致HA蛋白糖基化位点数目的减少,因此该位点的改变可能影响毒株的受体结合特性。我们的研究表明198T和198N分别可显着增强和降低H9N2毒株对小鼠肺脏组织的亲和力,这或许是导致突变毒株对小鼠致病性不同的原因。流感病毒对宿主的致病性是多基因共同作用的结果,HA-198T同样需要和PB2-627K联合作用才能导致H9N2毒株增强对小鼠的致病性。另外198位氨基酸位点的改变不影响H9N2毒株的抗原性以及热稳定性。重要的是,可增强对小鼠致病性的198T分子标记在当前H9N2流行毒株中占绝对优势（93.82%）,表明H9N2对公共卫生安全的威胁较大。综上所述,我们的研究新发现了 HA蛋白受体结合区优势流行位点198T和PB2-627K协同作用可显着增强H9N2亚型AIV对小鼠的致病性,为防范未来可能存在的H9N2大流行提供了预警信息。4 HA蛋白受体结合区222-224位缺失增强H9N2亚型AIV对小鼠致病性的宿主因素分析决定病毒对宿主致病力强弱的因素包括两个方面:一个是病毒本身的特性,另一个是病毒感染后宿主所作出的应答。我们将感染rSDKD1-WT和rSDKD1-△222-224毒株的小鼠肺脏进行转录组和蛋白质组联合测序分析,发现HA蛋白△222-224突变使H9N2毒株诱导更多的宿主基因和蛋白差异表达。进一步的生物信息功能分析结果表明rSDKD1-△222-224诱导的差异基因/蛋白参与的免疫相关生物过程条目显着多于rSDKD1-WT毒株;KEGG通路分析结果显示rSDKD1-WT毒株诱导的少数差异基因/蛋白仅参与RIG-I-like受体信号通路,而rSDKD1-△222-224毒株诱导的差异基因/蛋白参与了几乎所有重要的免疫相关信号通路。我们进一步对这些天然免疫相关基因/蛋白的表达水平进行了分析,结果显示rSDKD1-△222-224毒株可使大部分蛋白/基因表达水平上调,个别下调。综上所述HA蛋白△222-224突变使H9N2毒株诱导了更广泛以及更强烈的免疫反应,异常的免疫应答导致了严重的肺脏病理变化,因此增强了对小鼠的致病性。
刘艳晶[10]（2021）在《重组禽流感病毒（H5+H7）三价灭活疫苗（H5N1 Re-11株+Re-12株，H7N9 H7-Re3株）研究》文中研究表明高致病性禽流感是H5亚型和H7亚型流感病毒引起的一种禽类高度致死性传染病,它不仅严重危害养禽业发展,而且还具有重大公共卫生意义。疫苗免疫是中国防治禽流感的重要手段之一,鉴于禽流感病毒突变率高,疫苗株应定期测评,必要时进行更新。国家禽流感参考实验室通过对禽流感监测、病毒分离鉴定及现用疫苗对流行病毒免疫效果评估表明,从2019年起,H7N9变异株在我国出现,与原三价疫苗中H7N9 H7-Re2病毒的抗原性存在差异,攻击H7-Re2株疫苗免疫鸡后,免疫鸡不能获得完全保护,需要进行疫苗种毒更新;而H5亚型禽流感病毒流行株与疫苗株抗原性相似,现有疫苗可以起到完全保护的作用,因此不需要更新种毒。国家禽流感参考实验室利用反向遗传操作技术进行H7N9禽流感疫苗种毒更新,构建出针对H7N9病毒抗原变异株的重组禽流感病毒疫苗候选株,命名为H7-Re3株。本研究首先对重组H7N9亚型H7-Re3株的生物特性、传代稳定性和免疫原性等进行了研究。结果表明,该毒株在鸡胚上能稳定传代且生长滴度高,对鸡胚和鸡均无致病性,具有良好的免疫原性,免疫鸡能抵御流行病毒的攻击,因此该毒株是理想的灭活疫苗毒株。随后,用H5亚型Re-11株、Re-12株和H7亚型H7-Re3株病毒分别接种鸡胚培养,收获感染鸡胚液,经浓缩、甲醛溶液灭活后,乳化制成3批三价灭活苗,并进行疫苗性状检验、对鸡的安全性、免疫效力、对流行毒株的免疫保护试验以及抗体和攻毒保护关系试验。结果显示,3批疫苗均合格;以2 m L/羽的剂量接种家禽,均无副作用。按建议剂量接种后,免疫后21 d,SPF鸡H5亚型Re-11株、Re-12株、H7亚型H7-Re3株平均HI抗体效价在7.7 log2以上,SPF鸭3种毒株HI抗体效价在1:124～1:148之间,商品鹅3种毒株HI抗体效价在1:32～1:44之间;用H5亚型2.3.4.4d分支、2.3.2.1d分支和H7N9效力检验毒株及流行株攻击免疫家禽,免疫家禽均无发病死亡且不排毒。以上结果表明,3批H5+H7三价灭活疫苗免疫鸡和水禽后能够对2019年监测到的H7N9抗原变异株及H5亚型2.3.4.4d分支、2.3.2.1d分支的代表毒株攻击提供完全免疫保护。疫苗接种后HI抗体与攻毒保护关系的研究表明,免疫鸡H5亚型Re-11株、Re-12株和H7亚型H7-Re3株HI抗体≥4log2时可对H5和H7亚型相应效检毒株攻击提供完全保护;H5亚型和H7亚型3种HI抗体≥1:10的免疫鸭,可为同源H5亚型和异源H7亚型效检毒株提供完全保护。最后,我们评估了重组禽流感病毒（H5+H7）三价灭活疫苗（H5N1 Re-11株+Re-12株,H7N9H7-Re3株）的临床应用效果,主要包括安全性和免疫效果两方面,选取山东某场白羽肉种鸡、哈尔滨某场商品蛋鸡、宁夏某场蛋种鸡和山东某场种鸭进行评估。结果显示,鸡群和鸭群按照各自程序免疫三价疫苗后,均表现正常,疫苗安全性良好,同时能够让免疫鸡和鸭产生较高水平的抗体,具有良好的免疫效力,能够保护鸡群和鸭群免受H5和H7亚型高致病性禽流感病毒的攻击。本研究表明,重组禽流感病毒（H5+H7）三价灭活疫苗（H5N1 Re-11株+Re-12株,H7N9 H7-Re3株）对鸡和水禽具有很好的安全性和免疫效果。该疫苗已于2020年9月开始在全国范围内应用,并取得了良好的效果,对H5和H7禽流感的防控起到了非常重要的作用。
二、我国马流感病毒不同分离株实验感染SPF鸡的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、我国马流感病毒不同分离株实验感染SPF鸡的研究（论文提纲范文）
（1）两株H9N2亚型禽流感病毒的遗传演化及其致病性分析（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要实验材料 |
| 1.2病毒的纯化及鸡胚半数感染量（EID50）的测定 |
| 1.3 病毒全基因组测序及遗传演化分析 |
| 1.4 SPF鸡和鸭的感染性试验 |
| 1.5 小鼠感染性试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 两株H9N2亚型AIV EID50的测定及遗传演化分析 |
| 2.1.1 HA的分子特征及其遗传进化分析 |
| 2.1.2 NA的分子特征及其进化分析 |
| 2.1.3内部基因编码序列特殊氨基酸位点的分析 |
| 2.2 分离病毒对SPF鸡的感染性试验结果 |
| 2.3 分离病毒对SPF鸭的感染性试验结果 |
| 2.4 分离病毒对BALB/c小鼠的感染性试验结果 |
| 3 讨论 |
（2）我国部分地区禽星状病毒分子流行病学调查及其基因组特性研究（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 病原学 |
| 1.1.1 病毒分类 |
| 1.1.2 病毒基因组结构 |
| 1.1.3 病毒结构蛋白 |
| 1.2 流行病学 |
| 1.3 临床症状及致病机理 |
| 1.4 检测方法 |
| 1.4.1 电镜检测 |
| 1.4.2 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 1.4.3 病毒分离和细胞培养 |
| 1.4.4 分子学检测方法 |
| 1.4.5 高通量测序 |
| 1.5 预防和控制 |
| 1.6 本研究的目的与意义 |
| 2 材料方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 样品来源 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 引物设计与合成 |
| 2.1.4 主要试剂及配制 |
| 2.1.5 主要仪器及设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 禽星状病毒的分子流行病学调查 |
| 2.2.2 病毒的分离鉴定 |
| 2.2.3 禽星状病毒的基因组特性 |
| 3 结果 |
| 3.1 禽星状病毒的分子流行病学调查 |
| 3.1.1 禽星状病毒流行病学调查结果 |
| 3.1.2 基于RdRp序列的遗传进化分析 |
| 3.1.3 禽星状病毒的分布情况 |
| 3.2 病毒的分离鉴定 |
| 3.2.1 病毒的分离 |
| 3.2.2 外源病毒检测结果 |
| 3.2.3 半数感染量(EID_(50))测定结果 |
| 3.2.4 致病性试验 |
| 3.3 禽星状病毒的基因组特性 |
| 3.3.1 核苷酸同源性分析 |
| 3.3.2 氨基酸同源性分析 |
| 3.3.3 禽星状病毒基因组的遗传进化分析 |
| 3.3.4 蛋白的抗原表位预测分析 |
| 3.3.5 蛋白的跨膜区结构预测分析 |
| 3.3.6 蛋白疏水性预测分析 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间论文及研究成果 |
（3）候鸟禽流感病毒遗传变异规律分析及在哺乳动物间传播机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 流感病毒病原学 |
| 1.1 流感病毒概述 |
| 1.2 流感病毒病原生态学特点 |
| 第二章 流感病毒受体 |
| 2.1 流感病毒受体概述 |
| 2.2 唾液酸的结构及种类 |
| 2.3 不同动物唾液酸受体的异质性 |
| 2.4 不同物种间流感病毒唾液酸受体的分布 |
| 2.5 病毒结合不同唾液酸受体的分子机制 |
| 2.6 流感病毒唾液酸受体研究方法 |
| 第三章 禽流感病毒跨种传播 |
| 3.1 禽流感病毒跨种传播的发生 |
| 3.2 影响禽流感病毒跨种传播的病原因素-基因突变 |
| 3.3 影响禽流感病毒跨种传播的病原因素-基因重组 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 中国东部地区候鸟禽流感流行病学调查研究 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 实验用鸡胚和细胞 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.1.4 样品采集 |
| 1.1.5 禽流感病毒分离 |
| 1.1.6 禽流感病毒RNA的提取 |
| 1.1.7 禽流感病毒高通量测序 |
| 1.1.8 候鸟禽流感病毒抗体检测 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 样品采集及毒株分离情况 |
| 1.2.2 候鸟AIVs亚型多样性和宿主特异性 |
| 1.2.3 H9N2 禽流感病毒在候鸟中流行的血清学调查 |
| 1.2.4 2020 年候鸟H5N8 禽流感病毒检测及抗原性分析 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 中国东部候鸟禽流感病毒遗传进化分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验用毒株 |
| 2.1.2 候鸟源禽流感病毒基因组收集及比对 |
| 2.1.3 系统发生分析 |
| 2.1.4 进化动力学的空间系统发育重建 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 候鸟源禽流感病毒遗传变异分析 |
| 2.2.2 候鸟源H9N2 禽流感病毒遗传进化分析 |
| 2.2.3 候鸟源H3N8 禽流感病毒遗传进化分析 |
| 2.2.4 候鸟源H13 亚型禽流感病毒遗传变异分析 |
| 2.2.5 候鸟源H5N8 禽流感病毒遗传变异分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 中国东部候鸟禽流感病毒分离株受体结合特性研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验用毒株 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 红细胞法检测禽流感病毒受体 |
| 3.1.5 糖芯片法检测禽流感病毒受体 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 候鸟禽流感病毒红细胞法受体测定 |
| 3.2.2 候鸟禽流感病毒糖芯片法受体测定 |
| 3.2.3 候鸟禽流感病毒结合聚糖结构分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 候鸟禽流感病毒在哺乳动物间跨种传播能力评估 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验用毒株 |
| 4.1.2 实验用动物 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 主要仪器 |
| 4.1.5 小鼠致病性实验 |
| 4.1.6 豚鼠间传播实验 |
| 4.1.7 雪貂间呼吸道飞沫传播实验 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 候鸟H9N2 亚型禽流感病毒小鼠致病性 |
| 4.2.2 候鸟H9N2 亚型禽流感病毒豚鼠间传播 |
| 4.2.3 候鸟H9N2 亚型禽流感病毒雪貂间传播 |
| 4.2.4 候鸟H5N8 禽流感病毒小鼠致病性 |
| 4.2.5 候鸟H5N8 禽流感病毒豚鼠间传播 |
| 4.2.6 候鸟H3 亚型禽流感病毒豚鼠间传播 |
| 4.2.7 候鸟T222 分离株及豚鼠适应一代毒株雪貂间呼吸道飞沫传播 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 候鸟源H3N8 禽流感病毒在哺乳间传播的分子机制研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验用毒株、细胞及载体 |
| 5.1.2 实验用动物 |
| 5.1.3 主要试剂 |
| 5.1.4 主要仪器 |
| 5.1.5 候鸟源H3N8 流感病毒野毒株RNA提取 |
| 5.1.6 候鸟源H3N8 流感病毒野毒株c DNA制备 |
| 5.1.7 候鸟源H3N8 流感病毒野毒株全基因组及载体扩增 |
| 5.1.8 候鸟源H3N8 流感病毒野毒株感染性克隆的构建 |
| 5.1.9 候鸟源H3N8 禽流感病毒及其突变株的体外拯救 |
| 5.1.10 流感病毒聚合酶活性检测 |
| 5.1.11 病毒滴定和复制动力学测定 |
| 5.1.12 动物实验 |
| 5.1.13 雪貂适应1 代毒株测序 |
| 5.1.14 雪貂适应1 代毒及受体结合能力检测 |
| 5.1.15 病理及组化 |
| 5.1.16 统计分析 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 T222 毒株及T222-G1 毒株氨基酸差异比对 |
| 5.2.2 rT222-wild及 rT222-S524G突变株拯救 |
| 5.2.3 rT222-wild及 rT222-S524G豚鼠间传播 |
| 5.2.4 rT222-wild及 rT222-S524G雪貂间呼吸道飞沫传播 |
| 5.2.5 rT222-wild及 rT222-S524G雪貂间传播变异分析 |
| 5.2.6 雪貂适应1 代毒株受体结合检测 |
| 5.2.7 PB1-S524G增强了病毒聚合酶活性 |
| 5.2.8 PB1-S524G增强了H3N8 禽流感病毒的体外复制能力 |
| 5.2.9 PB1-S524G增强了H3N8 禽流感病毒的体内复制能力 |
| 5.2.10 PB1-S524G增强了H3N8 禽流感病毒对小鼠的致病性 |
| 5.2.11 PB1-S524G增加了H3N8 禽流感病毒对雪貂的致病性 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 学位期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（4）血清4型禽腺病毒广西分离株全基因组测序分析、检测方法和致病性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 禽腺病毒病原学 |
| 1.1.1 分类 |
| 1.1.2 病原特征 |
| 1.1.3 基因组结构特征 |
| 1.1.4 禽腺病毒主要结构蛋白及其功能 |
| 1.1.5 理化特性 |
| 1.1.6 分离鉴定 |
| 1.2 心包积液-肝炎综合征的流行病学 |
| 1.2.1 流行情况 |
| 1.2.2 传播途径 |
| 1.2.3 自然宿主及易感动物 |
| 1.2.4 临床症状 |
| 1.2.5 组织病理学变化 |
| 1.3 禽腺病毒诊断方法 |
| 1.3.1 血清学诊断方法 |
| 1.3.2 分子生物学诊断方法 |
| 1.4 环介导等温核酸扩增(LAMP)技术研究概况 |
| 1.4.1 LAMP原理 |
| 1.4.2 可视化LAMP技术 |
| 1.4.3 LAMP技术与其他技术的联合应用 |
| 1.5 防控措施 |
| 1.5.1 加强饲养管理,改善饲养环境 |
| 1.5.2 疫苗预防 |
| 1.6 研究目的与意义 |
| 第二章 6 株血清4 型禽腺病毒广西分离株全基因组测序与分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 毒株和鸡胚 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 引物设计与合成 |
| 2.2.2 病毒的增殖 |
| 2.2.3 病毒全基因组序列的测定 |
| 2.2.4 全基因组序列拼接 |
| 2.2.5 全基因组生物信息学分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 全基因组测序结果 |
| 2.3.2 全基因组序列比对分析 |
| 2.3.3 全基因组核苷酸序列相似性分析 |
| 2.3.4 系统发育分析 |
| 2.3.5 FAdV-4 主要结构蛋白分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 血清4 型禽腺病毒变异株和非变异株二重荧光LAMP鉴别检测方法的建立 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 毒株 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 引物和探针的设计与合成 |
| 3.2.2 标准品制备 |
| 3.2.3 LAMP反应体系的初步建立 |
| 3.2.4 LAMP反应体系的优化 |
| 3.2.5 LAMP特异性试验 |
| 3.2.6 LAMP敏感性试验 |
| 3.2.7 LAMP干扰性试验 |
| 3.2.8 临床样品的检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 反应体系的优化 |
| 3.3.2 LAMP结果的可视性观察 |
| 3.3.3 二重荧光LAMP方法的建立 |
| 3.3.4 特异性试验 |
| 3.3.5 敏感性试验 |
| 3.3.6 干扰性试验 |
| 3.3.7 临床样品检测 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 血清4 型禽腺病毒广西分离株致病性研究 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 毒株与试验动物 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器设备 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 病毒的增殖 |
| 4.2.2 病毒TCID_(50)的测定 |
| 4.2.3 肌肉注射不同剂量FAdV-4 感染4 周龄SPF鸡 |
| 4.2.4 不同途径相同剂量FAdV-4 感染4 周龄SPF鸡 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 肌肉注射不同剂量FAdV-4感染4周龄SPF鸡 |
| 4.3.2 不同途径相同剂量FAdV-4感染4周龄SPF鸡 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（5）鸡传染性喉气管炎病毒流行株生物学特征及影响其复制相关宿主蛋白作用机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 引言 |
| 1.1 鸡传染性喉气管炎及鸡传染性喉气管炎病毒概述 |
| 1.1.1 鸡传染性喉气管炎病毒的发现及分类 |
| 1.1.2 鸡传染性喉气管炎流行病学 |
| 1.1.3 鸡传染性喉气管炎病毒的粒子特点及理化特性 |
| 1.1.4 鸡传染性喉气管炎的诊断与防控措施 |
| 1.2 鸡传染性喉气管炎病毒的分子生物学特征及研究进展 |
| 1.2.1 鸡传染性喉气管炎病毒基因组结构及特征 |
| 1.2.2 鸡传染性喉气管炎病毒与致病力及复制相关的主要基因 |
| 1.2.3 鸡传染性喉气管炎病毒的复制机制及细胞间的传播机制 |
| 1.3 CRISPR/Cas9基因编辑技术概述 |
| 1.3.1 CRISPR/Cas9系统介绍 |
| 1.3.2 CRISPR/Cas9系统的分类及作用机制 |
| 1.3.3 全基因组文库CRISPR/Cas9筛选 |
| 1.4 本研究目的与意义 |
| 2 试验一三株传染性喉气管炎病毒的生长特性及致病性研究 |
| 2.1 主要材料 |
| 2.1.1 毒株、鸡胚、细胞及试验动物来源 |
| 2.1.2 主要试剂与试剂盒 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 三株ILTV毒价的测定 |
| 2.2.2 三株ILTV生长趋势的比较 |
| 2.2.3 三株ILTV致病性试验 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 三株ILTV毒价测定 |
| 2.3.2 生长趋势比较 |
| 2.3.3 感染鸡临床症状 |
| 2.3.4 抗体检测 |
| 2.3.5 三株ILTV qPCR组织脏器分布 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 3 试验二三株传染性喉气管炎病毒基因组序列的测定与分析 |
| 3.1 主要材料 |
| 3.1.1 毒株、鸡胚、细胞及试验动物来源 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 ILTV的扩增 |
| 3.2.2 ILTV的纯化 |
| 3.2.3 ILTV的基因组DNA提取 |
| 3.2.4 ILTV全基因组高通量测序 |
| 3.2.5 基因组结构注释 |
| 3.2.6 三株ILTV全基因组及蛋白的进化与比较分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 三株ILTV病毒纯化后病毒基因组DNA电泳图 |
| 3.3.2 ILTV全基因组高通量测序 |
| 3.3.3 三株ILTV基因组结构注释 |
| 3.3.4 三株ILTV全基因组及相关蛋白系统进化树分析 |
| 3.3.5 三株ILTV重要蛋白的比较分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4 试验三利用CRISPR/Cas9敲除技术筛选对ILTV复制相关的宿主因子 |
| 4.1 主要材料 |
| 4.1.1 毒株、菌株及细胞来源 |
| 4.1.2 主要试剂与试剂盒 |
| 4.1.3 主要仪器设备 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 鸡全基因组CRISPR/Cas9敲除文库的构建 |
| 4.2.2 鸡全基因组CRISPR/Cas9敲除文库质粒的提取 |
| 4.2.3 鸡全基因组CRISPR/Cas9慢病毒的包装 |
| 4.2.4 鸡全基因组CRISPR/Cas9LMH细胞文库的构建 |
| 4.2.5 ILTV感染阳性细胞 |
| 4.2.6 LMH细胞基因组DNA的提取 |
| 4.2.7 引物设计 |
| 4.2.8 PCR产物胶回收 |
| 4.2.9 高通量测序 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 鸡全基因组CRISPR/Cas9建库结果 |
| 4.3.2 慢病毒感染效率 |
| 4.3.3 嘌呤霉素筛选靶细胞 |
| 4.3.4 ILTV病毒筛选靶细胞 |
| 4.3.5 sgRNA扩增结果 |
| 4.3.6 高通量测序结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 5 试验四与宿主蛋白SPCS3相互作用的ILTV相关病毒蛋白的分析 |
| 5.1 主要材料 |
| 5.1.1 主要毒株、菌株及细胞来源 |
| 5.1.2 主要试剂与试剂盒 |
| 5.1.3 主要仪器设备 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 SPCS3多克隆抗体的制备 |
| 5.2.2 ILTV在截短细胞系与正常细胞上生长差异的确定 |
| 5.2.3 ILTV蛋白的构建与表达 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 SPCS3蛋白截短细胞系验证 |
| 5.3.2 ILTV在1-14细胞和LMH细胞生长差异 |
| 5.3.3 LMH与SPCS3蛋白截短细胞系转染效率比较 |
| 5.3.4 ILTV蛋白表达 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 6 试验五SPCS3蛋白截短表达对其它α疱疹病毒复制的影响 |
| 6.1 主要材料 |
| 6.1.1 毒株、菌株及细胞来源 |
| 6.1.2 主要试剂 |
| 6.1.3 主要仪器设备 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 DEV和HSV-1在LMH及1-14细胞上的毒价滴定 |
| 6.2.2 DEV和HSV-1在LMH细胞与1-14细胞上生长差异的确定 |
| 6.2.3 DEV和HSV-1的病毒蛋白gL(UL1)蛋白在LMH细胞与1-14细胞表达差异的确定 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 DEV及HSV-1的毒价结果 |
| 6.3.2 DEV及HSV-1在LMH及1-14细胞上生长差异比较结果 |
| 6.3.3 DEV及HSV-1的gL蛋白在LMH及1-14细胞上表达差异比较 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 7 全文讨论 |
| 8 全文结论 |
| 9 创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（6）鸽源新城疫病毒的进化和宿主偏嗜性分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 综述 鸽源新城疫病毒的进化和宿主偏嗜性研究进展 |
| 1 新城疫病毒概述 |
| 2 鸽新城疫的流行情况 |
| 3 鸽源新城疫病毒的进化 |
| 4 鸽源新城疫病毒的宿主偏嗜性 |
| 5 研究目的和意义 |
| 第一章 2016～2020年我国部分地区鸽源新城疫病毒流行病学调查 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株 |
| 1.2 鸡胚、鸽胚、细胞和实验动物 |
| 1.3 主要试剂与仪器 |
| 1.4 分子生物学软件 |
| 2 方法 |
| 2.1 病毒的分离鉴定 |
| 2.2 病毒的纯化 |
| 2.3 病毒RNA提取与反转录 |
| 2.4 PCR反应与琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.5 PCR产物回收与序列测定 |
| 2.6 病毒F和HN基因序列分析 |
| 2.7 病毒的生物学特性测定 |
| 2.8 病毒感染鸡和鸽子的排毒监测 |
| 3 结果 |
| 3.1 2016～2020年PPMV-1流行病学监测情况 |
| 3.2 F基因序列分析 |
| 3.3 HN基因序列分析 |
| 3.4 病毒生物学特性分析 |
| 3.5 病毒感染鸡和鸽子的排毒情况 |
| 4 讨论 |
| 第二章 我国鸽源新城疫病毒的进化动力学分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 数据材料 |
| 1.2 主要试剂与仪器 |
| 1.3 分子生物学软件 |
| 2 方法 |
| 2.1 12株PPMV-1全基因组序列的测定 |
| 2.2 序列处理 |
| 2.3 遗传进化分析 |
| 2.4 进化速率计算和历史种群大小重建 |
| 2.5 时空动力学分析 |
| 2.6 适应性进化分析 |
| 2.7 氨基酸序列分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 遗传进化分析 |
| 3.2 进化速率和历史种群大小估算 |
| 3.3 中国地区PPMV-1时空动力学研究 |
| 3.4 适应性进化分析结果 |
| 3.5 氨基酸序列分析结果 |
| 4 讨论 |
| 第三章 鸽源和鸡源新城疫病毒的致病性和传播特性比较 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株 |
| 1.2 鸡胚、鸽胚、细胞和实验动物 |
| 1.3 主要试剂与仪器 |
| 1.4 分子生物学软件 |
| 2 方法 |
| 2.1 病毒的生物学特性测定 |
| 2.2 病毒对SPF鸡和鸽子的致病性分析 |
| 2.3 鸽子传播试验 |
| 3 结果 |
| 3.1 病毒毒力比较 |
| 3.2 膜融合能力分析 |
| 3.3 病毒受体结合特性分析 |
| 3.4 病毒神经氨酸酶活性分析 |
| 3.5 病毒生长曲线测定 |
| 3.6 病毒对SPF鸡和鸽子的致病性分析 |
| 3.7 鸽子传播试验 |
| 4 讨论 |
| 第四章 鸽源新城疫病毒宿主偏嗜性的分子机制 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株、质粒和细胞 |
| 1.2 鸡胚和实验动物 |
| 1.3 主要试剂与仪器 |
| 1.4 分子生物学软件 |
| 2 方法 |
| 2.1 Kuwait 256和NT-10全长感染性克隆的构建、病毒拯救及生物特性测定 |
| 2.2 Kuwait 256和NT-10基因互换重组全长质粒构建及重组病毒拯救 |
| 2.3 重组病毒的生物学特性测定 |
| 2.4 重组病毒对5周龄SPF鸡的致病性分析 |
| 2.5 重组病毒在鸽子中的传播性试验 |
| 3 结果 |
| 3.1 Kuwait 256和NT-10全长感染性克隆构建及病毒拯救 |
| 3.2 拯救毒株rKuwait 256和rNT-10的生物学特性测定 |
| 3.3 重组病毒的构建与拯救 |
| 3.4 重组病毒生物学特性分析 |
| 3.5 重组病毒对鸡的致病性分析 |
| 3.6 重组病毒在鸽子中的传播特性 |
| 4 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文目录 |
（7）新型鸭呼肠孤病毒流行株生物学特性研究及ELISA抗体检测方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 新型鸭呼肠孤病毒的病原学 |
| 1.1.1 NDRV的形态结构 |
| 1.1.2 NDRV的理化特性 |
| 1.2 新型鸭呼肠孤病毒的分子生物学特性 |
| 1.3 新型鸭呼肠孤病毒的流行病学 |
| 1.3.1 NDRV的流行情况 |
| 1.3.2 NDRV的致病性 |
| 1.4 新型鸭呼肠孤病毒的诊断方法 |
| 1.4.1 病毒分离鉴定 |
| 1.4.2 血清学诊断方法 |
| 1.4.3 分子生物学诊断方法 |
| 1.5 本研究的目的及意义 |
| 第二章 新型鸭呼肠孤病毒的生物学特性研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞、鸡胚及实验动物 |
| 2.1.2 主要实验试剂及仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 引物设计与合成 |
| 2.2.2 临床样品检测 |
| 2.2.2.1 临床病料及处理 |
| 2.2.2.2 样品RNA提取及c DNA合成 |
| 2.2.2.3 PCR |
| 2.2.3 NDRV的分离鉴定 |
| 2.2.3.1 NDRV的分离培养与传代 |
| 2.2.3.2 NDRV分离株的电镜观察 |
| 2.2.3.3 NDRV分离株的外源病毒检测 |
| 2.2.3.4 NDRV分离株的间接免疫荧光检测 |
| 2.2.3.5 NDRV分离株的σC基因扩增及遗传进化分析 |
| 2.2.3.6 动物回归实验 |
| 2.2.4 NDRV全基因组序列的扩增与遗传进化分析 |
| 2.2.5 NDRV流行株体外复制动力学研究 |
| 2.2.6 NDRV流行株对鸡胚和鸭胚致死率的测定 |
| 2.2.7 NDRV动物感染模型的建立 |
| 2.2.7.1 试验分组与设计 |
| 2.2.7.2 脾脏指数统计 |
| 2.2.7.3 脾脏组织病理学观察 |
| 2.2.7.4 脾脏组织病毒载量检测 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 NDRV临床样品的检测结果 |
| 2.3.2 NDRV的分离鉴定结果 |
| 2.3.2.1 分离毒株鸡胚传代及细胞病变观察 |
| 2.3.2.2 分离毒株的电镜观察 |
| 2.3.2.3 分离毒株的外源病毒检测 |
| 2.3.2.4 分离毒株的IFA鉴定结果 |
| 2.3.2.5 分离毒株的σC基因扩增及遗传进化分析 |
| 2.3.2.6 动物回归实验结果 |
| 2.3.3 NDRV全基因组序列及分析 |
| 2.3.4 NDRV流行株体外复制动力学研究结果 |
| 2.3.5 NDRV流行株对鸡胚和鸭胚致死率的测定结果 |
| 2.3.6 NDRV动物感染模型的建立 |
| 2.3.6.1 临床症状与剖检结果 |
| 2.3.6.2 脾脏指数 |
| 2.3.6.3 脾脏组织病理变化结果 |
| 2.3.6.4 脾脏组织病毒载量检测结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 NDRV的分离鉴定 |
| 2.4.2 SD19/6201 和SD19/6202 基因组特征及遗传进化特点 |
| 2.4.3 SD19/6201 增殖特性及动物感染模型建立 |
| 第三章 新型鸭呼肠孤病毒ELISA抗体检测方法的建立 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 毒株与血清 |
| 3.1.2 主要试剂与仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 NDRVσB重组蛋白的原核表达及纯化 |
| 3.2.1.1 引物设计与合成 |
| 3.2.1.2 σB基因的扩增及重组载体的构建 |
| 3.2.1.3 融合蛋白的表达、纯化及鉴定 |
| 3.2.2 NDRV间接ELISA检测方法术式的确定 |
| 3.2.2.1 蛋白最佳包被浓度和包被时间试验 |
| 3.2.2.2 最佳封闭液和封闭时间试验 |
| 3.2.2.3 最佳待检样品稀释度及作用条件试验 |
| 3.2.2.4 最佳酶标二抗稀释度及作用条件试验 |
| 3.2.2.5 最佳底物反应条件试验 |
| 3.2.2.6 临界值确定试验 |
| 3.2.3 NDRV间接免疫荧光方法的建立 |
| 3.2.4 间接ELISA方法的特异性试验 |
| 3.2.5 间接ELISA方法的敏感性试验 |
| 3.2.6 间接ELISA方法的重复性试验 |
| 3.2.7 间接ELISA方法对临床样品的检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 NDRVσB重组蛋白的原核表达及纯化 |
| 3.3.1.1 σB基因的扩增及重组载体的构建 |
| 3.3.1.2 融合蛋白的表达、纯化及鉴定 |
| 3.3.2 NDRV间接ELISA检测方法术式的确定 |
| 3.3.2.1 蛋白最佳包被浓度和包被时间的确定 |
| 3.3.2.2 最佳封闭液和封闭时间的确定 |
| 3.3.2.3 最佳待检样品稀释度及作用条件的确定 |
| 3.3.2.4 最佳酶标二抗稀释度及作用条件的确定 |
| 3.3.2.5 最佳底物反应条件的确定 |
| 3.3.2.6 间接ELISA反应程序的确定 |
| 3.3.2.7 临界值的确定 |
| 3.3.3 NDRV间接免疫荧光方法的建立 |
| 3.3.4 间接ELISA方法的特异性试验结果 |
| 3.3.5 间接ELISA方法的敏感性试验结果 |
| 3.3.6 间接ELISA方法的重复性试验结果 |
| 3.3.7 间接ELISA方法对临床样品的检测 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（8）H3亚型犬流感病毒的分离鉴定及其荧光定量RT-PCR方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 A型流感病毒基本特征 |
| 1.2 A型流感病毒的抗原变异 |
| 1.2.1 抗原漂移 |
| 1.2.2 抗原转移 |
| 1.3 流感病毒的受体结合特性 |
| 1.3.1 HA蛋白受体结合位点 |
| 1.3.2 HA蛋白的受体结合特异性 |
| 1.4 犬流感病毒的流行病学 |
| 1.4.1 CIV概述 |
| 1.4.2 H3N8亚型CIV |
| 1.4.3 H3N2亚型CIV |
| 1.4.4 H5N1亚型CIV |
| 1.4.5 H5N2亚型CIV |
| 1.4.6 H1N1亚型CIV |
| 1.4.7 H3N1亚型CIV |
| 1.4.8 H9N2亚型CIV |
| 1.4.9 H6N1亚型CIV |
| 1.4.10 CIV的发病机理 |
| 1.5 犬流感病毒的诊断 |
| 1.5.1 病毒的分离培养 |
| 1.5.2 血清学检测 |
| 1.5.3 RT-LAMP检测 |
| 1.5.4 RT-PCR试验 |
| 1.5.5 荧光定量RT-PCR |
| 1.5.6 SYBR GreenⅠ荧光染料法 |
| 1.5.7 Taq Man探针法 |
| 1.6 本研究的目的及意义 |
| 第二章 犬流感病毒的分离鉴定及遗传演化分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病料 |
| 2.1.2 鸡胚 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.2 病毒的分离鉴定 |
| 2.2.1 病料的采集与接种 |
| 2.2.2 病毒的鉴定 |
| 2.2.3 病毒RNA的提取 |
| 2.2.4 病毒RNA反转录与PCR |
| 2.2.5 病毒全基因组序列测定 |
| 2.2.6 病毒遗传演化分析 |
| 2.2.7 抗原性分析 |
| 2.2.8 受体结合特性分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 犬流感病毒的分离鉴定 |
| 2.3.2 病毒核苷酸同源性比较 |
| 2.3.3 HA基因遗传演化分析 |
| 2.3.4 NA基因遗传演化分析 |
| 2.3.5 PB2基因遗传演化分析 |
| 2.3.6 PB1基因遗传演化分析 |
| 2.3.7 PA基因遗传演化分析 |
| 2.3.8 NP基因遗传演化分析 |
| 2.3.9 M基因遗传演化分析 |
| 2.3.10 NS基因遗传演化分析 |
| 2.3.11 抗原性分析 |
| 2.3.12 受体结合特性 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 通用型犬流感病毒荧光定量PCR诊断方法的建立 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 毒株和核酸样品 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 引物和探针的设计合成 |
| 3.1.4 重组质粒标准品的制备 |
| 3.1.5 荧光定量PCR的条件优化和标准曲线的建立 |
| 3.1.6 特异性试验 |
| 3.1.7 敏感性试验 |
| 3.1.8 重复性试验 |
| 3.1.9 临床样品检测 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 重组质粒标准品的构建与鉴定结果 |
| 3.2.2 荧光定量PCR的条件优化和标准曲线的建立 |
| 3.2.3 特异性试验结果 |
| 3.2.4 敏感性试验结果 |
| 3.2.5 重复性试验结果 |
| 3.2.6 临床样品检测结果 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 H3 亚型犬流感病毒荧光定量PCR诊断方法的建立 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 毒株和核酸样品 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 引物和探针的设计合成 |
| 4.1.4 重组质粒标准品的制备 |
| 4.1.5 荧光定量PCR的条件优化和标准曲线的建立 |
| 4.1.6 特异性试验 |
| 4.1.7 敏感性试验 |
| 4.1.8 重复性试验 |
| 4.1.9 临床样品检测 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 重组质粒标准品的构建与鉴定结果 |
| 4.2.2 荧光定量PCR的条件优化和标准曲线的建立 |
| 4.2.3 特异性试验结果 |
| 4.2.4 敏感性试验结果 |
| 4.2.5 重复性试验结果 |
| 4.2.6 临床样品检测结果 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（9）HA蛋白受体结合区及邻近区域适应性变异协同PB2-627K增强H9N2亚型禽流感病毒对小鼠致病性的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 综述一 禽流感病毒的跨种间传播 |
| 综述二 当前我国H9N2亚型AIV的流行现状以及对公共卫生安全的威胁 |
| 第1章 天然携带哺乳动物分子标记的H9N2病毒SDKD1/15株生物学特性测定 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料 |
| 1.2.1 毒株和细胞 |
| 1.2.2 实验动物 |
| 1.2.3 主要试剂和仪器 |
| 1.3 方法 |
| 1.3.1 病毒RNA提取和反转录 |
| 1.3.2 病毒全基因组测序 |
| 1.3.3 病毒的空斑纯化 |
| 1.3.4 病毒各基因片段的遗传进化分析 |
| 1.3.5 鸡胚半数感染量(EID_(50))的测定 |
| 1.3.6 细胞半数感染量(TCID_(50))的测定 |
| 1.3.7 鸡多抗血清的制备 |
| 1.3.8 鸡静脉接种致病指数(IVPI)的测定 |
| 1.3.9 病毒的受体结合能力测定 |
| 1.3.10 病毒在不同细胞中的生长动力学测定 |
| 1.3.11 病毒对BABL/c小鼠的致病性 |
| 1.3.12 病毒在鸡群中气溶胶传播能力测定 |
| 1.3.13 病毒通过气溶胶方式进行跨种间传播能力的测定 |
| 1.3.14 应用Tapman探针荧光定量PCR方法测定病毒核酸拷贝数 |
| 1.4 结果 |
| 1.4.1 SDKD1/15株遗传进化分析 |
| 1.4.2 SDKD1/15株关键氨基酸位点分析 |
| 1.4.3 SDKD1/15株基本生物学特性的测定 |
| 1.4.4 SDKD1/15株受体结合能力测定 |
| 1.4.5 SDKD1/15株在不同细胞中的生长动力学 |
| 1.4.6 SDKD1/15株对小鼠的致病性 |
| 1.4.7 SDKD1/15株可通过气溶胶的方式在鸡群中传播 |
| 1.4.8 SDKD1/15株可通过气溶胶的方式发生跨种间传播 |
| 1.5 讨论 |
| 第2章 H9N2毒株SDKD1/15在小鼠体内的适应性研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 毒株,细胞和质粒 |
| 2.2.2 实验动物 |
| 2.2.3 主要试剂和仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 SDKD1/15毒株在BALB/c小鼠肺脏中连续传代 |
| 2.3.2 鼠适应株病毒的纯化 |
| 2.3.3 鼠适应株和母本病毒的全基因序列比对 |
| 2.3.4 HA蛋白三维结构模拟 |
| 2.3.5 质粒的构建 |
| 2.3.6 质粒的点突变 |
| 2.3.7 野生毒株和点突变毒株的拯救 |
| 2.3.8 拯救的野生毒株和突变毒株基本生物学特性测定 |
| 2.3.9 病毒对小鼠的致病性实验 |
| 2.3.10 病毒的受体结合特性测定 |
| 2.3.11 病毒在不同种属细胞中的生长动力学测定 |
| 2.3.12 病毒对不同种属细胞的吸附能力测定 |
| 2.3.13 病毒对不同种属组织的吸附能力测定 |
| 2.3.14 病毒在细胞上形成噬斑能力的比较 |
| 2.3.15 病毒在豚鼠中的传播实验 |
| 2.3.16 病毒的热稳定性实验 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 鼠适应株的获得 |
| 2.4.2 野生毒株和鼠适应株全基因序列比对 |
| 2.4.3 各点突变病毒的拯救和鉴定 |
| 2.4.4 影响H9N2毒株对小鼠致病性的关键氨基酸位点的确定 |
| 2.4.5 点突变对HA蛋白三维结构的影响 |
| 2.4.6 HA突变增强H9N2毒株对小鼠的致病性以及在体内的复制 |
| 2.4.7 突变毒株在不同种属细胞中的生长动力学 |
| 2.4.8 突变毒株在豚鼠中的传播特性 |
| 2.4.9 突变毒株的受体结合特性分析 |
| 2.4.10 突变毒株对不同种属细胞的吸附能力 |
| 2.4.11 突变毒株对不同种属组织的吸附能力 |
| 2.4.12 突变毒株在细胞上形成噬斑的能力 |
| 2.4.13 突变毒株的热稳定性 |
| 2.4.14 HA蛋白点突变和PB2-627K协同作用导致H9N2对小鼠致病性增强 |
| 2.4.15 HA蛋白点突变和PB2-627K协同作用增强H9N2病毒对小鼠的致病性具有普适性 |
| 2.5 讨论 |
| 第3章 HA蛋白受体结合区198位变异影响H9N2亚型AIV对小鼠致病性的机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料 |
| 3.2.1 毒株,细胞和质粒 |
| 3.2.2 实验动物 |
| 3.2.3 主要试剂和仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 HA蛋白序列的比对分析 |
| 3.3.2 糖基化位点分析 |
| 3.3.3 HA蛋白三维结构模拟 |
| 3.3.4 点突变质粒的构建 |
| 3.3.5 重组病毒和点突变病毒的拯救 |
| 3.3.6 拯救的野生毒株和突变毒株基本生物学特性测定 |
| 3.3.7 探究H9N2病毒HA基因片段对小鼠毒力的影响 |
| 3.3.8 探究影响H9N2病毒对小鼠致病性的HA关键位点 |
| 3.3.9 HA蛋白198位氨基酸突变毒株在小鼠体内的复制动力学 |
| 3.3.10 小鼠肺脏病理切片的制作和观察 |
| 3.3.11 受体结合偏嗜性和亲和力检测 |
| 3.3.12 HA蛋白198位氨基酸突变毒株对不同种属组织的亲和力分析 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 重组和点突变病毒的生物学特性 |
| 3.4.2 HA基因互换影响H9N2毒株对小鼠的致病性 |
| 3.4.3 SDKD1/15和AH320/15毒株的HA蛋白氨基酸位点差异 |
| 3.4.4 SDKD1/15和AH320/15毒株HA蛋白三维结构预测 |
| 3.4.5 SDKD1/15和AH320/15毒株HA蛋白糖基化位点预测 |
| 3.4.6 HA蛋白受体结合区198位变异影响H9N2毒株对小鼠的致病性 |
| 3.4.7 HA蛋白受体结合区198位变异影响H9N2病毒在小鼠各脏器中的复制 |
| 3.4.8 HA蛋白受体结合区198位变异影响小鼠肺脏的病理变化 |
| 3.4.9 HA蛋白受体结合区198位变异影响H9N2病毒的受体亲和力 |
| 3.4.10 HA蛋白受体结合区198位变异影响H9N2病毒和不同种属组织的吸附能力 |
| 3.4.11 HA蛋白受体结合区198T和PB2-627K协同作用影响H9N2毒株对小鼠的致病性 |
| 3.4.12 HA蛋白受体结合区198位变异不影响H9N2毒株的热稳定性 |
| 3.4.13 HA蛋白受体结合区198位变异不影响H9N2毒株的抗原性 |
| 3.4.14 HA蛋白受体结合区198位氨基酸类型的变化趋势 |
| 3.5 讨论 |
| 第4章 HA蛋白受体结合区222-224位缺失增强H9N2亚型AIV对小鼠致病性的宿主因素分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料 |
| 4.2.1 毒株 |
| 4.2.2 鸡胚和实验动物 |
| 4.2.3 主要试剂 |
| 4.2.4 主要仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 BALB/c小鼠感染实验 |
| 4.3.2 转录组测序 |
| 4.3.3 蛋白质组测序 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 转录组数据分析 |
| 4.4.2 蛋白质组数据分析 |
| 4.4.3 转录组数据和蛋白质组数据关联分析 |
| 4.5 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（10）重组禽流感病毒（H5+H7）三价灭活疫苗（H5N1 Re-11株+Re-12株，H7N9 H7-Re3株）研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 禽流感病毒介绍 |
| 1.2 H5和H7亚型禽流感的流行及危害 |
| 1.2.1 H5亚型禽流感的流行及危害 |
| 1.2.2 H7亚型禽流感的流行及危害 |
| 1.2.3 H7N9亚型流感的流行和危害 |
| 1.3 H5、H7亚型禽流感的防控 |
| 1.3.1 H5亚型禽流感疫苗研究进展 |
| 1.3.2 H7N9禽流感疫苗研究进展 |
| 1.3.3 禽流感综合防治措施 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 第二章 重组禽流感病毒H7N9亚型H7-RE3株生物学特性研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病毒株 |
| 2.1.2 实验动物及试验地 |
| 2.1.3 标准阳性血清及抗原 |
| 2.1.4 疫苗 |
| 2.1.5 主要试剂和仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 重组禽流感病毒H7-Re3株在鸡胚中的增殖及其鉴定 |
| 2.2.2 重组禽流感病毒H7-Re3株的致病性试验 |
| 2.2.3 重组禽流感病毒H7-Re3株灭活疫苗的免疫效力试验 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 重组禽流感病毒H7-Re3株在鸡胚中的增殖和遗传稳定性结果 |
| 2.3.2 致病性试验结果 |
| 2.3.3 重组禽流感病毒H7-Re3株灭活疫苗的免疫效力试验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 重组禽流感病毒(H5+H7)三价灭活疫苗的实验室研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 疫苗用毒株 |
| 3.1.2 效检病毒株 |
| 3.1.3 试验鸡胚和试验动物 |
| 3.1.4 HI抗原和标准阳性血清 |
| 3.1.5 主要试剂和仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 活性成分抗原相容性研究 |
| 3.2.2 安全性检验 |
| 3.2.3 疫苗效力检验 |
| 3.2.4 3批疫苗免疫效力试验 |
| 3.2.5 对流行毒株的免疫效力试验 |
| 3.2.6 重组禽流感H7亚型H7-Re3株HI抗体与攻毒保护关系研究 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 抗原病毒液制备及浓缩结果 |
| 3.3.2 病毒液灭活检验结果 |
| 3.3.3 制备疫苗检验结果 |
| 3.3.4 安全性检测结果 |
| 3.3.5 两种不同抗原含量的三价苗分别与三种单苗免疫效力比较结果 |
| 3.3.6 3批三价疫苗免疫效力试验结果 |
| 3.3.7 对流行毒株的免疫效力试验结果 |
| 3.3.8 抗体与攻毒保护关系研究结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 重组禽流感病毒(H5+H7)三价灭活疫苗的临床应用评估 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 抗原及标准阳性血清 |
| 4.1.2 疫苗 |
| 4.1.3 试验动物及场地 |
| 4.1.4 试剂和仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 三价疫苗对山东某场白羽肉种鸡的安全性和免疫效果研究 |
| 4.2.2 三价疫苗对肇东某场商品蛋鸡的安全性和免疫效果研究 |
| 4.2.3 三价疫苗对宁夏某场蛋种鸡的安全性和免疫效果研究 |
| 4.2.4 三价疫苗对山东某场种鸭的安全性和免疫效果研究 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 安全性评估结果 |
| 4.3.2 三价疫苗对山东某场白羽肉种鸡的免疫效果研究结果 |
| 4.3.3 三价疫苗对肇东某场商品蛋鸡的免疫效果研究结果 |
| 4.3.4 三价疫苗对宁夏某场蛋种鸡的免疫效果研究结果 |
| 4.3.5 三价疫苗对山东某场种鸭的免疫效果研究结果 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
四、我国马流感病毒不同分离株实验感染SPF鸡的研究（论文参考文献）
- [1]两株H9N2亚型禽流感病毒的遗传演化及其致病性分析[J]. 房敬真,侯玉杰,尹馨,王冬雪,邓国华,崔鹏飞,施建忠,陈化兰. 中国预防兽医学报, 2021(09)
- [2]我国部分地区禽星状病毒分子流行病学调查及其基因组特性研究[D]. 张富友. 山东农业大学, 2021(01)
- [3]候鸟禽流感病毒遗传变异规律分析及在哺乳动物间传播机制研究[D]. 张醒海. 吉林大学, 2021
- [4]血清4型禽腺病毒广西分离株全基因组测序分析、检测方法和致病性研究[D]. 栾勇娇. 广西大学, 2021(12)
- [5]鸡传染性喉气管炎病毒流行株生物学特征及影响其复制相关宿主蛋白作用机制的研究[D]. 吴咪. 内蒙古农业大学, 2021(01)
- [6]鸽源新城疫病毒的进化和宿主偏嗜性分子机制研究[D]. 展天松. 扬州大学, 2021
- [7]新型鸭呼肠孤病毒流行株生物学特性研究及ELISA抗体检测方法的建立[D]. 罗丹. 中国农业科学院, 2021
- [8]H3亚型犬流感病毒的分离鉴定及其荧光定量RT-PCR方法的建立[D]. 吴颖. 中国农业科学院, 2021(09)
- [9]HA蛋白受体结合区及邻近区域适应性变异协同PB2-627K增强H9N2亚型禽流感病毒对小鼠致病性的机制研究[D]. 刘开拓. 扬州大学, 2021
- [10]重组禽流感病毒（H5+H7）三价灭活疫苗（H5N1 Re-11株+Re-12株，H7N9 H7-Re3株）研究[D]. 刘艳晶. 中国农业科学院, 2021