一、胰岛素作用原理的研究——Ⅳ.胰岛素受体定位的放射自显影观察（论文文献综述）
易玮[1]（2002）在《针刺对胰岛素抵抗干预作用的研究》文中研究说明胰岛素抵抗（Insulin Resistance，IR）是指机体对一定量的胰岛素的生物学反应低于预计正常水平的一种状态，亦称胰岛素不敏感。近年来大量研究发现胰岛素抵抗可能与多种疾病（如冠心病、高血压、糖尿病、肥胖、脑血管意外等）相关联，并可能成为上述疾病共同的发病基础。因此开展胰岛素抵抗的研究已成为当今医学研究领域的热点之一，尤其是在胰岛素抵抗的形成机理及其干预措施等方面的探讨显得较为重要，这样不仅可以探索出许多改善胰岛素抵抗的有效方法，而且也为临床治疗多种与胰岛素抵抗相关的疾病不断提供新的思路。针灸作为一种自然疗法，因其简、便、验、廉等优势在几千年的中医传统诊疗中起着十分重要的作用，且众多的研究也证实针灸具有良好的调节内分泌代谢的作用，在治疗诸多现代疾病中已逐渐显示出优势。虽然目前针刺治疗胰岛素抵抗等研究工作开展得较少，但针刺对糖尿病、肥胖、脑梗塞等相关疾病的疗效早已得到了国内外同行的公认。因此本文依据这些研究基础，选择从胰岛素抵抗的病理生理学机制入手，着重探讨针刺对胰岛素抵抗的干预作用，为临床针灸治疗胰岛素抵抗及其相关疾病奠定坚实的理论基础。全文分文献研究、实验研究和小结三大部分进行。 一．文献研究 通过对大量关于胰岛素抵抗的文献综合研究，从胰岛素抵抗概念、胰岛素抵抗与相关疾病关系、胰岛素抵抗发生的影响因素以及胰岛素抵抗发生机理及防治等多方面阐述了胰岛素抵抗的最新研究进展，并对中医药防治胰岛素抵抗的研究现状进行了分析，特别对针灸治疗胰岛素抵抗的国内外研究进展进行了评述，提出今后的研究方向，认为针刺不失为改善胰岛素抵抗的有效方法之一，应加强对其作用机理的深入研究和探讨。 针刺对胰岛素抵抗干预作用的研究．中英文摘要 二．实验研究“ 本实验采用高糖饲料喂养大鼠的方法，诱导出胰岛素抵抗模 型，并通过观察在受体前、受体及受体后水平上针刺对大鼠空腹血 糖、血浆胰岛素、胰岛素敏感性指数、胰岛素受体、抗体以及 TNF－a和GLUT。等相关指标的影响，探讨针刺改善胰岛素抵抗的 作用机理。实验结果报道如下：二 1．由于胰岛素抵抗是机体对一定量的胰岛素生物学反应低于 预计正常水平的一种状态，因此观察大鼠空腹血糖、血浆胰岛素、 胰岛素／C肽的变化，可在一定程度、一定范围内反映出胰岛素敏感 性，具体方法依据我国学者李光伟提出的计算胰岛素敏感性指数方 法，即ISI－l八FPGXFINS厂 我们在本实验中即以此方法作为评估 胰岛素敏感性的指标。具体方法：通过给予实验大鼠高糖饲料喂养 3 5 天后，结果发现模型组大鼠空腹血糖、血浆胰岛素、胰岛素川 肽值均明显高于正常对照组。而ISI则明显降低（P＜O．01），证明 大鼠已存在明显的胰岛素抵抗。给予针刺“脂三针”加“肾俞”穴 治疗 10天后，大鼠空腹血糖、血浆胰岛素、胰岛素屹肽值较模型 组明显降低，lsl 明显升高（P＜0．01），提示针刺能有效改善实验 大鼠胰岛素抵抗状况。 2．胰岛素抗体的形成，在受体前水平即干扰了胰岛素与其受 体的正常结合，从而削弱了胰岛素的生物学效应，导致胰岛素抵抗 的产生。针刺能有效改善胰岛素抵抗状况，但这种改善作用机制是 否通过针刺影响胰岛素与其抗体的结合途径而实现，我们拟通过实 验证实。实验通过放射免疫方法检测了胰岛素抗体结合率，结果发 现无论是模型组大鼠还是正常对照组大鼠血样品中胰岛素抗体结合 率阳性者均为零，针刺后胰岛素抗体结合率仍未见变化，提示针刺 改善胰岛素抵抗作用机制并非是通过改变抗体结合率而是通过其他 1 作用途径影响胰岛素生物效应的发挥。 3．胰岛素与细胞膜上受体的结合是启动胰岛素作用的关键步 骤，如果胰岛素受体数目减少或胰岛素受体亲和力下降等原因，导 致胰岛素与其受体结合障碍，则会影响胰岛素生物效应的发挥，从 而导致胰岛素抵抗。胰岛素受体结合实验证实了针刺能促进胰岛素 受体与胰岛素的结合，治疗后的专一结合量与总结合之比从模型组” 的36．03o提高至48．giO，差异具有显著统计意义（P＜0．of）。 ．2． Z j 一一 ，提示针刺?
林忆阳[2]（2004）在《应用基因芯片技术筛选2型糖尿病骨骼肌胰岛素抵抗相关基因及其鉴定》文中认为[研究背景] 目前全世界大约有140，000，000名2型糖尿病患者，糖尿病已渐成为失明、肾功能衰竭、缺血性心脏病、截肢的主要原因。不同人群、种族中糖尿病患病率差异较大，如在Pima印地安人中超过50％，而智利的印地安部落中患病率仅有2％。2型糖尿病患者最显著的病理生理学特征即是胰岛素抵抗，胰岛素抵抗是指外周组织，如骨骼肌与脂肪，对胰岛素的敏感性下降，胰岛素诱导的骨骼肌对葡萄糖的摄取受损。遗传因素是胰岛素敏感性的重要决定因子。目前已发现胰岛素抵抗的许多候选基因，如胰岛素受体底物1，糖原合成酶，UCP-3，GLUT4，己糖激酶Ⅱ，磷脂酰肌醇3-激酶，丝氨酸-苏氨酸激酶，Rad基因与钙调蛋白-10等。虽然在2型糖尿病中的确存在这些物质的改变，但还不清楚到底是这些变化通过破坏胰岛素的信号传导引起2型糖尿病，还是仅仅由于患者胰岛素敏感性下降而引起这些物质继发的变化。而且，还没有哪个单独的基因可作为大多数2型糖尿病患者的首选致病基因，所以最可能的结论就是：2型糖尿病是由这许许多多不同的遗传因素及环境因素共同作用的产物。我们对参与糖尿病胰岛素抵抗的基因掌握的越多，就越有希望通过干预更多的靶点来防止或延缓糖尿病的发生与发展。基因芯片微矩阵技术能同时检测成千上万个基因转录产物，很适宜应用于2型糖尿病的病理生理机制分子水平的研究，能使我们更深入地了解肌肉胰岛素抵抗是如何发生、发展，并可为糖尿病的治疗提供新的治疗靶点。 [研究目的] 运用基因芯片技术获取2型糖尿病患者与对照组骨骼肌组织中差异表达的基因，并采用Northern blot技术进一步鉴定其中两条基因，探讨骨骼肌胰岛素抵抗的分子机制。 [实验方法] 1、设立实验组（2型糖尿病伴胰岛素抵抗）与对照组（非糖尿病，无胰岛革二二军医口吮学俘d二论文中文摘要素抵抗）各4例，均为在本院骨科行腰椎间盘手术的住院患者，诊断均经临床及影像学诊断证实。术中取其腰部骨骼肌，分为两份，快速液氮保存，一份用于基因芯片研究，另一份用于Northem blot验证。 2、常规法抽提骨骼肌组织总RNA，纯化mRNA，将4096种人类基因PCR产物用Cartesian点样微矩阵列点样于化学涂层的载玻片上，制成基因芯片;将等量的两组骨骼肌组织mRNA分别逆转录合成荧光标记的cDNA混合物探针，与上述基因芯片杂交，经严格洗片后，用GenePix40OOB扫描仪扫描芯片荧光信号图像，计算机软件数据处理，将所得的数据进行比较，得到二者间基因表达的差异信息。 3、常规法抽提骨骼肌组织总RNA，设计并合成脂肪酸结合蛋白3（FABP3）、eGMp刺激的磷酸二酷酶ZA（PDEZA）、GAPDH引物，Northem blot半定量分析FABP3、PDEZA的mRNA表达量，探讨这两种基因与胰岛素抵抗的相关性，对基因芯片的结果进行验证。 【结果】 l、通过4次基因芯片筛选，在4096种基因中获得与2型糖尿病骨骼肌胰岛素抵抗可能相关的37条基因，这37条基因表达均降低（0.5倍以下），涉及细胞代谢与信号转导，还包括原癌与抑癌基因、离子通道与运输蛋白基因、凋亡基因、免疫相关基因、蛋白翻译合成基因、细胞增殖与分化相关基因、细胞骨架组成基因等。 2、Northem blot半定量研究显示编码FABP3与PDEZA的基因在无胰岛素抵抗者的骨骼肌组织中高表达，而在2型糖尿病患者骨骼肌组织中低表达，结果与基因表达谱芯片结果吻合，但差异表达的相对变化值要小于基因芯片检测值。 【结论】 l、通过基因芯片技术比较2型糖尿病伴胰岛素抵抗患者与无胰岛素抵抗正常对照的骨骼肌组织，筛选出差异表达基因37条，均呈下调表达，它们参与包括细胞能量代谢与信号转导、原癌与抑癌、离子的转运、细胞凋亡、免疫防卫、蛋白的翻译合成、细胞的增殖与分化、细胞骨架组成等多种生命活动。提示胰岛絮二二军医大学博.士论文中文摘要素抵抗与多种基因表达异常有关。 2、应用Northem blot技术对第一部分中差异表达较明显的基因FABP3与PDEZA进行验证，结果与芯片扫描结果吻合，提示这2条基因的下调表达与骨骼肌胰岛素抵抗有关，为探索胰岛素抵抗的机制提供了新的方向，也为2型糖尿病的防治提供新的靶点。 3、基因芯片筛选正常成人与胰岛素抵抗患者骨骼肌差异表达的基因具有样品用量少、高质量、高速度、高敏感等特性。
常永生[3]（2002）在《血糖调节相关基因的克隆及其功能的初步研究》文中研究指明本研究应用差异显示技术克隆血糖调节相关基因作为糖尿病的候选基因。通过颈静脉—右心房插管技术建立了大鼠血糖自动调节模型，葡萄糖注入大鼠形成短暂高血糖前后，取其骨骼肌进行mRNA差异显示分析。下游3个单锚定引物分别与上游10个随机引物进行30种组合PCR扩增，得到181条差异条带中，狭缝杂交证实葡萄糖上调表达的基因片段56条、下调表达的基因片段18条。选取8条表达上调的EST和9条表达下调的EST进行Northern杂交分析，确认EST-89，EST-62，EST-119为表达上调片段，EST-17，EST-76，EST-124为表达下调的EST。筛库后得到EST-89的全长cDNA，命名为Fang—1，其全长cDNA为2.3Kb，Genbank收录号为AF399873；EST-76的全长基因命名为Fang—2，全长约0.9kbp，Genbank收录号为AF399874。 Blast软件分析后发现Fang—1在人类有同源基因，GenBank收录号为AK001644，但是该基因功能目前未知。 为了确定Fang—1对哺乳动物细胞糖代谢的影响，将全长Fang—1克隆到哺乳动物表达载体pCDNA3.1，转染CBRH7919细胞系，RT-PCR和Northern杂交分析表明Fang—1高表达可以上调胰岛素受体底物1（insulin receptor substrate 1，IRS1）的表达。 将Fang—1 cDNA的一段编码区序列克隆到原核细胞表达载体pGEX-4T3中，转化大肠杆菌BL21，应用亲和层析法纯化表达的融合蛋白，并以该蛋白为抗原，免疫新西兰大白兔，制备多克隆抗体，其滴度达到1：32万，为进一步研究Fang—1的功能打下了基础。将Fang—1全长编码区融合pEGFP，转染细胞后观察到细胞质和细胞核均有表达。 为了确定细胞内与Fang—1相互作用分子，我们首先构建了大鼠骨骼肌酵母双杂交文库，文库独立克隆数超过106，符合文库质量要求。然后将Fang—1编码区分为两段以及全长Fang—1分别克隆到载体pGBKT7作为诱饵蛋白，验证这些蛋白对酵母没有毒害作用和自激活作用。目前正在筛库，鉴定与这些诱饵蛋白相互作用的基因。
张雅静[4]（2011）在《TSH与脂肪细胞胰岛素抵抗发生的相关性研究》文中提出目的：流行病学研究发现,血清促甲状腺激素（TSH）水平与胰岛素抵抗正相关。然而,血清TSH水平与胰岛素抵抗之间存在相关性的机制目前尚不清楚。研究发现,促甲状腺激素受体（TSHR）不仅存在于甲状腺滤泡细胞表面,在前脂肪细胞和脂肪细胞表面同样检测到TSHR的表达。TSH可以直接与脂肪细胞表面的TSHR结合,发挥甲状腺以外的效应。TSH与TSHR结合后可促进已分化成熟的3T3-L1脂肪细胞,通过环腺苷酸-蛋白激酶A（cAMP-PKA）途径分泌白介素-6。然而,升高的TSH是否同样会刺激脂肪细胞分泌肿瘤坏死因子-a（TNF-a）,进而下调葡萄糖转运蛋白4 （GLUT4）表达和转位,导致胰岛素抵抗的发生,尚不清楚。本研究拟探讨TSH是否可促进3T3-L1脂肪细胞TNF-a的分泌,进一步影响脂肪细胞GLUT4表达和转位,参与脂肪细胞胰岛素抵抗发生的慢性非特异性炎症过程。方法:1.动物学研究：OLETF大鼠8只为糖尿病组（DM组）,LETO大鼠8只为正常对照组（N组）。42周龄时目内眦取血,酶联免疫吸附法（ELISA）检测两组大鼠血清TSH水平。股动脉放血处死大鼠,Western blotting方法检测附睾脂肪组织TSHR、Phospho-NF-κBp65 Ser276、TNF-a、GLUT4的表达。2.细胞学研究：体外诱导3T3-L1前脂肪细胞为成熟脂肪细胞。①采用0.1mIU/ml牛TSH,分别刺激前脂肪细胞和诱导成熟的脂肪细胞,于刺激0-24h,采用ELISA方法检测培养基TNF-a水平,以观察TSH刺激后所产生的效应,以及产生效应的的最佳时间；②以不同浓度牛TSH （0.01mIU/ml 0.1mIU/ml 1mIU/ml）刺激后,检测培养基TNF-a水平,Real time PCR法检测细胞GLUT4 mRNA表达水平、Western blotting方法检测Phospho-NF-κBp65 Ser276的表达水平、GLUT4总蛋白及膜表达水平；③分别以1μM Forskolin及1mIU/ml牛TSH刺激后,检测培养基TNF-a水平；④检测予以1mIU/ml牛TSH刺激,及10μM H89预处理15分钟后,Phospho-NF-KBp65 Ser276蛋白表达水平、及培养基TNF-a水平,免疫共沉淀（Co-IP）法检测IκBα/PKAc复合物的产生；⑤给予Rapamycin 20nM预处理1h后,以1mIU/ml牛TSH刺激后,检测3T3-L1脂肪细胞GLUT4 mRNA表达水平及总蛋白及膜蛋白水平。结果：1.动物学研究：与N组相比,DM组大鼠血清TSH水平升高（P<0.01）,DM组大鼠附睾脂肪组织TSHR、Phospho-NF-κBp65 Ser276、TNF-a蛋白表达水平升高（P<0.05,或P<0.01）,GLUT4蛋白水平降低（P<0.01）；相关分析显示,大鼠血清TSH水平与附睾脂肪组织Phospho-NF-κBp65 Ser276、TNF-a蛋白表达水平均呈正相关（P<0.05）,与附睾脂肪组织GLUT4蛋白表达水平及IAI均呈负相关（P<0.05,或P<0.01）。2.细胞学研究：①随着TSH刺激时间的延长,诱导分化成熟的3T3-L1脂肪细胞培养基内TNF-a浓度呈上升趋势,刺激4h趋于达峰（P<0.05）,但该效应未见于前脂肪细胞；②与空白对照组相比,随TSH刺激浓度的增加,培养基中TNF-a水平呈上升趋势（P<0.05）；③与1mIU/ml牛TSH刺激组相比,Forskolin刺激组培养基中TNF-a水平无明显变化（P>0.05）；④与空白对照组相比,予以10μM H89干预组培养基中TNF-a水平未见升高（P>0.05）；⑤随着TSH刺激剂量的增加,Phospho-NF-KBp65 Ser276蛋白表达水平呈上升趋势（P<0.05）,H89可以抑制TSH对Phospho-NF-κBp65 Ser276蛋白表达促进作用,与培养基TNF-a水平的变化趋势相同,且予以1mIU/ml牛TSH刺激组,可以检测IκBα/PKAc复合物。予以10μM H89干预组未检出IκBα/PKAc复合物产生；⑥随着TSH刺激浓度的增加,GLUT4mRNA、总蛋白及膜蛋白结果呈下降趋势（P<0.05）, Rapamycin可以逆转TSH对GLUT4 mRNA、总蛋白及膜蛋白的下调作用。结论：1.DM大鼠血清TSH水平及附睾脂肪组织TSHR的蛋白表达水平均高于N组,TSH与TSHR结合后可能会参与胰岛素抵抗发生的慢性非特异性炎症过程；2.TSH能够剂量依赖性地促进3T3-L1脂肪细胞TNF-a的分泌；3.TSH与3T3-L1脂肪细胞表面TSHR结合后,可能通过激活cAMP-PKA途径,产生IκBα/PKAc复合物,磷酸化IκB使其构象发生改变,活化NF-κB而诱导NF-κB依赖的TNF-a基因转录,促进TNF-a分泌,进一步下调GLUT4基因、蛋白的表达,并抑制其转位,有可能进一步参与胰岛素抵抗的发生。
INSULIN RESEAKCH GROUP, DIVISION OP ENDOCRINOLOGY, PEKING INSTITUTE OP ZOOLOGY, ACADEMIA SINICA[5]（1977）在《胰岛素作用原理的研究——Ⅳ.胰岛素受体定位的放射自显影观察》文中提出 胰岛素是一种代谢功能比较广泛的激素。早期许多工作,主要是研究它对脂肪和糖代谢的调节作用和途径;近年来,又认识到它能刺激核酸和蛋白质的合成,有促进细胞生长的功能。但对它的原发作用部位一直不清楚,这是许多人关心的一个问题。Sutherland（1972）提出蛋白质激素作用方式的假说,认为首先是激素与细胞膜上的特异性部位结合,激发了细胞内cAMP的改变,这种变化做为第二信使再引起细胞产生一系列生理效应。Cuatrecasas（1969,1972）的一系列工作更进一步证明胰岛素的特异性受体是在细胞膜上,最后并得出一结论认为细胞质内没有胰岛素的特异性结合物质,这样就使人们形成一个
高玲玲[6]（2013）在《SET在多囊卵巢综合征高雄激素血症中的作用机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景：多囊卵巢综合征（PCOS）是常见的内分泌及代谢紊乱性疾病，主要表现为高雄激素血症、卵巢多囊样改变及稀发排卵或无排卵，常伴有胰岛素抵抗或胰岛细胞功能障碍，致使其合并2型糖尿病、代谢综合征和心血管疾病的远期风险增加。高雄激素血症是PCOS的主要临床特征之一，其雄激素来源于卵巢和肾上腺，并以卵巢来源为主，但PCOS患者高雄激素血症的确切病因与病理生理机制仍不清楚。为研究PCOS发生发展的分子机制，本实验室前期通过基因芯片技术比较正常育龄妇女和PCOS患者卵巢内的全基因组表达谱，发现PCOS患者卵巢中SET基因高表达，其表达水平是正常卵巢的2倍多。SET蛋白在全身多个组织器官中均有表达，包括中枢神经系统、肾上腺和性腺的甾体激素合成细胞。既往研究表明，在人神经前体细胞及小鼠睾丸间质细胞中SET蛋白能够激活基础状态及激素刺激状态下的CYP17A1基因转录；在多种细胞中SET能抑制PP2A酶活性，而在NCI-H295A细胞系中PP2A能够使P450c17丝氨酸、苏氨酸去磷酸化从而使P450c17裂解酶活性增加。我们推测，SET蛋白在人卵巢中参与调节雄激素生成与释放；而PCOS患者卵巢组织SET高表达则可能参与了高雄激素血症发生发展的病理生理机制。再则，SET蛋白在卵巢中参与雄激素生成调节和PCOS高雄激素的机制更需要细致研究。为了验证上述三项科研假说，本研究首先验证SET蛋白在卵巢中的细胞与亚细胞定位以及SET蛋白在PCOS卵巢中的高表达；通过SET重组腺病毒载体实现SET在小鼠卵泡及膜-间质细胞中的超表达和干涉，观察SET对膜细胞雄激素合成的影响；然后通过酶动力学研究、RNAi、化学激动剂抑制剂、免疫荧光共定位及免疫共沉淀等技术，阐明SET在调控雄激素生成中的作用机制。这些前沿性的研究，将阐述SET蛋白在人卵巢中调节雄激素生成的作用及其机制，也将有助于探讨SET在PCOS高雄激素血症中的病理生理作用，为PCOS研究提供新的思路。材料和方法第一部分：SET在多囊卵巢综合征和正常育龄妇女卵巢中的定位及差异表达1.免疫组织化学方法观察SET蛋白在人卵巢组织中的细胞及亚细胞定位。2.通过Western blot比较SET蛋白在PCOS和正常育龄妇女卵巢组织中的表达。第二部分：SET对小鼠窦前卵泡雄激素合成的影响1.通过免疫组化方法观察SET蛋白在小鼠卵巢组织中的细胞及亚细胞定位。2.重组腺病毒AdCMV-SET和AdH1-SiRNA/SET感染小鼠卵泡48小时后，Western blot验证SET在卵泡膜细胞中的超表达及干涉效率，酶联免疫法测定培养液中睾酮的浓度。3.重组腺病毒AdCMV-SET和AdH1-SiRNA/SET感染小鼠卵泡48小时后，Real-time RT-PCR检测雄激素生成相关的酶StAR、CYP11A1、CYP17A1、HSD3B2mRNA水平。第三部分：SET通过PP2A调节小鼠窦前卵泡雄激素合成1.重组腺病毒AdCMV-SET和AdH1-SiRNA/SET感染小鼠卵泡24小时后，超高效液相色谱-串联质谱法检测P450c17裂解酶活性变化，Western blot检测P450c17蛋白表达变化。2. Real-time RT-PCR检测AdCMV-SET和AdH1-SiRNA/SET感染小鼠卵泡24小时后POR及CYB5的mRNA水平改变。3.通过冰冻切片免疫荧光观察PP2A在小鼠卵巢组织中的表达定位。4.通过免疫荧光共定位观察SET和PP2A在小鼠膜-间质细胞中相互关系。5.通过免疫荧光共定位和免疫共沉淀方法，观察PP2A和P450c17在小鼠膜-间质细胞中的相互关系。6.重组腺病毒AdCMV-SET和AdH1-SiRNA/SET感染小鼠卵泡24小时后，通过PP2A免疫沉淀磷酸酶检测试剂盒检测超表达及干涉SET对PP2A酶活性的影响，Western blot检测超表达及干涉SET对PP2A蛋白表达的影响。7. PP2A化学抑制剂OA及激动剂1,9-dideoxyforskolin，FTY720分别处理小鼠卵泡48小时，酶联免疫法测定培养液中睾酮的浓度；AdH1-SiRNA/PP2A腺病毒载体感染小鼠卵泡48小时，酶联免疫法测定培养液中睾酮的浓度，超高效液相色谱-串联质谱法检测P450c17裂解酶活性，western blot检测P450c17蛋白水平。8. AdH1-SiRNA/SET或AdH1-SiRNA/NS重组腺病毒感染小鼠卵泡24小时后加入PP2A抑制剂OA，24小时后酶联免疫法测定卵泡培养液中睾酮含量。结果第一部分：SET在多囊卵巢综合征和正常育龄妇女卵巢中的定位及差异表达1.在人卵巢组织中，SET蛋白主要表达于卵泡膜细胞及卵母细胞；在膜细胞中主要定位于细胞质及细胞核中。2. PCOS患者卵巢组织中SET蛋白表达较正常育龄妇女卵巢明显升高，约为正常育龄妇女的3倍（p<0.05）。第二部分：SET对小鼠窦前卵泡膜细胞雄激素合成的影响1. SET蛋白在小鼠卵巢中主要表达于膜细胞、卵母细胞，与人卵巢组织中的表达一致；在小鼠初级卵泡、窦前卵泡及窦卵泡的膜细胞中均有表达；在膜细胞中，SET蛋白定位于细胞核及细胞质。2.重组腺病毒AdCMV-SET感染小鼠卵泡膜细胞48小时后，SET蛋白表达较AdCMV-GFP感染组增加1.79倍（p<0.05），睾酮的浓度显著升高（177.42±54.94pg/ml vs79.43±25.23pg/ml）（p<0.05）；相反，重组腺病毒AdH1-SiRNA/SET感染小鼠卵泡膜细胞48小时后，AdH1-SiRNA/SET感染组SET蛋白表达较AdH1-SiRNA/NS感染组显著降低（p<0.05），干涉效率达48%，睾酮浓度显著降低（73.59±21.34pg/ml vs33.11±6.64pg/ml）（p<0.05）。3.重组腺病毒AdCMV-SET感染小鼠卵泡膜细胞24小时后，与AdCMV-GFP感染组相比，AdCMV-SET感染组卵泡SET mRNA水平显著增加（p<0.05），为对照组的1.66倍，雄激素生成酶CYP17A1、HSD3B2mRNA表达显著增加（p<0.05），分别为对照组的2.46倍、3.36倍，而CYP11A1，StAR mRNA无明显改变（p>0.05）。相反，重组腺病毒AdH1-SiRNA/SET感染小鼠卵泡膜细胞24小时后，与AdH1-SiRNA/NS感染组相比，CYP17A1、HSD3B2mRNA表达显著下降（p<0.05），分别下降33%和70%，而CYP11A1，StAR mRNA无明显改变（p>0.05）。第三部分：SET通过PP2A调节小鼠窦前卵泡雄激素合成1.重组腺病毒AdCMV-SET感染小鼠卵泡膜细胞24小时后，P450c17裂解酶活性升高（p<0.05），而P450c17蛋白表达无明显影响（p>0.05）；相反，重组腺病毒AdH1-SiRNA/SET感染小鼠卵泡膜细胞24小时后，P450c17裂解酶活性降低（p<0.05），P450c17蛋白表达无明显影响（p>0.05）。2.重组腺病毒AdCMV-SET或AdH1-SiRNA/SET感染小鼠卵泡膜细胞24小时后，POR及CYB5mRNA水平均无明显影响（p>0.05）。3. PP2A蛋白在小鼠卵巢广泛表达，主要表达于膜细胞、颗粒细胞、间质细胞等。4.在小鼠膜-间质细胞中SET定位于细胞核和细胞质中，且在细胞核中信号较强。而PP2A主要定位于细胞质中，与SET在细胞质中部分共定位。5.在小鼠膜-间质细胞中PP2A和P450c17在细胞质中共定位且相互结合。6.重组腺病毒AdCMV-SET感染小鼠卵泡24小时后，与对照组相比，PP2A蛋白表达量无明显改变（p>0.05），而PP2A酶活性显著下降（p<0.05），约为对照组的43%；相反，重组腺病毒AdH1-SiRNA/SET感染小鼠卵巢膜细胞24小时后，与对照组相比，PP2A蛋白表达量无明显改变（p>0.05），而PP2A酶活性显著升高（p<0.05），为对照组的1.45倍。7. PP2A化学抑制剂OA处理卵泡48小时后，睾酮生成较DMSO组明显升高（252.13±92.83pg/ml vs93.46±2.91pg/ml）（p<0.05）；PP2A化学激动剂1,9-dideoxy-forskolin和FTY720处理卵泡48小时后，睾酮浓度较DMSO组下降（74.84±13.85pg/ml vs65.63±22.10pg/ml；104.77±15.80pg/ml vs65.63±22.10pg/ml）（p<0.05）。重组腺病毒AdH1-SiRNA/PP2A感染小鼠卵泡膜细胞48小时后，PP2A蛋白表达较AdH1-SiRNA/NS感染组显著降低（p<0.05），睾酮浓度显著升高（214.19±40.86pg/ml vs91.07±23.42pg/ml）（p<0.05）。AdH1-SiRNA/PP2A感染小鼠卵泡膜细胞24小时后，P450c17裂解酶活性升高（p<0.05），而P450c17蛋白表达无明显变化（p>0.05）。8. AdH1-SiRNA/SET或AdH1-SiRNA/NS重组腺病毒感染卵泡24小时后加入PP2A抑制剂OA，AdH1-SiRNA/SET+DMSO组睾酮浓度较AdH1-SiRNA/NS+DMSO组降低（41.55±10.30pg/ml vs111.19±14.17pg/ml）（p<0.05），AdH1-SiRNA/SET+DMSO组睾酮浓度较AdH1-SiRNA/SET+OA组降低（41.55±10.30pg/ml vs115.47±23.23pg/ml）（p<0.05），而AdH1-SiRNA/NS+DMSO组睾酮浓度较AdH1-SiRNA/SET+OA组无明显差异（111.19±14.17pg/ml vs115.47±23.23pg/ml）（p>0.05）。结论1. SET蛋白在PCOS患者卵巢中较正常育龄妇女卵巢高表达，且主要表达于膜细胞和卵母细胞；SET在小鼠初级卵泡、窦前卵泡及窦卵泡的膜细胞中均高表达，且定位于细胞核及细胞质。提示SET参与卵泡膜细胞某种（些）生物学过程的调控。2. SET蛋白在小鼠窦前卵泡中正向调节睾酮的合成，促进雄激素生成酶CYP17A1、HSD3B2mRNA表达，并促进P450c17裂解酶活性，而对POR及CYB5mRNA水平无明显影响。因此，SET参与调节卵泡膜细胞的雄激素生成。3. PP2A表达于卵泡膜细胞、间质细胞、颗粒细胞等，与SET在细胞质部分共定位；在小鼠膜-间质细胞中，PP2A和P450c17在细胞质中共定位且相互结合。PP2A抑制小鼠卵泡睾酮合成及P450c17酶活性，SET蛋白通过抑制PP2A酶活性，促进P450c17裂解酶活性进而导致卵泡雄激素合成增加。所以，SET调节雄激素生成的分子机制是：SET通过抑制PP2A酶活性促进P450c17裂解酶活性增加，从而使雄激素生成增加。4.本研究首次提示了卵巢中SET蛋白通过PP2A调控P450c17裂解酶活性，从而参与卵巢膜细胞雄激素生成的调节；而PCOS卵巢高表达SET蛋白，是PCOS高雄激素血症的病理机制之一。
韩晓娟[7]（2014）在《Alzheimer病星形胶质细胞和海马神经元胰岛素信号通路蛋白变化的研究》文中研究说明研究背景阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）是一种神经退行性疾病,也是老年人痴呆中最常见的类型,表现为进行性加重的认知功能障碍和神经精神症状及生活能力的逐渐丧失。该病发病率高,是继心脑血管疾病和肿瘤之后导致人类死亡的主要原因,正日益成为对老年人健康的重要威胁。AD是一种多因素共同作用而致的复杂异质性疾病,淀粉样蛋白（beta-amyloid protein, Aβ）沉积、神经存活通路紊乱、糖代谢障碍、线粒体损伤、氧化应激和炎症等均参与疾病的发生发展。其中,Ap沉积是公认的“源头”,尤其以Aβ1-42寡聚体毒性最强,而其他的病理改变和致病途径可能是Aβ过量沉积的继发结果。胰岛素信号通路参与能量代谢和神经内分泌两个过程,能调节糖脂代谢、突触形成及重塑、细胞存活和生长、炎症反应、线粒体功能和学习记忆等。该通路破坏不仅与糖尿病和肥胖等疾病相关,而且与神经退行性变及认知功能下降密不可分,且已经证实该通路损伤后能增加痴呆的发病风险。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin, mTOR）是蛋白激酶B（protein kinase B, Akt/PKB）的下游底物之一,并且能调节星形胶质细胞谷氨酸转运体的表达。两者还能通过相互作用来调节突触活动及记忆形成。因此,增强胰岛素信号通路的活性能起到神经保护及改善认知的作用。星形胶质细胞是脑组织的支持细胞,为神经元提供稳定的内环境。具体而言,星形胶质细胞能维持突触的正常功能、转移和储藏信息、参与认知、产生营养因子、移除毒素和代谢产物、维持正常的氧化还原电势以及调节神经递质和离子的浓度等。最重要的是,星形胶质细胞表达有大量胰岛素受体（insulin receptor, IR）,并能受胰岛素的影响。谷氨酸是中枢神经系统（central nervous system, CNS）中最重要的兴奋性神经递质,在学习和记忆中起举足轻重的作用。谷氨酸在神经元活动时释放到突触间隙中,然后被星形胶质细胞上的兴奋性氨基酸转运体（excitatory amino acid transporters, EAATs）快速重吸收。该转运体被破坏的直接后果是导致谷氨酸在细胞外过度蓄积而对神经元产生兴奋性毒性损伤,而这也是多种神经退行性疾病包括AD的发病机制之一研究目的观察Aβ1-42寡聚体对人星形胶质细胞的影响,探索人星形胶质细胞上是否存在insul in/Akt/EAAT通路,以及Aβ1-42寡聚体和胰岛素对该通路蛋白表达水平和活性的影响作用；同时还观察Aβ1-42寡聚体侧脑室灌注AD模型大鼠的行为学改变及海马神经元胰岛素信号转导通路相关蛋白表达的变化；进一步寻找AD的发病机制及有效的干预靶点。研究方法1.Aβ1-42寡聚体的制备和鉴定。我们分别使用基础的方法和改良的方法制备Aβ1-42寡聚体,后者能在短时期内相对稳定保存。具体而言,首先,将Aβ1-42冻干粉与室温平衡后加入六氟异丙醇（hexafluoro-isopropanol, HFIP）使其单体化,再用无水二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide, DMSO）溶解Aβ1-42肽膜。然后,使用SDS-PBS重悬Ap-DMSO溶液并于4℃孵育24h。最后,用PBS稀释重悬液,再于4℃孵育2周后用不含血清的DMEM稀释至实验所需的浓度。Ap1-42寡聚体制备完成后在透射电镜下进行观察和鉴定。2.细胞分组和药物干预。星形胶质细胞共分为6组,待饥饿处理结束后即加药。C组为空白对照组,即给予无胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）的DMEM;I组给予100nmol/L的Aβ1-42寡聚体溶液；II组给予1μmol/L的Aβ1-42寡聚体溶液。将三组细胞置于37℃、饱和湿度、5%CO2含量的恒温细胞培养箱中培养24h。后三组是在前三组的基础上均再给予100nmol/L人合成胰岛素作用30min,即III组为给予无FBS的DMEM培养24h后再给予100nmol/L胰岛素作用30min;Ⅳ组为给予100nmol/L的Aβ1-42寡聚体溶液培养24h后再给予100nmol/L胰岛素作用30min;Ⅴ组为给予1μmol/L的Aβ1-42寡聚体溶液培养24h后再给予100nmol/L胰岛素作用30mmin。3.观察星形胶质细胞对药物的反应及检测insulin/Akt/EAAT通路相关蛋白的表达和活性。首先,用荧光定量RT-PCR和Western blot检测胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）的mRNA和蛋白水平,再通过免疫荧光染色的方法观察细胞形态变化。然后,使用荧光定量RT-PCR检测IR, Akt、 mTOR、EAAT1和EAAT2的mRNA水平；使用Western blot的方法检测IR-α IR-β、磷酸化胰岛素受体（phosphorylation of insulin receptor, p-IR, Y1361）、Akt、磷酸化蛋白激酶B （phosphorylation of protein kinase B, p-Akt, S473） mTOR、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（phosphorylation of mammalian target of rapamycin, p-mTOR, S2448）, EAAT1和EAAT2的蛋白水平；使用免疫荧光染色的方法进一步观察IR-α、IR-β口p-IR在细胞内的表达情况。4.星形胶质细胞活性的检测。使用MTT的实验方法检测星形胶质细胞在Aβ1-42寡聚体和胰岛素作用下细胞活性的变化。5.动物分组和AD动物模型的建立。3-4月龄的健康成年雄性Wistar大鼠50只,体重为225±25g。术前行为学检测淘汰5只,将剩余45只大鼠分为3组。即正常对照组（C组,大鼠仅行手术而未行任何注射）、生理盐水组（NS组,向大鼠侧脑室内缓慢持续泵入生理盐水）和Aβ1-42寡聚体注射组（AD组,向大鼠侧脑室内缓慢持续泵入Aβ1-42寡聚体）,各组动物数量均为15只（n=15）。先将Aβ1-42寡聚体溶液或者生理盐水注满微渗泵后再把各部分装置组装起来,并在脑立体定位仪的作用下植入微渗泵。调节流量调节器,使Aβ1-42寡聚体溶液或者生理盐水缓慢持续泵入,每天泵入3μL,连续给药30天。所有操作均遵循无菌操作的原则。术后待大鼠清醒后进行神经功能评定,并常规给予肌肉注射青霉素8万单位以防止切口感染,连续给药3天。6.行为学检测。给药结束后行Morris水迷宫实验评估大鼠的学习和记忆能力。术后第31-34天进行定向航行实验,第35天进行空间探索实验。将平台置于南象限（随机预设）,记录分析每只大鼠的逃避潜伏期,即在定向航行实验时大鼠到达平台的时间；记录分析空间探索实验时大鼠经过平台原位置的次数；记录分析空间探索实验时大鼠在南象限停留的时间；记录分析空间探索实验时大鼠在南象限游动的路程；计算空间探索实验时大鼠在南象限游动的时间及路程占总时间和总路程的比率。7.大鼠海马神经元胰岛素信号通路相关蛋白表达的检测。麻醉大鼠,取材、固定海马组织后行免疫组织化学染色观察IR、胰岛素受体底物-1（insulin receptor substrate, IRS-1）、Akt、B淋巴细胞瘤／白血病基因-2（B cell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2）和环磷腺苷反应元件结合蛋白（cAMP response element binding protein, CREB）的表达水平。8.统计学分析。所有数据应用SPSS17.0或SPSS13.0软件进行统计分析,数据分析的结果采用均数土标准差（mean±SD）表示。多组之间的差异采用单因素方差分析（analysis of variance, ANOVA）进行比较,两组之间的差异用Tukey’s检验进行比较。以p<0.05表示差异具有统计学意义。研究结果1.Aβ1-42寡聚体的鉴定结果：在透射电镜下观察,发现Aβ1-42寡聚体形态比较一致,大小比较均匀,呈规则的球形或椭球形,直径为12-25nm,且未在寡聚体溶液中检测到纤丝状物质形成。2.星形胶质细胞对Aβ1-42寡聚体的反应：GFAP的mRNA水平和蛋白水平在Aβ1-42寡聚体的作用下均升高（p<0.05）,且两者均与Aβ1-42寡聚体的浓度呈剂量依赖性；形态学研究结果显示星形胶质细胞呈反应性增生,表现为胞体和胞核均增大,突起肥大,细胞数量无明显改变。3.星形胶质细胞insulin/Akt/EAAT通路相关蛋白的表达及活性检测结果：①Aβ1-42寡聚体降低星形胶质细胞IR的mRNA水平（p<0.05）,胰岛素对此无影响（p>0.05）；随Aβ1-42寡聚体浓度升高,IR-α、IR-β和p-IR的表达均逐渐减少,而胰岛素能逆转这三种蛋白下降的趋势（p<0.05）。②Akt的mRNA水平和总蛋白水平均不受Aβ1-42寡聚体和胰岛素影响（P＞0.05）；随Aβ1-42寡聚体浓度升高,p-Akt表达减低,而胰岛素则能增加p-Akt的水平（p<0.05）。③在Ap1-42寡聚体和胰岛素的作用下,mTOR的mRNA和总蛋白水平均未改变（P＞0.05）；而p-mTOR的表达随Aβ1-42寡聚体浓度升高而降低（p<0.05）,胰岛素能逆转减少的p-mTOR（p<0.05）。④在Aβ1-42寡聚体和胰岛素作用下,EAAT1和EAAT2的mRNA水平保持不变（p>0.05）；而在Aβ1-42寡聚体作用下,EAAT1和EAAT2的总蛋白水平下降（p<0.05）；在胰岛素的刺激下,与相应对照组相比,III组、IV组和V组的EAAT1和EAAT2的蛋白水平均增加（p<0.05）4.星形胶质细胞活性的测定结果：Aβ1-42寡聚体在浓度为100nmol/L和Iμmol/L时都能导致星形胶质细胞的活性下降（p<0.05）。而与对照组相比,胰岛素的刺激则能增强细胞的活性（p<0.05）5.动物的行为学评估结果：定向航行实验中大鼠的逃避潜伏期能反应其学习能力,而空间探索实验中大鼠经过平台所在位置的次数、寻找平台的时间比例和路程比例则能反应其记忆能力。①AD组大鼠逃避潜伏期为87.40±6.70s,比NS组（15.23±4.65s,p<0.05）和C组（14.00±6.01s,p<0.05）均明显延长,NS组与C组的逃避潜伏期无明显差异（p>0.05）。②AD组大鼠经过原平台所在位置的次数比NS组和C组明显减少（p<0.05）。③AD组大鼠寻找平台所在位置的时间比例（AD组vs.NS组是0.24±0.09s vs.0.34±0.07s,p<0.05；AD组vs.C组是0.24±0.09s vs.0.35±0.01s,p<0.05）和路程比例（AD组vs.NS组是0.27±0.05vs.0.35±0.03,p<0.05；AD组vs.C组是0.27±0.05vs.0.35±0.06,p<0.05）也均要比NS组和C组显著减少；而在NS组和C组中,大鼠寻找平台所用的时间比例和路程比例也均无明显差异（p>0.05）。6.大鼠海马神经元胰岛素信号通路相关蛋白的检测结果：①Aβ1-42寡聚体降低海马神经元IR的表达（AD组vs.NS组是0.25±O.02vs.0.38±0.03,p<0.05；AD组vs.C组是0.25±0.02vs.0.40±0.02,p<0.05）。②IRS-1在AD组的表达水平明显比NS组和C组低（AD组vs.NS组是0.22±0.02vs.0.35±0.03,p<0.05；AD组vs.C组是0.22±0.02vs.0.29±0.06,p<0.05）,而NS组与C组的差异无统计学意义（p>0.05）。③Akt在AD组的表达水平比NS组（0.20±0.03vs.0.37±0.03,p<0.05）和C组（0.20±0.03vs.0.38±0.03,p<0.05）均减少,在NS组与C组无差异（p>0.05）。④Aβ1-42寡聚体使Bc1-2表达降低（AD组vs.NS组是0.20±0.02vs.0.41±0.04,p<0.05；AD组vs.C组是0.20±0.02vs.0.40±0.06,p<0.05）。⑤AD组大鼠海马神经元CREB的表达与NS组（AD组vs.NS组是0.43±0.03vs.0.40±0.03）和C组（AD组vs.C组是0.43±0.03vs.0.41±0.03）相比无明显差异（p>0.05）。研究结论1.采用改良的方法制备Aβ1-42寡聚体能稳定储存,透射电镜鉴定结果符合实验要求,可用于AD模型的制备。2.Aβ1-42寡聚体对星形胶质细胞和神经元均能造成毒性损害,侧脑室持续微量泵入Aβ1-42寡聚体的大鼠出现学习记忆能力下降。3.星形胶质细胞上存在insulin/Akt/EAAT通路,且Aβ1-42寡聚体在浓度为100nmol/L时就能使该信号通路相关底物表达异常；AD大鼠海马神经元胰岛素信号转导通路也能在Aβ1-42寡聚体的作用下发生紊乱。即星形胶质细胞和神经元上的胰岛素信号通路紊乱是AD发病的重要机制之一。4.尽管慢性持续性高血浆胰岛素水平对脑组织有害,但100nmol/L的胰岛素作用于星形胶质细胞30min能保护insulin/Akt/EAAT通路,且对该通路激活有重要意义,即以正确的途径给予合适浓度的胰岛素可能对AD起治疗作用。
李云峰[8]（2004）在《血糖调节相关基因的功能分析》文中指出通过mRNA差异显示本组已经从高血糖刺激的SD大鼠骨骼肌中克隆到一系列与血糖调节相关基因，其中一个基因被命名为Fang1（GenBank收录号为AF399873），经BLAST分析已获得的Fang1基因，它同人的泛酸激酶（pantothenate Kinase 4，PANK4）具有很高的同源性（GenBank收录号为AK001644），二者核苷酸序列同源性达86％，氨基酸序列同源性达到92％，因此我们可以确定Fang1就是大鼠泛酸激酶基因（rat PANK4）。从NCBI分析结果看，PANK4基因从小鼠到人都很保守。分析PANK4的结构域发现，在PANK4蛋白中含有两个保守的结构域，分别为：KOG2201，其同源结构域fumble与细胞分裂有关；KOG4582，其同源结构域DUF89，存在于原核蛋白pfam01937内，但功能未知。 用PANK4基因与绿色荧光蛋白融合表达的质粒转入L-6TG，HEK293T和HeLa细胞中，发现PANK4表达于细胞质中。用免疫兔子获得的PANK4抗体对SD大鼠的骨骼肌、心肌、肺、肝脏、肾脏、胰腺、甲状腺、大脑、小肠和脾脏进行免疫组化检测，发现PANK4多表达于需要较高能量或合成旺盛的细胞中。通过酵母双杂交实验，发现PANK4与SD大鼠的丙酮酸激酶（Pkm2）相互作用，二者的相互作用进一步通过pull-down和免疫共沉淀实验得以验证。在HEK293T和Hela细胞中的细胞免疫荧光实验分析EGFP-PANK4和带FLAG标签的Pkm2瞬间表达，激光共聚焦显微镜观察结果表明，二者共表达于细胞质中。同时，两个结构域（KOG2201和KOG4584）分别与Pkm2进行免疫共沉淀实验后发现，两个结构域都可以与Pkm2蛋白结合，它为确定KOG4584结构域的功能提供了思路，提示KOG4584结构域可能是Pkm2的一个重要调节因子。PANK4可以直接与Pkm2基因相互作用，说明PANK4可以直接参与血糖代谢，它可能是通过调节Pkm2的活性来调节糖代谢的。 Pkm2是糖酵解途径的关键酶之一，它在细胞内有低活性的二体形式和高活性的四体形式，高浓度的葡萄糖可以促进Pkm2的二体迅速转变成为高活性的四体形式，从而促进Pkm2的活性。从Pkm2的活性实验可以看出，PANK4的表达促进Pkm2的活性，同时KOG2201结构域也可以很大程度提高Pkm2的活性，我们推测两个结构域可能分别与两个二体的Pkm2作用，然后促进Pkm2形成高活性的四体。 根据本组在人PANK4基因上发现的与2型糖尿病相关的SNP位点，我们克隆了人PANK4基因，并引进了位于Exon13的阳性SNP位点。为研究该SNP位点对于PANK4的功能的影响奠定了基础。
石玉华[9]（2004）在《中国人多囊卵巢综合征相关因素系列研究》文中研究表明第一部分 多囊卵巢综合征患者体重指数、内分泌、代谢指标相关研究 目的:全面分析多囊卵巢综合征患者体重指数、内分泌、血糖、胰岛素和血脂水平,旨在了解这些指标在PCOS中关系,为PCOS的正确诊断、合理治疗提供依据。 方法:随机选择2003年1月～5月在山东省立医院生殖中心就诊的PCOS患者120例,测量身高、体重,计算体重指数（BMI）,用化学发光法测定血中内分泌、胰岛素水平,用生化仪测定血脂与糖耐量,根据不同指标分组分别计算两组间相关指标的差异。 结果:（1）根据BMI分组后发现肥胖组（BMI≥25kg/m2）空腹、服葡萄糖后30分钟、60分钟、120分钟血糖及胰岛素、胰岛素抵抗指数明显高于瘦型组（BMI<25kg/m2）,差异有统计学意义（P<0.05）,胰岛素敏感指数明显低于瘦型PCOS组,血脂结果显示除甘油三酯肥胖组显著高于对照组外（P<0.05）,其余指标两者之间差异无显著性（P>0.05）。内分泌比较中除LH水平瘦型PCOS组明显高于肥胖型PCOS组外,其余结果差异均无统计学意义（P>0.05）。（2）根据PCOS患者有无胰岛素抵抗分组比较两组间体重指数、各时点血糖、胰岛素、血脂、内分泌水平,结果发现胰岛素抵抗组空腹、服葡萄糖后30’、60’、120’血糖和胰岛素明显高于无胰岛素抵抗组,差异极其显著（P<0.001）,胰岛素抵抗组内分泌与无抵抗组之间差异无显著性,两组间血脂无显著性差异（P>0.05）。（3）按PCOS患者空腹睾酮水平分为高雄激素血症组（T≥50ng/dl）和无高雄激素血症组（T<50ng/dl）,比较两
徐云生[10]（2004）在《健脾调肝、化痰活血改善2型糖尿病胰岛素抵抗的研究》文中研究指明目的： 通过临床与实验研究，观察具有健脾调肝、化痰活血功效的中药胰苏灵煎剂对2型糖尿病IR的疗效，并从细胞与分子水平上，揭示其作用机理，寻求其治疗2型糖尿病IR的理论依据。 方法： 1．理论研究： 对现代医学和中医学研究2型糖尿病IR的现状与进展进行了全面的综述。在此基础上，根据导师经验及临床实践，运用传统的中医理论，首先提出了肝郁脾虚、痰瘀阻滞为2型糖尿病IR的主要病理机制。由此确立健脾调肝、化痰活血法为2型糖尿病IR新的标本兼治之法。并以此组成胰苏灵方剂，进而对本病的理法方药进行了系统的理论探讨。 2．临床研究： 将临床诊断为2型糖尿病IR的120例患者随机分为两组，即治疗组（胰苏灵组）60例，对照组（二甲双胍组）60例，两组均以2个月为一疗程。治疗前后分别观察临床症状、空腹及餐后2h血糖和胰岛素、糖基化血红蛋白、血脂、血流变学、BMI、IR、IAI等指标。结果：胰苏灵能够明显改善患者的临床症状，还具有良好的降糖、降脂、改善血液流变学及IR、增加胰岛素敏感性等综合疗效，总有效率达88.3％，明显优于对照组。 3．实验研究： 胰苏灵可明显降低2型糖尿病IR模型大鼠的（STZ诱导+高脂饮食）体重、血糖、糖基化血红蛋白、胰岛素水平，显著升高胰岛素敏感性指数、提高IAI，改善胰岛素抵抗：明显降低血浆TC，TG，LDL-C，升高HDL-C，具有显著的调节脂质代谢作用：显著降低血流变指标和血小板聚集率，改善血液的粘滞性、聚集性；明显降低血清FFA、血清及脂肪组织TNF-a、血清ET的含量，升高模型大鼠血清NO、NOS及骨骼肌GLUT4mRNA的相对含量，对受体后IR具有显著的治疗作用。山东中医药大学2001届博士学位论文鼠血清一氧化氮（NO）、一氧化氮合酶（Nos）及骨骼肌葡萄糖转运蛋白一4mRNA （GLUT4mRNA）的相对含量，对受体后IR具有显著的治疗作用。结论: 1.脾虚肝郁、痰疲阻滞为2型糖尿病IR的主要病理机制。其中，脾气虚为发病之关键，为病之本;肝气郁滞为发病的重要环节;痰癖阻滞作为病理产物及致病因素，为病之标。健脾调肝、化痰活血法为2型糖尿病IR新的标本兼治之法，以此组成的胰苏灵具有良好的治疗2型糖尿病IR的作用。它是通过纠正脂质代谢紊乱、降低血液流变学指标、减少TNF一a及FFA的水平、调节血管内皮细胞功能、增加GLUT4mRNA的相对含量等多环节、多靶点的综合作用而起到改善IR及降低血糖的效果的。 2.本研究从理论、临床与实验等方面对2型糖尿病IR的病机、治法、疗效与机理进行了系统观察研究，充分验证了对本病的病机演变与治疗方法理论认识的正确性与可行性，为中医药防治2型糖尿病IR提供了一种科学实用的新思路与确实有效的新方法，并为建立中医药治疗2型糖尿病IR的新理论，进一步提高临床疗效，开发出高效低毒的治疗药物，奠定了良好的基础。
二、胰岛素作用原理的研究——Ⅳ.胰岛素受体定位的放射自显影观察（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、胰岛素作用原理的研究——Ⅳ.胰岛素受体定位的放射自显影观察（论文提纲范文）
（1）针刺对胰岛素抵抗干预作用的研究（论文提纲范文）
| 前言 |
| 第一部分 文献研究 |
| 一. IR概念的提出及其意义 |
| 二. IR与相关疾病的关系 |
| 三. IR发生的影响因素 |
| 四. IR的机理研究 |
| 五. IR的干预措施 |
| 六. 中医药防治IR的研究进展 |
| 七. 针刺对IR干预作用的研究现状 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第一节 概述 |
| 一. 动物模型选择 |
| 二. IR的检测方法 |
| 三. 针刺穴位的选择 |
| 第二节 针刺对IR大鼠空腹血糖、血浆胰岛素、C肽及ISI的影响 |
| 一. 材料与方法 |
| 二. 结果 |
| 三. 讨论 |
| 第三节 IR大鼠血清胰岛素抗体含量变化及针刺对其影响 |
| 一. 材料与方法 |
| 二. 结果 |
| 三. 讨论 |
| 第四节 IR大鼠骨骼肌胰岛素受体变化及针刺对其影响 |
| 一. 材料与方法 |
| 二. 结果 |
| 三. 讨论 |
| 第五节 IR大鼠骨骼肌肿瘤坏死因子含量变化及针刺对其影响 |
| 一. 材料与方法 |
| 二. 结果 |
| 三. 讨论 |
| 第六节 IR大鼠骨骼肌GLUT_4mRNA的改变及针刺对其影响 |
| 一. 材料与方法 |
| 二. 结果 |
| 三. 讨论 |
| 第三部分 小结 |
| 一. 文献研究 |
| 二. 实验研究 |
| 三. 本研究的创新之处 |
| 四. 展望 |
| 五. 结语 |
| 附篇 |
| 一. 参考文献 |
| 二. 致谢 |
（2）应用基因芯片技术筛选2型糖尿病骨骼肌胰岛素抵抗相关基因及其鉴定（论文提纲范文）
| 缩略语中英文对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 2型糖尿病骨骼肌胰岛素抵抗差异表达基因的筛选与分析 |
| 引言 |
| 对象与方法 |
| 结果 |
| 分析和讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 2型糖尿病骨骼肌胰岛素抵抗差异表达基因的鉴定 |
| 引言 |
| 对象与材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 分析和讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 |
| 致谢 |
（3）血糖调节相关基因的克隆及其功能的初步研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 试验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 综述一 |
| 综述二 |
| 附录 |
| 致谢 |
（4）TSH与脂肪细胞胰岛素抵抗发生的相关性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、糖尿病大鼠脂肪组织TSHR蛋白表达的研究 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 DM动物模型建立、分组及取材 |
| 1.1.2 两组大鼠附睾脂肪组织蛋白Western blotting检测 |
| 1.1.3 统计方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 DM大鼠模型 |
| 1.2.2 Western Blotting检测大鼠附睾脂肪组织TSHR蛋白表达结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 动物模型的建立 |
| 1.3.2 TSHR的结构及其活化的分子机制 |
| 1.3.3 TSHR在甲状腺以外组织的表达及可能信号传导通路 |
| 1.4 小结 |
| 二、糖尿病大鼠血清TSH水平与胰岛素抵抗发生相关性研究 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 DM动物模型建立、分组及取材 |
| 2.1.2 两组大鼠血清TSH浓度的测定 |
| 2.1.3 两组大鼠附睾脂肪组织蛋白Western Blotting检测 |
| 2.1.4 统计方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 DM大鼠模型 |
| 2.2.2 大鼠血清TSH检测结果 |
| 2.2.3 Western Blotting检测结果 |
| 2.2.4 大鼠血清TSH水平与各检测指标相关性分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 TSH的概述 |
| 2.3.2 胰岛素抵抗概述 |
| 2.3.3 TSH与胰岛素抵抗的关系 |
| 2.4 小结 |
| 三、TSH对3T3-L1脂肪细胞GLUT4表达和转位的影响 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 3T3-L1细胞的培养及诱导分化 |
| 3.1.2 细胞培养基TNF-α浓度的测定 |
| 3.1.3 GLUT4mRNA的测定 |
| 3.1.4 GLUT4总蛋白、膜蛋白、NF-κ Bp65的Western Blotting检测 |
| 3.1.5 I_κB_α/PKAc复合物的免疫共沉淀检测 |
| 3.1.6 统计方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 3T3-L1前脂肪细胞的培养及诱导分化 |
| 3.2.2 TSH对3T3-L1脂肪细胞TNF-α分泌的影响 |
| 3.2.3 TSH对3T3-L1脂肪细胞Phospho-NF-κ Bp65 Ser276的影响 |
| 3.2.4 TSH对3T3-L1脂肪细胞GLUT4表达及转位的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 3T3-L1脂肪细胞模型的建立 |
| 3.3.2 脂肪细胞与胰岛素抵抗 |
| 3.3.3 TSH在脂肪细胞的甲状腺以外效应 |
| 3.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 促甲状腺激素在胰岛素抵抗发生中的作用 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
（5）胰岛素作用原理的研究——Ⅳ.胰岛素受体定位的放射自显影观察（论文提纲范文）
| 材料与方法 |
| (一)标记胰岛素在体内示踪试验 |
| (二)天然胰岛素与标记胰岛素在体内对靶细胞的竞争结合实验 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 图版Ⅰ |
| 图版Ⅱ |
（6）SET在多囊卵巢综合征高雄激素血症中的作用机制研究（论文提纲范文）
| 目录 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 SET 在多囊卵巢综合征和正常育龄妇女卵巢中的定位和差异表达 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 第二部分 SET 对小鼠窦前卵泡雄激素合成的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 第三部分 SET 通过 PP2A 调节小鼠窦前卵泡雄激素合成 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
（7）Alzheimer病星形胶质细胞和海马神经元胰岛素信号通路蛋白变化的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 第一部分 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 第二部分 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 英文论文一 |
| 英文论文二 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（8）血糖调节相关基因的功能分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 载体的构建 |
| 2.2 重组蛋白的表达和纯化 |
| 2.3 多克隆抗体的制备 |
| 2.4 Western blot分析 |
| 2.5 免疫组织化学方法 |
| 2.6 酵母双杂交 |
| 2.7 细胞复苏、传代和冻存 |
| 2.8 真核细胞的转染 |
| 2.9 细胞免疫荧光实验 |
| 2.10 GST Pull-Down实验 |
| 2.11 免疫共沉淀实验 |
| 2.12 丙酮酸激酶表达及活性的测定 |
| 2.13 人泛酸激酶(PANK4)基因的获得 |
| 2.14 2.15 PANK4的蛋白质组学研究 |
| 实验结果 |
| 1.Fang1基因的生物信息学分析 |
| 2.Rat PANK4蛋白质的表达和纯化 |
| 3.抗Rat PANK4蛋白质的多克隆抗体的制备 |
| 4.rat PANK4在组织和细胞中的定位 |
| 5.酵母双杂交文库的构建 |
| 6.构建DNA-BD融合蛋白 |
| 7.获得与PANK4相互作用的蛋白质分子 |
| 8.酵母双杂交中阳性克隆全长cDNA片段的克隆 |
| 9.Pkm2与PANK4蛋白体内结合的验证 |
| 10.PANK4蛋白与Pkm2蛋白体外结合的验证(GST pull-down) |
| 11.PANK4的两个保守结构域与Pkm2体内结合的验证 |
| 12.PANK4对Pkm2的可能的影响 |
| 13.人PANK4基因SNP位点的引入 |
| 14.PANK4蛋白中的KOG2201结构域的功能研究 |
| 15.PANK4蛋白质组的研究 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 文献综述 |
| 致谢 |
（9）中国人多囊卵巢综合征相关因素系列研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 多囊卵巢综合征患者体重指数、内分泌、代谢指标相关研究材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 多囊卵巢综合征患者胰岛素受体基因17外显子基因多态性研究材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 多囊卵巢综合征患者抵抗素基因第2内含子研究材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附综述 抵抗素与多囊卵巢综合征 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
（10）健脾调肝、化痰活血改善2型糖尿病胰岛素抵抗的研究（论文提纲范文）
| 引言 |
| 第一部分 理论研究 |
| 1 现代医学对2型糖尿病胰岛素抵抗的研究进展 |
| 1.1 胰岛素抵抗的历史沿革 |
| 1.2 胰岛素抵抗在2型糖尿病中的地位和作用 |
| 1.3 2型糖尿病胰岛素抵抗的发生机理 |
| 1.4 胰岛素抵抗与2型糖尿病并发症 |
| 1.5 2型糖尿病胰岛素抵抗的防治 |
| 1.6 胰岛素抵抗的检测方法、动物模型及评价 |
| 参考文献 |
| 2 中医对2型糖尿病胰岛素抵抗的研究概况 |
| 2.1 胰岛素抵抗的中医病因病机 |
| 2.2 中医药对2型糖尿病胰岛素抵抗的防治 |
| 2.3 中医药改善胰岛素抵抗的作用机理 |
| 参考文献 |
| 3 存在的问题与展望 |
| 4 对2型糖尿病胰岛素抵抗病因病机的认识 |
| 4.1 脾虚与2型糖尿病胰岛素抵抗 |
| 4.1.1 脾的主要生理与病理 |
| 4.1.2 脾之生理病理与胰岛素的生物学效应 |
| 4.1.3 脾虚为2型糖尿病胰岛素抵抗的主要病理机制 |
| 4.2 肝郁与2型糖尿病胰岛素抵抗 |
| 4.2.1 肝的生理与病理 |
| 4.2.2 情志失调是消渴病发生的常见诱因 |
| 4.2.3 肝气郁滞是2型糖尿病胰岛素抵抗的重要病理机制 |
| 4.2.4 肝郁气滞与2型糖尿病并发症的发生密切相关 |
| 4.3 痰与2型糖尿病胰岛素抵抗 |
| 4.4 瘀血与2型糖尿病胰岛素抵抗 |
| 4.5 脾虚肝郁、痰瘀阻滞是2型糖尿病胰岛素抵抗的基本病机 |
| 4.5.1 肝与痰瘀 |
| 4.5.2 脾与痰瘀 |
| 4.5.3 肝脾相联 |
| 4.5.4 痰瘀相关 |
| 5 治法与方药分析 |
| 5.1 治法分析 |
| 5.1.1 健脾益气以治本 |
| 5.1.2 调畅气机解肝郁 |
| 5.1.3 化痰祛瘀治其标 |
| 5.2 方药讨论 |
| 5.3 药理研究 |
| 参考文献 |
| 第二部分 临床观察 |
| 1 一般资料 |
| 1.1 病例来源 |
| 1.2 病例分组 |
| 1.3 疗前比较 |
| 2 病例选择标准 |
| 2.1 纳入病例标准 |
| 2.1.1 明确诊断为2型糖尿病 |
| 2.1.2 存在胰岛素抵抗 |
| 2.1.3 中医辨证标准 |
| 2.2 排除病例标准 |
| 3 治疗方法 |
| 3.1 基础治疗 |
| 3.2 药物治疗 |
| 3.3 观察指标 |
| 3.4 疗效标准 |
| 3.5 统计方法 |
| 4 结果 |
| 4.1 胰苏灵对2型糖尿病胰岛素抵抗患者临床症状体征的疗效 |
| 4.2 胰苏灵对2型糖尿病胰岛素抵抗患者血糖、糖基化血红蛋白的影响 |
| 4.3 胰苏灵对2型糖尿病胰岛素抵抗患者胰岛素水平、胰岛素敏感指数以及胰岛素抵抗指数的影响 |
| 4.4 胰苏灵对2型糖尿病胰岛素抵抗患者血脂的影响 |
| 4.5 胰苏灵对2型糖尿病胰岛素抵抗患者血液流变学的影响 |
| 4.6 胰苏灵对2型糖尿胰岛素抵抗病患者体重指数的影响 |
| 4.7 胰苏灵对2型糖尿病胰岛素抵抗患者综合疗效比较 |
| 参考文献 |
| 附: 中医症状体征评分标准 |
| 第三部分 实验研究 |
| 1 实验目的 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 实验药物 |
| 2.2 仪器与试剂 |
| 2.3 实验动物 |
| 2.4 药物配制 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 2型糖尿病IR模型大鼠的复制 |
| 3.2 分组及给药 |
| 3.3 实验步骤 |
| 4 统计分析 |
| 5 实验结果 |
| 5.1 胰苏灵对2型糖尿病IR模型大鼠用药前后体重的影响 |
| 5.2 胰苏灵对2型糖尿病IR模型大鼠用药前后空腹血糖的影响 |
| 5.3 胰苏灵对2型糖尿病IR模型大鼠用药前后胰岛素的影响 |
| 5.4 胰苏灵对2型糖尿病IR大鼠治疗前后胰岛素敏感性指数的影响 |
| 5.5 胰苏灵对2型糖尿病IR大鼠血液流变学的影响 |
| 5.6 胰苏灵对2型糖尿病IR大鼠血小板聚集率的影响的影响 |
| 5.7 胰苏灵对2型糖尿病IR大鼠血脂的影响 |
| 5.8 胰苏灵对2型糖尿病IR大鼠肿瘤坏死因子、游离脂肪酸的影响 |
| 5.9 胰苏灵对2型糖尿病IR大鼠的影响一氧化氮、内皮素的影响 |
| 5.10 胰苏灵对2型糖尿病IR大鼠骨骼肌中葡萄糖转运蛋白-4mRNA相对含量的影 |
| 参考文献 |
| 第四部分 效果与分析 |
| 1 临床症状与体征疗效 |
| 2 改善糖代谢 |
| 3 纠正脂质代谢紊乱 |
| 4 对肿瘤坏死因子的减低作用 |
| 5 对游离脂肪酸的积极影响 |
| 6 调节血管内皮细胞功能 |
| 7 增加葡萄糖转运蛋白-4mRNA的相对含量 |
| 8 减肥增敏 |
| 9 降低血液流变学指标 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 致谢 |
四、胰岛素作用原理的研究——Ⅳ.胰岛素受体定位的放射自显影观察（论文参考文献）
- [1]针刺对胰岛素抵抗干预作用的研究[D]. 易玮. 广州中医药大学, 2002(02)
- [2]应用基因芯片技术筛选2型糖尿病骨骼肌胰岛素抵抗相关基因及其鉴定[D]. 林忆阳. 第二军医大学, 2004(01)
- [3]血糖调节相关基因的克隆及其功能的初步研究[D]. 常永生. 中国协和医科大学, 2002(11)
- [4]TSH与脂肪细胞胰岛素抵抗发生的相关性研究[D]. 张雅静. 天津医科大学, 2011(12)
- [5]胰岛素作用原理的研究——Ⅳ.胰岛素受体定位的放射自显影观察[J]. INSULIN RESEAKCH GROUP, DIVISION OP ENDOCRINOLOGY, PEKING INSTITUTE OP ZOOLOGY, ACADEMIA SINICA. 动物学报, 1977(04)
- [6]SET在多囊卵巢综合征高雄激素血症中的作用机制研究[D]. 高玲玲. 南京医科大学, 2013(10)
- [7]Alzheimer病星形胶质细胞和海马神经元胰岛素信号通路蛋白变化的研究[D]. 韩晓娟. 山东大学, 2014(12)
- [8]血糖调节相关基因的功能分析[D]. 李云峰. 中国协和医科大学, 2004(12)
- [9]中国人多囊卵巢综合征相关因素系列研究[D]. 石玉华. 山东大学, 2004(06)
- [10]健脾调肝、化痰活血改善2型糖尿病胰岛素抵抗的研究[D]. 徐云生. 山东中医药大学, 2004(04)