一、伊氏锥虫(T.evansi)的溶性抗原分析及对同源和异源株T.evansi的免疫保护作用(论文文献综述)
刘琴[1](2007)在《东方巴贝斯虫cDNA文库构建及其应用》文中研究指明东方巴贝斯虫(Babesia orientalis)是一种经镰形扇头蜱传播的重要血液原虫,是由本实验室发现和命名的一个巴贝斯虫新种,主要引起水牛巴贝斯虫病。该病在我国长江以南许多省份发生和流行,临床上患病牛以高热、贫血、黄疸和血红蛋白尿等为特征,甚至引起死亡,造成重大的经济损失。本研究首先进行了B.orientalis的分子分类学研究,在此基础上建立了B.orientalis的半巢式PCR诊断方法,然后构建了B.orientalis cDNA文库,以该文库为基础,进行了B.orientalis EST序列的测定和分析,并进一步克隆和原核表达了东方巴贝斯虫热休克蛋白70(HSP70)基因。(1) B.orientalis分子分类学研究利用真核生物18S rRNA通用引物扩增了B.orientalis 18S rRNA基因。测序后BLAST分析表明该虫种属巴贝斯虫。将该基因1,700bp长片段序列与GenBank中15种已知巴贝斯虫的相应序列进行比较分析,建立系统发育树。结果表明,B.orientalis与南非未定种的巴贝斯虫亲缘关系最近,与羊巴贝斯虫亲缘关系较近,与牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫的亲缘关系较远。这一结果从分子生物学上进一步证实了东方巴贝斯虫是一独立种。(2) B.orientalis半巢式PCR诊断方法的建立与应用根据B.orientalis 18S rRNA基因V4多变区设计引物,建立了检测B.orientalis的半巢式PCR(semi-nested PCR),特异性扩增B.orientalis 18S rRNA基因257bp的片段,敏感性试验表明其敏感性达到0.00000012%。运用建立好的半巢式PCR与传统的姬姆萨染色显微镜检的方法对湖北长江以南4个巴贝斯虫病疫区121份水牛血样,385份镰形扇头蜱样品及湖北长江以北3个巴贝斯虫病非疫区71份水牛血样进行了检测,检测结果为:湖北长江以南4个疫区,血液样品镜检5份阳性,半巢式PCR 24份阳性,蜱的样品半巢式PCR 35份阳性;湖北长江以北3个非疫区镜检梨形虫17份阳性,半巢式PCR未检测到阳性样品。针对上述检测结果,利用18S rRNA通用引物扩增非疫区的17份阳性模板,测序后分析均为泰勒虫。实验结果表明:本试验建立的B.orientalis半巢式PCR检测方法具有很高的特异性和敏感度,是一个快速有效的检测方法。从流行病学调查的结果显示:B.orientalis在湖北长江以南广泛分布,流行严重。(3) B.orientalis cDNA文库的构建利用E.Z.N.ATM Blood RNA Kit提取纯化的红细胞期B.orientalis的总RNA,利用SMARTTM cDNA Library Construction Kit反转录合成cDNA第一链,LD-PCR扩增长片段cDNA,连接λTriplEx2噬菌体载体,利用Gigapack?ⅢGold Packaging Kit体外包装,构建了B.orientalis cDNA文库。对原初文库及扩增文库的质量和滴度的监测表明:文库的插入片段在0.5~3.0kb之间,蓝白斑实验表明其重组率约98.8%,原初文库的滴度为2.0×106pfu/mL,扩增文库的滴度为5.8×108pfu/mL。结果表明:成功的构建了B.orientalis cDNA文库。利用制备的抗B.orientalis兔血清对构建好的B.orientalis cDNA文库进行免疫学筛选,筛选到3个强阳性克隆子。测序后BLAST分析分别为:B.orientalis热休克蛋白70(HSP70)基因,核动蛋白(nuclear movement protein)基因及功能未知的假定蛋白(hypothetical protein)基因。(4) B.orientalis EST序列的测定及分析从B.orientalis cDNA文库中随机挑取噬菌斑,转染BW25.8,经PCR鉴定后送插入片段大于300bp的阳性克隆子测序,共测定了324条B.orientalis EST序列,对有效EST序列运用phrap等软件进行拼接,聚类后BLAST分析,得到46个同源性较高的unigene,这些基因分别为:类红细胞表面抗原、类裂殖体表面抗原、代谢相关的磷酸酶及蛋白酶、核糖体蛋白、热休克蛋白70、类热休克蛋白90、肌动蛋白、锌指蛋白等基因的部分或全基因及功能未知的假定蛋白(hypothetical protein)基因部分或全基因。(5) B.orientalis HSP70基因的克隆与原核表达根据EST测序的结果,设计一对特异性扩增B.orientalis HSP70基因开放性读码框(ORF)的引物,克隆了B.orientalis HSP70的ORF全长基因,构建原核表达质粒pGEX-KG-HSP70,在E.coli BL21-CodonPlus中实现了高效表达,表达产物经Western-blot检测分析,结果表明原核表达的HSP70具有较强的免疫反应原性。本研究对B.orientalis的分子分类学研究,从分子水平证实了B.orientalis是一独立的新种。建立的半巢式PCR诊断方法,解决了目前水牛巴贝斯虫病不易准确诊断的难题,对水牛巴贝斯虫病的临床诊断、流行病学调查等具有重要意义。本研究构建的B.orientalis的cDNA文库、EST序列的测定以及HSP70基因的克隆和原核表达为进一步进行B.orientalis分子生物学的研究,获得免疫原性基因和其他基因信息以及水牛巴贝斯虫病的免疫预防、致病机制等研究奠定良好的基础。
张步彩[2](2006)在《鸡柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)DNA疫苗pEtK2-IL-2免疫程序、交叉免疫及稳定性研究》文中研究说明鸡球虫病的免疫预防研究越来越受到人们的重视。寻找免疫原性好的保护性抗原,是完成基因工程苗和核酸疫苗研究的前提。实践证明,激发宿主细胞免疫反应来防治鸡球虫病是更有效的途径之一。DNA疫苗的一个显着优势是刺激机体产生广泛的细胞免疫反应和持久的免疫记忆,尤其是联合应用一些细胞因子,构建调节型DNA疫苗,更有诱人的应用前景。国内外关于DNA疫苗免疫程序的研究,还很少有人涉及,一个好的免疫程序对生产实践具有不可低估的应用价值。本研究对鸡柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)免疫调节型DNA疫苗pcDNA4.0(c)-pEtK2-IL-2、pVAX1-pEtK2-IL-2进行免疫程序筛选,在此基础上再进行交叉免疫与稳定性试验。主要包括以下几个方面: 1 鸡柔嫩艾美耳球虫DNA疫苗pEtK2-IL-2免疫剂量的研究 鸡柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)免疫调节型DNA疫苗pcDNA4.0(c)-pEtK2-IL-2设计了200μg、100μg、50μg、25μg四个剂量组,pVAX1-pEtK2-IL-2设计了100μg、80μg、50μg、25μg四个剂量组,均经胸部肌肉二周龄首免,三周龄加强免疫接种,第四周龄攻鸡柔嫩艾美耳球虫卵囊5×104个/羽。第五周龄剖杀所有试验鸡,观察增重、盲肠病变记分、克盲肠内容物卵囊数和抗球虫指数。结果表明,重组质粒pcDNA4.0(c)-pEtK2-IL-2剂量50μg免疫保护效果最为明显,ACI可达189.90;重组质粒pVAX1-pEtK2-IL-2剂量80μg免疫时ACI可达184.87。说明pcDNA4.0(c)-pEtK2-IL-250μg和pVAX1-pEtK2-IL-2 80μg每羽的免疫组具有较高的抗球虫指数,免疫效果优于其它剂量组。 2 鸡柔嫩艾美耳球虫DNA疫苗pEtK2-IL-2免疫途径的研究 DNA疫苗pcDNA4.0(c)-pEtK2-IL-2以剂量50μg/羽、pVAX1-pEtK2-IL-2以剂量80μg/羽经胸部肌肉注射、颈部皮下注射、翼下静脉注射、口服、滴鼻滴眼五种途径二周龄首免三周龄加强免疫。鸡只处理、攻虫量、观察项目及抗球虫指数计算与上述免疫剂量研究试验相同。实验结果表明,两种DNA疫苗均以胸部肌肉注射免疫保护效果明显,抗球虫指数(ACI)均达180以上。 3 鸡柔嫩艾美耳球虫DNA疫苗pEtK2-IL-2免疫次数和首免日龄筛选试验 鸡E.tenella DNA疫苗pcDNA4.0(c)-pEtK2-IL-2、pVAX1-pEtK2-IL-2分别设计一周龄首免不加强免疫、一周龄首免二周龄加强免疫、二周龄首免不加强免疫、二周龄首免三周龄加强免疫四个试验组。pcDNA4.0(c)-pEtK2-IL-2以剂量50μg/羽、
穆桂萍[3](2005)在《伊氏锥虫VSG抗原库的建立及其免疫保护效果检测》文中提出锥虫(Trypanosome)能通过不断改变膜表面变异糖蛋白(variable surface glyco- protein,简称 VSG),逃避宿主免疫反应。VSG 是公认的强免疫原,但只能使机体产生针对同型虫体的免疫保护,而对异型虫体不起保护作用。有研究表明锥虫在感染动物早中期产生的变异体数目是有限的,且这些变异体出现的重复率很高,最高可达 60%,我们称这些变异体为优势变异体。我们设想提纯全部优势变异体 VSG,建立优势 VSG 抗原库,期望该抗原库能抑制虫体变异或抑制虫体的第二次变异,从而对动物起到较好的免疫保护作用,克服因抗原变异引起的免疫失败。 根据锥虫在兔体内可产生不同变异体的特性,将伊氏锥虫云南水牛单克隆株顺序感染五只新西兰大白兔,分离到 50 个单克隆群体,经间接免疫荧光实验证明:后四只兔子出现第一次虫血症高峰的变异体,均包含在第一只兔体内分离得到的 9个优势变异体之内;这 50 个变异体分属于 20 个抗原型,即共分离到 20 个优势变异体。提纯所有优势变异体表面糖蛋白,制备 VSG 抗原库。用不同剂量抗原库免疫小鼠后进行攻虫,结果显示:经四次免疫后,20μg 剂量对随机抽取的两个变异体100 条虫体的保护率分别达到 83%和 67%;改变免疫方法,经三次免疫后的保护效果不理想;用单一 VSG 抗原免疫小鼠,接种来自不同兔体的同型虫体,不能起到相应保护作用。 该抗原库的最佳免疫保护率达到 80%以上,它的建立为伊氏锥虫疫苗的研制开辟了一条新的途径。
王权,沈杰[4](1999)在《锥虫疫苗的研究进展》文中研究指明为了掌握锥虫病免疫预防苗的研究概况和今后研究方向,对国内外有关文献资料作了综述,包括锥虫弱毒苗、强毒苗、亚单位苗、抗独特型抗体苗、基因工程苗等各类疫苗的制备方法和使用效果,还包括免疫佐剂和免疫接种方法等方面内容,并分析了未能成为实用疫苗的原因,指出了今后研制疫苗的途径。
蔡建平,汪志楷,沈永林,李祥瑞,潘红杰[5](1998)在《伊氏锥虫(T.evansi)的溶性抗原分析及对同源和异源株T.evansi的免疫保护作用》文中认为 以超声波粉碎法裂解纯化的不同地理株伊氏锥虫(T.evansi)单虫克隆群体,提取可溶性蛋白组分,进行 SDS-PAGE 和 Western blotting 分析,结果表明经 SDS-PAGE 分析,不同株 T.evansi 的可溶性蛋白组分中都包括20~30种蛋白成分,相对分子量(Mr)范围大约为7.9~109.5D,主要蛋白成分的 Mr 约为49~66kD 之间,Wertern botting 分析揭示不同株 T.evansi 间有10~20条为特异抗体所识别的抗原组
二、伊氏锥虫(T.evansi)的溶性抗原分析及对同源和异源株T.evansi的免疫保护作用(论文开题报告)
(1)论文研究背景及目的
此处内容要求:
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例:
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
(2)本文研究方法
调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、伊氏锥虫(T.evansi)的溶性抗原分析及对同源和异源株T.evansi的免疫保护作用(论文提纲范文)
(1)东方巴贝斯虫cDNA文库构建及其应用(论文提纲范文)
中文摘要 |
Abstract |
缩略语表 |
第一章 文献综述 |
1.1 牛的巴贝斯虫病研究进展 |
1.1.1 形态学及超微结构 |
1.1.2 传播媒介蜱 |
1.1.3 核酸组成及特点 |
1.1.4 侵入红细胞阶段原虫配体和宿主受体之间的分子作用 |
1.1.5 免疫机制 |
1.1.6 流行病学 |
1.1.7 诊断及治疗 |
1.1.8 免疫预防 |
1.2 cDNA文库的研究进展 |
1.2.1 cDNA文库的载体系统 |
1.2.2 cDNA文库的构建方法进展 |
1.2.3 寄生虫cDNA文库的研究 |
1.2.4 蜱的cDNA文库的研究 |
1.3 EST技术及其应用 |
1.3.1 EST技术的原理和步骤 |
1.3.2 EST技术的应用 |
1.3.3 EST在寄生虫基因研究中的应用 |
第二章 东方巴贝斯虫18S rRNA基因的克隆和系统发育分析 |
2.1 研究的目的意义 |
2.2 材料与方法 |
2.2.1 试验材料 |
2.2.2 试验方法 |
2.3 结果与分析 |
2.3.1 PCR扩增水牛巴贝斯虫18S rRNA基因 |
2.3.2 水牛巴贝斯虫18S rRNA全基因序列的测定及与GenBank数据库中其它巴贝斯虫序列的比较 |
2.3.3 系统发生树 |
2.4 讨论 |
第三章 东方巴贝斯虫半巢氏PCR诊断方法的建立及应用 |
3.1 研究的目的意义 |
3.2 材料与方法 |
3.2.1 试验材料 |
3.2.2 试验方法 |
3.3 结果与分析 |
3.3.1 显微镜检查东方巴贝斯虫 |
3.3.2 semi-nested PCR检测结果 |
3.3.3 临床血液样品的检测 |
3.3.4 蜱样品的检测 |
3.3.5 SacII酶切鉴定 |
3.3.6 测序鉴定 |
3.3.7 统计学分析 |
3.4 讨论 |
第四章 东方巴贝斯虫cDNA文库的构建及初步鉴定 |
4.1 研究的目的意义 |
4.2 材料与方法 |
4.2.1 实验材料 |
4.2.2 实验方法 |
4.3 结果与分析 |
4.3.1 cDNA文库的构建 |
4.3.2 cDNA文库的免疫学筛选 |
4.4 讨论 |
第五章 东方巴贝斯虫表达序列标签(ESTs)的测定与分析 |
5.1 研究的目的意义 |
5.2 材料与方法 |
5.2.1 实验材料 |
5.2.2 实验方法 |
5.3 结果与分析 |
5.3.1 有效EST的获得 |
5.3.2 序列提交 |
5.3.3 片段重叠群分析及基因表达丰度分析 |
5.3.4 东方巴贝斯虫EST序列同源性分析 |
5.3.5 对已知功能基因的分析 |
5.4 讨论 |
第六章 东方巴贝斯虫HSP70基因的克隆与原核表达 |
6.1 研究的目的意义 |
6.2 材料与方法 |
6.2.1 试验材料 |
6.2.2 试验方法 |
6.3 结果与分析 |
6.3.1 基因的PCR扩增、克隆及序列测定 |
6.3.2 重组质粒在E.coli中的表达与表达产物分析鉴定 |
6.3.4 表达产物的存在形式 |
6.3.5 最佳诱导表达条件的确定 |
6.4 讨论 |
结论 |
参考文献 |
致谢 |
附录1 |
附录2 |
(2)鸡柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)DNA疫苗pEtK2-IL-2免疫程序、交叉免疫及稳定性研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
英文摘要 |
前言 |
文献综述 |
第一章 鸡抗球虫感染的免疫机制 |
1 鸡球虫的感染和宿主应答特征 |
2 鸡抗球虫感染的细胞免疫 |
3 鸡抗球虫感染的体液免疫 |
4 细胞因子介导的抗球虫免疫 |
参考文献 |
第二章 DNA疫苗的研究进展 |
1 DNA疫苗概念及其优点 |
2 DNA疫苗的免疫机制 |
3 DNA疫苗免疫效果的几个影响因素 |
4 球虫DNA疫苗的研究概况 |
参考文献 |
第三章 疫苗交叉免疫保护研究进展 |
1 寄生虫疫苗交叉免疫保护研究进展 |
2 细菌、病毒及其它微生物疫苗交叉免疫保护研究进展 |
参考文献 |
实验研究 |
第四章 鸡柔嫩艾美耳球虫免疫调节型DNA疫苗pEtK2-IL-2免疫剂量的研究 |
1 试验材料 |
2 试验方法 |
3 结果与分析 |
4 讨论 |
参考文献 |
英文摘要 |
第五章 鸡柔嫩艾美耳球虫免疫调节型DNA疫苗pEtK2-IL-2免疫途径的研究 |
1 试验材料 |
2 试验方法 |
3 结果与分析 |
4 讨论 |
参考文献 |
英文摘要 |
第六章 鸡柔嫩艾美耳球虫免疫调节型DNA疫苗pEtK2-IL-2首免日龄和免疫次数筛选试验 |
1 试验材料 |
2 试验方法 |
3 结果与分析 |
4 讨论 |
参考文献 |
英文摘要 |
第七章 鸡柔嫩艾美耳球虫免疫调节型DNA疫苗pEtK2-IL-2交叉免疫保护性试验 |
1 试验材料 |
2 试验方法 |
3 结果与分析 |
4 讨论 |
参考文献 |
英文摘要 |
第八章 鸡柔嫩艾美耳球虫免疫调节型DNA疫苗pEtK2-IL-2稳定性试验 |
1 试验材料 |
2 试验方法 |
3 结果与分析 |
4 讨论 |
参考文献 |
英文摘要 |
全文总结 |
致谢 |
攻读学位期间论文发表情况 |
(3)伊氏锥虫VSG抗原库的建立及其免疫保护效果检测(论文提纲范文)
1 引言 |
1.1 锥虫和锥虫病简介 |
1.2 有关锥虫研究的四个术语 |
1.2.1 Clone |
1.2.2 Stock |
1.2.3 Stabilate |
1.2.4 The First Relapse Population |
1.3 锥虫的VSG 分离纯化 |
1.4 锥虫的单克隆 |
1.4.1 动物体内克隆 |
1.4.2 体外克隆 |
1.5 锥虫抗原变异体 VAT 的建立和鉴定 |
1.6 锥虫的体外培养 |
1.7 锥虫疫苗研究进展 |
1.7.1 致弱锥虫制苗 |
1.7.2 强毒锥虫制苗 |
1.7.3 抗独特型抗体制苗 |
1.7.4 基因工程疫苗 |
1.7.5 亚细胞成分疫苗 |
1.7.6 锥虫疫苗展望 |
1.8 伊氏锥虫抗原变异规律研究 |
1.9 锥虫感染宿主后引起的免疫反应 |
2 实验一伊氏锥虫 VSG 的提纯和鉴定 |
2.1 材料 |
2.1.1 虫株 |
2.1.2 实验动物 |
2.1.3 主要试剂 |
2.2 方法 |
2.2.1 虫体复苏 |
2.2.2 虫体增殖 |
2.2.3 伊氏锥虫的纯化 |
2.2.4 伊氏锥虫优势变异体 VSG 抗原的提纯 |
2.2.5 兔源抗 VAT 抗血清采集 |
2.2.6 VSG 的SDS-PAGE 纯度和分子量鉴定 |
2.2.7 Wester-blot 半干法鉴定 VSG |
2.3 结果 |
2.3.1 提纯 VSG 的分子量测定 |
2.3.2 提纯 VSG 的 Western-blot 鉴定 |
2.4 讨论 |
3 实验二 VSG 抗原库免疫保护率检测 |
3.1 材料 |
3.1.1 抗原 |
3.1.2 实验动物 |
3.1.3 主要试剂 |
3.2 方法 |
3.2.1 VSG 抗原库对不同变异体免疫保护效果实验 |
3.2.2 不同抗原注射量的免疫保护效果检测 |
3.3 结果 |
3.3.1 VSG 抗原库对不同变异体免疫保护效果实验结果 |
3.3.2 不同抗原注射量的免疫保护实验结果 |
3.4 讨论 |
3.4.1 VSG 抗原库对不同变异体免疫保护效果讨论 |
3.4.2 初探该抗原库最佳免疫剂量结果讨论 |
4 实验三 VSG 抗原库及单一抗原免疫保护效果检测 |
4.1 材料 |
4.1.1 抗原 |
4.1.2 实验动物 |
4.1.3 主要试剂 |
4.2 方法 |
4.2.1 试验方案 |
4.2.2 血清制备 |
4.2.3 ELISA 检测方法的建立 |
4.3 结果 |
4.3.1 免疫保护率检测 |
4.3.2 ELISA 检测结果 |
4.3.3 三次免疫后血清抗体动态变化趋势 |
4.4 讨论 |
4.4.1 免疫失败的分析总结 |
4.4.2 免疫方法对免疫效果的影响 |
4.4.3 锥虫感染宿主后引起特异性抗体的变化 |
4.4.4 该抗原库建立的意义 |
5 结论 |
6 存在的问题 |
致谢 |
参考文献 |
作者简介 |
(4)锥虫疫苗的研究进展(论文提纲范文)
1 致弱锥虫制苗 |
1.1 单因子致弱 |
1.1.1 辐射致弱 |
1.1.2 药物致弱 |
1.1.3 传代致弱 |
1.2 多因子致弱 |
2 强毒锥虫制苗 |
2.1 同种虫株制苗 |
2.2 异种虫株制苗 |
3 亚细胞成分制苗 |
3.1 虫体表膜变异糖蛋白制苗 |
3.2 表面非变异蛋白制苗 |
3.3 可溶性抗原制苗 |
3.4 分泌代谢抗原苗 |
3.5 基因工程苗 |
4 抗独特型抗体苗 |
5 免疫方法 |
6 展望 |
四、伊氏锥虫(T.evansi)的溶性抗原分析及对同源和异源株T.evansi的免疫保护作用(论文参考文献)
- [1]东方巴贝斯虫cDNA文库构建及其应用[D]. 刘琴. 华中农业大学, 2007(02)
- [2]鸡柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)DNA疫苗pEtK2-IL-2免疫程序、交叉免疫及稳定性研究[D]. 张步彩. 南京农业大学, 2006(02)
- [3]伊氏锥虫VSG抗原库的建立及其免疫保护效果检测[D]. 穆桂萍. 内蒙古农业大学, 2005(05)
- [4]锥虫疫苗的研究进展[J]. 王权,沈杰. 中国兽医寄生虫病, 1999(04)
- [5]伊氏锥虫(T.evansi)的溶性抗原分析及对同源和异源株T.evansi的免疫保护作用[J]. 蔡建平,汪志楷,沈永林,李祥瑞,潘红杰. 中国农业大学学报, 1998(S2)