一、Namalwa细胞干扰素制备系统的改进研究(论文文献综述)
郭葆玉,杜平[1](1983)在《Namalwa细胞干扰素制备系统的改进研究》文中研究指明本研究主要目的,旨在建立高产、低成本的Namalwa细胞干扰素制备系统。结果表明:用廉价易得的猪血清(10%)可代替传统的增殖培基中的小牛或胎生血清;用本室配制的Eagle营养培基可代替进口RPMI1640培基作为细胞增殖培基;用无血清的Eag]e培基和0.5%乳蛋白水解物(LH)培液可代替RPMI1640培基作为IFN诱导培基;此外,还就各种诱生剂的诱导性能及诱牛IFN的各种最适条件进行了比较研究。
郭葆玉,杜平[2](1982)在《Namalwa细胞干扰素制备系统的改进研究》文中认为本研究主要目的。旨在建立高产、低成本的Namalwa细胞干扰素制备系统。结果表明:用廉价易得的猪血清(10%)可代替传统的增殖培基中的小牛或胎牛血清;用本室配制的Eagle营养培基可代替进口RPMI1640培基作为细胞增殖培基,用无血清的Eagle培基和0.5%乳蛋白水解物(LH)培液可代替RPMI1640培基作为IFN诱导培基;此外,还就各种诱生剂的诱导性能及诱生IFN的各种最适条件进行了比较研究。
戚中田,杜平[3](1983)在《临床级Namalwa细胞干扰素纯化方法的比较研究》文中研究表明 盐析配合有机溶剂溶解是初步纯化Namalwa细胞干扰素(Namalwa-IFN)的首选方法,它既可浓缩粗制Namalwa-IFN,为更进一步纯化提供方便;又能达到一定的纯度,供临床应用。盐析沉淀Namalwa-IFN可用硫氰酸钾(KCNS)、硫酸铵(AS)和三氯醋酸(TCA);溶解IFN盐析沉淀物可用冰镇酒精。为了筛选较好的初提方
杜平,杨嗣坤,杨蓉芬,杨文国,吴清璇[4](1980)在《人白细胞干扰素制备系统的改进》文中研究说明 采用“国际标准化系统”制备人白细胞干扰素,要用人的新鲜静脉血(或血库贮存的血),并需从中提取出生长活性良好的白细胞,供作诱生干扰素。这样不仅来源困难,价格昂贵,且操作手续较繁,易影响干扰素的产量。为了克服这些缺点,我们采用中国医学科学院
叶华[5](2019)在《脂多糖广谱型核酸适配体的定向筛选、序列优化及分析应用》文中提出脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)是革兰氏阴性细菌细胞膜的固有组成成分,是对宿主具有一定生物毒性的非分泌性物质,所以又称内毒素(Endotoxin)。当细菌裂解或死亡,脂多糖便释放出来,若进入血液则能引起机体发热,产生一系列的炎症反应,是败血性休克、多器官功能障碍综合症等疾病发生的主要致病因子。脂多糖污染不可避免,常见于食品及饮用水、药品及医疗产品中,对人体健康产生巨大的威胁和危害。因此,筛选特异性的脂多糖识别分子和拮抗物质一直是人们关注的重点和研究热点。核酸适配体(Aptamer)因具有亲和力高、特异性强、易于修饰、体外合成方便、不需要动物实验等特点已成为近年来生物识别分子领域的研究热点,在安全检测、疾病治疗、生物分析等方面得到了广泛的应用。本研究采用Capture-SELEX技术并加以改进,以鼠伤寒沙门氏菌脂多糖为靶标筛选获得了一条广谱型脂多糖核酸适配体,然后对其序列结构进行剪裁优化,同时结合荧光偏振、圆二色谱、等温滴定微量热以及分子模拟等技术探讨了序列结构功能,分析了核酸适配体与脂多糖的结合机制,建立了快速、均相的检测方法并进行了细胞抗炎性能试验,为今后脂多糖的快速检测及拮抗分子的开发奠定了良好的基础。具体研究内容如下:首先,基于Capture-SELEX技术建立定向策略筛选获得了广谱型脂多糖核酸适配体。根据碱基互补配对原则设计了一条互补序列作为桥接序列,将ssDNA筛选文库固定在合成的磁性纳米颗粒上,然后将筛选靶标鼠伤寒沙门氏菌脂多糖与其孵育,这样有亲和力、特异性的ssDNA从磁珠上解离下来与靶标形成游离复合物,通过磁分离获得PCR模板进行扩增、酶切制备单链后进行下一轮循环,经过前6轮的正筛、反筛富集后,引入鼠伤寒沙门氏菌等活菌作为定向筛选物质,再经过9轮的正筛、反筛和定向筛交替筛选后,进行克隆测序以及亲和力、特异性试验,最终获得了一条能识别四种细菌来源脂多糖的广谱型核酸适配体EA7,其Kd值为102±17 nM。其次,为进一步验证EA7分子的识别性能,构建了Structure-switching型核酸适配体生物传感器,实现了脂多糖的均相检测。在5’端标记FAM荧光基团的EA7序列的上游设计了一条3’端带有DABCYL猝灭基团标记的短互补序列qCS,在没有靶标脂多糖存在的情况下,核酸适配体与qCS结合,使得FAM与DABCYL相互靠近发生荧光共振能量转移,荧光被猝灭;当靶标出现后,由于特异性亲和力作用,脂多糖取代qCS与EA7结合,而使EA7结构发生转变,从而互补链qCS从EA7上解离下来,FAM与DABCYL相互远离,荧光恢复,根据荧光变化可实现LPS的均相检测。在最优条件下,对鼠伤寒沙门氏菌脂多糖、肠炎沙门氏菌脂多糖、铜绿假单胞菌脂多糖和大肠杆菌脂多糖线性范围分别为:5-250 ng/mL、0.025-10?g/mL、0.05-5?g/mL、0.1-10?g/mL,最低检测限分别为3.0 ng/mL、21.30 ng/mL、47.70 ng/mL、99.31 ng/mL,饮用水加标回收率在95.1%-105.1%之间。该方法操作简便、无需分离、灵敏可靠。第三,对脂多糖广谱型核酸适配体EA7(为便于编号,重新命名为LA80)序列结构及功能进行了剪裁优化和分析。根据核酸适配体的一级序列和二级序列结构对全长核酸适配体LA80采用两种剪裁优化策略,共获得7条剪裁序列,然后构建了荧光偏振竞争法对其进行特异性分析以及利用ITC法进行亲和性分析,最终通过优化去除了部分多余的序列,确定长27 bp的核酸适配体LA27为最佳优化核酸适配体,它不仅保留了对鼠伤寒沙门氏菌脂多糖、铜绿假单胞菌脂多糖和大肠杆菌脂多糖等3种脂多糖的结合能力,其亲和力还提高了约1倍,解离常数Kd=46.2±9.5 nM。通过分析,我们认为LA27上5’端的CC和3’端CGA形成的开环状部分可能是脂多糖结合的支撑区,而其余碱基组成的茎环结构则可能是与脂多糖发生作用的主要结合区。圆二色谱CD结果进一步表明LA27可能以嵌入的方式与脂多糖结合。第四,建立了基于氧化石墨烯(GO)增强荧光偏振信号的分析方法快速检测脂多糖,以对LA27在分析检测方面的性能进一步进行分析。利用水浴超声法制备获得的氧化石墨烯纳米片吸附核酸适配体分子探针,形成GO/aptamer复合物,荧光偏振信号迅速增强,加入脂多糖后,分子探针从GO上解离下来与其结合形成LPS/aptamer复合物,荧光偏振信号降低,从而实现了脂多糖的快速、均相检测。结果表明,在最优条件下,LA27对鼠伤寒沙门氏菌脂多糖、铜绿假单胞菌脂多糖和大肠杆菌脂多糖的检测限分别为38.7 ng/mL、88.7 ng/mL、154 ng/mL,比LA80作为分子探针的检测限分别提高了4.8、29和18倍;动力学试验结果表明该方法检测快速,可在30 min内完成检测。氯化钠注射液样品加标回收率在92%-112.5%之间。以上结果表明剪裁优化后的LA27由于序列更短、亲和力更好,使其检测效果更佳。第五,分析探讨了核酸适配体LA27的抗炎性能及其与LPS的结合位点和作用模式。以四种脂多糖分别诱导HepG2细胞使其产生炎症因子,利用ELISA法检测了空白组、LPS诱导组、LA27抑制组中TNF-?,IL-1?和IL-6等三种炎症因子的表达水平。结果发现,LA27抑制组中由鼠伤寒沙门氏菌脂多糖、铜绿假单胞菌脂多糖和大肠杆菌脂多糖三种脂多糖分别刺激的细胞中TNF-?,IL-1?和IL-6炎症因子的表达水平显着降低(p<0.01),而肠炎沙门氏菌脂多糖中表达的炎症因子水平无显着性差异(p<0.01)。这说明LA27具有一定的抗炎效果,且进一步验证了其对鼠伤寒沙门氏菌脂多糖、铜绿假单胞菌脂多糖和大肠杆菌脂多糖的识别能力。利用MOE2018软件模拟分析发现,在疏水作用、氢键作用以及静电作用三种力的共同作用下,LPS可能通过类脂A上的脂肪酸链与由LA27上T3、T4、T6、T16、T17、T19、T20等7个胸腺嘧啶T碱基形成的疏水性大沟区域结合,形成了稳定的类似“T”型结构的复合物,从而特异性识别。
吕敬龙[6](2013)在《褐藻糖胶预防性减少MM细胞逃逸阿糖胞苷杀伤》文中研究说明目的:通过体外建立迁移侵袭模型研究褐藻糖胶预防性减少MM细胞“逃逸”阿糖胞苷杀伤及机制,为临床预防MRD形成提供理论依据。方法:(1)用ELISA方法检测12例正常人和53例MM患者(Durie-Salmon分期:Ⅰ期8例,Ⅱ期17例,Ⅲ期28例)血清中SDF-1含量。(2)用正常人和不同分期MM患者血清、Boyden小室及Matrigel胶体外建立迁移侵袭模型,以检测阿糖胞苷(血峰浓度)对RPMI8226细胞和U266细胞迁移侵袭能力的影响、不同分期MM患者血清对MM细胞的趋化作用以及该迁移侵袭现象的最佳观察时间点。(3)用MTT法分别检测不同浓度(25、50、100、200及400μg/ml)、不同时间(24h、48h和72h)褐藻糖胶对RPMI8226细胞和U266细胞的增殖抑制作用,并分别求得褐藻糖胶对RPMI8226细胞和U266细胞的IC50。(4)用Annexin V-FITC和PI双染法分别检测12.5μg/ml褐藻糖胶(即1/4IC50)对RPMI8226细胞和U266细胞凋亡率的影响。(5)通过体外模型进一步观察褐藻糖胶对由阿糖胞苷所致的MM细胞“逃逸”的影响:实验设对照组、阿糖胞苷组、褐藻糖胶预处理+阿糖胞苷组及褐藻糖胶预处理组。(6)采用流式细胞术检测阿糖胞苷、褐藻糖胶对RPMI8226细胞和U266细胞膜表面趋化因子受体CXCR4表达水平的影响。(7)Western blot方法检测经趋化因子配体SDF-1a诱导和未经SDF-1a诱导的各实验组细胞MMP-9和RhoC蛋白表达情况。结果:(1)SDF-1在正常人和MM患者中的含量:SDF-1含量在正常人、I期、II期以及III期患者中分别为1.71±0.08ng/ml、1.77±0.05ng/ml、2.22±0.18ng/ml和2.80±0.13ng/ml,SDF-1含量呈现出随着临床分期增高而增高趋势。(2)体外建模结果显示:阿糖胞苷可促使MM细胞“逃逸”,且随着临床分期越高“逃逸”至小室下细胞数目越多;6h为该“逃逸”现象最佳观察时间点。(3)MTT结果显示:褐藻糖胶对RPMI8226细胞和U266细胞增殖抑制作用均呈时间-剂量依赖性增强,IC50分别为48μg/ml和53μg/ml。(4)用12.5μg/ml(即1/4IC50)褐藻糖胶处理RPMI8226细胞和U266细胞72h,RPMI8226细胞和U266细胞凋亡率相比对照组,差异无统计学意义(P>0.05)。(5)用12.5μg/ml褐藻糖胶预处理RPMI8226细胞和U266细胞72h,发现褐藻糖胶可预防性减少阿糖胞苷所致的RPMI8226细胞和U266细胞“逃逸”,穿膜细胞数相比阿糖胞苷组明显减少。(6)流式检测各实验组CXCR4表达情况;结果显示阿糖胞苷组表达率高于对照组、褐藻糖胶预处理组、褐藻糖胶预处理+阿糖胞苷组;褐藻糖胶预处理组、褐藻糖胶预处理+阿糖胞苷组相比对照组,表达率显着下降;褐藻糖胶预处理组相比褐藻糖胶预处理+阿糖胞苷组,无统计学差异(P>0.05)。(7)与未经SDF-1α孵育组相比,经SDF-1α孵育后各实验组MMP-9、RhoC蛋白表达水平均明显增高;并且阿糖胞苷组高于对照组、褐藻糖胶预处理组及褐藻糖胶预处理+阿糖胞苷组,差异性均有统计学意义(P<0.05);褐藻糖胶预处理组、褐藻糖胶预处理+阿糖胞苷组相比对照组,其表达量减少,差异性有统计学意义(P<0.05);褐藻糖胶预处理组相比褐藻糖胶预处理+阿糖胞苷组,差异性无统计学意义(P>0.05)。结论:(1)阿糖胞苷可促使RPMI8226细胞和U266细胞“逃逸”。(2)褐藻糖胶可预防性减少RPMI8226细胞和U266细胞“逃逸”阿糖胞苷杀伤。(3)上调RPMI8226细胞和U266细胞膜表面CXCR4分子表达可能是阿糖胞苷促使MM细胞“逃逸”的主要机制之一。(4)降低RPMI8226细胞和U266细胞膜表面CXCR4分子和MMP-9、RhoC蛋白表达水平可能是褐藻糖胶减少MM细胞“逃逸”阿糖胞苷杀伤的重要机制之一。(5)RhoC、MMP-9及SDF-1/CXCR4轴在该“逃逸”现象中扮演着重要的角色。
戚少龙[7](2020)在《血管内皮损伤相关因子的荧光检测技术研究》文中提出闭塞性动脉粥样硬化、动静脉血栓形成作为血管外科疾病中最主要、最常见两类疾病,其发生、发展与体内众多细胞因子有着千丝万缕的联系。血管内细胞功能障碍作为这两类疾病的始动环节,在疾病的整个进程中发挥着十分重要的作用。血管内皮细胞作为人体内最大的异质性“器官”,是血液与组织之间调控的关键界面,因此也成为了多种细胞活性物质的潜在作用靶点。虽然血管内皮细胞具备较强的自我修复能力,但在持续受到某些血管活性物质(NO、SO2)、活性氧(H2O2、O2-、Cl O-)、小分子生物硫醇(半胱氨酸(Cys)、高半胱氨酸(Hcy))、炎症因子(白介素-17(IL-17)、血管内皮细胞粘附分子-1(VCAM-1))、各种免疫因子、药物、微生物等作用下,内皮细胞对血管的保护作用减弱甚者消失,导致血管内皮细胞功能障碍(endothelial dysfunction ED)。其作为多种血管疾病的始动环节,主要通过调节血管收缩、促进白细胞粘附聚集、血小板凝聚、氧化应激损伤、平滑肌增殖及血栓形成等途径引发动脉粥样硬化,动静脉血栓形成等多种血管疾病。21世纪以来,随着科技进步,基因组学及蛋白质组学得到迅猛发展,人类对疾病发生、发展、评估治疗、改善预后也由传统的临床症状、体征、结构影像逐渐过渡到致病分子水平变化上来,医学影像技术也逐渐由结构成像、功能成像逐渐发展为分子成像。分子影像技术是运用新型影像学方法在细胞及分子水平对话活体状态下的生命过程,在分子及基因水平诊断及指导疾病治疗,从而达到个体化精准-可视化治疗,是分子生物学与多样化现代医学影像技术相结合的技术。因此,推动医学影像技术在临床血管疾病早期诊断及治疗中的应用具有重要意义。本论文围绕血管内皮损伤分子的荧光检测技术进行研究,通过设计合成高选择性、高灵敏性的小分子荧光探针,建立了血管内皮损伤重要相关分子(SO2、活性氧(Cl O-)、生物硫醇(Cys))的检测方法,考察了探针在细胞(体外)和小鼠活体(体内)成像中的应用情况,为指导相关临床血管疾病早期诊断、评估治疗疗效及改善预后提供了理论基础和实验依据。本论文主要包括以下四部分工作:1、从吲哚磺酸盐与不同结构的芳香醛出发,设计合成了3种能在纯水中检测SO2/HSO3-的新型荧光探针ISBD、ISPD、ISND,检测过程能在1min内快速完成,检测限分别为9.21×10-9mol/L(9.21 n M)、4.25×10-8 mol/L(42.5 n M)和8.11×10-8 mol/L(81.1 n M)。通过三种探针的性能比较,筛选出荧光强度更强(荧光量子产率更高)、发射波长更长、干扰性更小的荧光探针ISND。并对其抗干扰能力与生物检测能力进行了重点考察,发现17种干扰离子对于HSO3-的检测基本没有影响。细胞毒性及荧光实验也证实探针ISND毒性低、膜透性良好、能够完成血浆及细胞内复杂生物环境中的SO2/HSO3-检测,为进一步进行生物活体内实时成像奠定了基础,为今后临床工作中开展血浆SO2/HSO3-的水平监测提供了可行方案。2、以萘酰亚胺为荧光团,异氰基乙酸乙酯为识别基团,设计合成了一种用于生物环境内源性Cl O-检测的荧光探针NAEC。通过研究发现,该探针具有响应速度快(<10 s)、灵敏度高(检测限低至4.9 n M)、斯托克斯位移大(100 nm)等优点,能快速、灵敏、特异性的检测血浆及细胞中Cl O-浓度。竞争干扰实验证实,包括体内多种小分子生物硫醇及其他ROS在内的22种干扰物质对Cl O-的检测基本没有影响。此外,NAEC的膜透性较好,能够快速透过细胞膜进入细胞内部进行特异性Cl O-成像检测。同前面报导的探针ISND相比,探针NAEC的斯托克斯位移较大、能量利用率更高、发射波长更长,实现了细胞的内源性Cl O-的荧光检测。这不仅有助于荧光探针成为生命医学研究人员研究体内Cl O-分布和作用机制的有效工具,还能为动脉粥样硬化、动静脉血栓形成等血管疾病的早期诊断、个体化治疗、改善预后及术后内环境稳态监测等方面提供分子水平的重要参考。3、在前两部分内容基础上,充分利用吲哚磺酸盐的良好水溶性与萘酰亚胺基团的优异发光性能,设计合成了一种基于萘酰亚胺及吲哚磺酸盐结构的比率型双检测(HSO3-/Cl O-)的荧光分子探针NASF,该探针能够同时高灵敏度、高选择性完成HSO3-/Cl O-的定性及定量检测,实现一探针多用,并且在两种物质检测过程中产生不同波长的荧光信号,不会相互干扰。同前两部分的探针相比,探针NASF除了具有更大的斯托克斯位移(Cl O-:115 nm,HSO3-:88 nm)、较长的发射波长(Cl O-:515 nm,HSO3-:548 nm)、良好的水溶性(DMF/水=1:99,v/v)等优点以外,探针NASF作为比率型荧光探针,可以通过检测两个不同发射波长的荧光强度来提供内部自行校准,减少来自背景的干扰,能将探针浓度的影响降至最低,提高检测的精准度。体内、外成像实验发现,探针NASF可以很好的完成细胞内源性Cl O-的检测,无需外源性加入即可完成细胞内成像,同时在鉴别肿瘤细胞方面也具备良好的生物应用前景。但在进一步运用到活体肿瘤组织成像时表现乏力,这可能与探针NASF发射波长较短(λem=515 nm)、组织穿透能力较弱有关。研究显示:不同波长荧光组织穿透能力不同,生物组织在可见光区域(350-600 nm)有较高的光吸收。大部分荧光信号被动物毛发,皮肤等组织吸收、散射,难以完成高质量的活体荧光成像。当波长>600 nm时,各种波长的光对小鼠各器官的透过率将显着增加,在波长为650-900 nm的近红外区间,血红蛋白、脂肪、水对这些波长的光吸收均保持在较低水平。因此,选择激发和发射均位于近红外(650-900 nm)区域的荧光探针标记,更利于活体内可视化成像,特别是深层组织成像。4、鉴于第3部分内容中,探针NASF在活体成像中的欠佳表现以及近红外荧光成像在活体内的应用优势。结合临床实际应用,我们从目前唯一被美国FDA批准的临床使用的近红外光学成像对比剂-吲哚菁绿入手。对吲哚菁绿(ICG)化学结构进行优化改进,设计合成了一种新型荧光探针CYNA。该探针不仅可以实现Cys的特异、灵敏检测,同时还具备与吲哚菁绿相近的近红外成像能力,生物毒性低、组织相容性好、检测限达14 n M。探针NASF的激发波长和发射波长位于近红外I区(excitation:710 nm,emission:820 nm),能够在出色完成细胞内源性Cys成像及血浆中Cys浓度测定的同时,大大提高了探针对活体组织的成像能力。活体成像实验中,我们通过静脉注射的方式将探针注射进小鼠体内,对探针的体内分布及代谢途径进行了初步研究。结果发现,静脉注射探针CYNA后,前60 min内,小鼠体内出现逐渐增强的近红外荧光信号;60 min以后,小鼠体内的荧光信号逐渐减弱;注射100 min后,荧光信号逐渐消失殆尽。另外,为了进一步探究实验小鼠体内荧光的聚集情况及信号来源,我们对不同时间节点小鼠的离体器官进行了荧光成像检测,发现荧光信号主要来自于肝脏及小肠,其他器官(心脏、肾、肺、脾)几乎没有可见荧光信号发出,荧光变化趋势与活体实验结果基本一致。根据以上实验结果,我们推测探针CYNA具有与ICG相类似的体内代谢途径,主要经肝脏代谢,并以游离形式进入肠道,进而随肠道排出体外。活体成像实验结果不仅证实探针CYNA可用于体内Cys的全身可视化研究,还将为下一步开展基于吲哚菁绿的新型淋巴显影剂的研发工作提供了理论基础及实验依据。
崔凤杰[8](2006)在《灰树花深层发酵条件优化及其菌丝体抗肿瘤糖肽的研究》文中研究指明灰树花[ Grifola frondosa (Dicks. Fr.) S. F. Gray ]是近年来开发比较多的珍奇药食用菌之一,其多糖和多糖复合物在抗肿瘤、抗病毒、增强免疫、降血糖、治疗糖尿病等多方面的具有明显的生物活性。本论文在实验室前期研究工作的基础上,对灰树花菌丝体的深层发酵培养基优化、扩大培养、菌丝体中抑瘤活性物质的分离和筛选、组成结构、抑瘤活性物质的体内外抑癌活性及机理等方面进行了较为深入的研究。根据实验室前期工作所得到的结论,利用Box-Behnken 3×3设计优化了影响灰树花深层发酵菌丝体和胞外聚合物的生产的主要培养基组成碳源(葡萄糖)、氮源(蛋白胨)和无机盐(KH2PO4)。响应面分析结果表明,各因素及其交互作用对响应值(灰树花菌丝体和胞外聚合物产量)均存在显着的相关性。通过典型性分析,获得最大菌丝体(17.61 g/l)时培养基组成为:葡萄糖45.2 g/L,KH2PO4 2.97 g/L,蛋白胨6.58 g/L,MgSO4·7H2O 1 g/L和玉米浆15 g/L;而获得最大胞外聚合物量(1.326 g/L)时的培养基组成为:葡萄糖58.6 g/L,KH2PO4 4.06 g/L,蛋白胨3.79 g/L,MgSO4·7H2O 1 g/L和玉米浆15 g/L。与其他实验组的结果相比,优化后的灰树花菌丝体与胞外聚合物的量都有较大的增加。15 L发酵罐扩大培养的结果表明,在优化培养基组成的条件下,扩大培养后的菌丝体产量最大值达22.50 g/L。采用15 L搅拌式发酵罐研究灰树花的扩大培养条件,主要考察了搅拌转速和通气量对灰树花菌丝量、胞外聚合物产率、溶氧、菌丝形态以及发酵液粘度的影响。研究结果表明搅拌转速和通气量能显着影响灰树花的生长,并且通过对灰树花菌丝球的大小、形态以及胞外聚合物的分泌影响发酵液的粘度。并得出较为优化的培养条件为:温度25℃,通气量0.75 vvm,搅拌转速100 r/min,装液量60%;在此条件下,发酵10天后,灰树花菌丝体最大得率为23.95 g/L,胞外聚合物的得率为1.421 g/L。以体外抑制肿瘤细胞增殖的活性作为筛选导向,采用DEAE-Sepharose Fast Flow柱、Sephadex G-100柱和AKTA快速分离制备系统对灰树花发酵菌丝体的粗提物进行分离纯化,从灰树花深层发酵培养菌丝体中提取、分离纯化得到一种活性酸性糖肽GFPS1b。HPGPC法测得其重均分子量为21 kDa。样品中蛋白含量16.70%,糖含量为86.0%,并含有4.3%的糖醛酸。利用化学方法(单糖组成分析、部分酸水解、甲基化分析)和光谱方法(GC、GC-MS、红外吸收光谱、核磁共振)分析GFPS1b的糖链结构,结果表明其单糖组成主要有Glc、Gal、Ara,其糖链主链由两个α–D-Glc (1→3)、α–D-Gal (1→4)、α–D-Glc (1→3,6)和α–D-Gal(1→6)组成的,其中葡萄糖基的6位发生取代,取代侧链主要为α-L-Ara -(1→4)-α–D-Glc (1→。该结构与从灰树花子实体中所提取的多糖D-Fraction以及杜巍等所纯化的组分G.F.-2的结构都有很大的不同,因此可以认定GFPS1b为一新的糖肽。通过建立小鼠移植黑色素瘤B16模型,研究了GFPS1b的体内抗肿瘤作用。对荷瘤
梁希若,郑志坚,马志贤,罗瑞仙[9](1982)在《用扁桃体细胞制备临床级α干扰素(IFN—α)》文中研究表明 当前干扰素的研究,在医学上主要着重于使干扰素能早日应用于对人类疾病的防治有关的基础理论与临床研究。目前国内外用正常细胞生产与制备的人干扰素可概括为三种:1.由人血白细胞产生的白细胞干扰素(称α干扰素IFN—α);2.由人成纤维细胞
孙达权[10](2008)在《山羊乳腺特异性载体的构建及细胞转染》文中研究说明基因打靶通过DNA转移手段将外源DNA导入靶细胞或组织中,利用外源DNA序列与靶细胞内基因组中部分DNA序列间的同源性使它们在分裂前期发生DNA间的同源重组,从而对靶细胞基因组上的某一确定位点或座位进行精确的遗传修饰的一门新技术。乳腺生物反应器是基于胚胎操作和转基因技术平台,外源基因导入动物基因组中并利用内源基因的启动元件使外源基因在动物乳腺中表达,并利用动物乳腺的分泌能力从乳汁中获得具有重要使用价值的药用蛋白等外源蛋白的一类转基因动物的总称。随机整合将外源基因随机导入靶细胞基因组中,由于“位置效应”而导致外源基因表达低下甚至沉默。为提高外源蛋白在转基因动物中的表达量,本研究以基因打靶等技术构建山羊乳腺特异性载体,并通过稳定转染和细胞筛选来获得中靶转基因山羊胎儿成纤维细胞,以中靶体细胞为核供体细胞生产乳腺生物反应器动物,解决了外源基因由于随机整合而产生“位置效应”这一难题,并利用乳蛋白基因的启动元件在乳腺中高效表达外源基因。本试验以山羊β-酪蛋白基因座为打靶位点,从西农萨能奶山羊血液中提取DNA基因组,利用LA-PCR分两段扩增了山羊的β-酪蛋白基因,经TA克隆和鉴定后再用LA-PCR的方法从中克隆了该基因的5’端包括调控序列和信号肽在内的3 kb的DNA序列和3’端2 kb的DNA序列作为两条同源臂。同时以在两个LoxP之间插有新霉素磷酸转移酶基因(neo)并在两个LoxP外侧各有一个疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-tk)的通用性打靶载体pA2T为骨架载体,构建了乳腺特异性条件性基因打靶载体。采用具有广谱抗菌、抗病毒、改善免疫、组织修复、改善组织局部血液循环和分解脓液等作用的人溶菌酶基因和具有溶解血块、保持血管的畅通等作用且半衰期相对较长的指形区缺乏的人组织纤溶酶原激活剂基因为打靶载体的外源目的基因,两者均通过PCR从带有该基因的载体中克隆出来的,并通过酶切和连接的方法构建打靶载体。另外,试验以带有核定位信号的AcGFP基因为标记基因,外源目的基因通过具有独立起始翻译随后基因作用的IRES序列与AcGFP基因相联系。以质粒pEGFP-C1为骨架载体,先通过改造GFP基因ATG附近的序列使GFP高效表达,再将具有增强剪接作用的间插序列(IVS)与IRES序列与GFP基因相连,再在IVS前加入另一个带有多克隆位点的IVS,构建了载体p3I-GFP,通过细胞转染确实发现载体p3I-GFP及去除了MluI位点的p3I-GFPN能够高效表达标记基因,且荧光亮度要明显高于购买的pIRES2-AcGFP-Nuc载体。再以p3I-GFPN为骨架载体,将人溶菌酶基因导入多克隆位点,通过细胞转染发现的确能够表达绿色荧光蛋白。在此基础上,在CMV启动子和人溶菌酶基因之间插入山羊CSN2的启动子,再将GFP基因用从人胎盘中以PCR的方法扩增获得的干扰素A基因替代,最终构建了一个乳腺中独立表达人溶菌酶和人干扰素蛋白的载体,用于乳腺炎防治的研究。为获得中靶山羊胎儿成纤维细胞株,本试验以山羊胎儿成纤维细胞为打靶体细胞,脂质体2000转染细胞后用含800μg/ml的遗传霉素初步筛选培养,7天后用含400μg/ml的遗传霉素和200 nmol/ml的丙氧鸟苷的细胞筛选液筛选培养,初步筛选中靶细胞。为获得纯化的中靶细胞株,首先建立一个单细胞培养体系,即以5 mg/ml丝裂霉素C处理2h的山羊胎儿成纤维细胞为饲养层和新鲜的细胞培养液,以这个单细胞培养体系培养初步筛选的中靶单个细胞,最后得到扩增的细胞株,再用含400μg/ml的遗传霉素和100 nmol/ml的丙氧鸟苷的细胞培养液培养,获得纯化的中靶山羊胎儿成纤维细胞株。
二、Namalwa细胞干扰素制备系统的改进研究(论文开题报告)
(1)论文研究背景及目的
此处内容要求:
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例:
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
(2)本文研究方法
调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Namalwa细胞干扰素制备系统的改进研究(论文提纲范文)
(5)脂多糖广谱型核酸适配体的定向筛选、序列优化及分析应用(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
缩略符号说明 |
第一章 绪论 |
1.1 脂多糖 |
1.1.1 脂多糖的化学结构 |
1.1.2 脂多糖的危害 |
1.1.3 脂多糖的检测技术 |
1.1.4 脂多糖的拮抗剂研究进展 |
1.2 核酸适配体 |
1.2.1 核酸适配体的产生历史 |
1.2.2 核酸适配体的筛选技术 |
1.2.3 核酸适配体的序列优化工程 |
1.2.4 核酸适配体在食品安全检测方面的应用 |
1.2.5 核酸适配体在疾病治疗方面的应用 |
1.3 核酸适配体-靶标作用机制研究技术及进展 |
1.3.1 毛细管电泳-激光诱导偏振技术 |
1.3.2 原子力单分子测定技术 |
1.3.3 等温滴定微量热技术 |
1.3.4 圆二色谱技术 |
1.3.5 分子模拟 |
1.4 立题背景及意义 |
1.5 主要研究内容 |
第二章 基于Capture-SELEX技术定向筛选广谱型LPS核酸适配体 |
2.1 前言 |
2.2 试验材料与设备 |
2.2.1 主要试剂与材料 |
2.2.2 主要仪器与设备 |
2.3 实验方法 |
2.3.1 亲和素化磁性纳米颗粒的制备 |
2.3.2 二元杂合筛选文库的制备 |
2.3.3 筛选文库的固定 |
2.3.4 基于Capture-SELEX的定向筛选 |
2.3.5 PCR扩增、纯化及单链文库制备 |
2.3.6 克隆测序及序列分析 |
2.3.7 候选核酸适配体亲和性分析 |
2.3.8 候选核酸适配体特异性分析 |
2.4 结果与讨论 |
2.4.1 功能化磁性纳米颗粒的表征 |
2.4.2 ssDNA筛选文库的固定化 |
2.4.3 基于Capture-SELEX的定向筛选 |
2.4.4 候选适配体亲和性和特异性分析 |
2.5 本章小结 |
第三章 Structure-switching型脂多糖核酸适配体传感器研究 |
3.1 前言 |
3.2 实验材料与设备 |
3.2.1 主要实验材料与试剂 |
3.2.2 主要实验仪器和设备 |
3.3 实验方法 |
3.3.1 荧光猝灭效果的条件优化 |
3.3.2 荧光恢复效果的条件优化 |
3.3.3 实际样品分析应用 |
3.4 结果与讨论 |
3.4.1 检测原理 |
3.4.2 荧光猝灭效果的条件优化 |
3.4.3 荧光恢复效果的条件优化 |
3.4.4 标准曲线的绘制 |
3.4.5 加标回收试验 |
3.5 本章小结 |
第四章 广谱型脂多糖核酸适配体序列优化与结构功能分析 |
4.1 前言 |
4.2 实验材料与设备 |
4.2.1 主要实验材料与试剂 |
4.2.2 主要实验仪器和设备 |
4.3 实验方法 |
4.3.1 氧化石墨烯纳米片的制备 |
4.3.2 核酸适配体剪裁原则 |
4.3.3 核酸适配体特异性试验 |
4.3.4 核酸适配体亲和性试验 |
4.3.5 圆二色谱分析 |
4.4 结果与讨论 |
4.4.1 氧化石墨烯的表征 |
4.4.2 裁剪核酸适配体的特异性试验结果 |
4.4.3 剪裁核酸适配体的亲和力分析 |
4.4.4 核酸适配体LA80序列结构与功能分析 |
4.4.5 核酸适配体LA80和LA27结合脂多糖前后的圆二色谱结果 |
4.5 本章小结 |
第五章 基于剪裁核酸适配体及GO双信号增强的LPS荧光偏振快速检测方法研究 |
5.1 前言 |
5.2 实验材料与设备 |
5.2.1 主要实验材料与试剂 |
5.2.2 主要实验仪器和设备 |
5.3 实验方法 |
5.3.1 氧化石墨烯纳米片的制备 |
5.3.2 核酸适配体浓度的优化 |
5.3.3 氧化石墨烯浓度的优化 |
5.3.4 分析检测时间的优化 |
5.3.5 加标回收试验 |
5.4 结果与讨论 |
5.4.1 检测原理 |
5.4.2 核酸适配体与氧化石墨烯浓度的优化 |
5.4.3 荧光法和荧光偏振法的动力学试验结果比较 |
5.4.4 分析检测时间的优化 |
5.4.5 LA27和LA80分别作为分子探针的检测结果比较 |
5.4.6 样品分析 |
5.5 本章小结 |
第六章 核酸适配体LA27的抗炎性能及其结合脂多糖的作用模式分析与探讨 |
6.1 前言 |
6.2 实验材料与设备 |
6.2.1 主要实验材料与试剂 |
6.2.2 主要实验仪器和设备 |
6.3 实验方法 |
6.3.1 细胞培养 |
6.3.2 脂多糖诱导和LA27抑制试验 |
6.3.3 细胞炎性因子的检测 |
6.3.4 分子模拟计算方法 |
6.3.5 数据处理与分析 |
6.4 结果与讨论 |
6.4.1 细胞炎性因子的检测原理 |
6.4.2 脂多糖处理时间对诱导HepG2 细胞产生炎症因子水平的影响 |
6.4.3 LA27核酸适配体抑制细胞炎性因子表达的效果 |
6.4.4 结合模式分析 |
6.5 本章小结 |
主要结论与展望 |
主要结论 |
展望 |
本论文创新点 |
致谢 |
参考文献 |
附录:作者在攻读博士学位期间发表的论文 |
(6)褐藻糖胶预防性减少MM细胞逃逸阿糖胞苷杀伤(论文提纲范文)
英汉缩略语名词对照 |
摘要 |
ABSTRACT |
前言 |
第一部分 观察阿糖胞苷对 RPMI8226 细胞和 U266 细胞迁移侵袭能力的影响 |
1 材料和方法 |
2 结果 |
3 讨论 |
第二部分 褐藻糖胶预防性减少 RPMI8226 细胞和 U266 细胞逃逸阿糖胞苷杀伤 |
1 材料和方法 |
2 结果 |
3 讨论 |
全文总结 |
参考文献 |
文献综述 |
参考文献 |
致谢 |
攻读硕士学位期间发表的论文 |
(7)血管内皮损伤相关因子的荧光检测技术研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
abstract |
英文缩略词表 |
第一章 引言 |
第二章 综述 |
2.1 血管外科疾病概述 |
2.1.1 血管外科疾病分类 |
2.1.2 血管外科疾病病因及发病机制 |
2.1.3 症状体征 |
2.1.4 辅助检查 |
2.1.5 诊断及治疗 |
2.2 血管内皮损伤机制研究 |
2.2.1 血管内皮细胞损伤机制研究历程 |
2.2.2 血管内皮损伤机制 |
2.3 分子影像学 |
2.3.1 分子影像学及分子成像技术 |
2.3.2 各分子成像技术简介 |
2.3.3 多模态分子成像技术 |
2.4 本论文思想提出 |
第三章 血管活性物质SO2/HSO3-的荧光检测技术研究 |
3.1 引言 |
3.2 实验部分 |
3.2.1 试剂与原料 |
3.2.2 实验仪器 |
3.2.3 实验方法 |
3.3 结果与讨论 |
3.3.1 探针ISBD、ISPD和 ISND的检测性能对比实验 |
3.3.2 探针ISND的响应时间 |
3.3.3 探针ISND对 HSO3-的选择性和竞争性实验 |
3.3.4 探针ISND分子的传感机理研究及理论化学计算 |
3.3.5 探针ISND对血浆样品中HSO3-的浓度测定 |
3.3.6 探针ISND的细胞毒性实验 |
3.3.7 探针ISND的细胞成像实验 |
3.4 结论 |
第四章 活性氧(ClO-)的荧光检测技术研究 |
4.1 引言 |
4.2 实验部分 |
4.2.1 试剂与原料 |
4.2.2 仪器设备 |
4.2.3 实验方法 |
4.3 结果与讨论 |
4.3.1 pH值及响应时间 |
4.3.2 裸眼识别及紫外-可见吸收光谱 |
4.3.3 探针NAEC检测ClO-的荧光光谱 |
4.3.4 竞争与干扰 |
4.3.5 探针分子的传感机理研究 |
4.3.6 血浆样品中ClO-的检测 |
4.3.7探针NAEC的细胞毒性实验 |
4.3.8 探针NAEC的体外细胞成像 |
4.4 结论 |
第五章 血管活性物质SO2/HSO3-与活性氧(ClO-)的双检测荧光成像技术研究 |
5.1 引言 |
5.2 实验部分 |
5.2.1 试剂与原料 |
5.2.2 仪器设备 |
5.2.3 实验方法 |
5.3 结果与讨论 |
5.3.1 pH值对探针NASF检测性能的影响 |
5.3.2 探针NASF对 ClO-的紫外-可见吸收及荧光滴定 |
5.3.3 探针NASF对 HSO3-的紫外-可见吸收及荧光滴定 |
5.3.4 探针NASF对 ClO-和HSO3-的选择性及干扰性研究 |
5.3.5 探针分子的传感机理研究 |
5.3.6 血浆样品中HSO3-及ClO-的浓度检测 |
5.3.7 探针NASF的细胞毒性 |
5.3.8 生物应用:探针NASF的细胞成像检测 |
5.3.9 生物应用:肿瘤细胞的识别 |
5.3.10 生物应用:探针NASF活体肿瘤成像 |
5.4 结论 |
第六章 生物硫醇(Cys)的荧光检测技术研究 |
6.1 引言 |
6.2 实验部分 |
6.2.1 试剂与原料 |
6.2.2 仪器设备 |
6.2.3 实验方法 |
6.3 结果与讨论 |
6.3.1 响应时间与pH |
6.3.2 裸眼识别及紫外-可见吸收光谱 |
6.3.3 荧光发射光谱 |
6.3.4 探针CYNA对 Cys的干扰和竞争性研究 |
6.3.5 探针分子的传感机理研究 |
6.3.6 血浆样品中Cys检测 |
6.3.7 探针CYNA的细胞毒性实验 |
6.3.8 探针CYNA的细胞成像实验 |
6.3.9 活体成像应用 |
6.4 结论 |
第七章 总结与展望 |
创新点 |
参考文献 |
附录 |
附录1 |
附录2 |
附录3 |
附录4 |
作者简介及博士期间所取得的科研成果 |
致谢 |
(8)灰树花深层发酵条件优化及其菌丝体抗肿瘤糖肽的研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
ABSTRACT |
第一章绪论 |
1.1 药食用真菌液体发酵的研究进展 |
1.2 药用真菌多糖及其复合物研究概况 |
1.3 灰树花研究现状 |
1.4 课题的立题背景和研究内容 |
第二章 运用多元数学模型优化灰树花GF9801发酵培养基组成的研究 |
2.1 材料与方法 |
2.2 结果与讨论 |
2.3 本章小结 |
第三章 搅拌转速和通气量对灰树花深层发酵培养的影响 |
3.1 材料与方法 |
3.2 结果与讨论 |
3.3 本章小结 |
第四章 灰树花菌丝体体外抗肿瘤活性糖肽GFP516 的筛选及其糖链一级结构表征 |
4.1 实验材料、仪器 |
4.2 实验方法 |
4.3 结果与讨论 |
4.4 本章小结 |
第五章 灰树花菌丝体糖肽 GFP516 体内抗肿瘤作用及机理的初步研究 |
5.1 实验材料、仪器 |
5.2 实验方法 |
5.3 结果与讨论 |
5.4 本章小结 |
第六章 灰树花菌丝体糖肽 GFP516 诱导肿瘤细胞凋亡及相关机制研究 |
6.1 实验材料、仪器 |
6.2 实验方法 |
6.3 结果与讨论 |
6.4 本章小结 |
参考文献 |
论文主要结论 |
论文创新点 |
博士在读期间已发表(含待发表)论文 |
致谢 |
(10)山羊乳腺特异性载体的构建及细胞转染(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
文献综述 |
第一章 基因打靶研究进展 |
1.1 基因打靶的概念和原理 |
1.1.1 基因打靶的概念 |
1.1.2 基因打靶的原理 |
1.2 基因打靶载体的类型 |
1.2.1 置换型基因打靶载体 |
1.2.2 插入型基因打靶载体 |
1.3 基因打靶历史进程 |
1.3.1 经典基因打靶 |
1.3.2 胚胎干细胞技术 |
1.3.3 基因打靶策略 |
1.3.4 条件性基因打靶 |
1.3.5 体细胞基因打靶 |
1.4 基因打靶的效率 |
1.4.1 打靶载体的影响 |
1.4.2 打靶位点的影响 |
1.4.3 调控元件的影响 |
1.4.4 外源DNA 转移方式的影响 |
1.4.5 靶细胞的影响 |
1.4.6 基因表达的影响 |
1.5 乳腺基因打靶的研究进展 |
1.5.1 乳腺生物反应器的研究进展 |
1.5.2 溶菌酶、干扰素等在乳腺炎防治中的作用 |
1.5.3 用基因打靶生产乳腺反应器动物是发展的趋势 |
试验部分 |
第二章 通用性真核高效表达载体p31-GFPN 的构建 |
2.1 材料和方法 |
2.1.1 试验材料 |
2.1.2 试验方法 |
2.2 结果 |
2.2.1 pGFP3、pGFP854、pGFPC58 载体的构建结果 |
2.2.2 pIGD 载体的构建结果 |
2.2.3 pIGPb 载体的构建结果 |
2.2.4 p31-GFP 及p31-GFPN 载体的构建结果 |
2.2.5 p31-GFPN 等载体细胞转染的结果 |
2.3 讨论 |
2.4 结论 |
第三章 基因克隆 |
3.1 试验材料和方法 |
3.1.1 试验材料 |
3.1.2 试验方法 |
3.2 结果 |
3.2.1 人溶菌酶基因的克隆结果 |
3.2.2 指形区缺乏的人组织纤溶酶原激活剂基因克隆的结果 |
3.2.3 人干扰素A 基因的克隆结果 |
3.2.4 萨能奶山羊β-casein 基因的克隆结果 |
3.3 讨论 |
3.4 结论 |
第四章 山羊乳腺特异性载体的载体的构建 |
4.1 材料和方法 |
4.1.1 材料 |
4.1.2 试验方法 |
4.2 结果 |
4.2.1 pIRES2-AcGFP-Nuc 的改造结果 |
4.2.2 目的基因的添加结果 |
4.2.3 同源臂的添加 |
4.2.4 载体pCMV/CSN2-hLY-hIFA 构建的结果 |
4.2.5 打靶载体的构建结果 |
4.3 讨论 |
4.4 结论 |
第五章 山羊乳腺特异性载体的细胞转染和筛选 |
5.1 材料和方法 |
5.1.1 材料 |
5.1.2 试验方法 |
5.2 结果 |
5.2.1 细胞筛选的结果 |
5.2.2 pLIAN、pTIAN 、pL31 和pCLIAN、pCTIAN、pCL31 的细胞转染结果 |
5.2.3 pC2-hL-hI 的细胞转染和筛选结果 |
5.2.4 pCLD 和pCtD 的细胞转染和细胞筛选结果 |
5.3 讨论 |
5.4 结论 |
结论 |
参考文献 |
附录1 试验仪器 |
附录2 试验试剂及配制方法 |
附录3 DNA 测序图谱 |
附录4 部分基因的DNA 序列比对结果 |
致谢 |
个人简介 |
四、Namalwa细胞干扰素制备系统的改进研究(论文参考文献)
- [1]Namalwa细胞干扰素制备系统的改进研究[J]. 郭葆玉,杜平. 第二军医大学学报, 1983(S1)
- [2]Namalwa细胞干扰素制备系统的改进研究[J]. 郭葆玉,杜平. 第二军医大学学报, 1982(01)
- [3]临床级Namalwa细胞干扰素纯化方法的比较研究[J]. 戚中田,杜平. 第二军医大学学报, 1983(03)
- [4]人白细胞干扰素制备系统的改进[J]. 杜平,杨嗣坤,杨蓉芬,杨文国,吴清璇. 解放军医学杂志, 1980(02)
- [5]脂多糖广谱型核酸适配体的定向筛选、序列优化及分析应用[D]. 叶华. 江南大学, 2019(01)
- [6]褐藻糖胶预防性减少MM细胞逃逸阿糖胞苷杀伤[D]. 吕敬龙. 重庆医科大学, 2013(03)
- [7]血管内皮损伤相关因子的荧光检测技术研究[D]. 戚少龙. 吉林大学, 2020(08)
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