一、浙江蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)毒激肽释放酶Ⅰ酶解产物激肽的鉴定（论文文献综述）
王云鹏[1]（2012）在《江浙蝮蛇蛇毒激肽释放酶在麦胚无细胞蛋白合成系统中的表达和优化》文中指出本研究在成功克隆得到江浙蝮蛇蛇毒激肽释放酶目的基因的基础上，在蛇毒激肽释放酶基因序列上引入BamHI和XhoI两个酶切位点以及由六个组氨酸组成的组氨酸标签，并将其与pCS2+表达载体相连，构建了质粒pCS2+/VK，经过酶切测序验证插入方向正确且未引起碱基序列的变化。将pCS2+/VK线性化后，进行体外转录，得到适合进行翻译的模板mRNA。再将mRNA同自制麦胚抽提物以及翻译缓冲液混合，26°C孵育16h，将反应后的混合物进行SDS-PAGE电泳，能够得到一条大约43kDa的条带，经Western blot验证为所需要目的蛋白。麦胚无细胞蛋白表达系统在安全准确的合成功能蛋白方面具有很大的潜力，但是能源物质的供应以及模板mRNA的稳定性一直是影响系统产率的主要因素。本文中磷酸肌酸和丙酮酸作为提供ATP二次能源物质加入系统中，在对蛋白产率进行比较之后，发现磷酸肌酸更适合于麦胚无细胞蛋白合成系统；为了提高mRNA模板稳定性，向系统中补充了质粒载体、SP6RNA聚合酶以及铜离子，并对这些条件进行了优化，最终建立了一个高效快速的麦胚无细胞蛋白合成系统。当向系统中加入30ng/μL质粒载体、15U SP6RNA聚合酶、25mM磷酸肌酸以及5mM Cu2+后，并在26°C反应16h时，蛇毒激肽释放酶产量从0.13mg/mL提高到0.74mg/mL。通过固定化金属亲和层析法（IMAC）对重组蛇毒激肽释放酶进行分离纯化，将纯化后的蛋白透析冻干，将重组蛋白（1.3U/mg）与天然蛇毒激肽释放酶（1.736U/mg）以及去糖基化后的天然蛇毒激肽释放酶（1.528U/mg）的活性进行了对比，发现重组蛇毒激肽释放酶比活力与天然蛇毒激肽释放酶比活力差异不显着，而与去糖基化后的天然蛇毒激肽释放酶更接近。本研究成果为进一步开展江浙蝮蛇蛇毒激肽释放酶结构功能研究以及麦胚无细胞蛋白合成系统的工业化应用奠定了良好的基础。
王心民,戚正武[2]（1983）在《浙江蝮蛇（Agkistrodon halys Pallas）毒激肽释放酶Ⅰ酶解产物激肽的鉴定》文中进行了进一步梳理 至今已知的蛇毒激肽释放酶作用于激肽原后都释放舒缓激肽,仅食鱼蝮（Agkistrodon piscivorus piscivorus）蛇毒激肽释放酶既释放舒缓激肽,又释放胰激肽（Iwanaga,1979）。今对浙江蝮蛇毒激肽释放酶Ⅰ作用于激肽原后的产物作了鉴定,证实也是舒缓激肽。因此蝮蛇毒激肽释放酶不同于哺乳动物的组织激肽释放酶,后者释放胰激肽（Fiedler,1979）。
陈俊[3]（2021）在《717解毒合剂治疗蝮蛇咬伤的临床及实验研究》文中指出1目的1.1观察717解毒合剂对蝮蛇咬伤患者的临床疗效,对蝮蛇伤患者血生化值如心肌酶谱（CK、CK-MB）,肝功能指标（AST、ALT）,肾功能指标（BUN、CREA）,血常规（WBC、CRP）,凝血功能（APTT、PT）,炎症介质（TNF-α、IL-6、5-HT、Histamine）等值进行检测,探求717解毒合剂治疗蝮蛇咬伤的作用机制。1.2蛋白组学观察蝮蛇伤大鼠创面组织差异蛋白表达:收集各组大鼠腓肠肌创面组织,采用基于双向电泳（2-DE）-基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）蛋白质组学分析方法,对比分析正常大鼠与蝮蛇上大鼠创面蛋白差异表达情况。1.3动物实验观察蝮蛇毒对大鼠致毒效应以及717解毒合剂的治疗作用;屏障环境下,从脏器系数、生化指标、炎症因子水平等方面,观察蝮蛇毒对大鼠的致毒效应。并从NF-κB和MAPK信号通路研究717解毒合剂抗蝮蛇毒治疗蛇伤机制。2方法2.1临床观察:从2018年9月至2020年11月间在江西省中医院外一科住院部就诊的患者中择取150例符合临床试验条件的病患,随机分为治疗组及对照组,每组各分配75例病患。对照组予西医常规治疗,治疗组在此治疗基础上,每日另口服1剂717解毒合剂,分2次（早、晚饭后）温服。详细记录两组患者治疗7天内的病情表现、生化仪检测相关生化指标、ELISA检测TNF-α、IL-6、5-HT、Histamine数值,具体内容为:2.1.1临床疗效;2.1.2两组患者病情程度与临床疗效比较;2.1.3肿胀、疼痛、瘀斑消退时间及治愈时间;2.1.4治疗前后局部症状、全身体征积分及总积分;2.1.5治疗前、治疗后1天、治疗后3天、治疗后7天总积分;2.1.6治疗前后心肌酶谱、肝功能指标、肾功能指标检测2.1.7两组患者治疗前后相关因子表达水平。2.2动物实验2.2.1实验一:将16只SPF级SD大鼠随机、对半分成两组,雌雄各半,取蝮蛇毒皮下注射于大鼠左下肢制成蛇伤模型,2h后取2种疮面肌肉进行蛋白质分析,2D-DIGE双向电泳,MALDI-TOF-MS质谱分析,观察大鼠蛋白表达情况,采用软件Mascot distiller过滤基线峰、识别信号峰。应用Mascot软件搜索NCBI数据库,寻找匹配的相关蛋白质,同时查询其功能,来明确鉴定的差异蛋白质为何种蛋白质。2.2.2实验二:52只SPF级SD大鼠（雌雄各半）分为正常组和蝮蛇毒组,蝮蛇毒组再分为2h、4h、12h、24h、36h、72h共计六组,于大鼠左后肢注射蝮蛇毒造模,分别于2h、4h、12h、24h、36h、72h麻醉模型大鼠并取心、肝、脾、肺、肾组织及动脉血。观察:（1）大鼠注射蛇毒后一般反应;（2）生化仪检测血清CK、CK-MB、LDH、AST、ALT、GLDH、ALP、UREA、CREA、UA等数值;（3）观察脏器病理学改变。2.2.3实验三:72只SPF级SD大鼠（雌雄各半）随机分为正常对照组、模型对照组、蛇毒血清组、低剂量药物组、中剂量药物组、高剂量药物组,共计6组。左下肢注射蝮蛇毒,2小时后给予治疗,蛇毒组尾静脉注射抗蛇毒血清0.6mL/只,717解毒合剂组按5、20、50mL/kg.d剂量灌胃,共灌6天。20只KM小鼠随机、对半分成2组,雌雄各半,按10mL/kg.d剂量灌胃,共灌3天。SD大鼠各组分别于注射蝮蛇毒后2h、治疗后72h、治疗第6天腹腔麻醉后腹主动脉取血、取肝脏组织。观察:2.2.3.1观察大鼠一般情况,蝮蛇毒小鼠腹膜情况,镜下大鼠肝脏组织结构;2.2.3.2 ELISA法检测三次取血所得血清中TNF-α、NF-κB含量,第6天所取血清中IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α、NF-κB、CRP、INF-β因子表达水平;RT-PCR法检测IκBαmRNA、p38MAPK mRNA表达水平,Western blot检测iNOS、COX-2蛋白表达,免疫组化法检测各组织中NF-кB P50、NF-кB P65表达。3结果3.1临床研究3.1.1治疗组、对照组总有效率分别为90.41%、76.39%,两组患者在临床疗效方面差异显着（P<0.05）,具有统计学意义;3.1.2治疗组62例轻、中度患者,治愈17例、显效25例、有效16例、无效4例;11例重度患者,治愈5例、显效2例、有效1例、无效3例。对照组65例轻、中度患者,治愈8例、显效20例、有效22例、无效15例;7例重度患者,治愈4例、显效1例、无效2例。两组在轻、中度患者的临床疗效上差异不显着（P>0.05）,在重度患者的临床疗效方面差异显着（P<0.05）,具有统计学意义;3.1.3治疗组患者平均肿胀、疼痛、瘀斑消退时间4.48±0.87天、4.95±0.57天、7.43±1.42天,平均住院时间4.98±1.17天;对照组患者平均肿胀、疼痛、瘀斑消退时间5.75±1.01天、6.50±0.86天、8.52±1.44天,平均住院时间6.46±1.45天。两组患者在肿胀、疼痛、瘀斑消退及疾病治愈时间方面差异显着（P<0.05）,具有统计学意义;3.1.4治疗后治疗组患者局部症状积分、全身体征积分、总积分具体为1.48±0.87、1.94±1.15、2.44±1.44;对照组分别为2.46±0.86、2.95±1.15、4.20±1.30,组间差异显着（P<0.01）,具有统计学意义;3.1.5 717解毒合剂能有效治疗蝮蛇咬伤患者,治疗后两组患者积分均下降,第3天、第7天积分下降明显（P<0.01）,比较有统计学意义;3.1.6两组患者治疗前后CK、CK-MB、LDH、ALT、AST、BUN、Cr值比较差异显着（P<0.05）,有统计学意义;3.1.7两组患者治疗后的WBC、CRP、APTT、PT、TNF-α、IL-6、5-HT、Histamine数值均下降,治疗前后有统计学意义。3.2动物实验3.2.1实验一蝮蛇伤模型大鼠较正常大鼠蛋白表达升高斑点为160个,降低的斑点为141个,其中蝮蛇伤四个斑点鉴定蛋白主要含有Myosin-4,Alpha-1B-glycoprotein两种蛋白,初步验证了蛋白组学技术应用于蛇伤早期鉴别诊断标志物筛选的可行性。3.2.2实验二3.2.2.1创面2h后出现中毒现象,4h水肿明显,12h组织液渗出,36h出现自愈趋势,72h开始结痂;3.2.2.2在无菌环境中,蝮蛇毒大鼠脏器或增大或减小,36h后各脏器均有恢复趋势;3.2.2.3治疗后,各组TP、ALB值均降低,GLOB先减小后增大,ALT、AST、ALP、CK、LDH、UREA、CREA、UA值先升高后降低,各指标均有后期恢复趋势;3.2.2.4心肌细胞、肝细胞、肾脏组织4h出现较明显损伤、见炎性浸润,72h出现组织溶解、坏死现象。肺组织后期见轻微肺泡间增宽现象,少见炎细胞浸润。3.2.3实验三3.2.3.1血清组及717解毒合剂中、高剂量组大鼠皮毛光润,精神状态良好,饮食、活动均趋于正常,创面愈合程度高;模型组大鼠皮毛较松散,精神状况不佳,饮食、活动量较少,反应迟钝。造模4小时后小鼠腹部皮下见紫黑色弥漫性出血,72小时症状减轻,中药组减轻更明显。3.2.3.2正常大鼠肝小叶肝细胞排列整齐呈多角形,模型组肝小叶结构稍紊乱,肝细胞体积增大,胞浆染色淡、胞内空泡化,有明显炎细胞浸润,点状坏死灶,717解毒合剂能减轻肝细胞肿胀程度,以高剂量组效果最明显,肝索排列较为整齐,组织结构趋向正常。3.2.3.3蝮蛇伤大鼠血清中TNF-α、NF-κB、IL-2、IL-4、IL-6、CRP、INF-β表达升高;肝组织中COX-2、i NOS、p38MAPK、p-p38MAPK、STAT3、P-STAT3、IκBαmRNA,NF-κB,NF-κB P50蛋白表达升高,p38MAPK mRNA、IκBα蛋白表达下调,717解毒合剂能起到有效的逆向调节作用。4结论4.1 717解毒合剂能有效治疗蝮蛇咬伤患者,减少肿胀、疼痛、瘀斑消退及疾病治愈时间,降低局部症状、全身体征积分及总积分;4.2 CK、CK-MB、LDH、ALT、AST、BUN、Cr,TNF-α、NF-κB、IL-6、p38MAPK、p-p38MAPK、STAT3、P-STAT3、IκBαmRNA、NF-κB P50等可作为蝮蛇咬伤程度及疗效评价指标;4.3 717解毒合剂通过调控NF-ΚB与MAPK信号通路起到抗蝮蛇毒活性,对主要炎症因子具有抑制作用,在治疗后期更具有抗炎活性及免疫调节作用,也为临床研究提供了实验依据。
廖丹葵[4]（2006）在《鸡蛋蛋黄蛋白质制备降血压肽的研究》文中进行了进一步梳理血管紧张素转化酶在血压调节中具有双重的作用，它将无催化活性的血管紧张素Ⅰ转化为具有活性的血管紧张素Ⅱ，同时，它还可催化降压物质舒缓激肽分解从而导致血压升高。食品蛋白质中存在着活性肽，其中对血管紧张素转化酶具有抑制作用的活性肽（降血压肽）的研究在国内外尤其引人注目，它可通过酶水解食品蛋白质而获得。采用鸡蛋蛋黄蛋白质为原料，经超临界CO2-乙醇萃取出蛋黄油和卵磷脂纯化蛋黄蛋白质，得到含量为74.68％的蛋黄蛋白质，蛋白质含量较传统的溶剂提取法提高了24％。经SDS—PAGE法测定，得蛋黄蛋白主要由35kDa、40kDa、67kDa和100kDa以上分子量的蛋白质组成。用12种蛋白酶酶解蛋黄蛋白质，结果显示所用酶水解产物对ACE皆具有抑制作用；采用体外保温抑制实验将其中活性较好的6种酶解产物进行筛选，确定了产物对ACE的抑制类型，并筛选出酶L为制备蛋黄降血压肽的酶类，其水解产物的IC50为1.19mg／mL。考察了各因素对酶解的影响，得到蛋黄蛋白质酶解作用最适水解时间为300min、温度为45℃、pH为9.5、底物浓度为60g／L、加酶量为0.42g／kg，此时蛋黄蛋白质水解度为17.2％，氮溶解指数为89.09％，平均肽链长度为6.5。建立了酶解蛋黄蛋白质的水解动力学模型，得到其动力学方程为r=（270.2E0-0.4125S0）exp[-0.23（DH）]，动力学模型与实验结果吻合较好。蛋黄水解液经活性炭脱色、采用截留分子量为10K和3.5K的超滤膜进行分离，所得蛋黄降血压肽超滤液对ACE抑制活性明显提高；用D61大孔阳离子交换树脂对分子量小于3.5kDa的水解液进行分离，确定了离子交换分离降血压肽的适宜条件为：采用pH4.1、浓度为0.05 mol／L的乙酸钠缓冲溶液+1.0mol／L的NaCl溶液，梯度洗脱，上样量为25mg／mL（湿树脂体积），洗脱速度为0.5mL／min，在此条件下，肽的得率与活性回收率分别为67.2％和73.59％。用Sephadex G-15对离子交换树脂分离出的穿透峰和洗脱峰分别进行分离和纯化，用RP-HPLC分离纯化最大活性组分峰，用RP-HPLC和高效毛细管电泳（HPCE）进行纯度鉴定，经薄层色谱分析和电喷雾质谱鉴定表征了降血压肽EY-1的结构序列为Leu-Tyr-Pro。蛋黄水解液的功能研究实验表明，蛋黄水解液有较好的耐热、耐酸稳定性，并发现不同分子量范围的水解产物具有较好的抗油脂氧化性能。与肠道酶作用结果表明，蛋黄水解液与胃蛋白酶作用后其IC50值由1.19mg／mL变为0.94mg／mL，与胰蛋白酶作用后产物的IC50则增至3.19mg／mL，活性有一定的损失，并经毛细管电泳肽谱图得到证实。
王茵[5]（2009）在《紫菜降血压肽的酶法制备及降压效果的研究》文中提出本文通过分析比较5种大型海藻的蛋白含量、氨基酸组成等因素确定了坛紫菜作为研究和制备海藻降血压肽的原料;经酶法、超滤、凝胶层析、反相高效液相色谱、质谱等技术研究了提取海藻降血压肽的工艺条件和技术方法,获得具有较高血管紧张素转化酶（ACE）抑制活性的海藻降血压肽。并通过动物实验进一步证实了所制备的紫菜降血压肽具有显着的降压效果。首先,通过对福建沿海5种大型海藻主要成分的分析,发现海藻中均含有丰富蛋白质、多糖和矿物质等营养成分,而蛋白质含量以坛紫菜为最高,约占干重的28.78%,且氨基酸组成中含有较多适合降血压肽结构模型的氨基酸,确定坛紫菜具有制备降血压肽的合适蛋白源,是制备海藻降血压肽的最佳原料。体外检测降血压肽ACE抑制活性的实验中需要大量的ACE,本实验通过硫酸铵分级盐析法提取猪肺组织中的ACE粗酶液,测定其酶活力为15.45×10-3 U/mg,比活力为33.80×10-3 U/mg,且活性较为稳定,可用于降血压肽关于ACE抑制率的检测。本研究中通过比较分析AS.1398中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、复合蛋白酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶等6种蛋白酶对紫菜的酶解效果,筛选出AS.1398中性蛋白酶为制备紫菜降血压肽的最佳蛋白酶;经正交实验获得其最佳酶解条件为温度50℃、酶浓度12000 U/g、底物浓度5%、pH7.5、酶解时间10 h。在该条件下获得的紫菜酶解产物的水解度为75.96%,ACE抑制率达78.34%。采用超滤、Sephadex G-15凝胶层析和RP-HPLC等分离技术对紫菜酶解液进行分离纯化,获得成分较为单一的降血压肽组分Ⅲ-E-6,其对ACE的抑制率达到89.54%。经过MALDI-TOF/MS分析,推测组分Ⅲ-E-6中降血压肽的分子量为860.17。动物实验中,通过急性毒性实验证实紫菜降血压肽属于无毒物质。以原发性高血压大鼠（SHR）和正常对照京都wistar大鼠（WKY）为模型动物。一次性给药实验结果显示,紫菜降血压肽500 mg/kg组、1000 mg/kg组、1500 mg/kg组和Captopril组的SHR在给药后,血压分别下降了18.7 mmHg、31.5 mmHg、45.2 mmHg和58.5 mmHg;长期性给药实验结果显示,在给药4周后,SHR的血压分别下降了21.2 mmHg、28.0 mmHg、37.0 mmHg和47.0 mmHg,表明随着剂量的增加,血压降低的效果越显着。在与WKY的对照实验中发现,紫菜降血压肽对WKY的正常血压没有显着影响,而Captopril对WKY仍有降压作用,同时还发现紫菜降血压肽饲喂的大鼠体重均有显着的增加。因此,说明紫菜降血压肽长期服用不仅可以达到控制血压的功效,还具有促进生长的作用。
叶勇[6]（2003）在《江浙蝮蛇毒镇痛C4组分提取纯化及其对内阿片肽调控机理研究》文中进行了进一步梳理本论文的研究源于中药戒毒制剂冰茶栓，它是导师王泽时教授经过多年研制的，以江浙蝮蛇毒为君药的中药复方制剂，能显着控制以疼痛为主的戒断症状。探索江浙蝮蛇毒在戒毒镇痛中所起的作用，对于阐明冰茶栓的作用机理具有十分重要的意义。但江浙蝮蛇毒是一种复杂蛋白，其中每一种蛋白均有不同的药理作用，因此需要从中分离出一种具有良好戒毒镇痛效果的蛋白质，明确其性质，才能进行相关的机理研究。本论文基于此目的，分离筛选出一种江浙蝮蛇毒碱性蛋白质，揭示了它的理化性质、作用途径及对中枢神经递质的调控机理，从而为江浙蝮蛇毒的新药开发奠定了理论基础。 第一部分 冰茶栓靶基因及靶药物的筛选研究 通过冰茶栓药物靶作用的研究，发现冰茶栓能显着控制海洛因依赖猴的戒断症状，同时通过猴大脑中枢纹状体组织的基因芯片研究，找到其有显着性差异表达的基因。用剂量递增法形成海洛因依赖性猴，并进行等级评分，判定猴对海洛因的依赖程度。当形成依赖后，撤药期间，取正常组、阴性组和冰茶栓治疗组猴，从心脏直接注入空气处死，立即取下大脑纹状体，液氮保存。通过总RNA抽提，预杂交和探针标记，将对照组和实验组分别标记Cy3和Cy5荧光，通过荧光信号强度和比值，判断差异表达基因。 戒断评分结果显示：冰茶栓治疗组的分值与阴性对照组有显着差异，但与阳性可乐定组无差异，海洛因依赖猴大脑纹状体基因表达在戒断期和冰茶栓治疗期出现了二个显着性差异基因，分别为前脑啡肽原（Preproenkephalin）和白细胞抗原（HLA-SB（DP）alpha）基因。当猴形成海洛因依赖后，其前脑啡肤原基因表达下调，而经冰茶栓治疗后，其前脑啡肤原基因表达上调，白细胞抗原基因表达下调。提示冰茶栓一方面促进了前脑啡肤原基因的表达，另一方面抑制了白细胞抗原基因的表达，然后达到控制戒断症状的疗效。用均匀设计方法对冰茶栓进行拆方研究，结果提示:江浙蝮蛇毒是冰茶栓中起镇痛作用的靶药物。 第二部分江浙蝮蛇毒组分的分离纯化和镇痛C4组分的筛选及其理化性质研究 探索冰茶栓的主要镇痛活性物质一一江浙蝮蛇毒中可能存在着相关蛋白。采用AKTA一ExPlorer100蛋白质纯化平台，对江浙蝮蛇毒各蛋白质组分进行了提取、分离和纯化，结合镇痛药效和毒性实验筛选最佳镇痛组分;并采用SDS一PAGE、等电聚焦、HPLC等方法获得分子量、等电点和纯度，用紫外光谱及氨基酸序列等进一步明确其理化性质。 分离实验中用阳离子交换柱、阴离子交换柱、分子筛和不同型号的分离介质，对江浙蝮蛇毒的分离效果进行了考察。采用正交设计L，（3’）考察了缓冲液pH、流速、盐浓度等分离参数对分离效果的影响;并用SCoLlting进行方法学考察。确定了先后以离子交换，两种型号分子筛的三步法，最终可获得蛋白质分离纯度为97.5%以上的纯品。 江浙蝮蛇毒经分离纯化，分离出14个蛋白组分，其中酸性组分5个，碱性组分5个，中性组分4个。进行分子筛纯化时，小流速洗脱分离效果最佳。 对分离出的各蛋白组分以小鼠热板法和醋酸扭体法进行E氏，和L氏，的测定。发现一种碱性蛋白质具有较强的镇痛作用和较低毒性，腹腔给药的LD。。为13.33mg/Kg，ED。，为0.63mg/Kg，该组分静脉注射30分钟起效，镇痛强度在5小时达高峰，并持续10小时以上，具有较好的应用价值。编号为C4（为阳离子交换柱分离的4号峰）。 C4组分测定分子量为16.6KD，等电点为8.8，在波长214.16n:和302.Osnm处有最大吸收，在273.09nrn处有最小吸收。H尸LC测定其纯度为92%，具有热不稳定性。该蛋白质N端的前10个氨基酸序列为:H一L一L一Q一F一R一K一M一I一K，经同源性比较，发现它与磷脂酶A2有同源性，但其分子量、HPLC保留时间、热不稳定性均不同于磷脂酶A2。 经大鼠催促戒断试验、大鼠自然戒断试验和C4组分的耐受性试验均表明，C4组分在长期用药过程中不产生身体耐受性和依赖性。 第三部分江浙蝮蛇毒镇痛C4组分的中枢作用研究 江浙蝮蛇毒镇痛C4组分具有镇痛作用，但它是否是中枢镇痛作用?其作用的部位又在哪里?是对其作进一步研究必须回答的问题。因此本实验研究了药物作用之靶区，及其C4组分对大脑中枢镇痛作用之靶点。 通过纳络酮、利血平、阿托品药物对江浙蝮蛇毒C4组分镇痛作用影响的实验，结果表明:阿托品对江浙蝮蛇毒C4组分的镇痛作用无影响，它不作用于乙酞胆碱受体;利血平对C4组分具有提高痛闲的作用;纳络酮对C4组分的镇痛作用具有部分拮抗效应，说明该组分与阿片受体有一定相关性。小鼠侧脑室给药1/400ED5。即表现良好的镇痛效果，说明C4组分具有中枢性作用。脊髓化鼠模型及大鼠足踢定压刺激法试验也表明C4组分是通过中枢起效的。在停药24小时取吗啡依赖大鼠的各脑区组织，测定发现大脑尾状核、壳核、丘脑、红核、苍白球和中脑导水管灰质等组织的亮氨酸脑啡肤含量明显下降，多数脑区的日内啡肤和P物质含量也有所下降。给予C4组分后，多数脑区的亮氨酸脑啡肤含量增加，尤其以尾状核、丘
裴剑竹[7]（2012）在《中介蝮（Gloydius intermedius）蛇毒一种丝氨酸蛋白酶的分离及生物学活性研究》文中研究说明蛇毒丝氨酸蛋白酶（Snake Venome Serine Proteinases, SVSPs）是蛇毒中一类重要的具有明显的抗凝、溶栓、促血小板聚集等功能的蛋白水解酶,对凝血-溶栓系统的作用广泛,在临床上有很大的应用价值。虽然其一级结构具有很大的同源性,但是不同的SVSPs却作用于不同的底物,而且一种SVSP往往同时能对多种蛋白底物或者小分子底物具有水解能力,因此成为研究蛋白质结构和功能的极好模型。中介蝮（Gintermedius）蛇隶属于蝰科蝮亚科（Crotalinae）,广泛分布于我国西北、华北地区,与广大人们的生活息息相关。因此,对其SVSPs的研究具有重要意义,而分离获得中介蝮的SVSPs是首要条件。本研究的内容和结果：1、中介蝮蛇毒中SVSPs勺分离纯化（1）以中介蝮粗毒为原料,用Sephacryl-200HR凝胶过滤层析自装柱进行初步分离,选择50mmol/L碳酸氢铵（pH8.0,含有0.15mol/LNaCl和0.2g/L的叠氮钠）作为平衡和洗脱缓冲液,分离得到5个蛋白组份（Peak1-5）。以BApNA为底物对获得的峰组份进行活性鉴定,并采用SDS-PAGE电泳对蛋白质纯度进行初步检测。结果表明,Peak2峰组份具有水角BApNA的活性。SDS-PAGE电泳分析显示Peak2非单一条带,说明含有其他种类的杂蛋白,需要进一步分离。（2）用HiTrap DEAE-FF阴离子交换层析柱对Peak2组份进行进一步的分离纯化。上样后以A液（50mmol/L碳酸氢铵,pH8.0）洗脱未结合的组份,之后从A液到100%B液（50mmol/L碳酸氢铵,0.5mol/LNaCl, pH8.0）进行线性梯度洗脱。收集各峰,然后以BApNA为底物对获得的峰组份进行活性鉴定,然后采用SDS-PAGE电泳分析各组份的蛋白纯度。结果表明,Peak2-3、Peak2-4具有水解丝氨酸蛋白酶特定底物BApNA的活性,由于SDS-PAGE、析显示这两个峰组份均不是单一条带,还需进行进一步的分离。（3）用HiTrap CM阳离子交换β β β β层析柱对Peak2-3组份进行最后的分离纯化。上样后以A液（50mmol/L醋酸钠,pH6.0）洗脱未结合的杂质组份,之后从A液到100%B液（50mmol/L醋酸钠,0.5mol/LNaCl, pH6.0）进行线性梯度洗脱。收集各峰,然后以BApNA为底物,对各峰组份进行活性鉴定,并采用SDS-PAGE电泳分析各组份蛋白纯度。结果表明,Peak2-3-1可水解底物BApNA, SDS-PAGE电泳显示Peak2-3-1基本为单一条带,为我们所需要的目的蛋白。2、生物活性表征（1）蛋白纯度鉴定：Peak2-3-1组份分别经还原性和非还原性的SDS-PAGE电泳鉴定蛋白纯度,结果显示Peak2-3-1在还原性和非还原性电泳中均为单一条带。（2）分离纯化出的Peak2-3-1经还原性SDS.PAGE后,将含目的蛋白的胶条切下,送公司进行质谱分析。（3）以BApNA为底物,测定Peak2-3-1的酶活力为8.4×10-3nmol/min/mg.（4）特异性抑制剂的作用：以BApNA为底物测定不同的抑制剂：PMSF. EDTA.β-锍基乙醇对Peak2-3-1酶活性的影响,以不加任何抑制剂的Peak2-3-1为对照。结果发现PMSF可显着的抑制Peak2-3-1对BApNA的水解（p<0.05）,而EDTA无抑制作用,说明Peak2-3-1是SVSPs,而不是蛇毒金属蛋白酶。（5）纤维蛋白原（Fg）水解活性：Peak2-3-1组份与纤维蛋白原溶液混合均匀,于37℃共同孵育,分不同的时间段取样（0,15,30min,1,2,4,8,12h）,然后用12%的SDS-PAGE检测Peak2-3-1又‘维蛋白原0l、13、Y链的水解情况,结果显示,Peak2-3-1能够快速水解纤维蛋白原的BB链,对Act链也有一定的水解作用。（6）类凝血酶活性：Peak2-3-1与纤维蛋白原溶液混合均匀后,37℃孵育,观察白色沉淀的生成。以凝血晦为阳性对照。结果表明,Peak2-3-1不能使纤维蛋白原溶液凝结,不具有类凝血酶活性。（7）纤溶活性：采用纤维蛋白平板法,测定Peak2-3-1的纤溶活性。结果娃示,Peak2-3-1可以水解纤维蛋白,具有纤溶活性。（8）出血活性测定：选用昆明系小鼠,以不同的Peak2-3-1量,对小鼠进行背部皮下注射,24h后处死小鼠,将处死小鼠的背部皮肤剥下,观察出血情况。结果发现,Peak2-3-1量达到50μg时,仍未发现皮下出血斑,说明Peak2-3-1不具有出血活性。（9）小鼠尾巴的流血时间的测定：选用昆明系小鼠,以生理盐水为对照,尾静脉注射Peak2-3-1,注射量为0.5g/kg,观察Peak2-3-1对小鼠尾静脉流血时间的影响。结果表明,与生理盐水对照组（599±165s）相比,Peak2-3-1能明显延长小鼠尾静脉流血时间（984±182s）。结论：采用凝胶过滤层析和离子交换层析技术,从中介蝮蛇粗毒中筛选分离得到了一种蛇毒丝氨酸蛋白酶一Peak2-3-1,其分子量为28.8KDa,是一种蛇毒纤溶酶。Peak2-3-1能够快速的水解纤维蛋白原的Bp链,缓慢水解Aα链。其酶活性可被PMSF显着抑制,而不受EDTA的影响。Peak2-3-1无类凝血酶活性和出血活性,能够显着延长小鼠尾静脉的流血时间。本工作为下一步研究中介蝮蛇毒丝氨酸蛋白酶的分子进化及作用机理奠定了基础。
李莹[8]（2012）在《泥鳅蛋白源ACE抑制肽的酶法制备及其降压活性研究》文中研究说明论文以泥鳅蛋白为原料,运用可控酶解技术,制备高活性降血压肽。经过超滤、凝胶过滤、反相高效液相色谱层析及质谱测序等技术分离、纯化并鉴定泥鳅降血压肽,通过体外、体内活性试验确定降血压肽的降压活性。采用z-scales;描述符构建了ACE抑制四肽的定量构效关系模型,为指导和设计新化合物提供理论依据。首先分析了泥鳅的基本营养成分,从氨基酸组成的角度评估其营养价值。泥鳅的蛋白含量17.4%,脂肪含量仅1.5%,灰分1.3%,水分77.2%,是一种典型的高蛋白低脂肪食品。除蛋氨酸外,蛋白质中的必需氨基酸含量都高于FAO/WHO模式。泥鳅蛋白的必需氨基酸总含量达到42.52%,高于WHO衡量理想蛋白资源推荐的比值36%。蛋氨酸和半胱氨酸是泥鳅蛋白的第一限制性氨基酸。功效比值PER Ⅰ值为2.9,PERⅡ值为2.9,PERⅢ值为2.3,氨基酸组成平衡性很好。高含量的疏水性氨基酸（47.9%）、芳香族氨基酸（13.3%）以及支链氨基酸（17.7%）是酶法生产ACE抑制肽的优良物质基础。广泛选取植物来源、动物来源及微生物来源的木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、酸性蛋白酶、复合蛋白酶、碱性蛋白酶和胰蛋白酶水解泥鳅蛋白,通过比较9种不同蛋白酶水解产物的半抑制浓度IC50,得到酶解泥鳅蛋白的最适用酶为菠萝蛋白酶。通过单因素和响应面法优化酶解工艺,得到高活性ACE抑制肽的最佳制备工艺：[E]/[S]4.9‰,底物浓度30%,pH6.5,温度54.4℃,酶解时间5.9h。泥鳅蛋白降血压肽的ACE抑制率（Y）对[E]/[S]（A）、温度（B）和酶解时间（C）的二次多项回归方程：Y=82.17+4.81A+5.57B+3.86C-4.1682-3.97AB+4.27AC。在最佳酶解条件下,菠萝蛋白酶水解泥鳅蛋白的酶解产物中疏水性氨基酸、芳香族氨基酸和支链氨基酸的含量显着增加,泥鳅多肽的ACE抑制率为88.9%。论文使用超滤、Sephadex G-15凝胶柱层析、AKTA半制备反相高效液相色谱和分析型反相高效液相色谱等多级分离技术,根据酶解产物中肽的分子量大小及疏水性差异逐级纯化,得到目标肽段的IC50值为18.2士0.9μg/mL,纯化倍数33.7,蛋白回收率5.2%。通过TOF-MS/MS质谱技术鉴定目标肽段的氨基酸序列为Ala-His-Leu-Leu,相对分子质量452.2Da。经肽谱库和文摘检索,该肽段为首次发现的ACE抑制四肽。泥鳅多肽在较宽的pH值（3-9）范围内具有优良的溶解性能,氮溶解指数均在70%以上。溶液pH7.0时,泥鳅多肽具有较好的乳化能力（60.8%）和乳化稳定性（68.6%）。泥鳅蛋白水解后,起泡性及起泡稳定性分别降低15.8%和15.5%；DPPH-清除率和ABTS·+清除率分别提高6.1倍和2.7倍,抗氧化能力显着增强（P<0.05）。温度≤80℃的中性条件下加热2h,泥鳅降血压肽的ACE抑制率没有显着变化（P>0.05）；100℃下加热2h,泥鳅降血压肽的ACE抑制率仍保持80%左右。在酸性至中性范围内,泥鳅降血压肽的ACE抑制活性变化不显着；当pH≥8时,其降压活性与pH值呈现负相关性。与喷雾干燥相比,冷冻干燥后所得产品的颗粒较大、复溶速度较快、降压活力的损失较低。室温下,泥鳅多肽溶液中添加5mmol/L金属离子静置2h,Mg2+对降压活性起到促进作用,Zn2+和Mn2+抑制了多肽的降压活性。泥鳅多肽溶液中添加食品配料,在121℃加热反应20min,结果显示：随着葡萄糖浓度的升高,泥鳅多肽的ACE抑制活性逐渐降低,褐变程度加深；氯化钠在低浓度范围内,对降压活性的影响显着,当浓度≥9%时,其降压活性与氯化钠浓度呈现负相关性。泥鳅降压肤的抑制类型为竞争性抑制,泥鳅多肽与底物竞争性结合ACE的活性结合部位,从而起到抑制ACE活性的作用。在模拟胃肠道消化体系中,胃蛋白酶的消化作用显着提高了产物的降压活性。但是经过胰蛋白酶消化后,泥鳅多肽的ACE抑制活性显着下降（P<0.05）。泥鳅多肽属于底物型ACE抑制肽。以原发性高血压大鼠（SHR）为动物模型,采用尾脉搏法测定大鼠的收缩压,从急性和长期实验评价泥鳅多肽的体内降压效果。急性降压试验中,一次性灌胃14h,收缩压达到最低值,血压降低29mmHg,之后血压出现回升。SHR灌胃泥鳅多肽2个月,大鼠心率无显着变化；SHR大鼠的体重显着低于空白对照组（P<0.05）。在灌胃泥鳅多肽的8周期间,SHR高剂量组0周的平均收缩压为195.0mmHg,4周降到最低点165.1mmHg,随后血压值略有升高,8周高剂量组和低剂量组的SBP值分别降低24.3mmHg和10.5mmHg,均表现出良好的降血压效果。与对照组相比,SHR高剂量组大鼠的腹主动脉体重比显着上升（P<0.05）,心体重比显着下降（P<0.05）,泥鳅多肽起到了一定保护器官的作用。SHR高剂量组大鼠血清中甘油三酯含量显着降低（P<0.05）,钠离子浓度显着降低（P<0.05）。8周后大鼠血清与腹组织中的丙二醛含量显着降低（P<0.05）,泥鳅多肽对SHR大鼠部分器官和血清的脂质过氧化损伤起到缓解和抑制作用。SHR高剂量组大鼠的血清中总游离氨基酸含量高于空白对照组和阳性对照组,其中His、Ala、Glu、Leu、Ile的含量明显增高（P<0.05）。SHR高剂量组大鼠的腹主动脉ACE酶活性显着降低17.6%（P<0.05）,推断泥鳅多肽的作用靶点位于腹主动脉。泥鳅蛋白酶解物中分离到一种高活性的降血压四肽,论文对四肽的定量构效关系进行深入研究。采用z-scales描述符,对92组ACE抑制四肽进行编码,通过Matlab软件偏最小二乘法对多元数据进行回归分析,得到ACE抑制四肽的QSAR模型：y=2.1519+0.0704x1+0.0443x2+0.0166x3+0.0302x4-0.0758x5-0.0084x6-0.031x7+0.1372x8-0.0629x9+0.0256x10+0.0396x11+0.035x12。模型的相关系数R为0.7489,交叉验证相关系数Rcv2为0.5956,预测能力和拟合度较强。泥鳅蛋白源的ACE抑制四肽AHLL对QSAR;模型进行检验,模型的预测结果准确性高。
刘文[9]（2013）在《牡蛎加工下脚料综合利用的关键技术研究》文中研究表明牡蛎是我国着名四大养殖经济贝类之一，牡蛎肉味鲜美，营养丰富，有“海中牛奶”之称。在加工过程中下脚料——牡蛎体液和牡蛎壳，被作为废弃物丢掉，造成资源的浪费。本文对牡蛎体液和牡蛎壳的开发利用进行了研究。首先，对牡蛎体液的营养成分和呈味物质进行了比较研究。结果显示：牡蛎体液富含蛋白质，氨基酸种类齐全，儿童所需的精氨酸和鲜味谷氨酸含量较高。煮牡蛎体液中饱和脂肪酸含量（319.75μg/mL）占脂肪酸总量的45.52%，以棕榈酸最高。不饱和脂肪酸含量（382.61μg/mL）占脂肪酸总量的54.48%，其中DHA和EPA的含量占到总脂肪酸含量的16.48%。呈味核苷酸中5′-CMP含量最高，其次5′-GMP、5′-IMP，未检出5′-AMP、5′-UMP。其次，运用顶空固相微萃取-气质联用法分析了不同温度下牡蛎体液的风味变化，结果显示：醛类和酯类是新鲜牡蛎体液的主要挥发性成分，以清新果香为主，略带奶香；100℃处理之后为呋喃类和酮类，产生浓郁的花果香和强烈的肉香、焦香味，风味更加丰富诱人；150℃处理后以酯类为主，焦香味更加浓郁，夹带水果甜香，风味不够柔和。电子鼻可以灵敏地检测到牡蛎体液风味的变化，具有快速、灵敏等特性，因此在食品气味鉴别领域具有很好的前景。第三，利用Sephadex G75凝胶柱层析、Q Sepharose FF离子交换柱层析和超滤法分离得到一电泳纯组分S2，此组分中含有较高的蛋白质和糖原，并且红外光谱表现出糖类和肽键的特征吸收峰，应为糖蛋白；该蛋白的分子量为21KD，糖肽键为N-糖苷键，肽链以α-螺旋构型存在，热变性温度为113.5℃，并且在209.7℃时有一个较大的能量变化。第四，牡蛎体液酶解物各组分中，相对分子质量在190Da-593Da之间的组分对ACE具有较好的抑制作用，并且得到了具有高ACE抑制活性的组分Ⅲ A，其IC50为231μg/mL。最后，利用廉价易得的牡蛎壳原料经900℃活化2h可制备一种主成分为CaO的高效吸附材料，这种新型吸附材料具有空隙多、比表面积大的优异结构。牡蛎壳主成分由活化前的三方晶系方解石型CaCO3转化为六方晶系CaO，其水化产物羟钙石利于与染料分子发生氢键作用，进一步提高了其吸附性能。该吸附材料对偶氮染料刚果红有较强的吸附效果，脱色率达98.13%±1.39%；对Cu2+的吸附效果也比较理想，脱色率为70.20%±1.33%。结果表明，以活化后的牡蛎壳粉作为吸附剂处理含刚果红的废水是一种有效的方法，达到以废治废的目的，具有良好的社会和经济效益。
张秉怡[10]（2010）在《白眉蝮蛇蛇毒5’-核苷酸酶分离纯化及理化性质研究》文中提出白眉蝮蛇（Agkistrodon blomhoffii Ussurensis）属于蝰蛇科蝮蛇亚科,是我国剧毒蛇类之一,在国内广泛分布河北、甘肃、上海、辽宁、台湾等省市,在国外朝鲜半岛也有分布。白眉蝮蛇毒已作为生产溶血栓药物“蛇毒溶栓酶”的主要原料,但蛇毒中其他活性组分的分离纯化、生物学特性及其经济价值还未得到全面深入研究。5’-核苷酸酶（5’-nucleotidase）是催化核苷酸分子中的磷酸键水解的一种特异性水解磷酸酶。5’-核苷酸酶能特异地水解5’-核苷酸酶和5’-脱氧核苷酸酶连接戊糖的5’-磷酸,生成对应的核苷或脱氧核苷和无机磷酸。5’-核苷酸酶是一种常规分子生物学酶试剂,因其活性的变化与很多疾病密切相关,还可以用作许多疾病的诊断对照试剂,比如：肝胆疾病、冠心病、肺癌、消化道肿瘤、甲亢、骨病、喉癌等。5’-核苷酸酶广泛分布于细菌、植物细胞和蛇毒毒液中。1951年Hepple首次从蛇毒中分离纯化出5’-核苷酸酶。至今为止已发现二十八种蛇毒5’-核苷酸酶,但尚未有白眉蝮蛇蛇毒5’-核苷酸酶相关研究报道。建立白眉蝮蛇毒5’-核苷酸酶的分离纯化方法,并对其理化性质进行研究,将为白眉蝮蛇毒的深入开发、积累5’-核苷酸酶基础数据等方面都具有重要意义。本论文采用离子交换DEAE Sephadex A-25柱层析、凝胶过滤SephadexG-75柱层析,从白眉蝮蛇蛇毒分离纯化得到了一个5’-核苷酸酶。采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis, SDS-PAGE）鉴定了其纯度并计算了其分子量,测定了其比活、最适pH、温度等理化性质,考察了常见金属离子对其活性的影响,还观察了简单糖对其活性的保护作用以及其对ADP诱导的血小板聚集过程的影响。经SDS-PAGE此5’-核苷酸酶分子量为70kDa,用高碘酸硝酸银阿利辛蓝染色法鉴定白眉蝮蛇蛇毒5’-核苷酸酶为糖蛋白。白眉蝮蛇蛇毒5，-核苷酸酶的最适温度为55℃,最适pH为pH 9.0。以AMP为底物测得纯化所得酶蛋白的5，-核苷酸酶活力为562.44U。从目前的实验结果看来,此5’-核苷酸酶对热稳定酶,耐碱性环境。Cu2+、Fe3+浓度范围为（0.05 mmol/L.0.3mmol/L）能抑制白眉蝮蛇蛇毒5’-核苷酸酶活性,Fe3+强烈抑制白眉蝮蛇蛇毒5’-核苷酸酶活性。Mg2+、Ca2+、K+浓度范围为（0.05 mmol/L.0.3mmol/L）均能促进白眉蝮蛇蛇毒5’-核苷酸酶活性,其中Ca2+促进效果更好。低溶度（0.05 mmol/L.0.25mmol/L）β-巯基乙醇对白眉蝮蛇蛇毒5’-核苷酸酶活性有一定促进作用。低浓度（0.05mmol/L.0.25mmol/L）EDTA对白眉蝮蛇蛇毒5’-核苷酸酶活性有促进作用,而0.3 mmol/L EDTA对白眉蝮蛇蛇毒5’-核苷酸酶有明显抑制作用。可能是因为低溶度EDTA能作为金属螯合剂先与抑制白眉蝮蛇蛇毒5’-核苷酸酶的金属离子结合比如Cu2+、Fe3+,随着EDTA溶度增加与促进白眉蝮蛇蛇毒5’-核苷酸酶金属离子结合比如Mg2+、、Ca2+、K+等。导致白眉蝮蛇蛇毒5’-核苷酸酶活性降低。本文还研究了单糖和双糖对酶蛋白的保护作用,实验中采用了葡萄糖、果糖、海藻糖、蔗糖四种。经测定,葡萄糖、果糖、海藻糖对白眉蝮蛇蛇毒5’-核苷酸酶均具有一定的保护作用。糖对白眉蝮蛇蛇毒5’-核苷酸酶保护作用从未有发现,具体机制尚待研究。白眉蝮蛇蛇毒5’-核苷酸酶对血小板聚集有诱导作用,促进ADP诱导的血小板聚集。白眉蝮蛇蛇毒5’-核苷酸酶可以作为血小板聚集的诱导剂。值得注意的是,这一实验现象与目前文献报道其他蛇毒5’-核苷酸酶活性相反。其机制还待进一步深入探讨。
二、浙江蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)毒激肽释放酶Ⅰ酶解产物激肽的鉴定（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、浙江蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)毒激肽释放酶Ⅰ酶解产物激肽的鉴定（论文提纲范文）
（1）江浙蝮蛇蛇毒激肽释放酶在麦胚无细胞蛋白合成系统中的表达和优化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 无细胞蛋白表达系统概述 |
| 1.1.1 大肠杆菌无细胞蛋白表达系统 |
| 1.1.2 兔网织红细胞系统 |
| 1.1.3 麦胚无细胞蛋白合成系统 |
| 1.2 无细胞表达系统研究进展 |
| 1.2.1 利用麦胚无细胞蛋白合成系统合成的蛋白 |
| 1.2.2 麦胚无细胞蛋白合成机制 |
| 1.2.3 无细胞表达系统的优点 |
| 1.2.4 无细胞表达系统中存在的问题 |
| 1.2.5 无细胞蛋白表达系统的应用和发展前景 |
| 1.3 江浙蝮蛇蛇毒激肽释放酶综述 |
| 1.3.1 激肽释放酶作用机制 |
| 1.3.2 激肽释放酶的应用 |
| 1.3.3 蛇毒中的激肽释放酶 |
| 1.4 研究目的及意义 |
| 1.5 研究内容及技术路线 |
| 第二章 江浙蝮蛇蛇毒激肽释放酶表达载体的构建 |
| 2.1 概述 |
| 2.2 材料与试剂 |
| 2.2.1 菌株、质粒、酶及试剂 |
| 2.2.2 常用试剂配制 |
| 2.2.3 主要仪器设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 江浙蝮蛇蛇毒激肽原酶全长基因的 PCR 扩增 |
| 2.3.2 构建克隆质粒 pGEM-T easy/VK |
| 2.3.3 DNA 序列测定与分析 |
| 2.3.4 重组表达质粒 pCS~(2+)/VK 的构建 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 PCR 扩增蛇毒激肽释放酶基因 |
| 2.4.2 全长基因胶回收结果 |
| 2.4.3 重组质粒 pGEM-T easy/VK 的酶切鉴定 |
| 2.4.4 蛇毒激肽释放酶全长基因测序结果分析 |
| 2.4.5 重组表达质粒 pCS~(2+)/VK 的鉴定 |
| 2.4.6 重组表达质粒 pCS~(2+)/VK 测序结果 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 蛇毒激肽释放酶的体外转录和翻译 |
| 3.1 概述 |
| 3.2 材料与试剂 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 常用试剂配制 |
| 3.2.2.1 抽提物缓冲液 |
| 3.2.2.2 体外翻译所需溶液 |
| 3.2.2.3 蛋白质电泳溶液 |
| 3.2.2.4 Western blot 溶液 |
| 3.2.2.5 RNA 电泳检测： |
| 3.3 主要仪器 |
| 3.4 实验方法 |
| 3.4.1 蛇毒激肽释放酶的体外转录 |
| 3.4.2 麦胚抽提物的制备[92] |
| 3.4.3 蛇毒激肽释放酶的体外翻译 |
| 3.4.4 目的蛋白的 SDS-PAGE 电泳检测 |
| 3.4.5 目的蛋白的 Western blot 检测 |
| 3.5 结果与分析 |
| 3.5.1 重组表达质粒 pCS~(2+)/VK 线性化 |
| 3.5.2 蛇毒激肽释放酶的体外转录结果 |
| 3.5.3 蛇毒激肽释放酶的体外翻译结果 |
| 3.6 讨论与小结 |
| 第四章 麦胚无细胞蛋白合成系统的优化 |
| 4.1 概述 |
| 4.2 材料与试剂 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 常用试剂配制 |
| 4.3 主要仪器 |
| 4.4 实验方法 |
| 4.4.1 两种二次能源物质磷酸肌酸和丙酮酸的比较 |
| 4.4.2 磷酸肌酸浓度的优化 |
| 4.4.3 Cu~(2+)浓度优化 |
| 4.4.4 转录翻译偶联系统的构建以及质粒浓度的优化 |
| 4.4.5 转录翻译偶联系统反应温度的优化 |
| 4.5 结果与分析 |
| 4.5.1 二次能源物质磷酸肌酸和丙酮酸对蛋白产率的影响 |
| 4.5.2 二次能源物质磷酸肌酸浓度对蛋白产率的影响 |
| 4.5.3 Cu~(2+)浓度对蛋白产率的影响 |
| 4.5.4 质粒浓度的优化 |
| 4.5.5 反应温度的优化 |
| 4.6 讨论 |
| 第五章 重组蛇毒激肽释放酶的纯化和酶学性质研究 |
| 5.1 概述 |
| 5.2 材料与试剂 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 试剂配制 |
| 5.3 主要仪器 |
| 5.4 试验方法 |
| 5.4.1 重组蛇毒激肽释放酶的分离纯化 |
| 5.4.2 重组蛇毒激肽释放酶酶活测定 |
| 5.4.3 蛋白浓度测定方法 |
| 5.5 结果与分析 |
| 5.5.1 重组蛇毒激肽释放酶分离纯化结果 |
| 5.5.2 重组蛇毒激肽释放酶酶学性质 |
| 5.6 讨论 |
| 第六章 全文总结与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 致谢 |
（3）717解毒合剂治疗蝮蛇咬伤的临床及实验研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 英文缩写词注释表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 717 解毒合剂治疗蝮蛇咬伤的临床研究 |
| 第一节 资料与方法 |
| 1 病例纳入 |
| 2 研究方法 |
| 第二节 结果与分析 |
| 1 一般资料分析 |
| 2 试验结果分析 |
| 第三节 讨论 |
| 1 中医学对蝮蛇咬伤的认识 |
| 2 现代医学对蝮蛇咬伤的认识 |
| 3 717 解毒合剂治疗蝮蛇咬伤的机制探讨 |
| 参考文献 |
| 第二章 实验研究 |
| 第一节 蝮蛇伤大鼠创面组织差异蛋白组学初步研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 实验小结 |
| 第二节 屏障环境下蝮蛇毒对动物致毒作用研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 实验小结 |
| 第三节 717 解毒合剂抗蝮蛇毒作用机制研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 实验小结 |
| 第三章 不足与展望 |
| 1 结论 |
| 2 创新 |
| 3 不足与展望 |
| 附录一:试验相关表格 717解毒合剂治疗蝮蛇咬伤临床试验病例观察表 |
| 附录二:综述 蛇毒的中毒机制与植物药干预研究综述 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
（4）鸡蛋蛋黄蛋白质制备降血压肽的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 简述 |
| 1.1.1 活性肽的概念与分类 |
| 1.1.2 生物活性肽吸收机制的研究 |
| 1.1.3 生物活性肽的作用与功能 |
| 1.1.4 生物活性肽的生产方法 |
| 1.2 高血压的产生及血管紧张素酶在血压调节过程中的控制机制 |
| 1.2.1 高血压的产生及分类 |
| 1.2.2 血管紧张素酶在血压调解过程中的控制机制 |
| 1.3 血管紧张素酶抑制剂的作用 |
| 1.3.1 天然血管紧张素酶抑制剂 |
| 1.3.2 合成血管紧张素酶抑制剂 |
| 1.3.3 降血压肽结构与功能的关系 |
| 1.4 食品降血压肽的研究进展 |
| 1.4.1 国外食品降血压肽研究进展 |
| 1.4.2 国内食品降血压肽研究进展 |
| 1.4.3 食品降血压肽的生产方法 |
| 1.4.4 食品降血压肽的应用前景及展望 |
| 1.5 本课题研究的目的、意义及主要内容 |
| 1.5.1 研究的目的 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 参考文献 |
| 第二章 血管紧张素转化酶抑制剂分析方法的选择 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 血管紧张素转化酶体外活性测定原理 |
| 2.3 实验药品及仪器 |
| 2.3.1 实验药品 |
| 2.3.2 实验仪器 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 Hip和HHL特征波长的确定 |
| 2.4.2 采用HPLC测定ACE抑制肽体外活性的方法 |
| 2.4.3 马尿酸(Hip)的回收率测定 |
| 2.5 实验结果及讨论 |
| 2.5.1 Hip和HHL特征波长 |
| 2.5.2 马尿酸的浓度和峰值的关系 |
| 2.5.3 HPLC测定ACE抑制肽体外活性的方法 |
| 2.5.4 马尿酸的回收率 |
| 2.5.5 Captopril IC_(50)的标定 |
| 2.5.6 Captopril抑制ACE酶的类型 |
| 2.6 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 蛋黄蛋白质的制备与蛋黄降血压肽的酶系筛选 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验药品及仪器 |
| 3.2.1 实验药品 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 原料及产物分析方法 |
| 3.3.2 蛋白质酶解实验及酶系筛选 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 蛋黄蛋白质提取物主要成分分析 |
| 3.4.2 蛋黄蛋白质氨基酸分析 |
| 3.4.3 蛋黄蛋白质分子量的测定 |
| 3.4.4 蛋黄蛋白质的酶法水解物对ACE的体外抑制活性效果 |
| 3.4.5 蛋黄酶解物对ACE保温稳定性分析及酶系筛选 |
| 3.5 本章小节 |
| 参考文献 |
| 第四章 蛋黄降血压肽酶解工艺条件优化及动力学研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料与设备 |
| 4.2.1 主要仪器 |
| 4.2.2 实验原料及药品 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 蛋黄蛋白质的酶法水解 |
| 4.3.2 水解度测定 |
| 4.3.3 酶解产物对ACE体外抑制活性的测定 |
| 4.3.4 蛋黄降血压肽平均肽链长度的计算方法 |
| 4.3.5 蛋黄蛋白质酶解液氮溶解指数的测定 |
| 4.4 酶解动力学研究 |
| 4.5 结果与讨论 |
| 4.5.1 不同时间下水解度(DH)变化及水解度和产物对ACE抑制效果随时间的变化 |
| 4.5.2 肽链长度和ACE抑制效果随水解度的变化 |
| 4.5.3 水解度和氮溶解指数随时间的变化 |
| 4.5.4 加酶量对水解度的影响 |
| 4.5.5 pH对水解度的影响 |
| 4.5.6 温度对水解度的影响 |
| 4.5.7 底物浓度对水解度的影响 |
| 4.6 酶解动力学研究 |
| 4.6.1 酶促动力学方程 |
| 4.6.2 酶促动力学模型的参数的确定 |
| 4.6.3 蛋白酶失活的常数确定 |
| 4.6.4 可控酶解的动力学模型验证 |
| 4.7 本章小节 |
| 参考文献 |
| 第五章 蛋黄降血压肽的分离纯化与结构表征 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验药品和设备 |
| 5.2.1 实验材料和药品 |
| 5.2.2 主要设备 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 蛋黄降血压肽的脱色 |
| 5.3.2 蛋白质浓度的测定方法 |
| 5.3.3 蛋黄降血压肽的超滤 |
| 5.3.4 离子交换纯化蛋黄降血压肽 |
| 5.3.5 Sephadex G-15纯化蛋黄降血压肽 |
| 5.3.6 RP-HPLC纯化蛋黄降血压肽 |
| 5.3.7 高效毛细管电泳鉴定EY-1的纯度 |
| 5.3.8 EY-1的氨基酸分析 |
| 5.3.9 MS测定EY-1的序列 |
| 5.4 结果和讨论 |
| 5.4.1 脱色对蛋黄降血压肽活性的影响 |
| 5.4.2 超滤分离蛋黄降血压肽 |
| 5.4.3 离子交换纯化蛋黄降血压肽 |
| 5.4.4 Sephadex G-15纯化蛋黄降血缸压肽 |
| 5.4.5 RP-HPLC纯化蛋黄降血压肽 |
| 5.4.6 高效毛细管电泳检验EY-1纯度 |
| 5.4.7 EY-1的氨基酸分析 |
| 5.4.8 MS测定EY-1序列 |
| 5.5 本章小节 |
| 参考文献 |
| 第六章 蛋黄降血压肽的功能性质研究 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 实验仪器和设备 |
| 6.2.1 主要仪器 |
| 6.2.2 实验材料和药品 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 蛋黄降血压肽的热稳定性研究 |
| 6.3.2 蛋黄降血压肽的酸稳定性研究 |
| 6.3.3 蛋黄降血压肽的体外消化道实验研究 |
| 6.3.4 蛋黄降皿压肽抗肠胃道酶降解的高效毛细管电泳肽谱图 |
| 6.3.5 蛋黄降血压肽抗氧化活性的研究 |
| 6.4 结果与讨论 |
| 6.4.1 加热时间对蛋黄降血压肽活性的影响 |
| 6.4.2 不同pH对蛋黄降血压肽活性的影响 |
| 6.4.3 蛋黄降血压肽抗肠胃道酶降解及其高效毛细管电泳肽谱图分析 |
| 6.4.4 不同分子量蛋黄水解物抗氧化活性的研究 |
| 6.5 本章小节 |
| 参考文献 |
| 结论与展望 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的文章 |
（5）紫菜降血压肽的酶法制备及降压效果的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 海洋生物活性肽的研究概况 |
| 1.1.1 生物活性肽概述 |
| 1.1.2 海洋生物活性肽的种类及开发前景 |
| 1.2 高血压的产生及降血压肽的功效 |
| 1.2.1 高血压的产生及血管紧张素转换酶在血压调节中的作用机制 |
| 1.2.2 降血压肽的作用机制 |
| 1.2.3 降血压肽的结构与功能的关系 |
| 1.3 降压肽的研究现状 |
| 1.3.1 国内外降血压肽的研究进展 |
| 1.3.2 降血压肽降压活性检测方法的研究 |
| 1.3.3 降血压肽的分离纯化提取 |
| 1.4 本课题的研究内容和意义 |
| 第二章 海藻主要成分分析及降血压肽原料的筛选 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 实验方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 海藻基本成分分析 |
| 2.2.2 坛紫菜部分氨基酸含量 |
| 2.2.3 坛紫菜蛋白质氨基酸营养评价 |
| 2.3 小结 |
| 第三章 ACE 的提取与活性测定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 标准曲线的绘制 |
| 3.2.2 ACE 酶活力的确定 |
| 3.2.3 ACE 的验证实验 |
| 3.2.4 自制ACE 与商品ACE 对比 |
| 3.2.5 自制ACE 的保藏期实验 |
| 3.3 小结 |
| 第四章 紫菜降血压肽的酶解工艺优化 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 实验仪器 |
| 4.1.4 实验方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 标准曲线的绘制 |
| 4.2.2 不同蛋白酶酶解坛紫菜的工艺条件研究 |
| 4.2.3 不同蛋白酶酶解产物对ACE 活性的抑制效果 |
| 4.2.4 AS.1398 中性蛋白酶水解工艺参数的优化 |
| 4.3 小结 |
| 第五章 紫菜降血压肽的分离纯化 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验试剂 |
| 5.1.2 实验仪器 |
| 5.1.3 实验方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 紫菜降血压肽超滤分离的组分活性检测 |
| 5.2.2 紫菜降血压肽的凝胶层析分离及活性检测 |
| 5.2.3 紫菜降血压肽的RP-HPLC 分离纯化及活性检测 |
| 5.2.4 MS 测定分子量 |
| 5.3 小结 |
| 第六章 紫菜降血压肽的动物实验研究 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 实验动物 |
| 6.1.2 实验仪器 |
| 6.1.3 实验方法 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 紫菜降血压肽的毒性分析 |
| 6.2.2 紫菜降血压肽一次性给药对大鼠血压的影响 |
| 6.2.3 紫菜降血压肽长期服用对大鼠血压的影响 |
| 6.2.4 长期服用紫菜降血压肽对SHR 和WKY 大鼠体重的影响 |
| 6.3 小结 |
| 第七章 结论与展望 |
| 7.1 海藻化学成分的分析 |
| 7.2 ACE 的提取 |
| 7.3 紫菜降血压肽的酶解制备 |
| 7.4 紫菜降血压肽的分离纯化 |
| 7.5 紫菜降血压肽体内降压效果的研究 |
| 7.6 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 研究生阶段发表的论文情况 |
（6）江浙蝮蛇毒镇痛C4组分提取纯化及其对内阿片肽调控机理研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 冰茶栓靶基因及靶药物的筛选研究 |
| 一、 冰茶栓差异表达基因的筛选研究 |
| (一) 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| (二) 结果 |
| 1 冰茶栓治疗后戒断症状评分 |
| 2 总RNA抽提及纯化结果 |
| 3 基因芯片的扫描结果 |
| 4 差异表达基因筛选结果 |
| 5 空白组猴与海洛因依赖猴戒断时基因表达差异 |
| 6 冰茶栓治疗后与海洛因依赖猴戒断时基因表达差异 |
| (三) 分析与讨论 |
| 1 冰茶栓对海洛因依赖猴的治疗作用 |
| 2 受体与相关基因芯片的作用 |
| 3 内源性阿片肽与吗啡依赖内在基因差异 |
| 4 冰茶栓治疗对基因表达的影响 |
| 二、 均匀设计对靶药物的确定 |
| (一) 实验材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 方法 |
| (二) 结果 |
| 1 不同组方的镇痛时效关系 |
| 2 配方优化 |
| (三) 分析与讨论 |
| 三、 小结 |
| 四、 参考文献 |
| 第二部分 江浙蝮蛇毒组分的分离纯化和镇痛C4组分的筛选及其理化性质研究 |
| 一、 江浙蝮蛇毒的分离纯化 |
| (一) 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 方法 |
| (二) 结果 |
| 1 不同分离介质分离效果比较 |
| 2 江浙蝮蛇毒主峰纯化条件筛选 |
| (三) 分析与讨论 |
| 1 江浙蝮蛇毒组分复杂性与可分离性 |
| 2 分离参数的优化及相对性 |
| 二、 C4组分的筛选及理化性质研究 |
| (一) 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| (二) 结果 |
| 1 江浙蝮蛇毒各组分的镇痛效果 |
| 2 镇痛组分的理化性质 |
| 3 镇痛组分的耐受性和依赖性 |
| (三) 分析与讨论 |
| 1 镇痛组分的确定 |
| 2 C4组分与磷脂酶的性质比较 |
| 三、 小结 |
| 四、 参考文献 |
| 第三部分 江浙蝮蛇毒镇痛C4组分的中枢作用研究 |
| 一、 材料和方法 |
| (一) 材料 |
| 1 动物 |
| 2 江浙蝮蛇毒C4组分 |
| 3 药品 |
| 4 仪器 |
| (二) 方法 |
| 1 阿托品实验 |
| 2 利血平实验 |
| 3 纳络酮实验 |
| 4 侧脑室给药实验 |
| 5 脊髓化鼠模型 |
| 6 大鼠足跖定压刺激法 |
| 7 不同脑区药物作用实验 |
| 二、 结果 |
| (一) 阿托品对C4组分镇痛效果的影响 |
| (二) 利血平对C4组分镇痛效果的影响 |
| (三) 纳络酮对C4组分镇痛效果的影响 |
| (四) 侧脑室给药C4组分的镇痛效果 |
| (五) 大鼠脊髓化鼠实验结果 |
| (六) 大鼠足跖定压刺激法实验结果 |
| (七) 不同脑区内源性阿片肽的分布 |
| 三、 分析与讨论 |
| (一) C4组分与药物相互作用对神经递质的影响 |
| (二) 江浙蝮蛇毒C4组分的中枢作用 |
| (三) 江浙蝮蛇毒C4组分的中枢作用部位 |
| 四、 小结 |
| 五、 参考文献 |
| 第四部分 应用微透析技术探索江浙蝮蛇毒镇痛C4组分对中枢内阿片肽的调控机理 |
| 一、 材料与方法 |
| (一) 材料 |
| 1 动物造模所需材料 |
| 2 血液采集所需材料 |
| 3 微透析实验所需材料 |
| 4 测定所需材料 |
| (二) 方法 |
| 1 动物造模 |
| 2 分组 |
| 3 麻醉 |
| 4 探针定位 |
| 5 透析液收集 |
| 6 给药方法 |
| 7 取血 |
| 8 测定 |
| 二、 结果 |
| (一) 吗啡造模大鼠体重变化 |
| (二) 透析膜回收率 |
| (三) 吗啡依赖大鼠脑组织间液神经肽的改变 |
| (四) 江浙蝮蛇毒C4组分对组织间液神经肽的影响 |
| (五) 单次给药与多次给药的比较 |
| (六) 脑透析液在不同时间神经肽的动态变化 |
| (七) 血浆放免测定的标准曲线 |
| (八) 血液中内阿片肽的含量变化 |
| 三、 分析与讨论 |
| (一) 吗啡依赖对内阿片肽的影响 |
| (二) 江浙蝮蛇毒C4组分对内阿片肽的作用 |
| (三) 江浙蝮蛇毒C4组分对外周血的内阿片肽的作用 |
| 四、 小结 |
| 五、 参考文献 |
| 全文讨论 |
| (一) 论证了中医药理论对阿片成瘾认识的科学性 |
| (二) 江浙蝮蛇毒中靶成分的确定 |
| (三) C4组分主要通过对脑啡肽调控发挥镇痛作用 |
| 全文小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 致谢 |
| 论着 |
| 附: |
| 文献综述(一) |
| 文献综述(二) |
（7）中介蝮（Gloydius intermedius）蛇毒一种丝氨酸蛋白酶的分离及生物学活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 蛇毒概述 |
| 1.2 蛇毒丝氨酸蛋白酶概述 |
| 1.2.1 类凝血酶 |
| 1.2.2 纤溶酶 |
| 1.2.3 纤溶酶原激活剂 |
| 1.2.4 蛋白C激活剂 |
| 1.2.5 凝血因子V激活剂 |
| 1.2.6 血小板聚集激活剂 |
| 1.2.7 凝血因子X激活剂 |
| 1.3 蛇毒SVSPs的结构与功能 |
| 1.3.1 SVSPs的结构特性 |
| 1.3.2 SVSPs的功能特性 |
| 1.3.3 SVSPs的结构与功能的关系 |
| 1.3.4 分子进化和种系发生 |
| 1.4 蛋白质的分离纯化 |
| 1.4.1 凝胶过滤层析 |
| 1.4.2 离子交换层析 |
| 1.4.3 亲和层析 |
| 1.4.4 高效液相色谱 |
| 1.5 蛇毒SVSPs的分离纯化进展 |
| 1.6 本文工作 |
| 第2章 中介蝮蛇毒丝氨酸蛋白酶的分离纯化 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 蛇毒 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 缓冲液 |
| 2.2 分离过程 |
| 2.2.1 凝胶过滤层析 |
| 2.2.2 丝氨酸蛋白酶的活性跟踪 |
| 2.2.3 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) |
| 2.2.4 阴离子交换层析 |
| 2.2.5 阳离子交换层析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 粗毒溶液浓度测定 |
| 2.3.2 凝胶过滤层析 |
| 2.3.3 HiTrap DEAE FF阴离子交换层析 |
| 2.3.4 HiTrap CM阳离子交换层析 |
| 第3章 中介蝮蛇毒丝氨酸蛋白酶生物学活性鉴定 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 仪器 |
| 3.2.2 实验试剂 |
| 3.2.3 实验动物 |
| 3.2.4 Peak2-3-1的纯度测定 |
| 3.2.5 Peak2-3-1的质谱鉴定 |
| 3.2.6 Peak2-3-1酶活力的测定 |
| 3.2.7 抑制剂对BApNA水解活性的影响 |
| 3.2.8 Fg溶解活性的测定 |
| 3.2.9 类凝皿酶活性测定 |
| 3.2.10 纤溶活性测定 |
| 3.2.11 出血活性测定 |
| 3.2.12 小鼠尾巴的流血时间的测定 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 Peak2-3-1的纯度测定 |
| 3.3.2 质谱分析 |
| 3.3.3 Peak2-3-1酶活力的测定 |
| 3.3.4 特异性抑制剂的抑制作用 |
| 3.3.5 Fg水解活性的测定 |
| 3.3.6 类凝血酶活性测定 |
| 3.3.7 纤溶活性测定 |
| 3.3.8 出血活性测定 |
| 3.3.9 小鼠尾巴的流血时间的测定 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 分离纯化 |
| 4.2 活性检测 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间研究成果 |
（8）泥鳅蛋白源ACE抑制肽的酶法制备及其降压活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语 |
| 第一章 绪论 |
| 1 泥鳅概况 |
| 1.1 泥鳅形态 |
| 1.2 泥鳅的分布及生活习性 |
| 1.3 泥鳅的营养及药用价值 |
| 1.4 泥鳅的生物活性分子及研究现状 |
| 2 血管紧张素转换酶与血管紧张素转化酶抑制剂 |
| 2.1 高血压及血管紧张素转换酶 |
| 2.2 血管紧张素转化酶抑制剂及其作用机制 |
| 3 血管紧张素转化酶抑制肽 |
| 3.1 生物活性肽 |
| 3.2 血管紧张素转化酶抑制肽的分类 |
| 3.3 食源性ACE抑制肽 |
| 4 制备ACE抑制肽的方法 |
| 4.1 血管紧张素转化酶抑制肽的酶法生产 |
| 4.2 管紧张素转化酶抑制肽的分离与纯化 |
| 5 血管紧张素转化酶抑制肽的测定与评价 |
| 5.1 体外检测 |
| 5.2 动物实验 |
| 5.3 降血压肽的结构鉴定 |
| 5.4 ACE抑制肽的构效关系研究 |
| 5.5 食源性ACE抑制肽的应用及前景 |
| 6 本课题研究的意义和主要内容 |
| 6.1 立题背景和意义 |
| 6.2 主要研究内容 |
| 参考文献 |
| 第二章 泥鳅蛋白的营养评价及蛋白酶的筛选 |
| 1 前言 |
| 2 材料与仪器 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 主要仪器 |
| 3 试验方法 |
| 3.1 泥鳅前处理 |
| 3.2 常规理化指标测定方法 |
| 3.3 氨基酸组成分析 |
| 3.4 泥鳅蛋白的营养价值评价 |
| 3.5 酶活力测定 |
| 3.6 酶解工艺流程 |
| 3.7 酶解条件 |
| 3.8 ACE抑制活性测定 |
| 3.9 半抑制浓度的测定 |
| 3.10 数据统计方法 |
| 4 结果与讨论 |
| 4.1 泥鳅的基本成分测定 |
| 4.2 泥鳅蛋白的氨基酸组成 |
| 4.3 泥鳅蛋白的营养价值评价 |
| 4.4 酶种类的选择 |
| 5 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 泥鳅蛋白酶解工艺条件的优化 |
| 1 前言 |
| 2 材料与仪器 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 主要仪器 |
| 3 试验方法 |
| 3.1 泥鳅前处理 |
| 3.2 酶解工艺流程 |
| 3.3 泥鳅蛋白酶解工艺条件 |
| 3.4 ACE抑制活性测定方法 |
| 3.5 半抑制浓度的测定 |
| 3.6 水解度的测定方法 |
| 3.7 氨基氮的测定 |
| 3.8 水解产物氨基酸组成测定 |
| 3.9 数据统计方法 |
| 4 结果与讨论 |
| 4.1 水解泥鳅蛋白工艺条件的优化 |
| 4.2 响应面法优化泥鳅蛋白酶解工艺条件 |
| 4.3 最佳酶解工艺下泥鳅酶解物的氨基酸组成 |
| 5 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 泥鳅蛋白降压肽的分离纯化及结构鉴定 |
| 1 前言 |
| 2 材料与仪器 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 主要仪器 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 泥鳅前处理 |
| 3.2 泥鳅酶解工艺 |
| 3.3 超滤 |
| 3.4 凝胶过滤色谱纯化泥鳅降压肽 |
| 3.5 反相高效液相色谱 |
| 3.6 肽的氨基酸组成分析 |
| 3.7 质谱测定肽的一级结构 |
| 3.8 ACE抑制活性测定方法 |
| 3.9 半抑制浓度的测定 |
| 3.10 蛋白质含量的测定 |
| 3.11 膜通量的测定 |
| 3.12 泥鳅多肽的ACE抑制类型 |
| 3.13 数据统计方法 |
| 4 结果与讨论 |
| 4.1 LPH中ACE抑制肽的分离纯化工艺 |
| 4.2 超滤法分离纯化泥鳅降压肽 |
| 4.3 凝胶过滤色谱纯化泥鳅降压肽 |
| 4.4 反相高效液相色谱 |
| 4.5 泥鳅降压肽的分离纯化步骤及结果 |
| 4.6 质谱法确定ACE抑制肽的一级结构 |
| 4.7 泥鳅降血压肽ACE抑制动力学研究 |
| 5 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 泥鳅ACE抑制肽的理化性质 |
| 1 前言 |
| 2 材料与仪器 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 主要仪器 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 泥鳅多肽的制备 |
| 3.2 溶解性的测定 |
| 3.3 泥鳅多肽乳化性 |
| 3.4 泥鳅多肽泡沫性质 |
| 3.5 泥鳅多肽的抗氧化性质 |
| 3.6 体外各因素对泥鳅多肽ACE抑制活性的影响 |
| 3.7 ACE抑制活性测定方法 |
| 3.8 泥鳅多肽ACE抑制活性保持率的计算 |
| 3.9 数据统计方法 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 泥鳅多肽的溶解性 |
| 4.2 泥鳅多肽的乳化特性 |
| 4.3 泥鳅多肽的起泡性 |
| 4.4 泥鳅多肽的抗氧化能力 |
| 4.5 体外各因素对泥鳅多肽ACE抑制活性的影响 |
| 5 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第六章 泥鳅ACE抑制肽降血压功能研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与仪器 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 主要仪器 |
| 3 试验方法 |
| 3.1 泥鳅降压肽制备 |
| 3.2 SHR大鼠的预处理 |
| 3.3 大鼠血压的测量方法 |
| 3.4 泥鳅蛋白降血压肽对SHR大鼠血压的影响 |
| 3.5 血清各项生化指标的测定 |
| 3.6 血清中游离氨基酸的测定 |
| 3.7 清及组织丙二醛的测定 |
| 3.8 组织蛋白质含量的测定 |
| 3.9 血清及组织ACE酶活力测定 |
| 3.10 数据统计方法 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 泥鳅蛋白ACE抑制肽对SHR大鼠血压的急性降压实验 |
| 4.2 长期灌胃泥鳅蛋白ACE抑制肽对实验大鼠的影响 |
| 4.3 长期灌胃泥鳅蛋白ACE抑制肽对大鼠组织器官的影响 |
| 4.4 长期灌胃泥鳅蛋白ACE抑制肽对大鼠部分血生化指标影响 |
| 4.5 长期灌胃泥鳅蛋白ACE抑制肽对血清及组织中过氧化脂质影响 |
| 4.6 长期灌胃泥鳅蛋白ACE抑制肽对组织、血清ACE酶活的影响 |
| 4.7 长期灌胃泥鳅蛋白ACE抑制肽对血清游离氨基酸的影响 |
| 5 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第七章 血管紧张素转化酶抑制四肽的定量构效关系 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 样本的收集 |
| 2.2 模型的构建方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 样本的数据整理 |
| 3.2 模型的构建 |
| 3.3 QSAR模型的回归图 |
| 3.4 QSAR模型变量投影重要性指示图 |
| 3.5 QSAR模型的检验 |
| 4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 结论与展望 |
| 1 全文结论 |
| 2 展望 |
| 论文创新点 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
（9）牡蛎加工下脚料综合利用的关键技术研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 绪论 |
| 1 牡蛎 |
| 1.1 简介 |
| 1.2 食用价值与药用价值 |
| 1.3 牡蛎壳的研究现状 |
| 1.4 生物活性研究现状 |
| 2 风味的研究 |
| 2.1 水产品的风味 |
| 2.2 风味研究的方法 |
| 2.3 滋味的研究 |
| 3 生物活性肽的研究 |
| 3.1 概述 |
| 3.2 生物活性肽功能 |
| 4 血管紧张素转换酶（ACE）抑制肽的研究 |
| 4.1 ACE 概述 |
| 4.2 ACE 与高血压 |
| 4.3 ACE 抑制肽作用机制 |
| 4.4 食源性 ACE 抑制肽及构效关系 |
| 4.5 ACE 抑制肽制备工艺研究进展 |
| 4.6 ACE 抑制肽抑制活性的评价 |
| 4.7 ACE 抑制肽的分离纯化 |
| 5 立题背景及主要研究内容 |
| 5.1 立题背景 |
| 5.2 主要研究内容 |
| 第二章 牡蛎体液营养成分及呈味物质的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 基本营养成分 |
| 2.2 脂肪酸组成 |
| 2.3 呈味核苷酸组成 |
| 2.4 牡蛎体液挥发性风味成分 |
| 3 讨论 |
| 3.1 营养成分及其呈味作用 |
| 3.2 加工温度对牡蛎体液挥发性风味的影响 |
| 3.3 牡蛎体液和牡蛎肉挥发性成分比较 |
| 4 本章小结 |
| 第三章 牡蛎体液糖蛋白的分离纯化及其理化性质研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 糖蛋白的分离纯化 |
| 2.2 理化特性 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第四章 ACE 抑制肽地分离纯化及分子量测定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 马尿酸标准曲线 |
| 2.2 ACE 抑制肽的分离纯化及活性测定 |
| 2.3 ACE 抑制肽的分子量分布 |
| 2.4 高活性 ACE 抑制肽的纯化 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第五章 牡蛎壳中钙的改性及吸附特性的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 钙含量 |
| 2.2 热重分析 |
| 2.3 扫描电镜（SEM）分析 |
| 2.4 X 射线衍射（XRD）分析 |
| 2.5 红外光谱分析 |
| 2.6 比表面积 |
| 2.7 吸附特性 |
| 3 讨论 |
| 3.1 微观结构的改变 |
| 3.2 成分的改变 |
| 3.3 吸附特性的改变 |
| 4 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 1 结论 |
| 2 展望 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 在学研究成果 |
| 致谢 |
（10）白眉蝮蛇蛇毒5’-核苷酸酶分离纯化及理化性质研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 蛇的简介 |
| 1.1.1 蛇的分类 |
| 1.1.2 区别有毒和无毒蛇 |
| 1.1.3 蛇伤诊断与急救 |
| 1.1.4 蛇的用途 |
| 1.2 蛇毒 |
| 1.2.1 蛇毒蛋白 |
| 1.2.2 蛇毒的采集与加工 |
| 1.2.3 蛇毒蛋白在我国药学方面的应用 |
| 1.3 白眉蝮蛇 |
| 1.3.1 白眉蝮蛇简介 |
| 1.3.2 白眉蝮蛇蛇毒蛋白理化性质 |
| 1.3.3 白眉蝮蛇蛇毒酶的应用 |
| 1.4 5 ’-核苷酸酶 |
| 1.4.1 5 ’-核苷酸酶简介 |
| 1.4.2 蛇毒5’-核苷酸酶的理化性质 |
| 1.4.3 5 ’-核苷酸酶在医药的应用 |
| 第二章 引言 |
| 2.1 5 ’-核苷酸酶研究的目的和意义 |
| 2.2 研究的主要内容 |
| 2.2.1 5 ’-核苷酸酶的分离纯化 |
| 2.2.2 5 ’-核苷酸酶理化性质研究 |
| 2.2.3 糖对酶的保护 |
| 2.2.4 5’-核苷酸酶抑制血小板聚集机制的研究 |
| 2.3 本研究的技术路线 |
| 第三章 白眉蝮蛇蛇毒5’-核苷酸酶分离纯化 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与仪器 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 主要仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 粗毒的处理 |
| 3.3.2 DEAE-Sephadex A-25离子交换色谱分离 |
| 3.3.3 Sephadex G-75分子筛色谱分离 |
| 3.3.4 5 ’-核苷酸酶活测定 |
| 3.3.5 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 3.4 实验结果与讨论 |
| 3.4.1 白眉蝮蛇5’-核苷酸酶活性方法可行性测定 |
| 3.4.2 DEAE-Sephadex A-25离子交换色谱分离 |
| 3.4.3 SDS-PAGE测A-25 5’-核苷酸酶 |
| 3.4.4 Sephadex G-75分子筛色谱分离 |
| 3.4.5 SDS-PAGE测G-75 5’-核苷酸酶 |
| 3.4.6 5 ’-核苷酸酶纯度鉴定 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 白眉蝮蛇蛇毒5’-核苷酸酶理化性质 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与仪器 |
| 4.2.1 材料 |
| 4.2.2 十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)试剂 |
| 4.2.3 其他试剂 |
| 4.2.4 主要仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 白眉蝮蛇蛇毒5’-核苷酸酶分子量的确定 |
| 4.3.2 糖蛋白的鉴定 |
| 4.3.3 温度对酶活的影响 |
| 4.3.4 pH对酶活的影响 |
| 4.3.5 金属离子对酶活的影响 |
| 4.3.6 抑制剂对酶活的影响 |
| 4.4 实验结果与讨论 |
| 4.4.1 白眉蝮蛇蛇毒5’-核苷酸酶分子量 |
| 4.4.2 白眉蝮蛇蛇毒5’-核苷酸酶糖蛋白鉴定 |
| 4.4.3 温度对酶活性的影响 |
| 4.4.4 pH对酶活的影响 |
| 4.4.5 常见金属离子对酶活的影响 |
| 4.4.6 抑制剂对酶活的影响 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 糖对白眉蝮蛇蛇毒5’-核苷酸酶的保护作用 |
| 5.1 前言 |
| 5.1.1 果糖的生物功能 |
| 5.1.2 葡聚糖的生物功能 |
| 5.1.3 壳寡糖的生物功能 |
| 5.1.4 海藻糖的生物功能 |
| 5.1.5 其他多糖的生物功能 |
| 5.2 材料与仪器 |
| 5.2.1 材料 |
| 5.2.2 主要仪器 |
| 5.2.3 糖溶液配置 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.4 实验结果与讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 白眉蝮蛇蛇毒5’-核苷酸酶对血小板聚集的影响 |
| 6.1 前言 |
| 6.1.1 血小板聚集 |
| 6.1.2 蛇毒对血小板聚集与聚集抑制活性 |
| 6.2 材料与仪器 |
| 6.2.1 材料 |
| 6.2.2 主要仪器 |
| 6.2.3 所需试剂 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 血小板样品制备 |
| 6.3.2 酶对血小板聚集活性检测 |
| 6.3.3 不同剂量的酶对血小板聚集活性促进率检测 |
| 6.4 实验结果与讨论 |
| 6.5 本章小结 |
| 总结与讨论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A 在读期间发布的论文 |
四、浙江蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)毒激肽释放酶Ⅰ酶解产物激肽的鉴定（论文参考文献）
- [1]江浙蝮蛇蛇毒激肽释放酶在麦胚无细胞蛋白合成系统中的表达和优化[D]. 王云鹏. 天津大学, 2012(05)
- [2]浙江蝮蛇（Agkistrodon halys Pallas）毒激肽释放酶Ⅰ酶解产物激肽的鉴定[J]. 王心民,戚正武. 动物学研究, 1983(04)
- [3]717解毒合剂治疗蝮蛇咬伤的临床及实验研究[D]. 陈俊. 江西中医药大学, 2021(01)
- [4]鸡蛋蛋黄蛋白质制备降血压肽的研究[D]. 廖丹葵. 广西大学, 2006(05)
- [5]紫菜降血压肽的酶法制备及降压效果的研究[D]. 王茵. 福建农林大学, 2009(12)
- [6]江浙蝮蛇毒镇痛C4组分提取纯化及其对内阿片肽调控机理研究[D]. 叶勇. 浙江中医学院, 2003(03)
- [7]中介蝮（Gloydius intermedius）蛇毒一种丝氨酸蛋白酶的分离及生物学活性研究[D]. 裴剑竹. 陕西师范大学, 2012(03)
- [8]泥鳅蛋白源ACE抑制肽的酶法制备及其降压活性研究[D]. 李莹. 南京农业大学, 2012(12)
- [9]牡蛎加工下脚料综合利用的关键技术研究[D]. 刘文. 宁波大学, 2013(08)
- [10]白眉蝮蛇蛇毒5’-核苷酸酶分离纯化及理化性质研究[D]. 张秉怡. 昆明理工大学, 2010(03)