一、套式聚合酶链反应检测体液中的丙型肝炎病毒核酸（论文文献综述）
戴俊斌[1]（2019）在《湖南省吸毒患者感染丙型肝炎病毒基因型特征分析》文中提出目的:1.根据HCV基因NS5B区段设计引物,对湖南省吸毒人群HCV患者的HCV病毒基因进行分型。2.探讨湖南省吸毒人群中HCV基因型的分布特点,为对该人群中HCV阳性者进行精确治疗提供指导和帮助。方法:收集湖南省内14个市州18岁以上、未接受抗病毒治疗、既往HCV抗体阳性的吸毒患者的血浆样本,每市州样本15份,共210份。对收集到的血浆样本分别进行HCV抗体ELISA复检、荧光PCR法定量HCV-RNA检测和基因分型检测。结果:在210名调查对象中,ELISA法复检HCV抗体阳性标本202例,阳性率96.19%;荧光PCR法检出HCV-RNA病毒载量>15IU/m L标本181例,阳性率86.19%。HCV基因型分别为1型18例（9.94%）,2型51例（28.18%）,3型47例（25.97%）,其他型别65例（35.91%）。区域分布以非1型为主,2型和3型普遍分布。结论:湖南省吸毒患者HCV基因型比较复杂,区域分布以非1型为主,2型和3型普遍分布,需进一步研究。
王振海[2]（2006）在《病毒性脑炎HCV和BDV感染的基础应用研究》文中提出目的:建立检测外周血液（PB）和脑脊液（CSF）丙型肝炎病毒（HCV）和博尔纳病病毒（BDV）的巢式逆转录酶荧光定量聚合酶链反应（FQ-nRT-PCR）的方法,快速、准确地定量检测外周血液单个核细胞（PBMCs）和CSF HCVE1和BDVp24基因片段,进一步证实病毒性脑炎（VE）是否存在HCV或BDV感染。探讨宁夏及其周边地区绵羊是否存在BDV感染。对BDV阳性产物进行基因序列测定、同源性和氨基酸顺序分析,绘制系统发生树,初探BDV感染的分子流行病学特征。方法:1、根据HCVE1基因序列,设计并合成引物和荧光标记探针。将PCR扩增的HCV基因片段克隆入载体,重组质粒经筛选、鉴定,作为阳性模板,用于标准曲线的制定和样品检测,建立检测HCV的FQ-nRT-PCR方法。2、应用FQ-nRT-PCR方法检测28例丙型病毒性肝炎、46例VE患者及42例对照者PBMCs和CSF HCV E1基因片段,并应用反向点杂交技术,对HCV感染的病例进行HCV基因型检测。3、应用徐平等开发的BDV重组质粒作为阳性模板,用于标准曲线
许信刚[3]（2005）在《逆转录病毒载体介导的丙型肝炎病毒（HCV）囊膜蛋白基因的表达及抗HCV中和抗体的研究》文中进行了进一步梳理丙型肝炎病毒（HCV）是输血后非甲非乙型肝炎以及社区获得性肝炎的主要病原因子,目前全世界约有2 亿HCV感染者。HCV感染后缺乏有效的保护性免疫。目前对HCV感染尚未找到有效的治疗手段,因此需要提高治疗手段和发展有效的疫苗以控制HCV感染。HCV 为单股正链RNA 病毒,属于黄病毒科的成员。其基因组全长9.4kb,编码约3 000 氨基酸的多聚蛋白前体,在宿主及病毒蛋白酶的作用下,将其切割成3 个结构蛋白和7 个非结构蛋白,其中有2 个糖蛋白E1 和E2 为HCV的包膜蛋白。由于其位于病毒颗粒的最外侧,是宿主免疫系统攻击的主要目标,也是HCV 疫苗研究的首选抗原。近年来各国学者运用基因重组技术对HCV包膜糖蛋白的结构和功能进行了深入研究,以期进一步理解HCV感染后慢性化机制及病毒与宿主相互作用的关系,并寻找有效的保护性疫苗及治疗药物。Chiron公司的研究人员在1994 年首先报道了用哺乳动物细胞表达的E1 和E2 蛋白共免疫大猩猩,可诱生出中和抗体能抵抗同源病毒攻击的。他们认为在大猩猩免疫试验中,E2 区尤其是E2 的高变区之一HVR1（386～411 位氨基酸）对于诱导中和抗体的保护性免疫具有更为重要的作用。但是由于E2 区的高度变异性,针对某种型或株的抗体往往对其他型或株的HCV 无中和作用。而且有的学者认为抗E2 抗体对病毒感染的预防作用仍难以肯定。由于尚未建立HCV 体外复制系统,病人血清中的HCV 病毒粒子又极难纯化,迄今为止的HCV被膜蛋白研究几乎完全以各种系统中表达的重组蛋白为对象。有证据表明,只有哺乳动物细胞中表达的E1、E2 糖蛋白才能较好地反映天然HCV病毒粒子上被膜蛋白的构象和性质。但就目前而言,E1 及E2 糖蛋白在哺乳动物细胞中的高效表达,以及表达蛋白的纯化,仍然是世界范围内都未攻克的难题,严重影响了被膜蛋白相关研究及其临床应用的进展,说明HCV 中和抗体的研究还面临许多困难。本研究由三部分构成,第一部分是用逆转录病毒载体将HCV囊膜蛋白基因整合到SP2/0 细胞基因组中,在SP2/0 细胞的细胞膜上成功表达了HCV 囊膜蛋
高秋菊[4]（2007）在《慢性HCV和/或HBV感染者Th1、Th2主要细胞因子基因多态性研究》文中研究说明不同个体感染HCV和/或HBV后,临床表现复杂多样。约15%的感染者可自发清除病毒而免受疾病侵袭,约85%的感染者会转为慢性,并且在慢转者中约20%可进展为肝硬化,甚至原发性肝细胞癌。分析原因可能是病毒因素和宿主遗传因素综合作用的结果,但有报道认为即使是相同的病毒分离株在感染不同个体时其临床表现也有很大差异,因此宿主的遗传因素在丙型、乙型肝炎慢性化作用中起着重要作用。据报道,不同个体对HCV和/或HBV感染所发生的免疫反应不同,个体间某些细胞因子的基因多态性可能导致机体免疫功能状态的差异,因而决定着HCV/HBV感染的不同临床转归。辅助性T细胞（Th）是免疫调节的核心细胞,在IFN-γ的作用下,Th0细胞可分化为Th1细胞,Th1主要分泌IL-2、IFN-γ等,通过介导细胞免疫,用于宿主的抗病毒、细胞毒效应、NK细胞自然杀伤作用等;在IL-4作用下,Th0细胞分化为Th2细胞,Th2主要分泌IL-4、IL-10等,刺激B淋巴细胞分化增殖产生抗体。Th1和Th2细胞因子的功能互相拮抗,Th1和Th2细胞功能的失衡将严重扰乱体液免疫和细胞免疫,进而影响着HCV、HBV感染者的慢性化和不同的临床转归。目前,关于慢性HCV和/或HBV感染者体内Th1主要细胞因子IFN-γ、IL-2和Th2主要细胞因子IL-4、IL-10的表达水平报道尚不统一,与表达细胞因子水平相关的基因多态性研究尚处于起步阶段,并且结果报道各异。为此,本研究以不同感染类型:慢性HCV重叠HBV感染、单纯HCV感染、单纯HBV感染和健康对照及不同临床转归:轻型、中重型肝炎、肝硬化和健康对照为研究对象,探讨IFN-γ+T874A、IL-2-T330G、IL-4-C589T、IL-10-G1082A、IL-10-A592C的基因多态性与不同感染类型、临床转归、病毒复制和肝功异常的关系及各细胞因子基因多态性对临床转归有无交互作用,探讨HCV和/或HBV感染者不同临床转归的免疫遗传机制。第一部分ELISA联合RT-n PCR检测慢性HCV感染者的结果分析目的:对比酶联免疫吸附试验（ELISA）和逆转录-套式-聚合酶链反应（RT-n PCR）检测慢性丙型肝炎病毒感染者的抗-HCV和HCV RNA结果,为临床检测和血站筛选健康献血员提供参考依据。方法:2005年5月对河北赵县某农村单采血浆还输血细胞HCV感染者133人及健康对照52人共185人采集空腹静脉血。该感染人群于1990年前单采血浆还输血细胞时感染、1993年经现场调查、血清生化指标及病原学标志检查确诊为HCV感染者、2002年追踪调查仍明确诊断者。用ELISA法检测抗-HCV,用RT-n PCR检测HCV RNA。结果:①185份血清标本中,抗-HCV和HCV RNA均阳性者92份,占49.73%;抗-HCV阴性、HCV-RNA阳性18份,占9.73%;抗-HCV阳性、HCV-RNA阴性22份,占11.89%,两者均阴性53份,占28.65%。两种方法检测结果一致符合率为78.38%（（92+53）/185）,Kappa=0.548（u=8.65, P<0.01）,另外用配对卡方检验两种方法不一致率亦无差别（χ2paried=0.40,P>0.05）,均说明两种检测方法高度一致;②ELISA法检测慢性HCV感染者的灵敏度为82.71%,特异度为92.31%,漏诊率为17.29%;RT-n PCR检测的灵敏度为81.20%,特异度为96.15%,漏诊率为18.80%,两种方法检测灵敏度无差别（χ2=0.10,P>0.05）;③并联试验检测灵敏度为96.75%,特异度为88.76%,其灵敏度明显高于单一ELISA法时的82.71%（χ2=9.62,P<0.01）,也明显高于串联试验67.16%的灵敏度（χ2=29.39,P=0.00）。结论:单独用ELISA法检测抗-HCV约有17%的漏检率,同时用RT-n PCR检测HCV RNA,可明显提高HCV感染者的阳性检出率。第二部分慢性HCV和/或HBV感染者Th1主要细胞因子基因多态性研究目的:研究Th1主要细胞因子基因IFN-γ+874和IL-2-330单核苷酸多态性（SNP）与单纯HCV、HBV感染及HCV重叠HBV感染、临床转归等的关系,探讨HCV/HBV感染者慢性化和临床转归的免疫遗传机制。方法:用序列特异性引物-聚合酶链反应（PCR-SSP）和限制性内切酶片段长度多态性-聚合酶链反应（RFLP-PCR）技术检测了79例慢性HCV重叠HBV感染、55例单纯HCV感染、69例单纯HBV感染和74例健康对照者的IFN-γ+874 SNP和IL-2-330SNP,Beckman LX-20生化分析仪检测肝功,RT-n PCR检测HCV RNA。分析了IFN-γ+874和IL-2-330基因型和等位基因频率与慢性HBV/HCV感染、临床转归、ALT异常和HCV RNA表达等的关系。结果:①不同感染类型与IFN-γ+874基因型频率有统计学关联（χ2=16.15, P=0.01）,单纯HCV、HBV感染和HCV重叠HBV感染者AA基因型频率明显高于对照组,TA基因型频率明显低于对照组,携带AA基因型个体感染HCV、HBV和HCV重叠HBV感染的相对危险度（OR）及95%可信限（95%CI）分别是TA基因型的3.22（1.437.25）、2.70（1.245.92）、4.02倍（1.888.55）;T、A等位基因频率与感染类型尚未发现统计学关联（χ2=4.87, P=0.18）; HCV和/或HBV感染类型间基因型、等位基因频率差异均不明显（P>0.05）。不同感染类型IL-2-330基因型存在显着差异（χ2=14.24, P=0.03）,单纯HCV、HBV感染和HCV重叠HBV感染者TT基因型频率明显高于对照组,GG基因型频率明显低于对照组,携带TT基因型个体感染HCV、HBV和HBV重叠HCV感染的OR及95%CI分别是GG基因型的3.46（1.1710.02）、7.14（2.1323.81）、2.93倍（1.157.46）;T、G等位基因频率在感染类型间差异有统计学意义（χ2=12.33, P=0.01）,携带T基因个体感染HCV、HBV、HCV重叠HBV的OR值和95%CI分别是G基因的1.82（1.093.03）、1.73（1.102.73）、2.26倍（1.393.69）;HCV和/或HBV各感染类型间基因型和等位基因频率差异均不显着（P>0.05）。②不同临床转归类型IFN-γ+874基因型频率之间差异有统计学意义（χ2=14.78,P=0.02）,轻型、中重型肝炎和肝硬化组AA基因型频率明显高于对照组,而TA基因型频率明显低于对照组;携带AA基因型个体进展为轻型、中重型肝炎、肝硬化的OR及95%CI分别是TA基因型的3.09（1.516.33 ）、3.85（1.708.70）、3.14倍（1.089.17）;T、A等位基因频率疾病转归尚未发现统计学关联（χ2=5.68, P=0.13）。不同疾病转归类型IL-2-330基因型频率差异存在显着的统计学意义（χ2=13.46,P=0.04）,轻型、中重型肝炎和肝硬化组TT基因型频率明显高于对照组,GG基因型频率明显低于对照组;携带TT基因型个体进展为轻型、中重型肝炎、肝硬化的OR值及95%CI分别是GG基因型的3.42（1.458.13 ）、3.29（1.109.80）、11.11倍（1.3290.91）;GG基因型频率与临床进展呈明显负相关（γ=-0.92,P<0.05）;T、G等位基因频率与疾病转归有统计关联（χ2=11.69, P=0.01）,携带T基因个体进展为轻型肝炎、中重肝炎和肝硬化的OR及95%CI分别是G基因的1.83（1.202.80）、1.70（1.022.82）、2.75倍（1.325.63）。③IFN-γ+874基因型和等位基因频率与HCV病毒复制未发现统计学关联（χ2=2.36,P=0.31;χ2=1.92,P=0.17）。IL-2-330基因型和等位基因频率与HCV病毒复制亦无统计学关联（χ2=0.83,P=0.66;χ2=1.97,P=0.66）;④IFN-γ+874基因型和等位基因频率与ALT异常未发现统计学关联（χ2=0.23,P=0.89;χ2=0.12,P=0.74）。IL-2-330基因型频率和等位基因频率与ALT水平亦无统计学关联（χ2=1.35,P=0.51;χ2=0.24,P=0.62）。结论:Th1主要细胞因子IFN-γ+874和IL-2-330基因多态性与HCV/HBV感染者慢性化及临床转归有明显的统计学关联,与病毒复制和肝功损伤无明显关联。IFN-γ+874AA基因型、IL-2-330 TT基因型和T等位基因可能是HCV和/或HBV感染及其临床转归的危险基因（型）,IFN-γ+874 TA、IL-2-330 GG基因型和T等位基因可能为其保护基因（型）。第三部分慢性HCV和/或HBV感染者Th2主要细胞因子基因多态性研究目的:研究Th2主要细胞因子IL-4-589、IL-10-1082和IL-10-592基因多态性与单纯HCV、HBV感染及HCV重叠HBVV感染、临床转归等的关系,探讨HBV和/或HCV慢性感染者和不同临床转归的遗传易感机制。方法:用SSP-PCR和RFLP-PCR技术检测79例HCV重叠HBV感染、55例单纯HCV感染、69例单纯HBV感染和74例健康对照者的IL-4-589 SNP、IL-10-1082和IL-10-592;用RT-n PCR方法检测血清HCV RNA;用Beckman LX-20全自动生化分析仪检测肝功能。结果:①IL-4-589位点基因型和等位基因频率与不同感染类型无明显统计关联（χ2=4.41,P=0.62;χ2=0.26,P=0.97）。不同感染类型与IL-10-1082位点基因型频率有统计学关联（χ2=13.05, P=0.04）,HBV和/或HCV感染者AA基因型频率明显高于对照组,而AG基因型频率明显低于对照组;携带AA基因型个体感染HCV、HBV、HCV重叠HBV的危险是AG基因型的2.34（1.075.10）、2.29 （1.104.78）、2.56倍（1.255.21）;HCV和/或HBV各感染类型间基因型差异均不显着（P>0.05）。IL-10-1082等位基因频率与不同感染类型间无明显的统计关联（χ2=4.65,P=0.20）。IL-10-592位点基因型和等位基因频率与不同感染类型无明显统计关联（χ2=2.83,P=0.83;χ2=1.10,P=0.78）。②IL-4-589位点基因型和等位基因频率与临床转归类型无明显统计关联（χ2=4.58,P=0.60;χ2=2.46,P=0.48）。IL-10-1082位点基因型频率与不同临床转归类型有统计学关联（χ2=11.40, P=0.07）,轻型、中重型肝炎和肝硬化组AA基因型频率明显高于健康对照组,而AG基因型频率明显低于健康对照;携带AA基因型个体进展为轻型、中重型肝炎和肝硬化的风险是AG基因型的2.03（1.033.98）、2.70（1.245.88）和4.26倍（1.5911.36） ; IL-10-1082 AA基因型频率与临床转归呈明显正相关（γ=0.99,P<0.01）,AG基因型频率与临床转归呈明显负相关（γ=-0.99,P<0.01）;IL-10-1082等位基因频率与临床转归未见统计学关联（χ2=5.85, P=0.12）;IL-10-592位点基因型和等位基因频率与临床转归无明显统计关联（χ2=2.50,P=0.87;χ2=0.92,P=0.82）。③IL-4-589位点基因型频率和等位基因与体内HCV病毒复制无统计学关联（χ2=1.53,P=0.47;χ2=1.24 P=0.27）。IL-10-1082位点基因型和等位基因频率与HCV病毒复制有统计学关联（χ2=12.27,P=0.00;χ2=5.36, P=0.02）;病毒复制组AA基因型和A等位基因频率明显高于无病毒复制组,而AG基因型和G基因频率明显低于无病毒复制组（OR=3.36（1.676.76）、1.67倍（1.082.57））;IL-10-592位点基因型频率和等位基因与体内有无HCV病毒复制无统计学关联（χ2=2.10,P=0.35;χ2=1.88,P=0.17）。④IL-4-589位点基因型和等位基因频率在ALT<80 U/L和≥80U/L间差异有明显的统计学意义（χ2=12.46,P=0.00;χ2=9.97, P=0.00）,ALT≥80U/L组CT和CC基因型频率明显高于肝功<80U/L组,ALT≥80U/L组TT基因型频率明显低于肝功<80U/L组,携带CT和CC基因型个体肝功损伤的OR值和95%CI是TT基因型的3.43（1.478.00）、8.25倍（1.7339.22）;ALT≥80U/L组C等位基因频率明显高于肝功<80U/L组,T等基因频率明显低于肝功<80U/L组,携带C等位基因的个体其肝功异常的风险是T等位基因的2.31倍（1.363.93）。IL-10-1082位点基因型和等位基因频率与ALT水平无明显统计学关联（χ2=3.25,P=0.20;χ2=1.79, P=0.18）。IL-10-592位点基因型频率在ALT<80 U/L和≥80U/L间差异有显着性（χ2=6.32,P=0.04）,ALT≥80U/L组AC基因型频率明显高于肝功<80U/L组,AC基因型个体ALT异常风险是AA基因型的2.83倍（1.266.37）,而等位基因频率与肝功异常无明显统计关联（χ2=2.30,P=0.13）。结论:Th2主要细胞因子IL-10-1082基因型与HCV和/或HBV感染类型、不同临床转归、病毒复制有明显的统计学关联,AA基因型可能是其危险基因型,AG基因型可能是其保护基因型;IL-10-592和IL-4-589位点多态性与HBV和/或HCV感染者的肝功损伤有一定联系,IL-10-592AC基因型、IL-4-589 CT、CC基因型和C等位基因可能是其危险基因（型）,IL-10-592AA基因型、IL-4-589 TT基因型和T等位基因可能是其保护基因（型）。第四部分Th1、Th2细胞因子基因多态性在慢性HCV和/或HBV感染者临床转归中的交互作用研究目的:探讨Th1、Th2细胞因子基因多态性在慢性HCV和/或HBV感染者临床转归中的交互作用。方法:用多因子降维法（MDR）分析Th1、Th2细胞因子基因多态性在慢性HCV和/或HBV感染者及临床转归中有无交互作用,患病风险用OR及95% CI评价,交互作用大小用交互作用指数（S）、交互作用归因比（API）、交互作用超额相对危险度（RERI）及95%可信限（95%CI）评价。结果:①MDR分析Th1主要细胞因子基因多态性,发现IFN-γ+874、IL-2-330位点对慢性HCV/HBV感染者临床转归有明显的交互作用（P=0.00）。IFN-γ+874 AA和IL-2-330 TT基因型共存时,HCV/HBV感染者进展为轻型.中重型肝炎和肝硬化的OR值分别为10.1（2.836.0）、10.6（2.938.8）和13.6（4.966.8）,分别是IFN-γ+874 AA基因型单独暴露的6.8、4.1和8.1倍,是IL-2-330 TT基因型单独暴露时的8.4、8.1和6.6倍;S分别为13.04.5.01和7.22;RERI分别为8.43（2.6127.23）、7.65（2.5023.42）和10.83（2.5346.32）;API分别为83.22%.72.44%和79.81%。②MDR分析Th2主要细胞因子基因多态性,发现IL-10-592和IL-4-589位点对慢性HCV和HBV感染者的肝脏炎症性损伤有明显的交互作用（P=0.00）。单独IL-10-592 AC基因型对慢性HCV/HBV感染者肝脏炎症性损伤无明显作用（OR=1.0）,但IL-4-589 CC或CT和IL-10-592 AC共存时OR为5.5（2.611.5）;S=7.10,RERI=3.70（2.116.49）;API=67.64%。③MDR分析Th1、Th2主要细胞因子基因多态性交互作用,发现IFN-γ+874、IL-2-330和IL-10-1082三个位点对慢性HCV和HBV感染者的临床转归有明显交互作用（P=0.01）。若只考虑三种基因型的单独效应,对HCV/HBV感染者临床转归的危险性从大到小依次是IL-10-1082 AA基因型（OR=2.7,4.3,7.1）、IFN-γ+874 AA基因型（OR=2.0,3.9,2.4）和IL-2-330 TT基因型（OR=1.2,1.3,2.8）,并且IL-10-1082 AA基因型与临床进展严重程度正相关（γ=0.99,P<0.05）。若考虑其中两种基因型的联合作用效应,IFN-γ+874 AA和IL-2-330 TT基因型共存时,感染者不同临床转归类型对应的OR值分别为7.5（2.028.4）、9.6（2.635.6）和10.7（1.480.2）（与单独分析IFN-γ+874 AA和IL-2-330 TT基因型的OR值不等,是因为存在IL-10-1082 AA基因型的交互作用）,分别是IFN-γ+874 AA单基因型暴露的3.8、2.5和4.5倍,是IL-2-330 TT单基因型暴露的6.3、7.4和3.8倍;S分别为5.3、2.7和3.0,RERI分别为5.3（1.124.5）、5.41（1.816.2）和6.5（1.331.5）,API分别为70.3%、56.4%、60.5%。IFN-γ+874 AA和IL-10-1082 AA共存时,感染者不同临床转归类型对应的OR值分别为1.6（1.02.5）、4.0（1.69.9）、5.3（1.519.1）,均小于IL-10-1082 AA基因型单独作用的OR值（2.7、4.3、7.1）;S分别为0.2、0.5、0.6,RERI分别为-2.1（-1.1-4.1）、-3.2（-1.5-6.8）、-3.2 （-1.3-7.6）,API分别为-130.0%、-79.5%、-59.1%。IL-2-330 TT和IL-10-1082 AA基因型共存时,感染者不同临床转归类型对应的OR值分别为3.0（1.37.2）、4.5（1.612.3）和8.5（2.035.7）,与IL-10-1082 AA基因型单独暴露时的OR值（2.7、4.3、7.1）相差不大;S分别为1.1、1.0、1.0,RERI分别为0.1、-0.1、-0.4,API分别为3.7%、0.0%、-0.4%。当IFN-γ+874 AA、IL-2-330 TT和IL-10-1082 AA三种基因型共存时,感染者不同临床转归类型对应的OR值分别为9.6（2.931.8）、12.8 （ 2.080.2 ）和32.0（5.1200.9）,是IFN-γ+874 AA、IL-2-330 TT共存时OR值的1.3、1.3和3.0倍;S分别为1.1、1.0、2.0,API为4.2%、-0.8%和47.5%,RERI为0.4（0.20.7）、-0.1（0.00.5）和15.2（3.664.3）。结论:Th1主要细胞因子IFN-γ+874 AA、IL-2-330 TT基因型对慢性HCV/HBV感染者不良临床转归有明显的协同作用;Th2主要细胞因子IL-4-589 CC或CT和IL-10-592 AC基因型对慢性HCV/HBV感染者肝脏炎症性损伤有明显的协同作用;Th1主要细胞因子基因型IFN-γ+874 AA、IL-2-330 TT和Th2主要细胞因子基因型IL-10-1082 AA对慢性HCV/HBV感染者进展为轻型、中重型肝炎交互作用不明显,对进展为肝硬化有协同作用。
彭丹[5]（2009）在《慢性HCV感染患者认知功能研究及其机制初步探讨》文中提出目的:通过本研究拟了解: 1.慢性HCV感染患者与慢性HBV病毒感染患者、正常对照间认知功能的差异,明确慢性HCV感染患者认知功能损害的程度和模式;以及与慢性HBV感染患者比较,认知功能损害是否为慢性HCV感染患者的独特特征。2.慢性HCV感染患者的认知功能与抑郁症状的关系。3.设计并建立巢式荧光定量PCR（Nested-qRT-PCR）检测慢性丙型病毒感染患者CSF中HCV 5’NCR基因片段,进一步证实慢性HCV感染患者的CSF中是否存在HCV感染。4.初步探讨HCV对CNS的直接感染是否与慢性HCV感染患者认知功能的损害有关。方法:1、采用目前较为常用的神经心理测验工具对36例轻度慢性HCV感染患者、32例慢性HBV病毒感染患者及28例对照者进行测验,各组还采用Beck抑郁自评量表（BDI-II）进行抑郁症状的评定。2、根据GenBank提供的基因序列,针对HCV基因的保守区域（HCV 5’NCR基因）,设计并合成特异性内外引物和荧光标记TaqMan探针。从重庆医科大学病毒性肝炎研究所惠赠的含有目的基因的质粒出发,利用PCR方法扩增获得目的基因,克隆至pGEM-T Easy载体进行体外转录,将得到的RNA纯化并使用RiboGreen方法进行定量后作为阳性标准品。分别建立正链和负链HCV RNA的巢式荧光定量RT-PCR方法并分析敏感性和特异性。3、应用Nested-qRT-PCR方法检测12例慢性丙型肝炎病毒感染患者外周血液单个核细胞和脑脊液HCV 5’NCR基因片段,并对脑脊液阳性样本进行分子克隆和测序分析。同时对这12例患者进行神经心理测验,比较脑脊液HCV阳性者与阴性者的测验成绩。结果:1、HCV感染患者在反映注意、记忆和言语功能的测验如数字符号、延迟逻辑记忆、言语流畅性测试重复数、连线B测验（TMT-B）和Stroop测验上与健康对照组有差异,尤其在数字符号、TMT-B和Stroop-cw测验上差异显着,而HBV患者与健康对照组各项测验值均无差异。2、本研究成功建立了正链和负链HCV巢式荧光定量RT-PCR检测方法,其最低检出限即敏感性分别为2.6×102copies/μl、2.6×101 copies/μl,标准曲线的定量范围分别为2.6×102～2.6×107copies/μl、2.6×101～2.6×107copies/μl,相关系数R2分别为0.9883和0.9969,不与其他病毒发生非特异反应。3、共对12例慢性丙型肝炎感染患者的PBMCs,脑脊液细胞中的正链和负链HCV RNA （positive-和negative- strands）进行了检测,10例PBMCs检测5’NCR基因片段为阳性,而其中3例CSF正链HCV RNA检测阳性（3/12）,2例负链HCV RNA检测阳性（2/12）。4、12例慢性丙型肝炎病毒感染患者中脑脊液HCV检测阳性者（3例）与脑脊液HCV检测阴性者（9例）以及健康对照组的神经心理测验成绩比较,脑脊液HCV阳性者在数字符号和TMT-B测验上与脑脊液HCV阴性者以及正常对照组有统计学上的差异。结论:1、慢性HCV患者在需要持续注意和更复杂的注意力集中测试的视觉扫描,以及知觉运动速度,工作记忆上存在障碍,此认知功能损害与抑郁自评症状之间无显着相关性。在HBV感染患者中没有发现类似的认知损害,提示这种认知功能损害模式是慢性HCV患者所独特的。2、本研究构建了HCV 5’NCR基因核酸定量检测用的正链和负链RNA标准品,并建立了正链和负链HCV巢式荧光定量RT-PCR检测方法。该方法具有灵敏性和特异性高、简便快捷等有点,不易出现污染引起假阳性结果,适用于脑脊液等体液细胞相对较少、RNA浓度过低的定量检测。3、部分慢性HCV感染患者脑脊液中存在有HCV感染,HCV对CNS的直接感染可能与慢性HCV患者的认知功能损害有关。
李晓鄂[6]（1997）在《多重PCR法一次性检测血清中HBV DNA，HCV RNA和HDV RNA》文中认为聚合酶链反应（PCR）技术用于病毒核酸的检测具有灵敏度高,特异性强等优点,已广泛用于各型肝炎病毒的实验室检测。乙型、丙型和丁型肝炎是引起输血后肝炎的主要原因,它们主要传播途径相同（经血或血制品）,可同时或重叠感染,加重病情,从临床症状和生化指标上较难区分。用针对三种不同肝炎病毒的传统PCR法对同一血样进行三次检测,劳动强度大、分析时间长、同时也增加了污染的危险性。 为了使PCR检测用于肠道外传播肝炎病毒更具有实用性,我们研究了一种多重PCR法,用于在单份病人或献血员的血清标本中一次性检出这三种肝炎病毒的单独、双重或多重感染。共用四对寡核苷酸引物,其中HBV和HDV各一对,HCV两对（用于套式PCR）,分别源自HBV的核心抗原（HBcAg）区,HDV的抗原（HDAg）区,HCV的5′—非翻译区（UTR）。扩增片段长度分别为418bp（HBV）,270bp（HDV）,121bp（HCV）。采用异硫氰酸胍裂解法从一份血清样本中同时提取这三种病毒核酸摸板,各加入一对引物在同一反应体系中同时进行逆转录并第一次PCR扩增,产物再进行第二次PCR扩增,所用三对引物除HCV以内套引物取代第一次扩增时的外套引物外,HBV和HDV所用引物不变。两次PCR所用试剂浓度和PCR循环条件都不相同。扩增产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测。并采用寡聚核苷酸探针分析法即Southern Blot对扩增产物中的HBV和HCV特异DNA扩增片段进行了鉴定。 为评估联合PCR检测的特异性和敏感性,我们对94份血清标本进行了HBV DNA PCR检测、HCV RNA RT-套式PCR检测、HDV RT-RNA PCR检测及多重PCR检测。结果表明我们研究的PCR联合一次性检测法与三种病毒的单独PCR检测法有很高的一致性,符合率为98.9%,说明其灵敏度和特意性与单项PCR检测相当。对血清标本检测结果的分析同样具有临床流行病学意义,在抗-HCV（+）血清中HBV的检出率高达26.3%,94份血清标本中HBV、HCV和HDV的同时检出率也不低,为3.2%,说明联合感染并非偶然现象,它具有临床流行病学代表性。 我们建立起的PCR联合检测法具有操做简便、敏感、特异、快速省时省材等优点,适合于大量临床标本的诊断、献血员筛选和大规模分子流行病学调查。对于近来愈来愈受到医学界关注的肝炎病毒临床联合感染的实验室研究和医院治疗效果评价都有其实用性。
胡向阳,黄晓明,高翼之,尤大钰[7]（1995）在《逆转录－套式PCR检测血清中丙肝病毒RNA》文中研究表明利用与丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）基因组５＇非编码区保守序列同源的套式引物，建立了检测血清中ＨＣＶＲＮＡ的聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术，由于在引物设计中选择了最保守的区域且避开了与黄病毒属的同源序列，保证了ＰＣＲ检测的灵敏度和特异性。经逆转录和两轮ＰＣＲ扩增，可检出１×１０－３ｕｌ血清中的ＨＣＶＲＮＡ。研究了影响ＨＣＶＲＮＡＰＣＲ检测的各种因素，并对ＲＮＡ分离及ＲＴ－ＰＣＲ反应体系进行了优化，在此基础上研制了ＨＣＶ的ＰＣＲ检测试剂盒。
姜文灿,岳素文,江洪,王成彬[8]（2015）在《TaqMan探针法实时荧光定量PCR的应用和研究进展》文中研究指明TaqMan探针法实时荧光定量PCR因其重复性好、特异性强、线性范围宽等特点在各个领域有着广泛的应用,内标系统的引入进一步提升了该方法的灵敏度,增加了其可靠性和实用性。然而,这一技术也因为假阴性和假阳性问题存在着改进的空间。本文从TaqMan探针法的简介、研究进展以及应用前景展开综述。
林毅雄[9]（2007）在《昆明地区HCV分子流行病学研究及Core蛋白表达质粒构建》文中认为丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）呈全球分布，自然感染率约为3％，即有1.7～2.0亿人为丙型肝炎感染者。近年来，HCV在部分地区的流行呈增长态势，我国的HCV估计感染率为2.5-4.9％，感染总人数超过5000万人。HCV一经感染，大部分感染者将发展成慢性丙型肝炎，并有较大比例的感染者最终发展成肝硬化、肝癌。由于缺乏可以治愈的药物和疫苗，对丙型肝炎尚不能有效的治疗与预防，丙型肝炎已经成为继艾滋病之后的又一大严重危害人类健康的传染病。由于HCV的依赖RNA的RNA聚合酶（RdRp）缺乏校对功能，导致HCV基因突变频率极高。根据HCV基因组核苷酸序列的同源性，HCV可被分为6个基因型，70多个亚型，以及众多的准种。HCV基因型分布呈现明显的区域差异；丙型肝炎患者的临床症状、病程进展，及药物治疗效果均与基因型密切相关。HCV基因型的研究有助于明确HCV流行的危险因素与传播途径，了解病毒的变异、进化特点，并为地方性疫苗的研制，药物的研究与开发，患者临床观察与治疗措施的制定提供流行病学依据。对HCV感染的早期诊断是控制HCV传播的重要手段，其中HCV核心抗原的检测对处于HCV感染“窗口期”的个体检测有很大价值。本研究经对采自云南省昆明市42例非吸毒所致丙型肝炎患者样品，和14例静脉吸毒所致HCV／HIV共感染者的样品，进行了血浆病毒核酸提取，HCV 5’NCR-C区基因的核苷酸序列测定与分析。发现：1．本研究建立的基于5’NCR-C区的基因分型方法可以将所有待测样本有效分型，弥补了5’NCR区在基因分型方法不能区分1型和6型固有缺陷。2．昆明市非静脉吸毒所致丙型肝炎病人中，1b亚型仍为主要流行型，其次为3型，2a亚型也有一定比例的流行，同时发现有6k和6n亚型，这与HCV在我国其它省份普通人群中1b／2a为主的基因型分布明显不同。3．昆明市静脉吸毒人群中HCV感染者中以1b和3为主，同时发现有6n，没有发现2a亚型，此种HCV基因型分布特点与东南亚国家更为相似。4．本研究中普通人群1b型的组成更为复杂，可被分为五个组，6例静脉吸毒1b型样品则全部归入第二个组中，证明昆明市普通人群HCV传入呈多途径方式，但对静脉吸毒人群则以单途径方式传入。5．HCV C区HLAA2型CTL抗原表位在1b与3b型之间有明显差异，可能是1b亚型易于慢性感染并快速致病原因之一。6．丙型肝炎病程与ALT、AST等肝功生化指标之间无显着相关性，不同基因型间ALT、AST水平无明显差异，但1b型患者HCV病毒载量显着高于其它基因型患者，与AST，ALT等肝功生化指标相比较，HCV病毒载量更适合作为丙型肝炎病程评价指标。对丙型肝炎早期诊断是控制HCV传播的重要手段，其中基于HCV核心蛋白及相关抗体反应的检测方法对HCV感染者“窗口期”诊断有很大价值，Core蛋白表达是建立此方法的核心步骤。本研究将HCV Core基因扩增产物克隆到pET 100／D-TopoVector，在BL21Chemically Competent Ecoli中表达，进而用SDS-PAGE电泳检测，发现：经克隆获得了正确的Core基因，并可诱导表达出预期大小的蛋白分子（约23KD），在诱导培养2.5小时，可获得最大表达量。综上所述，本研究对云南省昆明市丙型肝炎患者的HCV基因型分布进行了较为系统的研究，所取得结果将有助于明确云南省HCV分子流行病学特点、追溯HCV病毒传播来源，分析HCV病毒进化特点，同时为我省丙型肝炎患者病人临床诊断与治疗，及进行药物研发合地方性疫苗研制提供前期研究基础。HCV Core蛋白表达构建将为研制高特异性和敏感性的HCV抗体诊断试剂奠定基础。
李振勇[10]（2005）在《新型冠状病毒实验室诊断方法学研究》文中认为2002年11月,中国广东省出现了首例传染性非典型肺炎患者,世界卫生组织根据临床症状于2003年3月15日将其命名为严重急性呼吸道综合症——Severe Acute Respiratory Syndrome（SARS）,并于4月16日根据多国协作研究成果,正式宣布SARS的病原体为一种变异的新型冠状病毒（正单链RNA病毒,SARS CoV）。其后,WHO公布的资料显示,全球共计出现非典病人和疑似病人8450例,其中死亡784人,涉及33个国家和地区。由于其病征与感冒、腹泻等常见病病征相似,容易造成临床上的疑诊和误诊。因此,开展相关检测方法和试剂的研发,提供对SARS的早期诊断结果,是进行疾病预防、阻断传播、保护人类自身的首要措施之一,是世界性医学和社会的重大课题。 近两年的研究表明,SARS CoV S蛋白的受体已经很清楚（ACE2）,是病毒的主要保护性抗原,N蛋白和M蛋白也可以诱导免疫效应,是检测病毒抗体的良好抗原。本研究根据基因扩增、克隆表达和酶联免疫技术,结合生物信息学、F（?）ster等理论,以基因工程、荧光探针、高效核酸杂交等先进技术手段,提出了简单二级结构高熵值靶序列、空间压缩荧光/淬灭、反转录/抗污染整合等新思路,克服了荧光探针背景过高、RNA提取效率低、阳性对照具有潜在传染性/不稳定、反转录和抗污染不能兼顾等技术难题,取得了特异、适合检测的靶序列和引物、TaqMan-BC探针、高效提取方法、病毒样颗粒阳性对照和内对照、反转录/UNG系统抗污染、cDNA富集等技术创新,建立了荧光RT-PCR基因检测、酶免RT-PCR基因检测、酶免抗体检测等方法和试剂,是SARS早期鉴别诊断、病程监测、预后和流病调查的重要手段,社会意义巨大。 一、根据生物信息学理论,将核酸序列简单二级结构新思路引入靶序列的选择上。并根据基因组信息分析结果,获得了适合基因检测的高熵值靶序列;成功地设计了独特的TaqMan-BC荧光探针,将实际检测本底降低2倍以上; 二、建立了高效简便的核酸提取方法,巧妙设计了反转录/UNG抗污染、cDNA富集、扩增一体化组合的反应体系,在有效提高灵敏度的同时彻底解决了PCR实验过程中容易出现的污染问题,检测灵敏度达到45Copies/mL。 三、整合了RT-PCR和快速核酸杂交技术,通过化学交连,将探针高效地固定在
二、套式聚合酶链反应检测体液中的丙型肝炎病毒核酸（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、套式聚合酶链反应检测体液中的丙型肝炎病毒核酸（论文提纲范文）
（1）湖南省吸毒患者感染丙型肝炎病毒基因型特征分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 HCV感染者丙型肝炎知识知晓与接受直接抗病毒药物治疗意愿调查 |
| 1.1 对象与方法 |
| 1.1.1 调查对象 |
| 1.1.2 调查内容及方式 |
| 1.1.3 统计学分析 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 人口学情况 |
| 1.2.2 治疗意愿及影响因素 |
| 1.2.3 丙型肝炎知识知晓情况 |
| 1.3 讨论 |
| 第二章 湖南省吸毒患者感染丙型肝炎病毒基因型特征分析 |
| 2.1 实验材料与仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 样本来源 |
| 2.2.2 样本收集与处理 |
| 2.2.3 丙型肝炎病毒核酸定量和基因分型检测 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 检测结果 |
| 2.3.2 湖南省丙型肝炎基因型地理分布 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 创新点及展望 |
| 参考文献 |
| 综述一 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（2）病毒性脑炎HCV和BDV感染的基础应用研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 论文正文：病毒性脑炎HCV 和BDV 感染的基础应用研究 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 病毒性脑炎HCV 感染的分子生物学研究 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一章 HCV 荧光定量巢式RT-PCR 检测方法的建立 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 病毒性脑炎患者血液和脑脊液HCVE1 检测 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分宁夏及周边地区BDV 感染的分子流行病研究 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一章 病毒性脑炎患者血液和脑脊液BDVp24 的检测 |
| 1 资料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章宁夏及其周边地区绵羊外周血液BDVp24 检测 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章宁夏及周边地区BDV 感染的分子流行病学研究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 文献综述1 |
| 文献综述2 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表的学术论文 |
| 攻读博士学位期间参加编写的专着或教材 |
| 攻读博士学位期间申报的专利 |
| 攻读博士学位期间参加学术会议交流情况 |
| 攻读博士学位期间申报课题情况 |
| 攻读博士学位期间获奖情况 |
（3）逆转录病毒载体介导的丙型肝炎病毒（HCV）囊膜蛋白基因的表达及抗HCV中和抗体的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 文献综述 |
| 第一章 丙型肝炎病毒的分子生物学研究进展 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 丙型肝炎的流行现状、致病性与危害 |
| 1.3 病毒的颗粒特征 |
| 1.4 丙型肝炎病毒各区段基因组的结构和功能 |
| 1.4.1 5’非编码区(5’UTR) |
| 1.4.2 核心蛋白区 |
| 1.4.3 包膜蛋白区 |
| 1.4.4 p7 蛋白 |
| 1.4.5 非结构蛋白 |
| 1.4.6 3'非编码区(3'UTR) |
| 1.5 丙型肝炎病毒囊膜蛋白的研究进展 |
| 1.5.1 包膜蛋白的结构 |
| 1.5.2 E2 蛋白在HCV入胞过程中的作用 |
| 1.5.3 E2 与机体免疫反应 |
| 1.6 丙型肝炎病毒基因的变异及分型 |
| 1.6.1 HCV 的变异机制 |
| 1.6.2 HCV 各基因的变异情况 |
| 1.6.3 HCV 基因分型研究 |
| 1.6.4 HCV 基因型的地理分布特点 |
| 1.6.5 HCV 基因分型的方法 |
| 1.7 HCV 的体外复制模型及感染动物模型研究 |
| 1.7.1 HCV 体外复制模型 |
| 1.7.2 黑猩猩 |
| 1.7.3 猴 |
| 1.7.4 树鼩 |
| 1.7.5 转基因和免疫耐受人鼠嵌合肝模型 |
| 1.8 丙型肝炎病毒感染的免疫反应 |
| 1.8.1 体液免疫应答 |
| 1.8.2 细胞免疫应答 |
| 1.9 丙型肝炎预防和治疗 |
| 1.9.1 干扰素(IFN) |
| 1.9.2 病毒唑 |
| 1.9.3 LAK 细胞治疗 |
| 1.9.4 熊去氧胆酸治疗 |
| 1.9.5 免疫调节剂 |
| 1.9.6 联合用药 |
| 1.9.7 中医中药 |
| 1.9.8 丙型肝炎预防 |
| 1.10 丙型肝炎疫苗研究 |
| 1.10.1 重组HCV 蛋白质疫苗 |
| 1.10.2 HCV 基因疫苗 |
| 1.10.3 HCV 融合基因疫苗 |
| 1.10.4 丙肝肝炎口服活菌苗 |
| 1.10.5 丙肝疫苗研制面临的问题 |
| 1.11 丙型肝炎病毒单克隆抗体(HCV-McAb)的研究 |
| 1.11.1 鼠源HCV 单克隆抗体 |
| 1.11.2 人源HCV 单克隆抗体 |
| 1.11.3 HCV单克隆抗体的意义及其发展前景 |
| 1.12 丙型肝炎病毒的实验室诊断研究进展 |
| 1.12.1 血清抗-HCV 抗体检测 |
| 1.12.2 HCV RNA检测用于HCV 感染的诊断 |
| 1.12.3 HCV 抗原的检测 |
| 1.13 丙型肝炎的研究展望 |
| 1.13.1 规范分型 |
| 1.13.2 细胞与动物模型 |
| 1.13.3 大容量噬菌体抗体库与肽库的构建 |
| 1.13.4 基因的表达调控 |
| 1.13.5 发病机制 |
| 1.13.6 HCV 受体 |
| 1.13.7 治疗 |
| 1.13.8 疫苗 |
| 试验研究 |
| 第二章 HCV 囊膜蛋白基因E1E2 的亚克隆及序列分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 含有HCV 囊膜蛋白基因组的质粒 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 载体和菌种 |
| 2.1.4 PCR 引物 |
| 2.1.5 培养基 |
| 2.1.6 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 引物的设计与合成 |
| 2.2.2 目的基因的扩增、纯化和回收 |
| 2.2.3 纯化产物与PGEM-T easy Vector 连接 |
| 2.2.4 新鲜感受态细胞的制备(CaCl_2 法) |
| 2.2.5 连接产物的转化 |
| 2.2.6 重组质粒的提取 |
| 2.2.7 重组质粒的鉴定 |
| 2.2.8 序列的计算机分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 PCR 产物的电泳结果 |
| 2.3.2 重组质粒的PCR 鉴定结果 |
| 2.3.3 组质粒的酶切鉴定结果 |
| 2.3.4 测序结果 |
| 2.3.5 氨基酸序列分析结果 |
| 2.3.6 HCV E1E2 基因编码蛋白质的理化性质分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 逆转录病毒载体介导的HCV囊膜蛋白基因E1E2在真核细胞中的表达及动物免疫试验 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 主要试剂 |
| 3.1.2 细胞系 |
| 3.1.3 试验动物 |
| 3.1.4 质粒 |
| 3.1.5 载体核菌株 |
| 3.1.6 培养基 |
| 3.1.7 主要仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 逆转录病毒表达质粒的构建 |
| 3.2.2 逆转录病毒假病毒制备 |
| 3.2.3 逆转录病毒假病毒侵染SP 2/0 细胞及抗性筛选表达细胞 |
| 3.2.4 FACS 分析筛选膜表面表达E1E2 蛋白的SP 2/0 细胞 |
| 3.2.5 表达E1E2 囊膜蛋白的 SP2/0 细胞免疫Balb/c 小鼠 |
| 3.2.6 小鼠采血及血清分离 |
| 3.2.7 血清抗体的检测 |
| 3.2.8 血清中和抗体检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 重组质粒的PCR 鉴定结果 |
| 3.3.2 组质粒的酶切鉴定结果 |
| 3.3.3 HCV E1E2 基因的核苷酸和相应的氨基酸序列 |
| 3.3.4 FACS 分析检测表达E1E2 囊膜蛋白的 SP2/0 细胞 |
| 3.3.5 免疫小鼠血清抗体的FACS 检测 |
| 3.3.6 中和抗体检测结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 HCV 囊膜蛋白单克隆抗体的制备 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 主要试剂 |
| 4.1.2 细胞系 |
| 4.1.3 试验动物 |
| 4.1.4 主要仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 免疫原的制备 |
| 4.2.2 动物免疫 |
| 4.2.3 骨髓瘤细胞的准备 |
| 4.2.4 脾淋巴细胞的准备 |
| 4.2.5 细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养 |
| 4.2.6 阳性杂交瘤细胞的筛选 |
| 4.2.7 阳性杂交瘤细胞的克隆 |
| 4.2.8 杂交瘤细胞的冻存与复苏 |
| 4.2.9 小鼠腹水的制备 |
| 4.2.10 单抗中和活性的检测 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 分泌特异单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立 |
| 4.3.2 中和抗体检测结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小节 |
| 第五章 丙型肝炎病毒核酸疫苗的构建及动物免疫试验 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 主要试剂 |
| 5.1.2 细胞系 |
| 5.1.3 试验动物 |
| 5.1.4 基因组质粒 |
| 5.1.5 载体和菌株 |
| 5.1.6 培养基 |
| 5.1.7 主要仪器 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 引物的设计 |
| 5.2.2 目的基因的扩增、纯化和回收、纯化产物与PGEM-T easy Vector 连接、新鲜感受态细胞的制备(CaCl_2 法)、连接产物的转化、重组质粒的提取 |
| 5.2.3 重组质粒的鉴定 |
| 5.2.4 真核表达质粒的构建 |
| 5.2.5 重组真核表达质粒转染293T 细胞 |
| 5.2.6 FACS 分析表达E1E2 蛋白的293T 细胞 |
| 5.2.7 重组真核表达质粒的大量提 |
| 5.2.8 重组真核表达质粒免疫Balb/c 小鼠取 |
| 5.2.9 免疫小鼠采血及血清分离 |
| 5.2.10 免疫小鼠血清抗体的检测 |
| 5.2.11 小鼠血清中和抗体的检测 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 PCR 产物的电泳结果 |
| 5.3.2 重组pGEM-T Easy载体质粒的酶切鉴定结果 |
| 5.3.3 重组质粒的酶切鉴定结果 |
| 5.3.4 重组质粒的测序结果 |
| 5.3.5 FACS 分析重组真核表达质粒转染293T 细胞瞬时表达 |
| 5.3.6 免疫小鼠血清抗体的FACS 检测 |
| 5.3.7 中和抗体检测结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小节 |
| 第六章 HCV 囊膜蛋白基因E1 和E2 原核表达载体的构建及表达 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 菌株和质粒 |
| 6.1.2 酶和试剂 |
| 6.1.3 阳性血清及酶标抗体 |
| 6.1.4 主要仪器设备 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 引物的设计与合成 |
| 6.2.2 目的基因的扩增、纯化和回收、纯化产物与PGEM-T easy Vector 连接、新鲜感受态细胞的制备(CaCl_2 法)、连接产物的转化、重组质粒的提取、重组质粒的鉴定 |
| 6.2.3 原核重组表达载体的构建与鉴定 |
| 6.2.4 E2 基因在大肠杆菌中的表达 |
| 6.2.5 表达蛋白的鉴定 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 重组原核表达载体E1-pET32a 和E2-pET32a 的PCR鉴定 |
| 6.3.2 重组原核表达载体E1-pET32a 和E2-pET32a 的酶切鉴定 |
| 6.3.3 重组原核表达载体序列测定 |
| 6.3.4 表达蛋白的SDS-PAGE 检测 |
| 6.3.5 表达蛋白的Western blot 检测 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 缩略词英汉对照表 |
| 致 谢 |
| 作者简介 |
（4）慢性HCV和/或HBV感染者Th1、Th2主要细胞因子基因多态性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 研究论文 慢性HCV 和／或 HBV 感染者 Th1、Th2 主要细胞因子基因多态性研究 |
| 引言 |
| 第一部分 ELISA 联合RT-n PCR 检测慢性丙型肝炎病毒感染结果分析 |
| 前言 |
| 对象与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 慢性HCV和／或HBV感染者Th1主要细胞因子基因多态性研究 |
| 前言 |
| 对象与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 慢性HCV和／或HBV感染者Th2主要细胞因子基因多态性研究 |
| 前言 |
| 对象与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 Th1、Th2 主要细胞因子基因多态性在慢性 HCV 和／或 HBV 感染者临床转归中的交互作用研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述一 慢性丙型、乙型肝炎标志物检测研究进展 |
| 综述二 慢性乙型、丙型肝炎免疫遗传机制研究进展 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）慢性HCV感染患者认知功能研究及其机制初步探讨（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 论文正文：慢性丙型肝炎病毒感染患者认知功能研究及其机制初步探讨 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 轻度慢性HCV 感染患者的认知功能研究 |
| 前言 |
| 1 材料及方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 慢性丙型肝炎患者中枢神经系统HCV 感染及其与认知损害相互关系 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一章 正负链HCV RNA 巢式荧光定量RT-PCR 检测方法的建立 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 第二章 慢性丙型肝炎患者脑脊液HCV RNA 的检测及其与认知损害关系 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 附加内容：中国西部地区动物Nipah 病毒和Hendra 病毒感染调查 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述1 大脑认知功能的神经影像学研究现状 |
| 参考文献 |
| 文献综述2 慢性丙型肝炎病毒感染相关神经认知功能损害研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 攻读博士学位期间的课题申请与课题实施 |
（6）多重PCR法一次性检测血清中HBV DNA，HCV RNA和HDV RNA（论文提纲范文）
| 综述：分子诊断技术在乙、丙、丁型肝炎诊断中的应用 |
| 论文：多重PCR法一次性检测血清中HBV DNA、HCV RNA和HDV PNA |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 实验材料与方法 |
| 结果及分析 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
（8）TaqMan探针法实时荧光定量PCR的应用和研究进展（论文提纲范文）
| 1 Taq Man探针法简介 |
| 2研究进展 |
| 3应用及前景 |
（9）昆明地区HCV分子流行病学研究及Core蛋白表达质粒构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 HCV的研究进展 |
| 1.1 HCV病原学 |
| 1.2 HCV分子流行病学 |
| 1.3 HCV变异与免疫逃逸 |
| 1.4 丙型肝炎病毒检测与C抗原表达 |
| 1.5 本论文的研究目的 |
| 第二章 云南省昆明市丙型肝炎 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 研究方案 |
| 2.3 实验材料和方法 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.5 讨论部分 |
| 第三章 HCV核心蛋白的表达载体构建 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 研究方案 |
| 3.3 实验材料和方法 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 4.1 基于HCV 5’ NCR-C区分型方法的建立 |
| 4.2 云南省昆明市所HCV感染人群HCV分子流行病学特点 |
| 4.3 云南省昆明市HCV感染人群1b基因型的复杂性分析 |
| 4.4 核心蛋白CTL Epitope分析 |
| 4.5 基因型与病毒载量、ALT、AST分析 |
| 4.6 pET 100-Core在大肠杆菌中诱导表达和最适诱导时间筛选 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 在读期间已发表发表的论文和提交的序列: |
（10）新型冠状病毒实验室诊断方法学研究（论文提纲范文）
| 第一章 引言 |
| 1.1 传染性非典型肺炎的发现 |
| 1.1.1 传染性非典型肺炎的发现过程 |
| 1.1.2 传染性非典型肺炎疫情 |
| 1.1.3 全球非典型肺炎的防治措施 |
| 1.2 冠状病毒回顾 |
| 1.2.1 冠状病毒研究历史 |
| 1.2.2 冠状病毒科的分类 |
| 1.2.3 冠状病毒理化性质 |
| 1.2.4 冠状病毒的流行病学 |
| 1.2.5 冠状病毒的临床特点 |
| 1.2.6 新型冠状病毒特点 |
| 1.3 病原体检测方法回顾 |
| 1.4 SARS CoV检测方法 |
| 1.4.1 免疫学方法 |
| 1.4.2 基因检测 |
| 1.5 博士论文的设计思路和研究内容 |
| 第二章 新型冠状病毒(SARS CoV)基因组信息学 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 基因组基本情况 |
| 2.3.2 基因组结构分析 |
| 2.3.3 基因变异分析 |
| 2.3.4 进化分析 |
| 2.3.4 靶序列的选择、引物、探针设计和分析 |
| 2.4 结论 |
| 第三章 新型冠状病毒(SARS CoV)基因重组 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 抗核糖核酸酶的SARS CoVRNA片断重组病毒样颗粒的构建 |
| 3.3.2 重组SARS内对照(SARS-IC)病毒样颗粒的构建 |
| 3.3.3 SARS CoV结构基因M、N蛋白的克隆、表达 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.5 结论 |
| 第四章 新型冠状病毒(SARS CoV)核酸荧光 PCR检测研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 引物、探针合成 |
| 4.3.2 荧光探针的标记 |
| 4.3.3 引物和探针的检测 |
| 4.3.4 高效样品处理方法的研究 |
| 4.3.5 反转录扩增检测体系的建立及优化 |
| 4.3.6 实验数据分析 |
| 4.3.7 检测方法的灵敏度、特异性评价 |
| 4.3.8 实验阴阳对照、灵敏度和特异性样本、全程系统内参照物的制备 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.5 结论 |
| 第五章 新型冠状病毒(SARS CoV)酶免 PCR检测方法研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 探针、引物的设计与合成、检测分析 |
| 5.3.2 样品处理、反转录/cDNA富集、PCR扩增体系的构建 |
| 3.3.3 阳性对照 |
| 5.3.4 捕获微孔板的研制 |
| 5.3.5 微孔板杂交体系的构建 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.5 结论 |
| 第六章 新型冠状病毒(SARS CoV)抗体酶免检测方法研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与仪器 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 制备SARS免疫抗血清 |
| 6.3.2 双抗原夹心法检测模式的设计 |
| 6.3.3 酶标记抗原结合物的制备 |
| 6.3.4 抗原搭配实验 |
| 6.3.5 酶联免疫工艺过程的确定 |
| 6.3.6 检测方法参比品的配制 |
| 6.4 结果与讨论 |
| 6.5 结论 |
| 第七章 新型冠状病毒(SARS CoV)检测方法临床评价 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 SARS CoV抗体酶免检测方法的临床评价 |
| 7.3 SARS CoV PCR检测方法的临床评价 |
| 7.4 荧光 PCR、酶免 PCR和双抗原夹心法比较 |
| 7.5 结论 |
| 第八章 研究总结 |
| 参考文件 |
| 在读期间发表或接收的论文 |
| 获奖和技术应用情况 |
| 致谢 |
四、套式聚合酶链反应检测体液中的丙型肝炎病毒核酸（论文参考文献）
- [1]湖南省吸毒患者感染丙型肝炎病毒基因型特征分析[D]. 戴俊斌. 南华大学, 2019(01)
- [2]病毒性脑炎HCV和BDV感染的基础应用研究[D]. 王振海. 重庆医科大学, 2006(01)
- [3]逆转录病毒载体介导的丙型肝炎病毒（HCV）囊膜蛋白基因的表达及抗HCV中和抗体的研究[D]. 许信刚. 西北农林科技大学, 2005(02)
- [4]慢性HCV和/或HBV感染者Th1、Th2主要细胞因子基因多态性研究[D]. 高秋菊. 河北医科大学, 2007(06)
- [5]慢性HCV感染患者认知功能研究及其机制初步探讨[D]. 彭丹. 重庆医科大学, 2009(04)
- [6]多重PCR法一次性检测血清中HBV DNA，HCV RNA和HDV RNA[D]. 李晓鄂. 北京生物制品研究所, 1997(06)
- [7]逆转录－套式PCR检测血清中丙肝病毒RNA[J]. 胡向阳,黄晓明,高翼之,尤大钰. 临床检验杂志, 1995(S1)
- [8]TaqMan探针法实时荧光定量PCR的应用和研究进展[J]. 姜文灿,岳素文,江洪,王成彬. 临床检验杂志(电子版), 2015(01)
- [9]昆明地区HCV分子流行病学研究及Core蛋白表达质粒构建[D]. 林毅雄. 昆明理工大学, 2007(02)
- [10]新型冠状病毒实验室诊断方法学研究[D]. 李振勇. 郑州大学, 2005(08)