一、MORPHOLOGICAL CHANGES OF CELL JUNCTIONS DURING AMPHIBIAN EMBRYOGENESIS（论文文献综述）
余小珍[1]（2020）在《OCT4通过紧密连接通路影响人毛囊间充质干细胞红系造血的机制研究》文中提出目的:检测细胞形态、大小、粘附性的改变,对不同细胞亚型的转录组进行测序,富集分析差异表达基因的功能,并分析OCT4下游靶基因的表达及功能,揭示人毛囊间充质干细胞（human hair follicle mesenchymal stem cell,hHFMSC）中形态与粘附、多潜能性和造血之间的关联,阐明OCT4重编程的hHFMSC中红细胞生成的可能分子机制,为体外生成红细胞的研究提供新的思路。方法:①在细胞培养过程中收集含有悬浮细胞的上层培养液并离心,以分离贴壁细胞与悬浮细胞,于相差显微镜及荧光显微镜下观察细胞形态。②利用流式细胞术检测细胞前向散射,比较细胞的相对大小;通过细胞分离实验和细胞粘附实验分别检测细胞-细胞、细胞-细胞外基质粘附力的相对大小。③用RNA测序技术分析各组细胞转录本的差异并筛选差异表达基因（differentially expressed gene,DEG）,同时结合文献筛查OCT4下游靶基因的表达情况。④通过GO功能富集及KEGG信号通路富集计算,分析DEG的生物功能,并根据KEGG数据库注释TJ信号通路中的DEG。⑤qPCR和Western blot验证TJ通路基因、细胞骨架基因和造血基因的表达,包括TJPs、CLDNs、JAMs、ACTN2、E-cadherin、和 RUNX1 等。⑥通过 STRING 数据库对TJ通路主要成员基因、多潜能相关基因及造血相关基因之间的相互作用关系进行可视化并构建调控网络图。结果:①OCT4转导hHFMSC后出现悬浮细胞亚群,与贴壁细胞相比形态变圆、体积小、粘附性低。②转录组测序显示两种细胞亚群基因转录本具有显着差异,功能富集分析发现多潜能基因表达上调,悬浮细胞中部分多潜能基因表达相对于贴壁细胞下调,表明OCT4转导使hHFMSC去分化并获得一定的多潜能性,而悬浮细胞的多向分化潜能可能有所降低。③多潜能相关OCT4靶基因表达显着上调,而悬浮细胞中部分造血相关OCT4靶基因表达上调,上调基因显着富集于红系分化相关的生物过程,表明悬浮细胞丢失部分多潜能性,获得一定倾向造血分化的能力。④转导OCT4后下调基因显着富集于细胞连接、紧密连接（tight junction,TJ）通路、粘附和细胞骨架相关信号通路;悬浮细胞中形态、粘附相关基因和TJ通路基因表达下调更为显着。⑤qPCR和Western blot检测TJ通路基因TJPs、CLDNs、JAMs的表达,结果与测序数据一致（除TJP1外）;细胞骨架基因ACTN2和粘附基因E-cadherin在不同细胞亚群中的表达发生动态变化。⑥构建可视化基因调控网络揭示,OCT4重编程的hHFMSC通过TJ通路调节细胞形态和粘附性,其中TJP1通过KLF4、RUNX1影响多潜能的维持及造血分化之间的平衡。结论:OCT4调控hHFMSC中下游多潜能及造血相关靶基因表达,并通过TJ通路影响细胞形态和粘附,从而调控hHFMSC的多潜能性和造血分化之间的平衡。意义:本研究阐明OCT4重编程的hHFMSC通过TJ通路和下游靶基因表达调节红系分化潜能,为hHFMSC作为红细胞生成的新来源,能够在体外获得大量可扩增的造血潜能细胞并用于个体化治疗提供实验基础。
王雪[2]（2019）在《前列腺上皮组织特征维持及分子调控机制的研究》文中进行了进一步梳理目的:前列腺组织主要由两种类型上皮细胞组成,基底和管腔上皮细胞,两者存在一定的相似性,同时又存在多种因素在两者特异的表型方面参与调控及维持。本论文旨在:（1）研究前列腺基底上皮细胞特征是如何维持的?该过程需要哪些调控因子参与?（2）研究管腔上皮细胞特征是如何维持的?前列腺管腔上皮组织的三大属性,细胞间连接、细胞极性和细胞分裂轴定位三者之间存在怎样的相互作用?方法:通过开展一系列体内体外实验考察上皮间质转化（EMT）转录调控因子在前列腺上皮组织中的表达模式及生物学功能,利用高通量单细胞RNA测序分析及体内实验检测Zeb1表达上皮细胞中富集哪些相关信号通路调节因子来维持基底上皮干细胞亚群的干性、EMT特征和基底细胞的正常发育。通过开展一系列体内体外实验考察细胞间连接蛋白E-cadherin在前列腺上皮组织中的表达模式和黏附连接缺陷小鼠的表型。通过转录组测序分析和生化实验研究管腔上皮细胞特征维持的主要因素细胞间黏附连接蛋白E-cadherin,Scribble细胞极性蛋白复合物及LGN分裂纺锤体定位复合物三者之间的相互关系。所有的统计学检验均为双侧检验。结果:（1）上皮间质转化核心转录因子Zeb1仅阳性表达在前列腺基底上皮细胞层,同时表达上皮和间质细胞相关基因,且Zeb1+基底细胞富集分布在前列腺干细胞存在的近尿道区域。（2）Zeb1+基底细胞在前列腺自发肿瘤模型小鼠和人前列腺样本中均有发现,且比例明显增多,甚至出现了Zeb1+管腔细胞。（3）相比Zeb1-基底细胞,Zeb1+基底上皮细胞具有更强的体外连续类器官形成能力和体内连续肾包膜移植能力,既可以自我更新又可以分化产生其他两种不同类型上皮细胞。（4）体内和体外Zeb1表达缺失造成基底上皮细胞数目急剧减少,基底上皮细胞正常发育过程受阻,但对管腔上皮细胞和内分泌细胞发育并未产生明显影响。（5）活化的Wnt信号通路维持了Zeb1+基底上皮细胞的干性及基底细胞层的表型。（6）成年小鼠前列腺上皮组织中E-cadherin蛋白主要表达在管腔上皮细胞之间,而在零散存在的基底上皮细胞中几乎不表达。（7）在前列腺组织发育、去势再生及成熟等不同时期,E-cadherin表达缺失导致各个组织分叶管腔上皮细胞增殖比例显着增加,促进前列腺肿瘤的发生发展,21个月龄的E-cadherin敲除小鼠基底膜破损,基底上皮细胞缺失,肿瘤细胞浸润至微环境。（8）E-cadherin敲除显着增加了管腔上皮细胞分裂纺锤体轴定位异常的比例,分裂中后期纺锤体轴发生较大角度的异常偏转。同时,E-cadherin敲除导致纺锤体轴定位核心蛋白LGN和NuMA,细胞极性蛋白PAR和SCRIBBLE三元复合物,分布弥散,特异膜定位处结合能力显着下降。（9）相比对照组,E-cadherin敲除组中与促进细胞增殖和迁移相关的信号通路存在富集且表达显着上调,与增强细胞间连接相关的基因表达显着下调,且E-cadherin敲除组与TCGA数据库中人前列腺癌样本分子表达谱具有一定的相似性。（10）分子机制方面,管腔上皮细胞黏附连接蛋白E-cadherin、极性蛋白SCRIB和分裂轴定位蛋白LGN三者之间存在内源性的相互作用,且敲低E-cadherin蛋白表达水平,显着减弱SCRIB和LGN两者之间的结合作用,敲低SCRIB蛋白表达水平,显着削弱E-cadherin和LGN两者之间的结合作用。E-cadherin和LGN蛋白两者与SCRIB蛋白的PDZ结构域特异性结合。结论:（1）前列腺基底上皮细胞层发现一小群EMT转录因子Zeb1+细胞,这群细胞既可以自我更新又可以分化产生其他不同类型上皮细胞,同时对基底上皮细胞的正常发育是必不可少的。（2）前列腺管腔上皮细胞间黏附连接、细胞极性、分裂纺锤体轴定位三者之间存在着紧密的相互作用,E-cadherin/SCRIB/LGN三元蛋白复合物的形成维持了管腔上皮细胞的特征,保证其发育分化过程正常进行和有效地预防前列腺肿瘤的发生发展。科学意义:Zeb1+上皮细胞的发现及其生物学功能的探究,为前列腺上皮组织正常发育和细胞可塑性研究奠定了一定的理论基础,为肿瘤来源细胞（肿瘤起始细胞,肿瘤干细胞）研究提供了新的线索。上皮细胞间黏附连接、细胞极性和分裂轴定位三者之间紧密的相互作用维持了正常的前列腺管腔上皮组织结构,对前列腺组织正常发育和肿瘤发生发展有了新的理论认识,对临床治疗和预后具有重要的指导意义。
陈富美[3]（2019）在《基于孤雌生殖研究模型的水牛母源基因组功能及母源因子鉴定的初步研究》文中研究表明水牛（Bubalus bubalis）是南亚重要的经济牲畜种类,具有许多良好的特性,例如耐粗饲,适应性强;乳品质量高,香味浓;生长快,利用年限长;水牛肉瘦肉多,脂肪少;水牛性情温驯,易于管理等。然而,其经济价值受到其低繁殖效率的限制。导致水牛繁殖效率低的因素很多,例如,水牛适合繁殖的年龄晚于黄牛和奶牛;雌性水牛在怀孕期间的黄体酮水平远低于黄牛;雌性水牛的发情特征不明显,且产犊间隔长于黄牛和奶牛;雌性水牛对生殖激素的处理也不敏感。值得注意的是,在实验室条件下,从水牛卵巢收集的适合于IVM（体外成熟）的卵母细胞的数量少于黄牛和奶牛,同时在附植前胚胎发育过程中,水牛的卵裂率和囊胚率低于黄牛,这表明水牛附植前胚胎发育过程中可能存在其特有的调节机制,而在合子基因组激活之前,胚胎的早期发育主要受母源基因组的调控。哺乳动物孤雌生殖是生殖生物学中一个重要的研究课题和研究模型,因为它不需要任何父源因子的参与,这使其成为研究母源基因组的理想模型。母源基因在调节网络中发挥作用,这需要许多基因的参与。因此,全景式地了解这些母源基因组在早期胚胎发育过程中的作用对解析母源蛋白质或基因之间的互作关系是很有必要的。到目前为止,还没有一个以孤雌生殖为研究模型,探索由母源基因组调控表达的蛋白质或基因（没有父源基因组干扰）在附植前胚胎发育过程中的蛋白质水平和转录组水平的动态变化的研究报告。因此,本研究以母源基因组作为研究水牛生殖机制的切入点,将基于串联质量标签（Tandem Mass Tag,TMT）标记的定量蛋白质组学与单细胞/单胚胎的转录组测序技术相结合,研究早期胚胎发育过程中母源基因组的动态功能,为提高我们对母源基因组学调控机制的认识,及改善体细胞核移植技术和孤雌胚胎干细胞技术奠定理论基础。本文的主要研究结果如下:一、水牛卵母细胞孤雌激活前后的定量蛋白质组学研究。对水牛卵母细胞激活前后差异表达的蛋白质进行鉴定,并进行生物信息学分析和数据挖掘,发现了这些重要的差异表达蛋白质最多涉及的是紧密连接和间隙连接等信号通路。使用实时荧光定量PCR反应（RT-PCR）和蛋白质印迹技术验证和分析了 4种参与缝隙连接和紧密连接的差异表达蛋白质（TUBB3,CTNNA1,CDH3,MAP2K1）在转录和翻译水平的表达规律,并且使用细胞免疫荧光对这些蛋白质的迁移和表达规律进行了分析。基于这些结果,推测由母源基因组调控表达的蛋白质在孤雌激活后可能首先在细胞连接的形成中发挥作用。二、水牛孤雌胚胎在附植前发育各个过程的单细胞/单胚胎转录组学研究。结合单细胞转录组测序技术,获得和分析了胚胎发育过程中的八个阶段（GV,MII,2-细胞,4-细胞,8-细胞,16-细胞,桑椹胚,囊胚）的转录组数据,共有3567个基因被鉴定为在附植前发育这些所有连续阶段中差异表达。同时研究还鉴定到了 10,442个新基因,并且通多对这些新基因的GO分析表明它们具有广泛的细胞定位并参与许多分子功能和生物学过程。此外,我们确定了 8个仅在特定发育阶段高度表达的聚类,并富集到了许多与特定阶段相关的GO聚类和KEGG通路。此外,从母源基因组调控表达的基因网络中鉴定到了 1,530个关键基因（hub genes）,这些关键基因参与了 11个阶段特定的模块。使用Cytoscape 3.2.1软件进行可视化作图后,获得了这些关键基因的复杂的互作网络,这些互作关系主要集中在MII期,4细胞,16细胞-1,16细胞-2,桑椹胚-1和囊胚阶段。三、基于蛋白质组学和转录组学的联合分析,对水牛母源表达蛋白质或基因进行了初步的筛选和鉴定。在这部分的研究中,进行了水牛孤雌胚胎的转录组数据的表达聚类和相关性分析,同时结合在蛋白质组数据中鉴定得到的NPM2（核质蛋白质2）和NLRP5（胚胎需要的母体抗原,也称为Mater）在孤雌胚胎各个发育阶段的转录水平上的表达变化规律:即与所有其他阶段相比,在GV期中的这两个基因的mRNA表达量最高,在8-细胞阶段后,表达量显着降低,并且在囊胚期中几乎不表达。此外,分析了NPM2和Nlrp5是否具行组织表达特异性,发现它们仅在卵巢、MI[卵母细胞、2细胞期早期胚胎和颗粒细胞中表达,进一步说明NPM2和NLRP5可能是水牛的母源基因。基于以上结果,推测水牛孤雌生殖中可能也存在一个“母源基因组向合子基因组转变”（MZT）的过程,并且该过程可能发生在8细胞到16细胞阶段之间,这类似于正常的受精胚胎。四、为了分析研究中鉴定得到的孤雌激活后一些关键基因和蛋白质的在不同物种之间（人、小鼠和水牛）是否具有保守性,我们使用Blast软件进行同源性比对,并将在水牛中鉴定得到各阶段差异表达的基因和蛋白质的ID号转换成相应的人和小鼠的ID,并进行生物信息学分析（包括GO和KEGG等）,将我们的结果扩展到小鼠和人类。我们发现,这些蛋白质或基因在不同物种间进行同源BLAST后发现它们显示出较高的序列相似性,这表明在水牛母源基因组的这些发现将对人和小鼠的母源基因组功能的研究有比较好的参考价值。综上所述,本研究通过使用水牛孤雌生殖为研究模型,将高通量的蛋白质组学和转录组学分析的技术体系应用于水牛母源基因组功能的研究,为进一步研究和筛选母源效应基因或蛋白质提供了丰富的数据资源,提高了我们对水牛母源基因组学在附植前胚胎发育过程中的调控机制的认识,为进一步改善体细胞核移植和胚胎干细胞技术奠定了理论基础。同时,本研究的策略和方法也可为其他物种探索母源基因组的功能提供有价值的参考。
李世升[4]（2011）在《烟草顶—基细胞相互作用与顶细胞发育命运的抉择》文中研究说明合子是高等植物双受精产物之一,也是植物孢子体世代的起点。合子经历细胞分裂,分化等生长发育过程,完成胚胎发生并形成成熟胚,成为种子的重要组成部分。植物胚胎发生是一个十分复杂的自然过程,包含一系列精巧有序的发育事件。合子通常进行一次不等分裂形成一系列形态各不相同的两个子细胞。靠近珠孔端的一个称为基细胞,靠近合点端的一个称为顶细胞；顶细胞体积较小,具浓厚的细胞质及丰富的细胞器；基细胞体积较大,具大的液泡。顶细胞与基细胞在形态与组成上的差异是由合子的极性及不等分裂造成的。顶细胞将发育成成熟胚的胚体,而基细胞则经过有限次数的分裂成为胚柄。因而,顶细胞与基细胞的结构和发育命运呈现出明显不同。顶、基细胞都是合子分裂产物,为什么其各自发育命运迥然不同?两细胞的发育命运是什么时候,又是如何被决定的?顶、基细胞间有无相互作用?这些问题迄今没有明确的答案。本实验室通过激光切割技术结合体外细胞微培养技术,试图追踪顶细胞在没有基细胞存在时的发育情况,主要关注顶细胞发育命运及其与基细胞可能的相互作用,希望对顶细胞发育命运决定的大致时期及其与基细胞、胚柄发育的关系有较明确的认识。主要实验结果如下：1.通过手工显微操作及透明观察烟草合子以后各时期的胚胎,明确了从合子到早期球形胚时期这一过程中细胞的分裂模式,这为我们以后的研究工作提供可以参考的依据。综合以上两种观察方法,我们可以确认在烟草中,作为合子不等分裂产物之一的顶细胞先经历一次垂直于顶基轴向的横分裂,紧接着进行两次相互垂直的纵向分裂,形成早期球形胚。对早期胚胎发生过程中的细胞分裂,发育模式等重要特征进行了细致观察,为离体胚胎发生的观察准备了可资比较的模板。2.在烟草中业已经建立的合子离体培养系统的基础上,我们进一步改进了适合二胞原胚离体培养的条件。发现添加亚精胺能更好地促进细胞分裂及离体胚胎发生。借助该条件对二胞原胚进行离体培养,为在离体条件下研究顶、基细胞的互作和顶细胞命运决定机制提供了较好的技术基础。3.通过已在植物中成功应用的激光显微切割技术,收集大量的顶细胞,并对这些顶细胞进行了多种方法检测,结果显示它们是具备旺盛活力的。依据不同的切割技术,制备了三种类型的顶细胞,并对其进行了离体培养。在三类不同的单独顶细胞的培养中,我们发现带有大量基细胞残留物的顶细胞能持续分裂发育,这为我们后续分析提供宝贵的材料。4.经持续追踪观察及详尽记录所获得的顶细胞的体外培养发育情况,通过对比其与体内及离体正常二胞原胚中顶细胞的分裂发育模式,我们发现独立顶细胞在离体条件下可以分裂形成4-8细胞左右的胚。63.6%的顶细胞体外第一次分裂与体内分裂模式相同,即横向分裂。有26.8%独立顶细胞能进行三次以上分裂形成幼胚。正常二胞原胚离体培养时,顶细胞能进行三次以上分裂并形成幼胚比率为68.5%。这表明单独顶细胞发育命运没有受到基细胞缺失的影响,但其持续的发育在没有基细胞条件下受到抑制。另外,基细胞也影响着独立顶细胞发育产物中邻近基细胞的部分细胞分裂方式。5.以胚胎特异表达的基因Contig824作为标记,经RT-PCR检测,结果证实顶细胞离体培养产物具有胚胎特性。利用早期胚胎特异表达的基因DRP作为标记（NtDRP::GFP）,我们也发现其表达模式在顶细胞离体培养产物中与体内正常胚胎一致。进一步说明顶细胞离体培养产物具备正常胚胎的性质。6.结合顶、基细胞离体发育结果,我们利用光激活绿色荧光蛋白（Photo-activiated green fluorent protein, PAGFP）追踪观察了二胞原胚中顶-基细胞间的物质流动情况,以进一步探索顶基细胞间的相互作用关系。我们构建了ProNtDRP::PAGFP光激活绿色荧光蛋白载体,并获得烟草转基因植株。通过PCR检测及荧光观察证明为阳性植株。摸索了PAGFP的操作条件及其在顶基细胞中的分布情况。通过比较PAGFP的激发光强度,激活模式,激活部位等条件,发现激发光强度在50%,利用点激活模式,对两细胞的核,而不是细胞质激活是比较适合观察到荧光蛋白流动的。7.追踪观察PAGFP在二胞胚中顶基细胞的分布及流向,发现激活基细胞中的GFP后,有15.8%的基细胞内荧光流向顶细胞,而在所有顶细胞实验中没有观察到顶细胞中被激活的GFP荧光流向基细胞。说明类似于GFP这类物质在顶基细胞间的流向是有差别的,即一定物质由顶细胞流入基细胞比由基细胞向顶细胞流入困难。可能正是这种物质的极性运输影响着顶细胞的持续发育。8.利用激光显微切割技术,破坏邻近球形胚体的胚柄细胞,离体培养结果表明胚柄细胞在受到破坏的情况下,胚柄能从破坏的状态恢复过来,并正常生长且最终形成完整的胚柄,说明胚柄细胞有很强的自我修复能力；在此基础上,胚体也继续发育,并未受到部分胚柄细胞暂时破坏的影响,表明胚体的发育依赖于正常生长的胚柄。综上所述,在先前研究的基础上,本文通过体外单细胞微培养技术寻找到更能促进胚胎离体发生的小分子——亚精胺,在此条件下,追踪单独顶细胞的离体发育,结合胚胎特异基因表达检测及特殊的光激活绿色荧光蛋白在细胞间的流动情况观察,结果证明顶细胞的发育命运没有受到基细胞缺失的影响,但其持续的发育在没有基细胞的条件下受到抑制；顶基细胞间物质的极性运输可能就是基细胞影响顶细胞持续发育的因素之一。这些结果为我们理解顶基细胞命运是何时被决定及如何决定,顶基细胞间有无相互作用提供了可靠的实验依据。
李昊[5]（2019）在《Myostatin基因敲低克隆绵羊的研究》文中研究表明肌肉生长抑制素（Myostatin,MSTN）是一种生长因子,属于TGF-β超家族,主要在骨骼肌细胞中表达,对肌肉的生长具有负调控作用。MSTN基因的过表达可引起肌肉萎缩,而MSTN基因发生突变或被敲除时则会使动物的肌肉量增加,产生双肌现象。本研究利用克隆获得的绵羊MSTN基因构建真核表达载体,同时设计合成MSTN干涉序列并构建RNA干涉载体,共转染293GP细胞后经荧光定量PCR检测获得干涉效率最佳的载体;将其线性化后转染绵羊成纤维细胞后,经G418筛选获得MSTN敲低转基因细胞系;以MSTN敲低转基因细胞为核供体,利用细胞核移植的方法获得MSTN敲低转基因绵羊克隆胚和转基因绵羊,以期建立获得肌肉丰满绵羊新品系的方法。此外,本研究利用CRISPR/Cas9系统,获得了基因编辑胚胎和小鼠,为后续利用CRIISPR/Cas9系统获得基因打靶绵羊奠定基础。本研究的结果与结论如下:1、绵羊MSTN基因RNA干涉载体构建和活性分析（1）绵羊Myostatin基因的克隆:参照GenBank中绵羊MSTN基因序列（AF019622.1）,采用RT-PCR扩增技术,克隆绵羊肌肉生长抑制素基因,将其连接到pcDNA3.1（+）载体,获得肌肉抑制素基因真核表达载体;（2）RNA干涉表达载体的构建:参照绵羊MSTN基因的mRNA序列,设计合成RNA干涉序列并与pRNAT-U6载体连接,获得RNA干涉表达载体。与真核表达载体共转染293GP细胞后,通过实时定量PCR检测干涉效率,获得干涉效果最佳序列。（3）RNA干涉载体表达活性检测:将筛选获得的RNA干涉载体线性化,采用显微注射的方式,注射到小鼠原核时期的胚胎中,注射后的胚胎可以分裂为2细胞,经体外培养最终获得表达绿色荧光蛋白的囊胚,表明所构建的RNA干涉载体可以在胚胎中正常表达并支持胚胎的发育。2、绵羊MSTN敲低转基因成纤维细胞系的建立通过脂质体转染法将线性化的RNA干涉载体转染到绵羊成纤维细胞中,经G418筛选,获得转基因阳性细胞;PCR结果显示,构建的基因已整合到细胞基因组中;对获得的转基因阳性细胞的形态学特征、生长曲线以及冷冻复苏后特征的检测结果表明,转基因细胞具有正常细胞的生物学特征。3、绵羊MSTN敲低转基因胚胎的获得（1）供体细胞的修饰和处理:来源于成纤维细胞的核移植胚胎的卵裂率为44.6%,高于MSTN敲低转基因细胞的33.0%,且差异显着,但两者的桑/囊胚率差异不显着（分别为24.1%和15.6%）;供体细胞不需进行血清饥饿处理,使用接触抑制方法可以达到相同效果。（2）重构胚的融合、激活和培养:采用逐个融合（一次一个）的融合方式能显着提高融合效率,但融合后的胚胎发育能力和批量融合（一次多个）方法比差异不显着;采用A23187+6-DMAP激活卵母细胞与采用Ionomycin+6-DMAP激活方法之间的效果差异不大;重构胚融合后培养34 h后再进行激活可有效提高胚胎卵裂和囊胚发育率。KSOM和SOFaa都可以用来进行绵羊克隆胚的体外培养。4、转基因核移植胚胎的移植和胎儿鉴定（1）重构胚的移植:采用输卵管移植方法,将原核期或2-细胞期的核移植胚胎（242枚）移植到同步发情的受体绵羊（23只）体内,以检验其在体内的发育能力。（2）转基因胎儿鉴定:在23只受体中,最终只有1只受体妊娠,但妊娠期间发生流产,未能获得成活个体,获得流产胎儿1只;对流产胎儿进行PCR鉴定,结果显示,胎儿基因组中整合有目的基因。5、肌肉特异表达Cas9蛋白打靶胚胎的获得（1）Rosa26基因sgRNA的设计和体外验证:根据小鼠Rosa26基因序列设计sgRNA,体外编辑试验表明,所设计的sgRNA可以对Rosa26位点发生编辑作用;（2）肌肉特异打靶载体的构建:通过PCR和同源重组连接,成功构建了肌肉特异表达Cas9蛋白的同源打靶载体Donor-SP-Cas9-DsRed;（3）Rosa26基因编辑胚胎和小鼠的获得:注射Rosa26 sgRNA和Cas9到小鼠胚胎,注射后的胚胎可以正常卵裂并支持囊胚发育,通过PCR和测序结果显示,获得的胚胎为基因编辑胚胎,注射的胚胎经胚胎移植后,获得了 Rosa26基因编辑小鼠;（4）通过将同源打靶载体与Rosa26 sgRNA和Cas9联合注射的方式,获得肌肉特异表达Cas9蛋白的基因打靶胚胎;综上所述,通过构建MSTN基因RNA干涉载体、转染绵羊成纤维细胞建立MSTN敲低转基因细胞系和转基因细胞核移植等程序,可以获得MSTN敲低的绵羊转基因克隆胚,胚胎移植后获得流产胎儿且携带外源基因,表明获得的重构胚具有体内发育能力,可以通过该方法获得MSTN敲低的转基因绵羊。本研究结果为培育MSTN敲低的绵羊新品系提供了依据。此外,通过利用CRISPR/Cas9系统,获得了基因编辑胚胎和小鼠,初步在小鼠上建立了基因编辑和基因打靶体系,为后续利用CRISPR/Cas9系统获得基因打靶绵羊奠定基础。
龚宇[6]（2019）在《SCF/cKit信号通路在人胚眼早期发育中的功能与机制研究》文中研究说明研究背景:眼睛是人体最重要的感觉器官。不同于身体其他器官,视觉器官需要特殊的形态结构和精细的尺寸调控,以便光线得以聚焦在视网膜黄斑区,形成清晰的图像。视杯（optic cup,OC）是胚眼早期发育中形成的重要组织结构,视杯的形态发生中的任何异常都会导致严重的眼病,如无眼畸形、小眼球综合征和眼先天性缺损。神经视网膜（neural retina,NR）的内陷（invagination）是视杯形态形成过程中最关键的步骤,它包括三个连续的局部过程即:神经视网膜的松弛、睫状缘细胞顶端收缩和神经视网膜组织的扩张。组织生物力学的改变是组织形变的根本原因,其中细胞增殖提供的组织张力和细胞局部收缩提供的收缩力是组织生物力学的核心。视杯形态形成的三个局部过程均发生在视泡原始视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium,RPE）与原始神经视网膜交界区,即所谓的睫状缘区（ciliary marginal zone）。关于睫状缘区细胞是否参与视杯的形态形成及其参与生物力学调控的细胞及分子机制并不清楚。cKit表面抗原,也称为SCFR或CD117,作为介导胞外信号的细胞膜受体,在胚眼早期发育起始,就已经在视网膜有一定水平的表达。体外条件下,视网膜睫状上皮（ciliary epithelium,CE）神经干细胞中cKit表达上调,提示cKit介导的信号转导可能是神经视网膜干细胞行为的调控机制之一。但是,cKit在胚眼发育的生理和病理过程中的具体功能与调控机制并不清楚。研究目标:1.认识cKit及其配体SCF在hESC来源3D视杯发育中的表达与分布,尤其是其与睫状缘的关系;2.研究SCF/cKit信号通路在hESC来源3D视杯发育中的生物学功能及机制;3.研究SCF/cKit信号通路在眼发育性疾病病理过程中的生物学功能及机制。研究假设:SCF/cKit信号通路在hESC来源3D视杯发育过程中发挥了重要作用:SCF/cKit信号通过调节hESC来源3D视杯睫状缘区视网膜干/祖细胞的细胞增殖周期,改变睫状缘组织生物力学,促进视杯形态形成。在病理环境压力下,SCF/cKit信号通路的激活能够保护神经视网膜细胞的增殖和迁移,维持神经视网膜正常发育。研究方案:1、利用人胚胎干细胞（human embryonic stem cells,hESCs）诱导体外3D视杯,模拟人胚眼早期发育过程,研究cKit及其配体SCF在hESCs来源3D视杯的表达特征;2、药理学调控SCF/cKit信号通路,研究SCF/cKit信号通路在hESCs来源3D视杯的形态形成和神经发生中的功能和机制;3、利用乙醇和hESCs来源3D视杯建立酒精胚胎综合征眼发育畸形疾病模型,研究SCF/cKit信号通路的调控在胚胎酒精综合征眼发育畸形疾病病理过程中的功能及机制。研究意义:阐述SCF/cKit信号通路在胚眼发育的生理与病理过程中的功能与机制,完善胚眼早期发育中形态形成和神经发生的调控机制,为眼发育性疾病的早期诊断、治疗和研究提供理论基础。研究方法:根据不同的研究目标,本课题研究方法分为以下三部分。第一部分:本部分实验拟首先利用人胚胎干细胞（human embryonic stem cells,hESCs）诱导体外3D视杯的自发形成。利用免疫荧光染色和RT-PCR检测胚眼早期发育特异性基因的表达,利用免疫荧光染色和双光子显微镜活体钙成像技术考察睫状缘区组织形态、细胞多样性和干细胞相关的特征性钙离子发放频谱,验证hESCs来源3D视杯模拟人胚眼早期发育的可靠性,考察hESCs来源3D视杯中睫状缘的组织与细胞特性。第二部分:本部分实验首先利用免疫荧光染色研究cKit及其配体SCF在hESCs来源3D视杯多个发育时间点的空间表达特征,重点其在睫状缘区域的表达特点。通过cKit激活型配体SCF和特异性抑制剂isck03药理学调控SCF/cKit信号通路,利用形态测量、BrdU标记示踪和免疫荧光染色的方法研究SCF/cKit信号通路在hESCs来源3D视杯的形态形成和神经发生中的功能和机制。第三部分:本部分实验利用乙醇和hESCs来源3D视杯建立酒精胚胎综合征眼发育畸形疾病模型,通过免疫荧光染色和双光子显微镜活体钙成像技术研究该疾病模型的病理过程,并结合药理学干预研究SCF/cKit信号通路的调控在胚胎酒精综合征眼发育畸形疾病病理过程中的功能及机制。研究结果:根据不同的研究实验,本课题研究结果分为以下三部分。第一部分:hESCs来源3D视杯具有典型的神经视网膜与视网膜色素上皮的视杯样结构,且表达视网膜发育特异性基因如Rax、Chx10、Pax6和MITF等,可以很好模拟人胚眼早期发育。同时,hESCs来源3D视杯能发育出具有典型的长楔形形态的睫状缘结构,并阳性表达人睫状缘特异性分子标志SSEA1。hESCs来源3D视杯的睫状缘区视网膜干/祖细胞可以进一步划分为Chx10+Sox2-细胞和Chx10+Sox2+细胞两个细胞亚群。另外,hESCs来源3D视杯的睫状缘区视网膜干/祖细胞的钙离子发放主要呈全细胞一过性高幅值钙波和细胞局部的低幅值高频率钙波。之前的研究称这两种特征性钙波分别与神经发生中的往返运动性细胞核迁移（interkinetic nuclear migration,INM）和干细胞的增殖分化相关。第二部分:在hESCs来源3D视杯诱导第24天,cKit特异性表达分布于hESCs来源3D视杯神经视网膜,并在睫状缘中高表达,至诱导第30天其表达逐渐局限于睫状缘区,并至诱导第45天失去表达。SCF的表达主要分布于神经视网膜内层底端和视网膜色素上皮。SCF/cKit信号通路的激活能够提高hESCs来源3D视杯睫状缘区视网膜干细胞/祖细胞的BrdU摄取率和稀释率,增加细胞增殖速率,促进睫状缘视网膜干/祖细胞的细胞周期进展,从而增强细胞增殖提供的切线张力,加速神经视网膜内凹折叠形成视杯形态。SCF/cKit信号通路的激活能够增强hESCs来源3D视杯睫状缘区顶端pMLC活性,产生细胞顶端张力以产生朝向视网膜色素上皮的拉力;同时SCF/cKit信号通路的激活还能促进细胞骨架F-actin解聚,降低组织刚性以利于神经视网膜发生形变,促进视杯形态形成。SCF/cKit信号通路的激活促进了hESCs来源3D视杯中央部神经视网膜幼稚神经节细胞的迁移和成熟,减少了发育中的细胞凋亡。SCF/cKit信号通路的紊乱还能促使视网膜终末细胞提前分化,影响了视网膜祖细胞的命运选择及定向分化。第三部分:1%乙醇浓度导致hESCs来源3D视杯神经视网膜的厚度明显变薄,降低了3D视杯组织生长速率;显着增加了hESCs来源3D视杯神经视网膜细胞凋亡,减少了Ki67+增殖细胞数量;阻碍了幼稚神经节细胞的迁移和成熟,导致神经上皮底端神经节细胞Tuj1信号完全缺失;减弱了细胞增殖相关的一过性全细胞钙波,增加了细胞凋亡相关的细胞局部钙波,有效模拟了胚胎酒精综合征的眼发育畸形病理发生。SCF/cKit信号通路的激活可以减少酒精胚胎综合征眼发育畸形病理模型中的细胞凋亡,逆转神经节细胞迁移障碍,促进幼稚神经节细胞在神经视网膜内层的正常分布,维持hESCs来源3D视杯神经视网膜的正常组织发育。研究结论:1、本研究首次揭示了:hESCs来源3D视杯中的睫状缘细胞通过SCF/cKit信号通路的调控参与了视杯的形态形成。创新性利用慢病毒Lenti-CMV-GCaMP5G构建了表达遗传编码的钙指示剂GCaMP5G的人胚胎干细胞系H1-GCaMP5G,由此发现hESCs来源3D视杯中睫状缘区视网膜干/祖细胞具备一定的细胞多样性,具有与神经干细胞相关的钙离子发放频谱。2、本研究明确了:hESCs来源3D视杯诱导第30天,cKit的高表达局限于其睫状缘区,并随着发育进行其表达逐渐消失。因此,hESCs来源3D视杯诱导第30天时,其cKit+细胞可以按照cKit表达强度可以分为两类:位于周边部神经视网膜的cKit+strong睫状缘区视网膜干/祖细胞,和位于中央部神经视网膜内层的cKit+dim视网膜祖细胞。3、本研究首次阐述了:SCF/cKit信号通路在hESCs来源3D视杯发育中,能够调控睫状缘干/祖细胞的周期进展,调节睫状缘区细胞顶端张力,改变局部细胞系统动力学,促进神经视网膜内陷和形变,加速视杯的形态形成。另外,SCF/cKit信号还能调控hESCs来源3D视杯神经视网膜中幼稚的神经节细胞迁移,调控神经视网膜细胞凋亡,影响视网膜祖细胞命运,调控视网膜神经发生。4、本课题率先报道了:在胚眼发育性疾病的病理过程中,比如孕期饮酒导致的胚胎酒精综合征眼发育畸形,hESCs来源3D视杯SCF/cKit信号通路的激活可以减少神经视网膜细胞凋亡,逆转幼稚神经节细胞的迁移障碍,帮助胚胎视网膜组织应对病理因素的压力,维持神经视网膜正常的组织生长和神经发生。为胚胎酒精综合征眼发育畸形的诊治和研究提供了新的思路。
丁亭亭[7]（2015）在《拟南芥LOH1基因调节胚胎发生及胚后发育的功能研究》文中研究表明成熟的胚胎是植株个体的雏形,胚胎发生是形成植株的基础。多年来,人们对影响植物胚胎发生的相关基因进行了研究。其中一些基因参与胚胎早期的形态建成,这些基因功能各异,它们参与细胞生长、代谢、转运、转录等生物学过程。本文通过分析前期研究中得到的体细胞胚胎发生的转录组芯片数据,鉴定到一个体胚中特异高表达的基因LOH1（LAG ONE HOMOLOGUE 1）。对LOH1功能缺失突变体进行了表型分析,进而研究了LOH1基因在胚胎发生及胚后发育过程中的作用。具体研究结果如下：（1）通过对lohl突变体的胚进行形态学观察发现,与野生型相比,lohl突变体从早期胚胎发生开始就存在明显的缺陷。（2）胚后lohl突变体的表型观察表明,突变体植株相较野生型发育迟缓。在营养生长阶段,叶片数目减少,叶片浓绿；在生殖生长阶段开花和衰老时间延迟。同时雌、雄配子体发育异常。（3）lohl突变体在茎端和根端分生组织的形态建成方面存在缺陷。lohl突变体的茎端分生组织明显减小,根端分生组织的静止中心细胞存在异常分裂模式。（4）通过对LOHl基因的表达模式分析发现,LOHl基因在未受精的胚珠、幼嫩的胚胎（二细胞胚和心形胚）、子叶、茎端分生组织、根尖和花粉中表达。（5）LOH1蛋白很有可能定位于质体中,并参与叶绿体中Ⅱ类内含子的剪切过程。研究结果表明,拟南芥LOHl基因突变导致胚胎发生及胚后发育异常,其生物学功能是否通过叶绿体基因内含子的剪切起作用有待于近一步深入研究。
曹贵方[8]（1998）在《山羊体形和卵巢发生及卵泡组织化学的研究》文中研究说明研究山羊胚胎发生的规律,对于山羊的繁殖、育种、丰富胚胎学有关内容都具有重要意义。但目前,关于山羊胚胎发育、发生方面的研究较少,特别是有关山羊个体发生发育方面的研究尚未见报道,为补充这方面的资料,本文应用光镜、电镜、组织化学等手段对关中奶山羊胚胎的卵裂与囊胚形成、早期胚胎的超微结构、山羊的胚层发生、20天18时山羊胚胎系统形态发生、山羊体形发生、山羊原始生殖细胞的起源及迁移、山羊卵巢发生过程的组织学与超微结构变化、成年山羊卵巢中卵泡的糖组织化学等方面进行了系统研究。主要实验结果如下: 1 山羊交配后1.5天、2.0天、2.5天、3.5天、4.0天、5.5天、6.5天,胚胎分别发育到原核、2细胞、4细胞、8细胞、16细胞、桑椹胚、早期囊胚阶段。 2 山羊早期胚胎发生致密化时间是在桑椹胚期。 3 山羊早期囊胚的内细胞群外没有扁平样的滋养层细胞包围,内细胞群最外层的细胞为立方或柱状,与扁平的滋养层细胞虽然形态上不同,但功能上可能相似,在以后的发育中将消失,这有待进一步证实。 4 早期胚胎卵裂球近透明带一侧的质膜表面微绒毛随着卵裂与囊胚的形成,而逐步增加,增大了卵裂球表面,有利于营养物质吸收。 5 在卵子受精后,线粒体形态随着卵裂进行明显变化。桑椹胚期前,卵裂球中帽状线粒体较多。囊胚期后,转为体积大、嵴为板状的线粒体,帽状线粒体消失。 6 在原核后期及2细胞以后各阶段胚的卵裂球核膜都有内凹外凸产生大量管泡的现象。核内有些物质也随之外排,核膜这种内凹外凸现象在8细胞胚时最明显,此时核孔不发达,16细胞后,由于核孔发达,一些物质从核孔运出,因此,内凹外凸现象减弱,这种内凹外凸主要是增大核与质接触面,有利于物质的外运,产生的管泡是内外物质交换的一种方式。 7 在原核后期,就在雌原核中可见有大泡状核仁出现,2细胞时环状核仁明显,周边有颗粒物质产生。4细胞期核仁开始网状化,说明胚源性基因可能在原核后期及2细胞期就开始启动。 8 4细胞时,卵裂球之间可见有间隙连接、紧密连接,而典型的桥粒连接在桑椹胚才形成,间隙连接的产生有利于卵裂球同步分化及胚泡腔的产生。 9 9天10时的胚胎外被完整的滋养层包围,内细胞群最外层为即将退化的滋养层细胞,可能是从囊胚期内细胞群最外层的立方、柱状细胞而来,我们称之为类滋养层细胞。
陈漪[9]（2018）在《miR-202在斑马鱼早期胚胎发育中的功能与机制研究》文中研究说明miR-202属于microRNA中与细胞分化相关的let-7家族成员,是一种在脊椎动物中高度保守且特异存在的miRNA,广泛参与了生物体中诸多关键的生理、病理过程。近年来,关于miR-202功能的研究主要聚集在两方面,一是作为肿瘤抑制因子,参与调控某些恶性癌变的生理过程;二是影响性腺的分化和发育。在癌症相关的研究中发现miR-202与细胞的增殖分化有关,但对于其在胚胎发育过程中的功能依然是未知的。胚胎的早期发育过程非常复杂,包括了细胞分裂与分化、细胞运动、胚层形成和器官形成等生物过程。这些过程需要众多信号通路之间的相互协调、共同作用,一起控制整个发育过程的正常进行。斑马鱼是模式生物,它繁殖容易,发育快、体外受精、体外发育、胚胎透明等优点有利于研究胚胎发育过程。斑马鱼的胚胎形成过程中,囊胚期和外包时期是胚层细胞协同运作和合子基因表达的关键时期,其调控网络复杂且机制尚不明确。在实验室前期的研究中发现miR-202在斑马鱼早期胚胎发育中各个时期均具有持续的表达。采用注射反义核苷酸的方法阻断miR-202-3p的表达会引起斑马鱼胚胎发育在囊胚过渡时期停滞并最终死亡。进一步通过CRISPR-cas9系统在基因组上对miR-202所在的区域进行片段敲除,发现miR-202突变体纯合子胚胎出现了与反义抑制miR-202表达类似的胚胎发育异常,因而我们初步判断miR-202是一个对斑马鱼早期胚胎发育非常重要的miRNA。以前期的研究结果为基础,本文对miR-202在胚胎发育过程中的具体功能进行进一步实验研究并探讨其作用机制。我们发现在胚胎发育早期miR-202-3p的表达量较低,在成鱼卵母细胞中却大量存在,miR-202-3p开始合子型表达的时期与miR-202突变纯合子发育异常的时间点基本相符。实验对敲除miR-202的F2代斑马鱼从胚胎发育到成鱼进行了表型和基因型上的观察统计分析,发现miR-202纯合突变体在胚胎发育上出现剧烈的发育异常,尤其是在3.5hpf的囊胚原肠胚过渡时期,纯合子胚胎出现卵裂球破碎不均、发育过程延缓和发育异常。F2代杂合子则没有观察到胚胎发育异常。F2代成鱼中没有发现纯合子,证明了miR-202的缺失导致斑马鱼在早期发育过程中死亡。对于敲除miR-202后胚胎无法正常渡过早期发育阶段的现象,实验进行了F2代的转录组测序和蛋白组测序,进而比较分析miR-202缺失纯合胚胎与正常胚胎在3.5hpf时期的基因表达和蛋白表达差异。我们发现有400多个基因发生了差异表达,我们将差异基因对比其在正常发育过程中的0hpf到3.5hpf的表达量变化,分成三类在胚胎中异常调节的情况:表达量增加不足、表达量增加过量和表达量降低不足。这些差异基因分别富集到了与细胞凋亡、核糖体、氧化磷酸化、细胞连接等相关的通路;蛋白组分析中鉴定到了诸多核糖体相关蛋白在纯合胚胎中明显减少。说明miR-202的缺失造成了一些其调控的关键基因的异常表达,进而导致了对胚胎发育过程重要的通路出现异常调控。进一步检测实验发现在miR-202纯合突变体斑马鱼胚胎中发生了囊胚细胞凋亡、蛋白翻译障碍、细胞连接减弱、ROS等一系列异常效应,结合转录组的分析结果我们推测,在囊胚分裂时期,miR-202的缺失引起凋亡相关基因的异常过量的调节,导致了囊胚细胞的凋亡。凋亡进一步抑制了核糖体活性以及蛋白翻译功能,其过程伴随ROS的激活以及细胞连接的异常调节,最终导致了胚胎发育的异常甚至死亡。本实验证明miR-202参与调控斑马鱼胚胎发生发育过程中一些重要的通路,对胚胎的正常发育至关重要。实验探究了miR-202在胚胎发育过程中的一些调控功能并挖掘其调控过程,为进一步发掘miR-202在斑马鱼胚胎发育的早期阶段发挥功能的分子机制奠定基础。
时永香[10]（2005）在《人为亚极端环境对蟾蜍类动物早期胚胎发育及种群命运的影响》文中进行了进一步梳理环境与生命系统的关系,是整个生物学的根本问题。生命起源于环境,依赖于环境,同时又独立于环境和反作用于环境。在地球生物圈漫长的进化过程中,可以说地球本身的变化对生命的存亡与发展的选择,是基于对特定物种所造成的极端环境、亚极端环境和最适环境的变幻,因此生物种群的命运一直受其生存环境的影响。当今世界,伴随人类经济活动的持续发展,同时也导致了人为地球环境系统的重大变化。近30年来日趋严重的全球性气温升高、持续干旱,生物循环、能量循环、水循环发生恶化等重大问题均与化学污染有关。化学污染已使生命系统受到严重威胁,使越趋增多的生物类群处于维持生存的亚极端环境之中。蟾蜍类动物是脊椎动物进化历程中的一个重要类群,是研究发育生物学、进化生物学、功能基因组学和蛋白质组学等前沿学科的模式动物。由于蟾蜍类动物必须在水中繁育,对水源和水质环境的改变特别敏感,如果失去水源和良好的水质坏境,它们的生存将会受到严重威胁。因此以蟾蜍类动物生存质量作为检测水质环境恶化程度的探针,为探讨全球变化对生命系统的影响提供了良好的实验材料。研究人为亚极端环境对蟾蜍类动物早期胚胎发育的影响,将有助于阐释和预测全球变化与物种生存、延续及其命运的关系。水源,是所有生物赖以生存的重要条件。尤其是对于那些水生生物,水坏境的变化将直接对其生长繁殖、遗传及物种延续产生重要影响。光在生命的起源与演变、生物结构形态的变异与功能的进化中起着不可替代的作用。但阳光中的紫外线在特定能量下,对生物体也具有一定的损伤作用。近年来臭氧层的破坏,导致太阳照射在地面上的紫外线强度增高,将会对生命系统产生特定的物理效应。激光是光受激辐射放大而产生的一种光源,并且它的能量可以进行人为控制,可以依据激光的能级模拟一种对生命活动的亚极端环境,进而探知非自然因素对生命活动的影响。本课题以中华大蟾蜍作为模式动物,对其早期胚胎发育各个时期的变化进行了观察:并围绕亚极端环境（水质、紫外和激光照射）对中华大蟾蜍早期胚胎发育过程的影响。深入研究了激光照射导致蟾蜍早期胚胎遗传物质的染色体、细胞生化系统的同工酶和基因表达产物蛋白质发生改变的原因,进一步获得了亚极端坏境对生命过程造成致变、致畸和致死效应的实验依据。山东大学博士论文 中华大蟾蛤在曝晒过的自来水中抱对、产卵并受精。取受精卵和8细胞期胚胎放入盛有少许1/10 Holfreter液的培养皿中置于超净工作台内紫外灯下接受不同能量密度的照射,然后培养观察;取不同发育时期胚胎用YAG倍频激光器不同能量密度照射后,放入盛有少许1/10 Holfreter液的培养皿中,在培养过程中检测其病变率、畸变率和死亡率;取受精卵置于分别盛有1/10 Holfreter液、曝晒自来水、二次处理水、大明湖水、明泉湖水、拦河坝水、凤凰山水、小清河水的培养皿中,观察其发育状况;然后进一步对比分析在此条件下对蟾赊早期胚胎发育所产生的影响。在激光照射后当胚胎发育至尾芽期时,分别取对照组正常胚胎、照射后正常胚胎、照射致畸胚胎尾尖压片进行染色体分析;对畸胚采用垂直板凝胶电泳分析酷酶和乳酸脱氢酶:激光照射0.5h后将各组胚胎进行SDS一队GE,考玛斯亮蓝染色,脱色后用Bio一Rad成像系统GS一800蛋白胶光密度扫描仪成像,以Gene Tool from Syngene软件分析:对早囊胚、原肠胚、神经胚、尾芽胚进行双向电泳,电泳图谱以PDQest软件分析。该项研究所集中表明的下述问题,目前在国内外尚未检索到同类报告。1.实验证明生存于不同地域环境的蟾蛛其受精卵,在孵化过程中均有各种畸形胚的 发生,在污染严重的水质中可导致其胚胎死亡率增加。.长期生活于不同生态环境中的蟾蛤,其所产卵子的质量不同;调查结果提示这种 差异主要是与动物生存环境中所受化学污染的程度有关。.紫外线照射可影响蟾蛤类的胚胎发育。紫外线照射蟾蛛受精卵和8细胞胚胎可破 坏胶膜,随着照射剂量的增加,对胶膜破坏程度增大;紫外线照射后,在早期胚 胎发育过程中出现各种畸形胚,并随胚胎发育时间的延长而胚胎死亡率增加。.激光照射对蟾蛛胚胎发育的影响与所用激光的能量有关。其中低能量激光表现为 促进发育作用,使生长速度加快,孵化率增高:高能量激光对胚胎发育有抑制作 用;激光照射后胚胎死亡率随照射剂量的增加而增高。.激光照射蟾蛛早期胚胎出现原肠外突现象,可导致各种畸形胚的发生。激光照射 蟾赊受精卵出现头部尾部很难区分的不规则状畸胚、脊椎严重弯曲畸胚和发育不 良、个体弱小没有相应的比例关系的畸胚;激光照射蟾蛤4细胞胚胎出现腹部成 尹 水泡状的畸形胚和脊尾弯曲成直角状畸胚;激光照射蟾蛛囊胚可出现各种尾巴异 常畸形胚如尾巴成花状、尾巴向下弯曲、尾巴向体侧弯曲等。6.激光照射可导致畸胚染色体数目变化。激光照射后正常胚胎染色体无明显变化;山东大学博士论文 发育迟缓、形态严重扭曲的畸胚其染色体数目倍加;尾巴向下弯曲的畸胚染色 体丢失,染色体数目较正常中华大蟾蛛染色体数的22条少一条为21条。7.激光照射后致畸胚胎中乳酸脱氢酶
二、MORPHOLOGICAL CHANGES OF CELL JUNCTIONS DURING AMPHIBIAN EMBRYOGENESIS（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、MORPHOLOGICAL CHANGES OF CELL JUNCTIONS DURING AMPHIBIAN EMBRYOGENESIS（论文提纲范文）
（1）OCT4通过紧密连接通路影响人毛囊间充质干细胞红系造血的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 实验材料与试剂 |
| 1 细胞样本 |
| 2 实验仪器及设备 |
| 3 主要试剂 |
| 4 培养基及试剂配制 |
| 5 qPCR引物 |
| 6 抗体及稀释倍数 |
| 实验方法 |
| 1 细胞培养 |
| 2 流式细胞术检测前向散射 |
| 3 细胞分离实验检测细胞-细胞粘附 |
| 4 细胞粘附实验检测细胞-细胞外基质粘附 |
| 5 转录组测序及分析 |
| 6 qPCR检测TJ通路基因、细胞骨架基因及造血基因的表达 |
| 7 蛋白免疫印迹(Western blot)检测TJ通路蛋白的表达水平 |
| 8 统计学分析 |
| 实验结果 |
| 1 过表达OCT4改变hHFMSC的形态、大小及粘附性 |
| 2 转导OCT4改变hHFMSC的基因转录本 |
| 3 差异表达基因的筛选 |
| 4 过表达OCT4赋予hHFMSC多向分化潜能 |
| 5 hHFMSC~(OCT4)-floating获得造血分化潜能 |
| 6 DEG信号通路富集及功能富集分析 |
| 7 TJ通路基因、细胞骨架基因及造血基因表达的验证 |
| 8 以OCT4-TJP1为轴心的基因调控网络 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（2）前列腺上皮组织特征维持及分子调控机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 存在的科学问题 |
| 1.3 研究技术路线 |
| 1.4 科学意义 |
| 第一部分 前列腺基底干细胞维持基底上皮细胞特征和正常发育 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 上皮组织概述 |
| 1.2 基底上皮细胞特征维持中的EMT机制及分裂模式 |
| 1.3 EMT特征维持的信号通路 |
| 第二章 实验材料与操作方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物及人组织样本 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验仪器耗材 |
| 2.2 实验操作方法 |
| 2.2.1 小鼠基因型鉴定 |
| 2.2.2 原代细胞获得及细胞流式分选 |
| 2.2.3 细胞甩片及免疫荧光染色 |
| 2.2.4 冰冻切片及免疫荧光染色 |
| 2.2.5 石蜡切片及其H&E染色 |
| 2.2.6 质粒抽提实验 |
| 2.2.7 病毒制备及目的细胞感染 |
| 2.2.8 类器官培养及功能检测 |
| 2.2.9 泌尿生殖窦间质细胞分离及培养 |
| 2.2.10 原代前列腺上皮细胞分离及肾包膜移植实验 |
| 2.2.11 谱系示踪实验 |
| 2.2.12 单细胞RNA测序和数据分析 |
| 2.2.13 实时定量聚合酶链式反应 |
| 2.2.14 蛋白免疫印迹 |
| 2.2.15 统计学分析 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 发现EMT转录因子表达的前列腺上皮细胞 |
| 3.2 高通量单细胞RNA-seq发现Zeb1~+前列腺上皮细胞群 |
| 3.2.1 获得前列腺基底上皮单细胞 |
| 3.2.2 获得高质量单细胞RNA测序数据 |
| 3.2.3 单细胞RNA-seq数据分析得到Zeb1~+基底上皮细胞亚群 |
| 3.3 Zeb1~+上皮细胞与前列腺上皮组织之间的相关性研究 |
| 3.3.1 成功构建Zeb1 荧光报告小鼠 |
| 3.3.2 Zeb1 在前列腺上皮细胞中的分布及表达模式 |
| 3.4 Zeb1~+前列腺基底上皮细胞的生物学功能研究 |
| 3.4.1 体外Zeb1~+基底上皮细胞类器官形成实验 |
| 3.4.2 体内Zeb1~+基底上皮细胞肾包膜移植实验 |
| 3.4.3 体内谱系示踪Zeb1~+基底上皮细胞多向分化的命运 |
| 3.4.4 Zeb1 保证基底上皮细胞正常发育 |
| 3.5 Wnt信号通路正向调控Zeb1~+基底上皮细胞 |
| 3.5.1 单细胞RNA-seq数据显示Zeb1~+基底上皮细胞富集Wnt信号通路 |
| 3.5.2 qRT-PCR实验结果支持单细胞RNA-seq数据分析结果 |
| 3.5.3 APCmin模型小鼠中Zeb1~+基底上皮细胞比例显着增多 |
| 3.6 研究模型图及小结 |
| 第四章 实验结论、讨论及展望 |
| 4.1 实验结论 |
| 4.2 讨论和展望 |
| 4.3 科学意义 |
| 第二部分 细胞连接、细胞极性和细胞分裂轴定位共同维持前列腺管腔上皮细胞的组织特征 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 上皮细胞极性的建立及维持 |
| 1.1.1 上皮细胞极性组成-PAR complex |
| 1.1.2 上皮细胞极性组成-Scribble complex |
| 1.1.3 上皮细胞三种极性蛋白复合物之间的互作及应用 |
| 1.2 上皮细胞间连接的建立及功能 |
| 1.3 细胞分裂模式基础知识 |
| 1.3.1 细胞分裂模式相关分子调控机制 |
| 1.3.2 细胞分裂模式研究的应用 |
| 第二章 实验材料与操作方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物、细胞系、质粒 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验仪器耗材 |
| 2.2 实验操作方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 石蜡切片及其免疫组织化学染色 |
| 2.2.3 细胞增殖 |
| 2.2.4 细胞实时示踪实验 |
| 2.2.5 内源性免疫共沉淀 |
| 2.2.6 GST-pull down实验 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 黏附连接蛋白集中表达及分布在成年小鼠前列腺管腔上皮细胞间 |
| 3.1.1 qRT-PCR结果显示黏附连接蛋白集中分布在前列腺管腔上皮细胞间 |
| 3.1.2 免疫荧光染色结果表明黏附连接蛋白集中分布在前列腺管腔上皮细胞间 |
| 3.2 黏附连接E-cadherin缺失促进前列腺管腔上皮细胞增殖能力及肿瘤发生发展 |
| 3.2.1 体外E-cadherin表达下调促进前列腺上皮细胞增殖能力 |
| 3.2.2 E-cadherin前列腺特异性敲除小鼠模型构建及表型探究 |
| 3.3 黏附连接蛋白E-cadherin表达缺失导致细胞分裂轴定位异常 |
| 3.3.1 体外黏附连接蛋白表达下调严重影响细胞分裂轴正确定位 |
| 3.3.2 体内黏附连接缺陷造成管腔上皮细胞分裂轴偏转随机化 |
| 3.3.3 体外黏附连接蛋白表达下调显着减弱蛋白LGN-NUMA的结合能力 |
| 3.3.4 体内黏附连接缺失导致LGN蛋白复合物细胞膜分布异常 |
| 3.4 黏附连接蛋白E-cadherin丢失导致细胞极性蛋白复合物弥散分布 |
| 3.4.1 体外敲低黏附连接蛋白表达水平显着削弱蛋白DLG-SCRIB的结合能力 |
| 3.4.2 体内黏附连接缺失造成细胞极性蛋白复合物分布异常 |
| 3.5 考察细胞连接、细胞极性和分裂轴定位三者间的互作及分子机制 |
| 3.5.1 RNA-seq分析结果支持细胞连接、极性和分裂轴定位之间存在紧密互作 |
| 3.5.2 增殖活跃的E-cadherin蛋白表达缺失的管腔上皮细胞更易发生肿瘤转化 |
| 3.5.3 E-cadherin/SCRIB/LGN三元复合物的形成维持前列腺管腔上皮组织结构 |
| 3.6 研究模型图及小结 |
| 第四章 实验结论、讨论及展望 |
| 4.1 实验结论 |
| 4.2 讨论和展望 |
| 4.3 科学意义 |
| 全文总结 |
| 1.1 研究总结 |
| 1.2 研究创新性 |
| 1.3 科学意义 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间已发表或录用的论文 |
（3）基于孤雌生殖研究模型的水牛母源基因组功能及母源因子鉴定的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 母源基因组在早期胚胎发育过程中的功能研究综述 |
| 1.1.1 母源基因组在合子基因组激活前对早期胚胎发育的调控 |
| 1.1.2 母源基因组在合子基因组激活后对胚胎发育的调控 |
| 1.1.3 母源效应基因的研究进展 |
| 1.2 哺乳动物孤雌生殖的研究进展 |
| 1.2.1 哺乳动物卵母细胞孤雌激活的原理 |
| 1.2.2 哺乳动物卵母细胞孤雌激活技术 |
| 1.2.3 哺乳动物孤雌生殖的应用 |
| 1.3 蛋白质组学在哺乳动物早期胚胎发育过程中的研究进展 |
| 1.3.1 蛋白质组学技术 |
| 1.3.2 生殖细胞的蛋白质组研究 |
| 1.3.3 体外受精和孤雌胚胎的蛋白质组学 |
| 1.3.4 母源因子的蛋白质组学研究 |
| 1.4 转录组学在哺乳动物早期胚胎发育过程中的研究综述 |
| 1.4.1 牛早期胚胎发育过程中的基因表达的特点和规律 |
| 1.4.2 单细胞转录组测序技术研究进展 |
| 1.4.3 转录组学在哺乳动物早期胚胎发育过程中的研究进展 |
| 1.5 本课题的目的、研究意义和技术路线 |
| 第2章 水牛卵母细胞孤雌激活前后的定量蛋白质组学研究 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.1.3 本章试验数据的统计分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 使用串联质量标签对水牛卵母细胞孤雌激活前后进行定量蛋白质组学分析 |
| 2.2.2 差异表达蛋白质的基因本体论(GO)分析 |
| 2.2.3 差异表达蛋白质的KEGG通路分析 |
| 2.2.4 蛋白质组学数据的验证 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 水牛孤雌胚胎在附植前发育各个阶段的单细胞/单胚胎转录组学研究 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 实验材料和方法 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 水牛卵母细胞和孤雌生殖附植前胚胎发育各阶段胚胎的差异表达基因的鉴定 |
| 3.2.2 差异表达基因的聚类分析 |
| 3.2.3 特定模块的关键基因的识别和互作关系的可视化作图 |
| 3.2.4 孤雌生殖水牛胚胎发育过程中阶段特定模块的基因参与的信号通路 |
| 3.2.5 qRT-PCR验证 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 参与水牛早期胚胎合子基因组激活的母源表达蛋白质或基因的初步鉴定 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 实验材料和方法 |
| 4.1.2 生物信息学分析工具 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 水牛卵母细胞孤雌激活后附植前胚胎的转录图谱的相关性和层次分析 |
| 4.2.2 水牛孤雌胚胎蛋白质组中鉴定的候选母源蛋白质NPM2和NLRP5的mRNA表达规律分析 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 关键基因和蛋白质的跨物种同源性分析 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 实验材料和方法 |
| 5.1.2 生物信息学分析工具 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 水牛孤雌激活前后差异表达蛋白质的跨物种的同源性比对、ID转换和注释分析 |
| 5.2.2 水牛孤雌胚胎各阶段差异表达的关键基因(Hub genes)的同源性比对、ID转换和注释分析 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 全文总结和研究展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（4）烟草顶—基细胞相互作用与顶细胞发育命运的抉择（论文提纲范文）
| 本论文的创新点及意义 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 1.1 高等植物胚胎发生 |
| 1.1.1 合子不等分裂的调控机制 |
| 1.1.2 顶基细胞命运决定的可能机理 |
| 1.1.3 植物胚胎发生中的模式建成 |
| 1.1.3.1 顶基轴向的建立 |
| 1.1.3.1.1 顶端分生组织的形成 |
| 1.1.3.1.2 胚根的特化和形成 |
| 1.1.3.2 辐射轴向的建立 |
| 1.1.3.2.1 表皮的形成 |
| 1.1.3.2.2 内皮和皮层的形成 |
| 1.1.3.2.3 维管束的形成 |
| 1.1.4 细胞通讯在植物胚胎发生中的作用 |
| 1.2 胚柄的功能 |
| 1.2.1 胚柄的形成与分化 |
| 1.2.1.1 来自合子转录本在不对称分布对胚柄细胞分化的影响 |
| 1.2.1.2 细胞信号转导在胚柄分化中的作用 |
| 1.2.2 胚柄在胚胎发生中起重要作用 |
| 1.2.2.1 向胚体传输营养及生长调节物质 |
| 1.2.2.2 作为植物激素生物合成的场所 |
| 1.3 植物细胞命运决定机制 |
| 1.3.1 不等分裂 |
| 1.3.1.1 细胞骨架的极性分布 |
| 1.3.1.2 细胞器的极性分布 |
| 1.3.1.3 细胞内蛋白的极性定位 |
| 1.3.2 位置信息 |
| 1.4 体外胚胎发生培养系统 |
| 1.4.1 体细胞胚胎发生 |
| 1.4.2 雄配子胚胎发生 |
| 1.4.3 合子及胚胎培养 |
| 1.5 光激活荧光蛋白 |
| 1.6 激光显微切割技术 |
| 1.7 本文关注的问题和研究目的 |
| 第二章 对烟草原胚发育模式的显微观察 |
| 摘要 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 胚珠的整体透明 |
| 2.1.3 胚的分离 |
| 2.1.4 观察与图像分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 利用整体透明法观察烟草早期胚胎 |
| 2.2.2 利用酶解分离法观察烟草早期胚胎 |
| 2.2.3 两种观察方法在观察烟草胚胎过程中的比较 |
| 2.2.4 基于两种方法观察到的烟草早期胚胎发生模式 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 烟草二胞原胚体外培养系统的改进及多胺在胚胎发生过程中的作用 |
| 摘要 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 烟草胚胎的分离 |
| 3.1.3 子房消毒 |
| 3.1.4 制备饲养系统 |
| 3.1.5 胚胎培养 |
| 3.1.6 培养基的制备 |
| 3.1.7 观察与图像分析 |
| 3.1.8 数据统计 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 不同激素水平对二胞原胚离体发育的影响 |
| 3.2.2 多胺在烟草早期二细胞原胚离体培养过程中的作用 |
| 3.2.3 精胺在早期不同时期胚胎离体发生过程中的作用 |
| 3.2.4 多胺在BY-2细胞系分裂生长中的作用 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 生长素与胚胎发生的关系 |
| 3.3.2 亚精胺在胚胎发生及细胞分裂中的作用 |
| 3.3.3 亚精胺与植物生长素等激素的关系 |
| 第四章 利用激光显微切割技术获得单独的顶细胞 |
| 摘要 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 子房消毒与二胞原胚的分离 |
| 4.1.3 切割所用仪器及装置 |
| 4.1.4 胞原胚和顶细胞的细胞学观察与摄影 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 利用激光显微切割技术获取单个顶细胞并检测其活性 |
| 4.2.2 独立顶细胞发育潜能的检验 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 激光参数的设置对顶细胞活性的影响 |
| 4.3.2 基细胞不同残留程度对顶细胞活力及发育影响 |
| 第五章 顶细胞的离体发育 |
| 摘要 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 子房消毒与二胞原胚的分离 |
| 5.1.3 切割所用仪器及装置 |
| 5.1.4 顶细胞及发育产物的细胞学观察与摄影 |
| 5.1.5 植物组织及细胞RNA的提取 |
| 5.1.6 统计分析 |
| 5.2 实验结果 |
| 5.2.1 顶细胞发育产物的胚性检测 |
| 5.2.2 顶细胞第一次分裂面的方向性 |
| 5.2.3 顶细胞持续分裂模式 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 顶细胞发育过程中胚性的保持 |
| 5.3.2 基细胞的缺失对顶细胞第一次分裂的影响 |
| 5.3.3 顶细胞在体外进行离体生长分裂的基本模式 |
| 5.3.4 顶细胞的独立分裂方式与自身命运的联系 |
| 第六章 利用光激活绿色荧光蛋白研究顶、基细胞间物质交流 |
| 摘要 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 材料 |
| 6.1.1.1 植物材料 |
| 6.1.1.2 主要菌种和试剂 |
| 6.1.2 烟草体内胚胎的分离 |
| 6.1.4 观察与摄影 |
| 6.1.5 PAGFP转基因烟草的获得 |
| 6.1.5.1 PAGFP序列全长的获得 |
| 6.1.5.2 酶切 PCAMBIA1302 和 PAGFP 片段 |
| 6.1.5.3 回收、连接pCAMBIA1302片段和PAGFP片段 |
| 6.1.5.4 转化连接产物 |
| 6.1.5.5 PCR鉴定转化菌落 |
| 6.1.5.6 ProNtDRP：：PAGFP质粒的构建 |
| 6.1.5.7 烟草转基因及初步鉴定 |
| 6.2 实验结果 |
| 6.2.1 ProNtDRP：：PAGFP光激活绿色荧光蛋白载体的构建 |
| 6.2.2 转基植株的获得及验证 |
| 6.2.3 PAGFP的显微观察及参数设置 |
| 6.2.4 PAGFP在二胞原胚中顶基细胞间的流动情况 |
| 6.3 讨论 |
| 6.3.1 PAGFP在不同细胞中的分布情况 |
| 6.3.2 顶基细胞间的物质运输方向性 |
| 第七章 定点损伤胚柄细胞后胚柄与胚体发育的观察 |
| 摘要 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 材料 |
| 7.1.2 烟草胚的分离方法 |
| 7.1.3 观察与摄影 |
| 7.2 实验结果 |
| 7.2.1 激光切割早前期球形胚中胚柄的最顶端细胞 |
| 7.2.2 切割早前期球形胚中胚柄最顶端细胞后胚体的发育情况 |
| 7.3 讨论 |
| 7.3.1 对晚期胚进行激光切割的操作可行性 |
| 7.3.2 胚体与胚柄的相互作用关系 |
| 第八章 总讨论 |
| 8.1 离体条件下顶细胞的发育命运 |
| 8.2 顶细胞与基细胞的关系 |
| 8.3 胚体与胚柄的关系 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的论文 |
| 致谢 |
（5）Myostatin基因敲低克隆绵羊的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN) |
| 1.1.1 MSTN基因的发现 |
| 1.1.2 MSTN基因和蛋白结构 |
| 1.1.3 MSTN基因的表达 |
| 1.1.4 MSTN的作用机制 |
| 1.1.5 MSTN的表达调控机制 |
| 1.1.6 MSTN基因的应用前景 |
| 1.2 RNA干涉 |
| 1.2.1 RNA干涉现象的发现 |
| 1.2.2 RNA干涉的作用机制 |
| 1.2.3 RNA干涉的作用特点 |
| 1.2.4 siRNA和shRNA技术优缺点 |
| 1.2.5 哺乳动物的RNA干涉 |
| 1.2.6 RNA干涉的应用前景 |
| 1.3 卵母细胞的体外成熟 |
| 1.3.1 卵母细胞的成熟 |
| 1.3.2 卵母细胞的成熟调控机制 |
| 1.3.3 卵母细胞成熟的特征 |
| 1.3.4 卵母细胞成熟的影响因素 |
| 1.4 哺乳动物细胞核移植 |
| 1.4.1 哺乳动物胚胎细胞核移植研究进展 |
| 1.4.2 哺乳动物胚胎干细胞核移植研究进展 |
| 1.4.3 哺乳动物体细胞核移植研究进展 |
| 1.4.4 哺乳动物转基因细胞核移植研究进展 |
| 1.4.5 影响细胞核移植结果的因素 |
| 1.4.6 核移植存在的问题 |
| 1.5 CRISPR/Cas9 |
| 1.5.1 CRISPR/Cas9的发现 |
| 1.5.2 Cas9蛋白的结构 |
| 1.5.3 CRISPR/Cas9的作用机制 |
| 1.5.4 CRISPR/Cas9面临的问题和挑战 |
| 1.6 研究的目的与意义 |
| 2 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体构建与活性分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验动物、细胞和菌株 |
| 2.1.2 实验载体信息 |
| 2.1.3 药品和试剂 |
| 2.1.4 溶液的配制 |
| 2.1.5 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 绵羊Myostatin基因克隆与序列分析 |
| 2.2.2 绵羊Myostatin真核表达载体的构建 |
| 2.2.3 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体的构建 |
| 2.2.4 293GP细胞的复苏和传代培养 |
| 2.2.5 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体效率检测 |
| 2.2.6 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体的显微注射 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 绵羊Myostatin基因的克隆与序列分析 |
| 2.3.2 绵羊Myostatin基因真核表达载体的构建 |
| 2.3.3 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体测序 |
| 2.3.4 293GP细胞复苏传代与转染 |
| 2.3.5 RNA干涉效率结果与分析 |
| 2.3.6 RNA干涉载体表达活性分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 绵羊Myostatin基因敲低成纤维细胞系的建立 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 主要药品和试剂 |
| 3.1.3 溶液配制 |
| 3.1.4 主要仪器设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 RNA干涉载体的线性化 |
| 3.2.2 绵羊皮肤成纤维细胞的培养 |
| 3.2.3 G418浓度的筛选 |
| 3.2.4 绵羊皮肤成纤维细胞的转染及筛选 |
| 3.2.5 绵羊MSTN敲低转基因细胞系的鉴定 |
| 3.2.6 绵羊MSTN敲低转基因细胞的冷冻保存 |
| 3.2.7 绵羊MSTN敲低转基因细胞的冷冻复苏 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 绵羊皮肤成纤维细胞的原代培养 |
| 3.3.2 最适G418浓度的筛选 |
| 3.3.3 转基因细胞的生物学特征 |
| 3.3.4 转基因阳性细胞的PCR鉴定 |
| 3.3.5 冷冻复苏的转基因细胞的生物学特征 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 绵羊Myostatin基因敲低细胞核移植 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 药品试剂 |
| 4.1.3 溶液配制 |
| 4.1.4 仪器设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 绵羊卵母细胞的获取 |
| 4.2.2 绵羊卵母细胞的体外成熟 |
| 4.2.3 绵羊成熟卵母细胞的孤雌激活 |
| 4.2.4 绵羊皮肤成纤维细胞的复苏 |
| 4.2.5 显微操作前的实验准备 |
| 4.2.6 核供体细胞的准备 |
| 4.2.7 核受体卵母细胞的准备 |
| 4.2.8 卵母细胞的去核和注核 |
| 4.2.9 重构胚的融合与激活 |
| 4.2.10 重构胚的体外培养 |
| 4.2.11 转基因胚胎的分子鉴定 |
| 4.2.12 转基因胚胎的移植 |
| 4.2.13 数据统计 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 卵巢的保存和运输对绵羊卵母细胞成熟的影响 |
| 4.3.2 绵羊卵母细胞的采集方法和分级对卵成熟的影响 |
| 4.3.3 卵密度和不同成熟液对绵羊卵母细胞成熟的影响 |
| 4.3.4 绵羊卵母细胞成熟时间对成熟和去核的影响 |
| 4.3.5 不同的激活方法对绵羊卵母细胞孤雌激活的影响 |
| 4.3.6 供体细胞修饰和处理对绵羊重构胚发育的影响 |
| 4.3.7 绵羊重构胚融合方式对核移植胚胎发育的影响 |
| 4.3.8 重构胚激活前培养时间对绵羊重构胚发育的影响 |
| 4.3.9 不同培养液对绵羊核移植重构胚发育的影响 |
| 4.3.10 转基因重构胚的获得和PCR鉴定 |
| 4.3.11 胚胎移植和流产胎儿鉴定 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 卵巢的保存和运输 |
| 4.4.2 卵母细胞的采集、分级和培养 |
| 4.4.3 供体细胞的遗传修饰和处理 |
| 4.4.4 重构胚的融合、激活和培养 |
| 4.4.5 转基因动物的生产 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 肌肉特异表达Cas9蛋白打靶胚胎的获得 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验动物和菌株 |
| 5.1.2 实验载体信息 |
| 5.1.3 药品和试剂 |
| 5.1.4 溶液的配制 |
| 5.1.5 主要仪器设备 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 小鼠Rosa26基因sgRNA的设计与获得 |
| 5.2.2 Rosa26基因sgRNA体外编辑效率检测 |
| 5.2.3 肌肉特异性小鼠Rosa26同源打靶载体的构建 |
| 5.2.4 小鼠胚胎的显微注射 |
| 5.2.5 注射后囊胚的基因分型和检测 |
| 5.2.6 胚胎移植和基因分型检测 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 sgRNA获得与体外编辑效率检测 |
| 5.3.2 肌肉特异表达同源打靶载体的构建 |
| 5.3.3 小鼠Rosa26基因编辑胚胎的获得 |
| 5.3.4 Rosa26基因编辑小鼠的获得 |
| 5.3.5 肌肉特异表达Cas9蛋白小鼠胚胎的获得 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（6）SCF/cKit信号通路在人胚眼早期发育中的功能与机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 hESC来源的3D视杯模拟人胚眼早期发育 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料 |
| 2.3 方法 |
| 2.4 结果 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 SCF/cKit信号通路在hESCs来源3D视杯发育中的功能及机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料 |
| 3.3 方法 |
| 3.4 结果 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 SCF/cKit信号通路对胚胎酒精综合征眼发育病理模型的作用及机制研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料 |
| 4.3 方法 |
| 4.4 结果 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 胚眼早期形态形成的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间研究成果 |
| 致谢 |
（7）拟南芥LOH1基因调节胚胎发生及胚后发育的功能研究（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 植物胚胎发生过程 |
| 1.1.1 早期合子极性的建立 |
| 1.1.2 顶细胞的发育过程及胚体的形成 |
| 1.1.3 基细胞的发育过程 |
| 1.2 植物胚胎发生的分子遗传调控 |
| 1.2.1 胚胎顶-基轴建立的基因表达调控 |
| 1.2.2 胚胎辐射对称轴建立的基因表达调控 |
| 1.2.3 胚胎形态建成的基因表达调控 |
| 1.2.4 雌雄配子体中特异表达基因对胚胎发生过程的影响 |
| 1.3 茎端分生组织的结构与功能 |
| 1.3.1 胚胎发生过程茎端分生组织的起始与子叶分化 |
| 1.3.2 茎端分生组织的结构 |
| 1.3.3 维持茎端分生组织的分子机制 |
| 1.3.3.1 WUS基因在调控茎端分生组织发育过程中的作用 |
| 1.3.3.2 STM基因在调控茎端分生组织发育过程中的作用 |
| 1.4 植物根端分生组织的结构与功能 |
| 1.4.1 胚胎发生过程根端分生组织的起始 |
| 1.4.2 根端分生组织的结构 |
| 1.4.3 静止中心是根干细胞池的组织者 |
| 1.4.4 WOX5基因在静止中心特异表达维持干细胞的特性 |
| 1.4.5 SHR对静止中心的功能维持是必须的 |
| 1.5 真核生物RNA的剪切 |
| 1.5.1 CRM保守结构域 |
| 1.5.2 Ⅱ类内含子的剪切 |
| 1.6 本研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料及生长条件 |
| 2.1.2 酶与生化试剂 |
| 2.1.3 菌株与载体 |
| 2.1.4 各种缓冲液及培养基配方 |
| 2.1.5 引物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 拟南芥的种植与培养 |
| 2.2.2 拟南芥基因组的提取与纯化 |
| 2.2.3 表达载体构建 |
| 2.2.3.1 PCR扩增 |
| 2.2.3.2 目的片段的回收与纯化 |
| 2.2.3.3 连接反应 |
| 2.2.3.4 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 2.2.3.5 大肠杆菌转化 |
| 2.2.3.6 DNA序列测定 |
| 2.2.3.7 高纯度小提质粒 |
| 2.2.3.8 质粒DNA的酶切鉴定 |
| 2.2.3.9 LR反应连入表达载体 |
| 2.2.4 农杆菌感受态细胞的制备及遗传转化 |
| 2.2.4.1 冻融法根癌农杆菌感受态的制备 |
| 2.2.4.2 冻融法转化农杆菌 |
| 2.2.5 拟南芥的转化及转基因拟南芥的鉴定 |
| 2.2.5.1 PCR鉴定拟南芥突变体是否纯合 |
| 2.2.5.2 农杆菌介导的花序浸染拟南芥转化法 |
| 2.2.5.3 转基因植株的筛选及初步鉴定 |
| 2.2.6 拟南芥胚胎透明 |
| 2.2.7 植物总RNA的提取与纯化 |
| 2.2.8 RNA的反转录及cDNA第一链的合成 |
| 2.2.9 Quantitative Real-Time PCR分析 |
| 2.2.10 转基因植株的GUS染色分析 |
| 2.2.11 共聚焦显微镜观察和图像处理 |
| 2.2.12 烟草介导的瞬时转化 |
| 2.2.13 FM4-64 染色（MA Peflalva 2005) |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 LOH1功能缺失突变体鉴定 |
| 3.2 loh1突变体的表型分析 |
| 3.3 突变体的互补实验及表型分析 |
| 3.4 LOH1的表达模式分析 |
| 3.5 LOH1蛋白结构域分析 |
| 3.6 LOHl蛋白的亚细胞定位 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（8）山羊体形和卵巢发生及卵泡组织化学的研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 体形发生 |
| 第一章 山羊胚胎的卵裂与囊胚形成 |
| 第二章 山羊早期胚胎发育的超微结构研究 |
| 第三章 山羊的胚层发生——9天10时至17天18时胚胎发育的形态学研究 |
| 第四章 20天18时山羊胚胎系统形态及以后各时期体形发生的初步研究 |
| 第二部分 山羊卵巢发生 |
| 第五章 山羊原始生殖细胞(PGCs)的发生、迁移及定居 |
| 第六章 山羊卵巢发生过程中组织结构研究 |
| 第七章 山羊卵巢发生过程中超微结构观察 |
| 第三部分 山羊卵泡糖组织化学 |
| 第八章 山羊卵泡发育过程中卵子及其透明带的糖组织化学研究 |
| 第四部分 文献综述 |
| 第九章 卵子糖组织化学 |
| 第十章 原始生殖细胞和卵巢的发生 |
| 英文摘要 |
| 本人简历 |
（9）miR-202在斑马鱼早期胚胎发育中的功能与机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 1.1 microRNA |
| 1.2 miR-202 |
| 1.2.1 miR-202概述 |
| 1.2.2 斑马鱼中miR-202的结构 |
| 1.2.3 miR-202的研究现状 |
| 1.3 斑马鱼早期胚胎发育 |
| 1.3.1 斑马鱼早期胚胎发育过程概述 |
| 1.3.2 斑马鱼胚胎发育的中期囊胚转换(MBT)与外包 |
| 1.3.3 miRNA在斑马鱼发育上相关研究进展 |
| 1.4 本研究的主要内容和意义 |
| 第二章 miR-202敲除F2代突变体斑马鱼的性状研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 斑马鱼 |
| 2.2.2 仪器和试剂 |
| 2.2.3 miR-202序列分析及引物设计 |
| 2.2.4 miR-202实时荧光定量PCR(RT-qPCR) |
| 2.2.5 斑马鱼性腺组织的原位杂交 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 miR-202-3p在胚胎发育各时期的表达 |
| 2.3.2 miR-202敲除的F2代胚胎早期发育过程观察 |
| 2.3.3 miR-202敲除F2代成鱼的基因型检测和表型观察 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 miR-202敲除F2代胚胎的转录组和蛋白组学分析 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 斑马鱼 |
| 3.2.2 仪器和试剂 |
| 3.2.3 单胚胎RNA和DNA提取 |
| 3.2.4 巢式PCR |
| 3.2.5 转录组测序分析 |
| 3.2.6 iTRAQ蛋白质组学 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 转录组分析 |
| 3.3.2 蛋白质组学分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 miR-202对斑马鱼早期胚胎发育影响的功能验证 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 仪器和试剂 |
| 4.2.2 EGFPmRNA体外转录 |
| 4.2.3 斑马鱼胚胎显微注射 |
| 4.2.4 胚胎TUNEL凋亡检测 |
| 4.2.5 斑马鱼整胚ROS检测 |
| 4.2.6 斑马鱼整胚免疫荧光 |
| 4.2.7 巢式PCR检测基因型 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 miR-202影响早期胚胎发育的蛋白翻译过程 |
| 4.3.2 miR-202缺失引起斑马鱼囊胚期细胞凋亡 |
| 4.3.3 miR-202敲除胚胎中的ROS检测 |
| 4.3.4 miR-202敲除纯合子中细胞连接蛋白ZO-1的异常调节 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（10）人为亚极端环境对蟾蜍类动物早期胚胎发育及种群命运的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 一、前言 |
| 一)本课题的研究背景与文献综述 |
| (一)两栖类动物基础生物学研究概况 |
| (二)蟾蜍类动物研究现状 |
| (三)中华大蟾蜍早期胚胎发育研究背景 |
| (四)自然环境对中华大蟾蜍早期胚胎发育的影响 |
| 二)本课题的目的、研究思路与意义 |
| (一)课题的提出与研究目的 |
| (二)研究思路 |
| (三)课题研究的意义 |
| 二、材料与方法 |
| (一)实验材料 |
| (二)实验方法 |
| 三、实验结果 |
| (一)不同水质对中华大蟾蜍早期胚胎发育的影响 |
| (二)紫外线照射对中华大蟾蜍早期胚胎发育的影响 |
| (三)激光照射对中华大蟾蜍早期胚胎发育的影响 |
| 四、讨论 |
| (一)水源、水质环境对蟾蜍类动物早期胚胎发育的影响 |
| (二)紫外线照射对蟾蜍类动物早期胚胎发育的影响 |
| (三)激光照射对蟾蜍类动物早期胚胎发育的影响 |
| (四)亚极端环境与蟾蜍等两栖类动物的物种延续及其种群命运的关系 |
| (五)总结与结论 |
| (六)下一步需要深入探索的重要问题 |
| 五、参考文献 |
| 六、致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
四、MORPHOLOGICAL CHANGES OF CELL JUNCTIONS DURING AMPHIBIAN EMBRYOGENESIS（论文参考文献）
- [1]OCT4通过紧密连接通路影响人毛囊间充质干细胞红系造血的机制研究[D]. 余小珍. 青岛大学, 2020(01)
- [2]前列腺上皮组织特征维持及分子调控机制的研究[D]. 王雪. 上海交通大学, 2019(06)
- [3]基于孤雌生殖研究模型的水牛母源基因组功能及母源因子鉴定的初步研究[D]. 陈富美. 广西大学, 2019(06)
- [4]烟草顶—基细胞相互作用与顶细胞发育命运的抉择[D]. 李世升. 武汉大学, 2011(05)
- [5]Myostatin基因敲低克隆绵羊的研究[D]. 李昊. 东北林业大学, 2019(01)
- [6]SCF/cKit信号通路在人胚眼早期发育中的功能与机制研究[D]. 龚宇. 中国人民解放军陆军军医大学, 2019
- [7]拟南芥LOH1基因调节胚胎发生及胚后发育的功能研究[D]. 丁亭亭. 山东农业大学, 2015(03)
- [8]山羊体形和卵巢发生及卵泡组织化学的研究[D]. 曹贵方. 西北农业大学, 1998(03)
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