一、肝片吸虫虫体抗原氨基酸成分分析（论文文献综述）
张国武,孟庆玲,乔军,王熙凤,张凯,宁程程,季春辉,才学鹏[1]（2021）在《肝片吸虫天冬酰胺内肽酶的分子特征、遗传进化及抗原特性研究》文中研究说明【目的】分析肝片吸虫Legumain蛋白的分子特征、遗传进化及抗原性,评估其作为诊断抗原的潜力。【方法】根据GenBank中已发表的肝片吸虫（Fh）Legumain基因序列设计特异性引物,以Fh总RNA为模板,进行RT-PCR扩增,并将扩增产物克隆到pMD19-T载体中测序,分析其分子特征。将Legumain基因克隆入表达载体pET-32a（+）中,将其转化至Escherichia coli感受态细胞Transetta（DE3）中,IPTG诱导表达并获得纯化的重组蛋白Legumain,进行抗原性分析。【结果】Fh Legumain基因cDNA全长1278 bp,编码425个氨基酸,编码蛋白分子的优势抗原表位主要集中在第73～103、115～137、254～308、319～337、360～375位;1～21位有信号肽,无跨膜区,为亲水性蛋白。【结论】经SDS-PAGE检测,重组Legumain蛋白分子量约为65 kDa,与预期大小相符;Western blot分析表明,重组Legumain可被感染肝片吸虫的绵羊阳性血清特异性识别,证明具有良好的反应原性。小鼠免疫试验证实该蛋白具有良好的免疫原性。
王春群[2]（2021）在《捻转血矛线虫蛋白N-糖基化修饰的特征及其对免疫保护作用的影响》文中研究指明捻转血矛线虫是一种感染牛羊引起反刍动物养殖业重大经济损失的寄生线虫。当前对该寄生虫的防治还主要依靠抗蠕虫药物,但是长期过度地使用驱虫药物已造成呈全球性分布的寄生虫抗药性问题,疫苗作为一种长期有效的防控策略已经引起广泛的关注。捻转血矛线虫天然抗原（如H11抗原）能够诱导宿主产生高水平的免疫保护,研究表明捻转血矛线虫蛋白具有典型的壳二糖核心岩藻糖基化修饰,并且一些已知的候选抗原分子（如氨基肽酶和半胱氨酸蛋白酶）具有潜在N-糖基化修饰位点。然而,捻转血矛线虫蛋白N-糖基化修饰的结构特征怎样?N-糖基化修饰是否与免疫功能有关?我们对这些与免疫学相关的重要科学问题几乎是一无所知。为回答这些科学问题,本论文以捻转血矛线虫成虫及伴刀豆凝集素A（Con A）提取的H11抗原为研究对象,采用高精度生物质谱技术、凝集素组化技术以及动物免疫试验,全面探究了捻转血矛线虫蛋白N-糖基化修饰的结构特征及其对免疫保护作用的影响。具体研究内容如下:1.捻转血矛线虫成虫N-糖组学和N-糖蛋白组学的结构特征（1）基于糖组学分析技术,本研究利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-ToF MS）建立了捻转血矛线虫成虫完整的N-糖谱,识别到一系列带有或未带有岩藻糖的低甘露糖(Hex2-4Hex NAc2Fuc0-3)、高甘露糖(Hex5-9Hex NAc2)及复杂型聚糖结构(Hex3-4Hex NAc3-5Fuc0-2);二级质谱（MS/MS）分析表明该寄生虫存在一系列已知的蠕虫免疫原性聚糖表位,包括Gal-Fuc基序、LDNF（Gal NAcβ1-4（Fucα1-3）Glc NAc）以及壳二糖核心岩藻糖基序。（2）凝集素组化分析揭示甘露糖复合物主要表达在捻转血矛线虫雌雄虫肠道及雄虫粘腺部位;N-乙酰氨基葡萄糖复合物表达在雌雄虫肠道微绒毛及生殖腺（雌虫卵巢及雄虫粘腺）部位;而N-乙酰氨基半乳糖和岩藻糖复合物则分别定位于雌虫的卵巢和肠道细胞质部位。（3）对于糖蛋白组学研究,利用亲水作用色谱法（HILIC）富集联合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术共鉴定到291个N-糖蛋白和425个N-糖基化位点,其中发现45个位点具有潜在的免疫原性α1,3岩藻糖基化修饰;生物信息学分析显示,N-糖基化位点发生于保守的氨基酸基序（N-x-T/S,x≠P）,主要定位于蛋白质表面的无序卷曲结构;识别的N-糖蛋白主要与细胞外基质和基底膜相关联,并且主要富集在半胱氨酸蛋白酶家族、层粘连蛋白EGF样结构域和肽酶M1家族;数据分析发现几个已知的疫苗候选分子存在多个N-糖基化位点,其中也包含一个潜在的α1,3岩藻糖基化位点。2.捻转血矛线虫H11抗原N-糖基化修饰特征及其对免疫保护作用的影响（1）应用MALDI-ToF MS技术在捻转血矛线虫Con A纯化的H11蛋白复合物中共鉴定到38个不同质荷比的N-聚糖信号峰,大部分出现的聚糖信号与捻转血矛线虫成虫聚糖保持一致,在m/z 2396到m/z 3084范围内额外识别到一系列高分子聚糖信号(Hex3-5Hex NAc4-6Fuc2-4)。（2）基于HILIC富集联合LC-MS/MS技术,在H11抗原组分中共识别到125个N-糖蛋白和85个N-糖基化位点,其中20个位点具有潜在的免疫原性α1,3岩藻糖基化修饰;生物信息学分析显示,这些识别的N-糖基化位点发生于保守的（N-x-T/S,x≠P）基序,主要富集于半胱氨酸蛋白酶和氨基肽酶两类肽酶家族。（3）随后将H11抗原用高温变性处理以破坏其蛋白质结构或用高碘酸钠处理以破坏其聚糖结构。利用未处理、变性处理和高碘酸钠处理的H11抗原进行山羊免疫实验,结果表明与未处理的H11天然抗原对照组相比,高碘酸钠处理的H11抗原显着降低了对动物的免疫保护力和抗H11抗原的特异性IgG抗体,导致平均产卵量、成虫负荷量升高和皱胃组织病理变化严重;而变性处理的H11抗原未显着降低动物的免疫保护力和血清抗体水平。（4）凝集素Con A组化分析显示H11天然糖蛋白复合物来源于捻转血矛线虫的整个肠道部位;而凝集素Con A与IgG抗体的共定位显示免疫原性的糖蛋白特异性识别在该寄生虫的肠道微绒毛部位。（5）IgG抗体与寄生阶段虫体的体外抑制实验结果显示与正常IgG抗体培养组相比,未处理及变性处理组抗原产生的IgG抗体抑制了L4发育和成虫肠道氨基肽酶活性,而高碘酸钠处理组抗原产生的IgG抗体则降低了这种抑制反应,提示H11天然抗原的免疫保护作用与聚糖介导的特异性IgG抗体有关。综上所述,本研究系统解析了捻转血矛线虫成虫和H11抗原的N-糖组和N-糖蛋白组并探究了聚糖对免疫保护作用的影响。不仅完整地表征了两者的N-糖基化结构特征,还发现H11抗原聚糖对诱导山羊的免疫保护作用至关重要。这项研究为进一步探索寄生线虫N-糖基化修饰的生物合成和免疫功能奠定了基础,为抗寄生虫疫苗的研发提供了新思路。
靳纬坤[3]（2021）在《牛大片形吸虫病免疫学诊断方法的建立与应用》文中研究说明研究背景及目的:片形吸虫病对畜牧业危害严重,广西地区牛大片形吸虫病感染率较高。本研究旨在利用F22及其所含的关键分子作为诊断抗原建立起牛大片形吸虫病免疫学诊断方法,并利用该方法对广西地区牛大片形吸虫病进行流行病学调查;同时对本地区使用化学药物驱虫效果进行初步评估,为广西地区牛大片形吸虫病的防控提供借鉴。此外,国内外尚缺乏牛大片形吸虫病ELISA诊断试剂盒及胶体金快速诊断试纸条,本研究可为今后牛大片形吸虫病ELISA诊断试剂盒、胶体金快速诊断试纸条的研制奠定基础。研究方法与结果:1、本研究制备了F22并对其进行质谱鉴定,从中选取Fg SAP-2、Fg Cat L2、Fg LAP三种诊断抗原候选分子进行了原核表达。2、从三种分子中筛选出r Fg SAP-2作为诊断抗原并与F22一起进行了各项反应条件的优化从而建立起牛大片形吸虫病间接ELISA诊断方法并进行敏感性、特异性、稳定性及早期诊断价值的检测并与传统的Fg ESP作为诊断抗原的牛大片形吸虫病间接ELISA法进行比较,表明三种诊断方法均与前后盘吸虫、巴贝斯虫无交叉反应且稳定性均较好。其中F22作为诊断抗原检测的敏感性最高,假阴性率为0%。Fg ESP、F22、r Fg SAP-2作为诊断抗原均能在感染后2周检测到抗体,其中F22在感染后2周OD450nm值最大且极显着高于Fg ESP、r Fg SAP-2的OD450nm值（P<0.01）,提示F22具有更高的早期诊断价值。3、本研究成功研制出F22作为诊断抗原的牛大片形吸虫病胶体金快速诊断试纸条并证明其具有良好的敏感性、特异性、稳定性,在感染后2周即可检测到抗体,可以应用于牛大片形吸虫病的现场快速诊断。4、利用F22和Fg ESP作为诊断抗原的间接ELISA法对广西地区牛片形吸虫病进行流行病学调查发现,阳性率分别为68.37%和57.30%。利用上述两种间接ELISA法及胶体金试纸条对A牛场牛血清进行检测,检测的阳性率分别仅为6.15%、4.31%、2.00%。利用建立的方法对A牛场的片形吸虫病用药方案进行效果评价,初步表明其用药方案具有较好的驱虫效果。结论:本研究建立了牛大片形吸虫病免疫学诊断方法,即F22作为诊断抗原的间接ELISA法及胶体金快速诊断试纸条,均具有较好的敏感性、特异性、稳定性,并能用于牛大片形吸虫病早期诊断,为今后牛大片形吸虫病ELISA试剂盒及胶体金快速诊断试纸条研制奠定了基础。利用建立的方法对广西地区牛大片形吸虫病进行流行病学调查并对A牛场的用药方案进行效果评价,结果表明广西地区牛大片形吸虫感染情况比较严重,A牛场的用药方案具有较好的驱虫效果,该用药方案可供广西地区各牛场借鉴参考。
魏雅婷[4]（2021）在《基于TPx、CatB4两种重组蛋白的绵羊肝片吸虫病间接ELISA和胶体金试纸条诊断方法的建立》文中指出
孙益春[5]（2021）在《基于GAPDH、Catl-1两种重组蛋白的绵羊肝片吸虫病间接ELISA和胶体金试纸条诊断方法的建立》文中提出
何婷[6]（2021）在《食源性吸虫的分子鉴定与快速诊断试条的研制及评价》文中指出一、广西南宁地区片形吸虫的分子鉴定及遗传多态性分析目的:本研究选取核糖体内转录间隔区（ITS+）、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶亚基Ⅰ（NAD Ⅰ）、线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ（COX Ⅰ）和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（pepck）这4个遗传分子标记,采用分子生物学的方法与技术鉴定广西南宁地区的片形吸虫种类,并分析其种群遗传多态性。方法:从南宁某屠宰场收集11头感染了片形吸虫的水牛的肝脏,分离获得151条片形吸虫成虫,并孵育获得其虫卵。提取片形吸虫成虫的基因组DNA,PCR扩增ITS+、NAD Ⅰ和COX Ⅰ序列并测序,所得序列经NCBI在线BLAST做同源性分析,构建线粒体基因NADⅠ和COXⅠ单倍型网络图及系统进化树,结合pepck基因多重PCR的结果鉴定虫种;提取部分片形吸虫虫卵的基因组DNA,PCR扩增ITS+序列并测序;用BioEdit软件做多序列比对分析,掌握片形吸虫亲代及子一代的遗传变异情况。结果:共获得151条片形吸虫成虫,lTS+序列扩增产物长度约964bp,仅NN20-2样本是Fh型,与GcnBank中肝片形吸虫瑞士样本（登录号:MK321602）完全同源;NN17-11、NN20-9和NN20-14等三个样本携带巨片形吸虫和肝片形吸虫的双重序列特征,属于Fg/Fh杂合型,序列图谱上特定变异位点出现双峰,个体间双峰比值存在差异,NN17-11 为 Fg:Fh=1:1,NN20-9 和 NN20-14 为 Fg:Fh=1:5;其余147个样本是Fg型,可细分为19个亚型,其中NN4-1等100个样本与GenBank中巨片形吸虫越南样本（登录号:MN970009）完全同源,其余样品中共出现14个变异位点,多为双峰。线粒体基因NAD Ⅰ序列扩增产物长约535bp,有34个变异位点,细分为28种单倍型;COX Ⅰ序列扩增产物长约438bp,有22个变异位点,细分为21种单倍型,所有样本的NAD Ⅰ和COX Ⅰ均属于巨片形吸虫类群。pepck电泳结果显示NN17-11、NN20-2、NN20-9和NN20-14等4个样本出现巨片形吸虫和肝片形吸虫的双重条带,其它样本只有巨片形吸虫的单一条带。虫卵的ITS+序列检测结果显示,ITS-Fh型片形吸虫NN20-2成虫有1个虫卵（1/30）转变为Fg/Fh型;巨片形吸虫NN20-3成虫有5个虫卵（5/30）呈现Fg/Fh型,其余虫卵与母体基本一致。结论:广西南宁的片形吸虫种群以纯种巨片形吸虫为主,同时存在少量的杂合型片形吸虫;结合多个遗传标记进行分析,能够更加准确可靠地鉴定南宁片形吸虫虫种。二、快速诊断华支睾吸虫病的胶体金免疫层析试条研制与效果评价目的:研制特异性抗原Cs4快速诊断华支睾吸虫病的胶体金免疫层析试条,其次结合G蛋白与抗原同时双标金的方法进行改良,评价并比较两种试条的检测效果。方法:构让pET28b-Cs4重组表达载体,IPTG诱导Cs4重组蛋白（rCs4）的表达,使用组氨酸标签亲和纯化柱纯化rCs4;分别将SPA与rCs4包被在硝酸纤维素膜的合适位置,作为质控线和检测线,G蛋白单标记胶体金、G蛋白和Cs4抗原同时双标记胶体金分别作为检测探针,制备检测抗rCs4特异性抗体的单标金和双标金免疫层析试条。两种试条同时险测华支睾吸虫病（42份）、囊虫病（18份）、裂头蚴病（10份）、卫氏并殖吸虫病（17份）、日本血吸虫病（10份）和片形吸虫病（13份）患者以及健康者（42份）的血清,评价和比较两者的诊断价值。结果:单标金试条的敏感性为97.6%（41/42）,特异性为93.6%（103/110）,总符合率为94.7%（144/152）,双标金试条的敏感性为90.5%（38/42）,特异性为88.2%（97/110）,总符合率为88.8%（135/152）,两种试条的敏感性（P>0.25）、特异性（P>0.10）和总符合率（P>0.05）之间的差异均无统计学意义,但双标金试条的交叉反应略高。此外,用6μl血清即可检测,10-15min内观察试条的检测结果。结论:用Cs4抗原研制的胶体金免疫层析试条可以快速诊断华支睾吸虫病,且具有较高的诊断价值。
马晓晓[7]（2021）在《华支睾吸虫病诊断抗原的筛选与间接ELISA方法的建立》文中研究说明华支睾吸虫（Clonorchis sinensis）是一种重要的人兽共患病原,寄生在人及多种动物的肝胆管和胆囊中引起华支睾吸虫病。全球有超过2亿人存在感染华支睾吸虫的风险,而仅中国的感染人数就达1 300万之多,其中又以广东、广西和黑龙江尤为严重,对华支睾吸虫病的防控刻不容缓。粪便中检出虫卵是诊断华支睾吸虫病的金标准,但该方法敏感性低,容易漏诊,且无法进行早期诊断,临床亟需建立高效、准确的方法用于华支睾吸虫病的早期诊断。本研究利用蛋白质组学将华支睾吸虫排泄分泌抗原与不同宿主的血清互作,以期筛选出具有诊断潜力的抗原,初步建立间接ELISA诊断方法,为华支睾吸虫病诊断试剂盒的研发奠定基础。本研究主要包括三部分。（1）华支睾吸虫排泄分泌抗原（Excretory secretory products,ESPs）的制备及诊断抗原的筛选。体外培养华支睾吸虫,收集ESPs,分别与兔7 d、14 d、35 d、77 d的华支睾吸虫阳性血清、兔肝片吸虫阳性血清、兔日本血吸虫阳性血清、兔阴性血清进行免疫共沉淀联合液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）分析。ESPs中共获得了334个非冗余蛋白,通过同源比较及Uniport鉴定,在华支睾吸虫蛋白库中获得注释的有254种。将阳性血清与阴性血清结果进行第一轮差异筛选,以剔除阴性血清的成分,分别鉴定出32、18、39、35种与兔7 d、14 d、35 d、77 d阳性血清结合的差异蛋白。在一轮筛选的基础上,进行第二轮不同物种间阳性血清差异筛选,以筛除日本血吸虫及肝片吸虫的非特异性抗原,其中存在于兔7 d、14 d、35 d、77 d的特异蛋白分别有13、9、16、15种,四个时期都存在的差异蛋白有3种。（2）目的蛋白的克隆、表达及反应原性分析。结合蛋白相对表达量及生物信息学分析,初步筛选出6种具有潜在诊断价值的蛋白,分别为Dynein light chain-1（D1）、Dynein light chain-2（D2）、Myoferlin（MY）、Acetylornithine deacetylase（AD）、Phosphomethylpyrimidine synthase（PS）和Calcium-binding protein（Ca）,其中D1、D2、MY存在于华支睾吸虫生长发育的各个时期。经RT-PCR得到华支睾吸虫c DNA,设计引物分别扩增7种蛋白（选取Myoferlin抗原表位丰富位置将其截短为MY1、MY2两部分）序列,经双酶切后连接至p ET-32a载体,构建重组质粒。转化进BL21感受态细胞内,诱导表达后SDS-PAGE鉴定,其中D1、D2、Ca、PS为可溶性表达,其余为包涵体形式表达。Western Blot显示七种蛋白均与兔华支睾吸虫阳性血清反应,而不与阴性血清反应,均表现出良好的反应原性。（3）华支睾吸虫病间接ELISA诊断方法的建立与初步应用。对七种蛋白的诊断效果进行初步筛选,由P/N值得出CSD2蛋白最为适合用于间接ELISA方法的建立。同时对ELISA反应条件进行优化:最佳包被液为磷酸盐缓冲液、抗原最佳包被浓度为5μg/m L,最佳显色条件为37℃恒温显色20 min,一抗及二抗最佳稀释倍数分别为1:200及1:40 000。建立的ELISA方法不与东毕吸虫、日本血吸虫、肝片吸虫和大片吸虫的阳性血清发生交叉反应,表现出良好的特异性。最早能够识别人工感染7 d的华支睾吸虫阳性血清,可应用于早期诊断。本研究利用蛋白质组学在华支睾吸虫ESPs中鉴定出254个与宿主血清互作的已知蛋白,建立了可用于诊断抗原筛选的蛋白库。经生物信息学分析后,筛选出6种具备诊断候选潜力的抗原,并成功地对其进行表达及纯化,其中CSD2蛋白抗原表位丰富,具有良好的特异性和敏感性,具备成为华支睾吸虫病诊断抗原的潜力。以CSD2为诊断抗原建立的华支睾吸虫病间接ELISA诊断方法,与传统虫卵检测相比,检出率更高,为华支睾吸虫病临床诊断试剂盒的研发奠定了基础。
刘少雄[8]（2021）在《绵羊肝片吸虫感染间接ELISA及胶体金检测方法的建立及初步应用》文中进行了进一步梳理肝片吸虫是一种重要的人畜共患寄生虫,对畜牧业,尤其是养羊业,会造成重大的经济损失。肝片吸虫感染人后可导致贫血和黄疸等症状,对人类的健康造成严重的威胁。肝片吸虫的检测是防治该病的前提和重点,目前用于检测肝片吸虫感染的方法主要有病原学检测方法、分子生物学检测方法和免疫学检测方法等。其中免疫学检测方法作为常用的方法之一,因其具有稳定性好、敏感性高和特异性强等优点而被广泛使用。其原理为抗原与抗体可发生特异性结合,故可用已知抗原（或抗体）检测未知抗体（或抗原）,以达到检测的目的。目前虽然已经有了用于检测肝片吸虫的特异性基因,如半胱氨酸蛋白酶、组织蛋白酶L和谷胱甘肽S转移酶等,但相对来说用于检测的候选基因仍较少。本研究通过对肝片吸虫成虫c DNA表达文库的筛选,继续发掘新的肝片吸虫候选检测抗原基因,然后以该基因抗原建立间接ELISA和胶体金检测方法,对绵羊肝片吸虫感染的临床样品进行初步应用来评价所筛选抗原的检测实用价值,以期为检测肝片吸虫感染提供新的候选抗原和技术支撑。肝片吸虫候选检测抗原基因筛选及表达纯化利用绵羊肝片吸虫自然感染的阳性血清从肝片吸虫成虫c DNA表达文库筛选具有检测潜力的抗原基因。结果成功获取了肝片吸虫候选检测抗原基因12个,其中,2个为已报道的检测抗原基因,10个为新发现的可用于肝片吸虫感染检测研究的候选抗原基因。本研究选取新发现基因中的肝片吸虫变形虫样蛋白（Fasciola hepatica amoebapore-like protein,Gen Bank:AYA57790.1,以下简称FHA5蛋白）基因进行原核表达,并纯化获得重组肝片吸虫变形虫样蛋白。肝片吸虫感染间接ELISA检测方法的建立及初步应用以肝片吸虫FHA5蛋白为检测抗原,建立肝片吸虫感染间接ELISA检测方法。经条件优化,该方法抗原最佳包被量为0.187μg/孔;样品最佳稀释倍数为800倍;最佳封闭剂选择5%脱脂奶粉;HRP标记兔抗羊二抗最佳稀释浓度为1:5000;底物最佳反应时间为20 min。该方法敏感性可达到1:12800,经检测与绵羊双腔吸虫阳性血清无交叉反应,该方法表现出较高的特异性。分别用粪便检查法和本研究建立的ELISA方法对吉林省某地区的36例绵羊粪便和血清进行检测,结果发现粪便检查法检出的阳性样品为24份,阳性率为66.7%（24/36）;ELISA方法检出的阳性样品为26份,阳性率为72.2%（26/36）,两种检测方法的符合率为92%,间接ELISA方法的检出率更高,说明该方法具有更高的敏感性。随后应用该方法和商品化试剂盒分别检测黑龙江省某地区临床绵羊血清样品80份,结果发现这两种方法检出的阳性样品均为39份,阳性率均为48.7%（39/80）。本研究建立的间接ELISA方法和商品化试剂盒的检测结果一致,说明本方法所用的肝片吸虫FHA5蛋白具有成为检测抗原的潜力。肝片吸虫感染胶体金层析试纸条检测方法的建立及初步应用以肝片吸虫FHA5蛋白作为抗原,建立胶体金层析试纸条检测方法。经条件优化,最佳p H值为加入2μL 0.2 mol/L K2CO3时的p H值;SPA蛋白最佳标记量为6μg;检测线（T）最佳包被浓度为0.5 mg/m L;质控线（C）最佳包被浓度为0.25 mg/m L;该方法敏感性可达到1:160;经检测与绵羊双腔吸虫阳性血清无交叉反应,说明制备的胶体金试纸条具有较高的敏感性和特异性;经重复性试验和保存期试验发现,该试纸条在4℃、室温和37℃条件下的保存期分别为90、60和60天,表明该方法重复性和稳定性较好。应用建立的肝片吸虫感染胶体金层析试纸条检测方法对黑龙江省某地区80份临床绵羊血清样品进行检测,发现肝片吸虫感染阳性样品39份,感染阳性率为48.7%（39/80）。胶体金层析试纸条对80份临床样品的检测结果均与本研究建立的间接ELISA方法的结果相符,说明本研究建立的肝片吸虫感染胶体金层析试纸条同样具有较高的敏感性和稳定性,适用于现场使用。综上所述,本研究通过筛选肝片吸虫成虫c DNA表达文库,获得候选检测抗原基因变形虫样蛋白FHA5基因,以该抗原建立的用于检测绵羊肝片吸虫感染的间接ELISA检测方法和胶体金层析试纸条检测方法在初步检测临床样品时表现出较好的特异性和较高的敏感性,为我国肝片吸虫感染的检测和防控提供了一种新的候选检测抗原。
李亚兰[9]（2020）在《旋毛虫半胱氨酸蛋白酶ATG4B的表达与鉴定及其在侵入宿主肠粘膜过程中作用的研究》文中认为旋毛形线虫（Trichinella spiralis）是一种细胞内寄生性线虫。由旋毛虫感染引起的旋毛虫病是对经济和公共卫生危害严重的一种食源性人兽共患寄生虫病。人体旋毛虫病主要因生食或半生食含旋毛虫肌幼虫囊包的肉类。旋毛虫幼虫没有口器、刺突和板齿等器官侵入宿主,旋毛虫侵入宿主、在体内迁移的机制并不明确。研究认为旋毛虫肌幼虫侵入小肠粘膜不仅有机械力穿透作用,旋毛虫分泌的蛋白酶类对肠粘膜上皮细胞的损伤,在肌幼虫侵入小肠粘膜的过程中亦发挥着关键作用。半胱氨酸蛋白酶是一类重要的分布于多种生物体内的蛋白水解酶,不但具有蛋白水解及代谢的基本功能,还在寄生虫脱包囊/包囊形成、侵入宿主粘膜屏障、免疫逃避等过程中发挥着重要作用。本研究中,旋毛虫半胱氨酸蛋白酶ATG4B（TsATG4B,Genbank:XM＿003371464）属于半胱氨酸蛋白酶CA分支,C54蛋白酶家族,是旋毛虫早期感染血清识别成虫可溶蛋白,并通过质谱分析鉴定出的一种半胱氨酸蛋白酶。本研究构建重组质粒并进行原核系统表达,通过重组TsATG4B蛋白（rTsATG4B）的免疫原性分析、酶活性分析和生物学功能特性研究,对其在旋毛虫感染中的免疫保护作用及其在旋毛虫侵入宿主肠粘膜过程中的作用等进行系列研究。期望进一步明确旋毛虫侵入宿主肠粘膜组织的机制,并为新型疫苗的发展和寻求新的旋毛虫病治疗药物靶点做基础研究工作。材料与方法1.实验动物,旋毛虫虫种保种和收集,血清、细胞培养,质粒及菌株实验动物BALB/c小鼠和昆明小鼠均购自河南省实验动物中心,旋毛虫ISS534株最初是从中国河南省南阳地区家猪中分离的旋毛虫T1株,昆明雌性小鼠保种并传代。实验血清包括感染小鼠血清、免疫小鼠血清和正常小鼠血清。原核表达载体为p QE80L,克隆菌、表达菌分别为DH5α、BL21大肠杆菌菌株。小鼠小肠上皮细胞（IECs）来自本课题组前期分离BALB/c胎鼠小肠并保存,小鼠成肌细胞（C2C12）、人类结肠癌细胞（HT29）为本实验室保存。2.TsATG4B的生物信息学分析、克隆与表达利用NCBI、Ex Pasy、Signal P4.1 server、EMBI、TMHMM Server v.2.0等网站,在线对TsATG4B蛋白理化性质、结构域、信号肽、跨膜结构域等进行生物信息学分析及预测。SWISS-MODEL在线建模并预测TsATG4B分子空间结构;利用MEGA 7.0软件采用最大简约法构建系统进化树。构建重组质粒TsATG4B-sig-p QE80L/BL21进行大肠杆菌原核表达系统表达并进一步纯化,将纯化的rTsATG4B蛋白免疫BALB/c小鼠获得免疫小鼠血清,并用ELISA法检测免疫血清滴度及其引起的免疫应答类型。3.rTsATG4B蛋白的酶活性鉴定及其与IECs细胞的作用应用稀释法复性rTsATG4B蛋白并超滤浓缩,SDS-PAGE鉴定后,明胶酶谱法检测rTsATG4B活性及特异性抑制剂E-64对rTsATG4B活性的抑制作用。Cytation 5 imaging reader（Bio Tek）检测rTsATG4B断裂底物Ac-KKCha G-AFC后,在Ex/Em=380/500 nm时荧光值变化,进行酶动力学分析,并分别检测抑制剂E-64对rTsATG4B活性的影响及最适p H值、最适温度。Far-Western blot,ELISA,IFA检测rTsATG4B与IECs蛋白的相互作用。rTsATG4B与IECs共孵育后,对照木瓜蛋白酶与PBS观察对IECs细胞单层的损伤作用;多重细胞免疫荧光检测rTsATG4B对HT29细胞形态及细胞间连接蛋白E-cadiherin、Occludin、Claudin-1的作用及改变。应用抗rTsATG4B血清通过组织免疫荧光实验分别检测感染旋毛虫2 h、6 h、8 h、12 h小鼠小肠粘膜组织的损伤及改变。通过细胞免疫荧光及流式细胞术检测rTsATG4B对IECs的凋亡作用。4.TsATG4B的表达、定位及其在旋毛虫侵入宿主肠粘膜过程中的作用Western blot分析rTsATG4B蛋白抗原性和免疫原性,应用Real time-PCR观察TsATG4B基因在旋毛虫不同发育期的转录水平;应用间接免疫荧光实验（IFT）分析TsATG4B蛋白在旋毛虫的表达及其在虫体组织的定位。应用旋毛虫体外侵入IECs实验模型,观察rTsATG4B、抗rTsATG4B血清及特异性抑制剂E-64对旋毛虫肠道感染性幼虫侵入IECs的影响。5.rTsATG4B对旋毛虫感染的免疫保护作用将4-6周龄BALB/c雌鼠60只随机分为3组（每组20只）:rTsATG4B蛋白免疫组、弗氏佐剂对照组和PBS组。rTsATG4B蛋白组,每只小鼠20μg rTsATG4B蛋白每隔2周皮下免疫1次,共免疫3次。ELISA法检测Ig G、Ig G1、Ig G2a抗体水平。末次免疫后2周,每只小鼠攻击感染旋毛虫肌幼虫300条,分别于攻虫后6 d和35 d每组各剖杀10只小鼠,收集肠道成虫和肌幼虫,计算成虫减虫率和肌幼虫减虫率,评价rTsATG4B对旋毛虫感染的免疫保护作用。6.统计学分析使用IBM SPSS Statistics 25.0（美国IBM公司）对数据进行统计分析。TsATG4B基因在ML、IIL、3 d AW、6 d AW和NBL中的相对表达数据以均数±标准差（Mean±SD）显示,采用单因素方差分析比较各组之间的差异。使用卡方检验分析不同浓度（0-15μg/m L）的rTsATG4B和不同血清稀释度时侵入IECs细胞单层百分比的差异。统计学显着性定义为P<0.05。结果1.TsATG4B的生物信息学分析,克隆、表达TsATG4B基因ORF为基因序列全长,总长1245 bp,编码414个氨基酸,其中包括1个Peptidase＿C54保守结构域;TsATG4B蛋白分子量为46.94 k Da,p I为5.79;预测为非分泌性蛋白质,无跨膜结构域;基因全长由金唯智公司合成,建重组质粒TsATG4B-sig-p QE80L/BL21进行原核表达系统诱导表达蛋白,rTsATG4B存在于包涵体沉淀。SDS-PAGE结果表明,rTsATG4B蛋白纯化理想,分子量为43 k Da,与推算TsATG4B蛋白分子量大小一致。2.rTsATG4B蛋白复性及酶活性鉴定明胶酶谱显示rTsATG4B复性后能水解明胶基质,水解作用能被半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64抑制。合成荧光肽段底物Ac-KKCha G-AFC,应用Cytation 5imaging reader（Bio Tek）进行酶动力学分析,rTsATG4B最适反应温度与最适p H值分别为37℃和p H=5.5。依据米氏方程得出rTsATG4B对Ac-KKCha G-AFC的动力学参数Vmax=2.391 n M/min,Km=60.06 n M/min。rTsATG4B在37℃,p H=5.5,能够水解羊免疫球蛋白、人免疫球蛋白、鼠尾I型胶原蛋白及小鼠血红蛋白,随rTsATG4B浓度的升高,底物被水解更彻底。3.rTsATG4B蛋白的鉴定及其在旋毛虫侵入宿主肠粘膜上皮细胞过程中的作用Real time-PCR结果表明,TsATG4B基因在旋毛虫不同发育阶段均有转录,其中6天成虫期转录水平最高（F=98.144,P<0.01）。Western blot分析发现rTsATG4B可被旋毛虫感染小鼠血清、抗rTsATG4B小鼠血清识别。rTsATG4B免疫小鼠血清可识别不同发育期旋毛虫及肌幼虫ES中TsATG4B,说明rTsATG4B具有良好的免疫原性且为分泌性蛋白。IFT结果表明,TsATG4B在虫体定位于表皮,杆状体及胚胎周围。旋毛虫肠道感染性幼虫体外侵入IECs实验结果显示:rTsATG4B对旋毛虫感染性幼虫侵入IECs单层有明显的促进作用,该促进作用与rTsATG4B具有剂量依赖关系（r=0.97,P<0.01）,随rTsATG4B剂量的增加而呈现出上升趋势（F=52.623,P<0.01）。E-64能抑制rTsATG4B促进侵入的作用。与正常血清组相比,抗rTsATG4B血清和感染血清对侵袭具有抑制作用（χ2=112.418,P<0.01）。抗rTsATG4B血清的抑制作用随着稀释度的增加呈下降趋势,并且与抗rTsATG4B血清呈剂量依赖关系（r=0.96,P<0.01）。4.rTsATG4B对IECs的特异性结合及损伤作用Far-Western blot及ELISA检测结果显示,rTsATG4B与IECs具有特异性结合作用。细胞及组织间接免疫荧光实验表明,rTsATG4B可与IECs及小鼠小肠粘膜组织特异性结合,与C2C12细胞和小鼠肝组织无特异性结合。激光共聚焦显示结合部位为IEC胞质和胞膜。rTsATG4B对IECs细胞单层具有损伤作用,其损伤作用能被E-64抑制。多重细胞免疫荧光标记HT29细胞间连接蛋白E-cadiherin、Occludin、Claudin-1结果显示,rTsATG4B损伤HT29单层细胞并破坏细胞间连接蛋白。组织免疫荧光（抗rTsATG4B血清1:100）检测感染旋毛虫2 h、6 h、8 h、12 h小鼠小肠粘膜揭示,TsATG4B蛋白参与旋毛虫侵入小鼠小肠粘膜并引起肠粘膜损伤的病理改变,TsATG4B是旋毛虫侵入宿主肠粘膜的一种重要蛋白酶。应用Annexin V-FITC抗体及ANNEXIN V-FITC/PI凋亡检测试剂盒通过荧光显微镜及流式细胞仪检测rTsATG4B具有促发IECs凋亡损伤的作用。5.rTsATG4B对旋毛虫感染的免疫保护作用将rTsATG4B免疫4-6周龄BALB/c雌鼠3次后ELISA检测小鼠抗rTsATG4B抗体滴度为1:105,分析抗rTsATG4B血清Ig G亚型,Ig G1抗体水平显着高于Ig G2a抗体水平,表明rTsATG4B免疫小鼠后引起Ig G1升高为主型免疫反应。将300条旋毛虫幼虫攻击感染免疫小鼠后6 d与35 d,肠道6 d成虫和肌幼虫减虫率分别为53.7%和53.8%,表明rTsATG4B免疫小鼠对旋毛虫感染具有一定免疫保护作用。结论:1.rTsATG4B蛋白具有良好的免疫原性,具有半胱氨酸蛋白酶水解功能,诱导了Ig G1升高为主型免疫反应,对旋毛虫感染具有较好的免疫保护作用;2.TsATG4B可破坏细胞间连接蛋白,损伤IECs细胞单层,并诱导细胞凋亡,促进旋毛虫侵入宿主小肠粘膜上皮细胞;TsATG4B是参与旋毛虫侵入小鼠小肠粘膜组织过程中的一种重要蛋白酶。
吴丽佳[10]（2020）在《肝片形吸虫不同发育阶段虫体的蛋白质组学比较分析及胶体金试纸条研制》文中提出肝片形吸虫（Fasciola hepatica）主要寄生于牛、羊等反刍动物的肝脏和肝胆管内,引起的一种吸虫病称为肝片形吸虫病,肝片形吸虫病是一种人畜共患寄生虫病,该病在全球内广泛流行,每年因片形吸虫感染造成的经济损失超过30亿美元[1]。所以早期诊断变得尤为重要。本研究对肝片形吸虫囊蚴、童虫、幼虫和成虫四个主要发育阶段运用Label-free定量蛋白质组学进行分析,四个时期共鉴定到107501条肽段,2406个蛋白。采用Max Quant软件对蛋白质组学数据进行非标记定量计算,对定量结果进行显着性差异分析,发现囊蚴与其他三个时期虫体之间存在的差异蛋白数量显着低于其他三组之间存在的差异蛋白数,且童虫与成虫之间的差异蛋白数量最多。经过韦恩图、火山图和聚类分析图分析得到的结果与Label free算法的结果相符。对差异蛋白进行GO和KEGG分析,GO结果显示在生物学进程中参与蛋白质折叠过程的蛋白质最多;在细胞组分中,富集于细胞的蛋白质最多;在分子功能中,蛋白质主要参与蛋白结合功能。KEGG结果显示差异蛋白主要参与新陈代谢、遗传信息处理、环境信息处理、细胞过程、组织系统和其他这六个方面。经过对差异蛋白数据的筛选分析,将差异蛋白分为有明显趋势的50组,其中42、49、48、12、45、47组蛋白趋势较好,Profile42组主要为钙结合蛋白、硫氧还蛋白-谷胱甘肽还原酶、硫氧还蛋白过氧化物酶、谷胱甘肽转移酶和甘油-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）。Profile 49组主要为热休克蛋白90、热休克蛋白70、肌动蛋白。Profile 48组Ca2+不敏感的EF hand、醛脱氢酶家族蛋白。Profile 12组为Ras家族蛋白、钙调素样蛋白1、肌动蛋白、钙调素样蛋白3。Profile 45为分泌组织蛋白酶L1、脂肪酸结合蛋白III、蛋白质二硫化物异构酶、钙网蛋白家族蛋白、肌球蛋白尾。Profile 47组为肌球蛋白、原肌球调节蛋白、肌球蛋白调节轻链。我选取了Profile 42组的谷胱甘肽转移酶和Profile 45组的脂肪酸结合蛋白III,作为早期诊断抗原,其中谷胱甘肽转移酶为本实验室研制并保存。脂肪酸结合蛋白III经Uni Prot查询基因序列,成功构建原核表达载体PET-30a-FhFABⅢ,片段大小399bp,蛋白大小为16k Da,经Western bloting检测,肝片形吸虫抗体能够特异性识别重组表达蛋白,用重组Fh GST和FhFABⅢ蛋白纯化后作为诊断抗原,建立间接ELISA方法并优化其条件,检测结果显示FhFABⅢ重组抗原包被浓度每孔为9.275ng;血清稀释度为1:12800;FhFABⅢ重组抗原最佳孵育时间为4℃包被过夜;最佳封闭液选5%脱脂乳;最佳二抗孵育时间为60min;最佳底物作用时间为15 min。Fh GST重组抗原包被浓度为每孔为37.5ng;血清稀释度为1:12800;Fh GST重组抗原最佳孵育时间为37℃2h包被;最佳封闭液选10%脱脂乳,最佳二抗孵育时间为30min,最佳底物作用时间为15 min。在敏感性试验中,FhFABⅢ和Fh GST最早检出肝片形吸虫感染天数均为21d;在特异性实验中,肝片形吸虫FhFABⅢ和Fh GST重组抗原与华枝睾吸虫、日本血吸虫和捻转血矛线虫均无交叉反应;对不同生产批号的酶标板进行板间和板内的重复性实验,两种重复性实验结果显示变异系数均小于10%。临床检测样本95份,结果显示FhFABⅢ的阳性检出率为16.84%（16/95）,Fh GST的阳性检出率为12.63%（12/95）。用纯化好的FhFABⅢ和Fh GST重组蛋白免疫新西兰大白兔（1mg/kg）,每间隔两周免疫一次,当抗体效价达到105以上,便可心脏采血,采用Protrin A亲和层析法纯化多抗。采用柠檬酸三钠还原法制备了20nm大小的胶体金颗粒用来标记纯化后的兔多抗。FhFABⅢ最佳多抗标记量为5.07μg/m L,最适p H值为7.5;Fh GST最佳多抗标记量为10.15μg/m L,最适p H值为8.0。差速低温纯化金标抗体,FhFABⅢ多抗标记纯化后的胶体金颗粒作1:1稀释,Fh GST兔多抗标记纯化后的胶体金颗粒作1:4稀释,分别浸泡玻璃纤维。用FhFABⅢ和Fh GST抗原在硝酸纤维素膜上划检测线（T线）,最适划线浓度均为0.8mg/m L。对两种试纸条分别进行了敏感性、重复性、特异性实验。结果显示:两种胶体金试纸条检出最早感染肝片形吸虫的时间均为21d;FhFABⅢ检测最低稀释倍数为1:60,Fh GST检测最低稀释倍数为1:80;不同批次试纸条重复检测,结果无明显差异;两种试纸条均不与华枝睾吸虫、捻转血矛线虫和日本血吸虫发生反应,表明两种试纸条的敏感性、重复性和特异性良好。两种试纸条检测临床样本95份,Fh GST试纸条检测出11份阳性血清,阳性率为11.58%（11/95）,与ELISA方法的符合率为91.67%,FhFABⅢ试纸条检测出14份阳性血清,阳性率为14.71%（14/95）,与ELISA方法的符合率为87.5%。该结果表明,制备的基于FhFABⅢ和Fh GST蛋白多克隆抗体的胶体金免疫层析试纸条能够初步检测临床样本,可用于肝片形吸虫的诊断。
二、肝片吸虫虫体抗原氨基酸成分分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、肝片吸虫虫体抗原氨基酸成分分析（论文提纲范文）
（1）肝片吸虫天冬酰胺内肽酶的分子特征、遗传进化及抗原特性研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株、质粒及试剂 |
| 1.2 引物设计与合成 |
| 1.3 Fh Legumain基因的扩增、克隆及测序 |
| 1.4 Fh Legumain基因及其编码蛋白的分子特征分析 |
| 1.5 Fh Legumain基因的遗传进化分析 |
| 1.6 Fh Legumain基因的表达与鉴定 |
| 1.7 Fh Legumain蛋白的抗原特性分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 Fh Legumain基因的RT-PCR扩增及双酶切鉴定 |
| 2.2 Fh Legumain基因测序结果及分子特征分析 |
| 2.3 Fh Legumain基因的同源性与遗传进化分析 |
| 2.4 重组表达载体的鉴定 |
| 2.5 Fh Legumain重组蛋白的诱导表达与纯化 |
| 2.6 重组蛋白的反应原性与免疫原性分析 |
| 3 讨 论 |
| 4 结 论 |
（2）捻转血矛线虫蛋白N-糖基化修饰的特征及其对免疫保护作用的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 捻转血矛线虫概述 |
| 1.1.1 捻转血矛线虫的简介 |
| 1.1.2 捻转血矛线虫生活史及各阶段的基因组学 |
| 1.1.3 捻转血矛线虫耐药性问题 |
| 1.2 捻转血矛线虫疫苗的研究现状 |
| 1.2.1 捻转血矛线虫候选疫苗的简介 |
| 1.2.2 捻转血矛线虫H11抗原 |
| 1.2.3 捻转血矛线虫H-gal-GP抗原 |
| 1.2.4 捻转血矛线虫商业化疫苗的局限性 |
| 1.2.5 重组亚单位疫苗研发面临的挑战 |
| 1.3 寄生虫糖复合物疫苗的研发前景 |
| 1.4 线虫蛋白质N-糖基化修饰的生物合成及免疫功能 |
| 1.4.1 蛋白质N-糖基化修饰的简介 |
| 1.4.2 线虫蛋白质N-糖基化修饰的生物合成 |
| 1.4.3 捻转血矛线虫蛋白质N-糖基化修饰的研究 |
| 1.4.4 其他线虫物种蛋白N-糖基化修饰的研究 |
| 1.4.5 寄生虫蛋白N-糖基化修饰与宿主的免疫调节 |
| 1.5 研究目的及意义 |
| 第二章 捻转血矛线虫蛋白N-糖基化修饰的结构特征 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 寄生虫样品 |
| 2.2.2 主要生物试剂 |
| 2.2.3 主要仪器设备 |
| 2.2.4 主要溶液配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 虫体总蛋白提取 |
| 2.3.2 胰蛋白酶酶解 |
| 2.3.3 糖肽富集 |
| 2.3.4 N-聚糖样品的制备 |
| 2.3.5 MALDI-ToF和MALDI-ToF/ToF分析 |
| 2.3.6 凝集素组织化学染色 |
| 2.3.7 糖肽样品去糖基化 |
| 2.3.8 LC-MS/MS分析 |
| 2.3.9 数据库分析 |
| 2.3.10 生物信息学方法 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 捻转血矛线虫N-糖组和N-糖蛋白质组分析流程 |
| 2.4.2 捻转血矛线虫N-聚糖结构解析 |
| 2.4.3 捻转血矛线虫糖复合物的解剖学分布 |
| 2.4.4 N-糖蛋白组和N-糖基化位点的鉴定 |
| 2.4.5 糖蛋白的功能分析和亚细胞定位 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 捻转血矛线虫H11抗原N-糖基化修饰特征及其对免疫保护作用的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 寄生虫样品 |
| 3.2.3 主要生物试剂 |
| 3.2.4 主要仪器设备 |
| 3.2.5 主要溶液配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 H11天然抗原初步萃取 |
| 3.3.2 天然抗原H11提纯 |
| 3.3.3 SDS-PAGE分析 |
| 3.3.4 N-聚糖样品的制备 |
| 3.3.5 MALDI-ToF和MALDI-ToF/ToF分析 |
| 3.3.6 糖肽样品去糖基化 |
| 3.3.7 LC-MS/MS分析和数据库分析 |
| 3.3.8 天然抗原H11蛋白结构和聚糖结构破坏 |
| 3.3.9 免疫动物实验 |
| 3.3.10 血清抗体水平检测 |
| 3.3.11 血清IgG抗体的分离纯化 |
| 3.3.12 Western blot分析 |
| 3.3.13 组织染色 |
| 3.3.14 IgG抗体对四期幼虫孵化率及生长发育的影响 |
| 3.3.15 IgG抗体对成虫肠道氨基肽酶活性的影响 |
| 3.3.16 统计学分析 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 H11抗原的N-糖蛋白和N-糖基化位点鉴定 |
| 3.4.2 H11抗原的N-糖组结构解析 |
| 3.4.3 H11抗原的蛋白质或聚糖结构破坏及免疫动物方案 |
| 3.4.4 H11抗原蛋白质或聚糖结构破坏对免疫保护作用的影响 |
| 3.4.5 实验动物血清抗体水平检测 |
| 3.4.6 H11抗原在寄生虫体内的解剖学分布 |
| 3.4.7 血清IgG抗体对寄生阶段虫体的影响 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 全文总结与展望 |
| 4.1 全文总结 |
| 4.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录一 |
| 附录二 |
| 致谢 |
（3）牛大片形吸虫病免疫学诊断方法的建立与应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 片形吸虫病概述 |
| 1.1.1 片形吸虫的病原特性 |
| 1.1.2 片形吸虫病的流行状况及危害 |
| 1.2 片形吸虫病的诊断 |
| 1.3 片形吸虫诊断抗原研究进展 |
| 1.3.1 虫体可溶性抗原 |
| 1.3.2 被膜抗原 |
| 1.3.3 分泌排泄产物(ESP)抗原 |
| 1.3.4 纯化抗原 |
| 1.3.5 重组抗原 |
| 1.4 片形吸虫病诊断试剂盒的研究 |
| 1.5 片形吸虫病的治疗与防控 |
| 1.6 本课题的研究目的与意义 |
| 第二章 大片形吸虫诊断抗原的制备 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要试剂耗材 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.1.3 主要试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 F22的制备 |
| 2.2.2 F22的质谱分析 |
| 2.2.3 蛋白分子的生物信息学分析 |
| 2.2.4 蛋白分子的原核重组表达 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 F22的制备结果 |
| 2.3.2 F22的质谱结果 |
| 2.3.3 FgSAP-2、FgCatL2、FgLAP生物信息学分析结果 |
| 2.3.4 rFgSAP-2、rFgCatL2、rFgLAP制备结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 F22的制备及质谱鉴定 |
| 2.4.2 FgSAP-2、FgCatL2、FgLAP的生物信息学分析 |
| 2.4.3 FgSAP-2、FgCatL2、FgLAP的原核重组表达 |
| 第三章 牛大片形吸虫病免疫学诊断方法的建立 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 主要试剂 |
| 3.1.2 主要耗材 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.1.4 主要试剂配制 |
| 3.1.5 血清及其他样品来源 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 牛大片形吸虫病间接ELISA诊断方法的建立及效果评价 |
| 3.2.2 牛大片形吸虫病胶体金快速诊断试纸条的研制及效果评价 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 牛大片形吸虫病间接ELISA诊断方法的建立及效果评价 |
| 3.3.2 牛大片形吸虫病胶体金快速诊断试纸条的研制及效果评价 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 牛大片形吸虫病间接ELISA诊断方法的建立及效果评价 |
| 3.4.2 牛大片形吸虫病胶体金快速诊断试纸条的研制及效果评价 |
| 3.4.3 F22作为诊断抗原的牛大片形吸虫病间接ELISA法与胶体金试纸条诊断效果的比较分析 |
| 第四章 牛大片形吸虫病免疫学诊断方法的应用 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 主要试剂 |
| 4.1.2 主要仪器设备 |
| 4.1.3 主要试剂配制 |
| 4.1.4 血清 |
| 4.1.5 实验动物 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 广西部分地区牛大片形吸虫病流行情况调查 |
| 4.2.2 广西壮族自治区A牛场水牛血清的检测 |
| 4.2.3 广西地区牛片形吸虫病用药情况调查及用药试验 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 广西部分地区牛大片形吸虫病流行病学调查 |
| 4.3.2 广西壮族自治区A牛场水牛血清检测 |
| 4.3.3 广西地区针对牛片形吸虫用药情况调查 |
| 4.3.4 用药试验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 广西部分地区牛大片形吸虫病流行情况调查 |
| 4.4.2 广西壮族自治区A牛场水牛血清检测 |
| 4.4.3 广西地区针对牛片形吸虫用药情况调查 |
| 4.4.4 用药试验 |
| 第五章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
| 项目资助 |
（6）食源性吸虫的分子鉴定与快速诊断试条的研制及评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 背景 |
| 第一部分 广西南宁地区片形吸虫的分子鉴定及遗传多态性分析 |
| 前言 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 试剂与仪器 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 DNA提取 |
| 2.3.2 PCR引物的合成 |
| 2.3.3 目的序列的扩增 |
| 2.3.4 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.3.5 DNA序列分析 |
| 2.3.6 单倍型网络图和系统进化树的构建 |
| 3 结果 |
| 3.1 成虫的遗传多态性分析 |
| 3.1.1 PCR结果 |
| 3.1.2 ITS+序列分析 |
| 3.1.3 NAD Ⅰ序列分析 |
| 3.1.4 COX Ⅰ序列分析 |
| 3.1.5 pepck多重PCR分析 |
| 3.1.6 多个分子标记综合分析 |
| 3.2 虫卵ITS+序列分析 |
| 3.3 基于NAD Ⅰ和COXⅠ序列的遗传进化分析 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 快速诊断华支睾吸虫病的胶体金免疫层析试条研制与效果评价 |
| 前言 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 重组蛋白的表达 |
| 2.1.2 试条的研制 |
| 2.1.3 试条的评价 |
| 2.2 试剂与仪器 |
| 2.3. 方法 |
| 2.3.1 质粒的准备 |
| 2.3.2 重组蛋白的表达和纯化 |
| 2.3.3 胶体金免疫层析试条的制备 |
| 2.3.4 试条的使用和判断 |
| 2.3.5 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 重组蛋白的纯化 |
| 3.1.1 纯化试剂盒的选择 |
| 3.2 试条的制备 |
| 3.2.1 纤维素膜的选择 |
| 3.2.2 rCs4浓度的选择 |
| 3.2.3 胶体金的用量 |
| 3.3 试条检测效果的评价 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
| 附录1 |
| 附录2 |
（7）华支睾吸虫病诊断抗原的筛选与间接ELISA方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 华支睾吸虫病 |
| 1.1.1 病原 |
| 1.1.2 流行与防控 |
| 1.2 华支睾吸虫病诊断技术 |
| 1.2.1 病原学检查 |
| 1.2.2 影像学检查 |
| 1.2.3 分子生物学检测 |
| 1.2.4 免疫学诊断 |
| 1.3 华支睾吸虫互作抗原的筛选方法 |
| 1.3.1 免疫共沉淀 |
| 1.3.2 双向凝胶电泳 |
| 1.3.3 质谱分析 |
| 1.3.4 色谱分离技术 |
| 1.4 蠕虫ESPs蛋白质组学研究进展 |
| 1.4.1 吸虫ESPs蛋白质组学研究 |
| 1.4.2 绦虫ESPs蛋白质组学研究 |
| 1.4.3 线虫ESPs蛋白质组学研究 |
| 1.5 研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 虫体的采集 |
| 2.1.2 血清的获取 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 ESPs的制备 |
| 2.2.2 差异蛋白的筛选 |
| 2.2.3 差异蛋白的克隆表达 |
| 2.2.4 间接ELISA方法的建立与初步应用 |
| 2.2.5 间接ELISA效果评价 |
| 3 结果 |
| 3.1 华支睾吸虫的鉴定 |
| 3.1.1 形态学鉴定结果 |
| 3.1.2 分子生物学鉴定结果 |
| 3.2 ESPs的制备 |
| 3.2.1 最佳培养液的筛选 |
| 3.2.2 分泌排泄抗原SDS-PAGE分析 |
| 3.3 差异蛋白的筛选 |
| 3.3.1 免疫共沉淀SDS-PAGE分析 |
| 3.3.2 质谱数据分析 |
| 3.4 差异蛋白克隆表达 |
| 3.4.1 目的基因扩增结果 |
| 3.4.2 生物信息学分析结果 |
| 3.4.3 重组载体质粒构建 |
| 3.4.4 诱导表达鉴定 |
| 3.4.5 蛋白纯化及浓度测定 |
| 3.4.6 蛋白反应原性分析 |
| 3.4.7 诊断抗原的筛选 |
| 3.5 间接ELISA方法的建立及初步应用 |
| 3.5.1 包被液的选择 |
| 3.5.2 蛋白包被浓度的选择 |
| 3.5.3 血清稀释倍数的选择 |
| 3.5.4 二抗稀释倍数选择 |
| 3.5.5 显色时间的优化 |
| 3.5.6 阴阳临界值的判定 |
| 3.6 间接ELISA方法效果评价 |
| 3.6.1 敏感性实验 |
| 3.6.2 特异性实验 |
| 3.6.3 重复性实验 |
| 3.6.4 符合性实验 |
| 3.6.5 不同时期阳性血清的检测 |
| 3.6.6 临床样本的检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 华支睾吸虫体外培养 |
| 4.2 华支睾吸虫ESPs |
| 4.3 华支睾吸虫病的诊断抗原 |
| 4.4 华支睾吸虫病的诊断方法 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（8）绵羊肝片吸虫感染间接ELISA及胶体金检测方法的建立及初步应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一篇 肝片吸虫感染检测方法的研究进展 |
| 1 临床症状和病原学检测 |
| 2 分子生物学检测方法 |
| 3 免疫学检测方法 |
| 4 放射学检测方法 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 绵羊肝片吸虫感染候选检测抗原基因筛选及表达纯化 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 绵羊肝片吸虫感染间接ELISA检测方法的建立与初步应用 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 绵羊肝片吸虫感染胶体金层析试纸条检测方法的建立与初步应用 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介及科研成果 |
| 致谢 |
（9）旋毛虫半胱氨酸蛋白酶ATG4B的表达与鉴定及其在侵入宿主肠粘膜过程中作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 第一部分 TsATG4B的分子生物学鉴定及其对旋毛虫感染的免疫保护作用研究 |
| 1 实验材料与试剂配制 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 旋毛虫虫种、细胞系及实验动物 |
| 1.4 质粒载体、宿主菌株 |
| 1.5 主要试剂的配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 TsATG4B生物信息学分析 |
| 2.2 TsATG4B基因克隆与表达 |
| 3 统计学分析 |
| 4 结果 |
| 4.1 TsATG4B生物信息学分析 |
| 4.2 目的基因的合成及引物设计 |
| 4.3 TsATG4B基因的原核表达 |
| 4.4 重组质粒TsATG4B-sig-pQE80L诱导表达、可溶性分析及纯化 |
| 4.5 rTsATG4B免疫血清抗体滴度检测及抗体亚型分析 |
| 4.6 Western blot分析rTsATG4B及TsATG4B天然蛋白抗原性 |
| 4.7 rTsATG4B的复性与明胶酶谱酶活性分析及鉴定 |
| 4.8 TsATG4B在旋毛虫不同发育阶段的表达 |
| 4.9 rTsATG4B对小鼠感染旋毛虫的免疫保护作用 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第二部分 rTsATG4B的功能分析及其在侵入宿主过程中的作用机制研究 |
| 1 实验材料与试剂配制 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 旋毛虫虫种、细胞系及实验动物 |
| 1.4 主要试剂的配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 rTsATG4B酶活性检测 |
| 2.2 rTsATG4B降解不同蛋白质 |
| 2.3 rTsATG4B的获取,旋毛虫虫体的收集 |
| 2.4 rTsATG4B与 IEC作用的体外实验 |
| 2.5 rTsATG4B对宿主细胞的损伤作用 |
| 2.6 rTsATG4B对 IEC细胞的凋亡作用 |
| 2.7 体外侵入实验 |
| 3 统计学分析 |
| 4 结果 |
| 4.1 rTsATG4B酶活性测定 |
| 4.2 rTsATG4B与 IEC细胞的结合 |
| 4.3 rTsATG4B对 IEC细胞的作用 |
| 4.4 rTsATG4B对 IEC细胞的凋亡作用 |
| 4.5 rTsATG4B蛋白在旋毛虫侵入过程中发挥的作用 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 半胱氨酸蛋白酶在寄生虫中作用的研究 |
| 参考文献 |
| 个人简历、博士期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（10）肝片形吸虫不同发育阶段虫体的蛋白质组学比较分析及胶体金试纸条研制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 引言 |
| 1.1 肝片形吸虫概述 |
| 1.2 蛋白质组学研究进展 |
| 1.2.1 蛋白质组学的概念 |
| 1.2.2 蛋白质组学技术的发展 |
| 1.2.3 蛋白质组学在寄生虫研究中的应用 |
| 1.3 胶体金试纸条研究进展 |
| 1.3.1 免疫胶体金技术原理 |
| 1.3.2 免疫胶体金技术在寄生虫病诊断的应用 |
| 1.4 研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株和载体 |
| 2.1.2 实验动物和血清 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.1.5 主要试剂的配置 |
| 2.1.6 主要应用软件和数据分析 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 样品制备 |
| 2.2.2 SDS-PAGE |
| 2.2.3 蛋白质消化 |
| 2.2.4 LC-MS/MS分析 |
| 2.2.5 蛋白质鉴定与定量分析 |
| 2.2.6 生物信息学和多元性分析 |
| 2.2.7 引物的设计与合成 |
| 2.2.8 肝片形吸虫总RNA的提取 |
| 2.2.9 目的基因反转录 |
| 2.2.10 目的基因克隆 |
| 2.2.11 FhFABⅢ克隆载体的构建 |
| 2.2.12 FhFABⅢ基因原核表达载体的构建 |
| 2.2.13 重组蛋白诱导表达及纯化 |
| 2.2.14 重组蛋白的Western blotting分析 |
| 2.2.15 兔抗FhFABⅢ和 FhGST蛋白多克隆抗体的制备 |
| 2.2.16 亲和层析法纯化多抗 |
| 2.2.17 间接ELISA方法的建立 |
| 2.2.18 重组FhGST和 FhFABⅢ蛋白间接ELISA条件的优化 |
| 2.2.19 间接ELISA临界值的确定 |
| 2.2.20 重复性实验 |
| 2.2.21 敏感性实验 |
| 2.2.22 特异性实验 |
| 2.2.23 临床样本检测 |
| 2.2.24 免疫胶体金颗粒的制备与纯化 |
| 2.2.25 金标抗体的制备及鉴定 |
| 2.2.26 胶体金免疫层析试纸条的制备 |
| 2.2.27 试纸条质量的评估 |
| 3 结果 |
| 3.1 蛋白质组学结果 |
| 3.1.1 蛋白质鉴定结果统计分析 |
| 3.1.2 蛋白质聚类分析 |
| 3.1.3 蛋白主要成分分析 |
| 3.1.4 蛋白质相互作用分析 |
| 3.1.5 生物信息学结果 |
| 3.2 重组蛋白FhFABⅢ构建结果 |
| 3.2.1 肝片形吸虫FhFABⅢ基因的扩增 |
| 3.2.2 重组克隆载体的双酶切鉴定 |
| 3.2.3 重组克隆载体的序列测序结果 |
| 3.2.4 重组表达载体的双酶切鉴定 |
| 3.2.5 重组蛋白表达诱导时间的优化 |
| 3.2.6 重组蛋白表达IPTG诱导浓度优化 |
| 3.2.7 重组蛋白诱导温度的优化 |
| 3.2.8 重组蛋白的纯化结果 |
| 3.2.9 重组蛋白的Western blotting分析 |
| 3.2.10 肝片形吸虫FhGST和 FhFABⅢ多克隆抗体纯化 |
| 3.3 间接ELISE结果 |
| 3.3.1 抗原浓度和血清稀释度优化 |
| 3.3.2 抗原最佳孵育时间的优化 |
| 3.3.3 最佳封闭液的优化 |
| 3.3.4 二抗孵育时间的优化 |
| 3.3.5 显色时间的优化 |
| 3.3.6 临界值确定 |
| 3.3.7 敏感性实验 |
| 3.3.8 特异性实验 |
| 3.3.9 重复性实验 |
| 3.3.10 样本检测 |
| 3.4 试纸条制备结果 |
| 3.4.1 胶体金溶液的制备 |
| 3.4.2 胶体金稳定性 |
| 3.4.3 胶体金标记抗体的制备 |
| 3.4.4 胶体金诊断试纸条优化 |
| 3.4.5 敏感性检测 |
| 3.4.6 试纸条特异性检测 |
| 3.4.7 试纸条重复性检测 |
| 3.4.8 临床样本检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 蛋白质组学数据分析 |
| 4.2 间接ELISA方法检测效果的评估 |
| 4.3 胶体金试纸条检测效果的影响因素分析 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
四、肝片吸虫虫体抗原氨基酸成分分析（论文参考文献）
- [1]肝片吸虫天冬酰胺内肽酶的分子特征、遗传进化及抗原特性研究[J]. 张国武,孟庆玲,乔军,王熙凤,张凯,宁程程,季春辉,才学鹏. 西南农业学报, 2021(10)
- [2]捻转血矛线虫蛋白N-糖基化修饰的特征及其对免疫保护作用的影响[D]. 王春群. 华中农业大学, 2021
- [3]牛大片形吸虫病免疫学诊断方法的建立与应用[D]. 靳纬坤. 广西大学, 2021
- [4]基于TPx、CatB4两种重组蛋白的绵羊肝片吸虫病间接ELISA和胶体金试纸条诊断方法的建立[D]. 魏雅婷. 东北农业大学, 2021
- [5]基于GAPDH、Catl-1两种重组蛋白的绵羊肝片吸虫病间接ELISA和胶体金试纸条诊断方法的建立[D]. 孙益春. 东北农业大学, 2021
- [6]食源性吸虫的分子鉴定与快速诊断试条的研制及评价[D]. 何婷. 中国疾病预防控制中心, 2021
- [7]华支睾吸虫病诊断抗原的筛选与间接ELISA方法的建立[D]. 马晓晓. 黑龙江八一农垦大学, 2021
- [8]绵羊肝片吸虫感染间接ELISA及胶体金检测方法的建立及初步应用[D]. 刘少雄. 吉林大学, 2021
- [9]旋毛虫半胱氨酸蛋白酶ATG4B的表达与鉴定及其在侵入宿主肠粘膜过程中作用的研究[D]. 李亚兰. 郑州大学, 2020(02)
- [10]肝片形吸虫不同发育阶段虫体的蛋白质组学比较分析及胶体金试纸条研制[D]. 吴丽佳. 东北农业大学, 2020(04)