一、约氏疟原虫孢子增殖的影响因素观察（论文文献综述）
丁艳[1]（2020）在《FGL2在疟原虫感染中的作用及机制研究》文中指出疟疾仍然是全球严重威胁人类生命健康的的公共卫生问题之一,主要发生在世界热带和亚热带地区,是造成撒哈拉以南非洲地区患者发病和死亡的重要原因。据WHO报道,2019年全球仍有2亿疟疾病例,并导致40余万疟疾患者死亡（WHO,2019）。疟疾生命周期包括蚊体内的蚊期（mosquito stage）,以及人体内的红外期（又称肝期,liver stage）及红内期（blood stage）。疟原虫在人体内两个时期的发育中,机体免疫系统能够感知疟原虫并作出相应的免疫应答。在红外期发育中,肝细胞内的MDA5-MAVS-IRF3/IRF7信号通路能够识别疟原虫RNA并触发I型干扰素免疫反应[1],通过募集和诱导NK/NKT细胞分泌IFN-γ杀灭肝期疟原虫。在红内期发育中,机体抗感染的固有免疫和适应性免疫均能有效活化应对原虫增殖。感染早期,机体的树突状细胞（dendritic cells,DCs）[2]和巨噬细胞[3]能迅速通过TLR2/4或TLR9等受体识别入侵的疟原虫,并释放促炎因子,增强DCs和巨噬细胞对其胞内疟原虫的杀伤,在早期控制疟原虫的增殖。感染晚期,活化的DCs则激活后续机体适应性免疫应答,增强机体对入侵疟原虫的清除作用。例如,疟原虫特异性抗体能阻断裂殖体入侵红细胞[4],并可通过调理作用增强吞噬细胞吞噬能力[5]。CD4+T细胞通过分泌IFN-γ和TNF-α等促炎因子杀灭红内期原虫[6],并能有效辅助B细胞产生体液免疫应答[7];而CD8+T细胞通过产生perforin和granzyme B等效应分子对最终清除疟原虫及控制慢性感染非常重要[8]。然而,无论是红外期原虫还是红内期原虫,在机体强大的免疫攻击下仍然能够存活并持续增殖来完成生命周期。究其原因,主要在于疟原虫在长期进化过程中已经发展了一系列的免疫逃避或抑制策略。在红外期,子孢子通过SPECT-1、SPECT-2（sporozoite microneme protein essential for cell traversal,SPECT）及血小板反应蛋白相关匿名蛋白（thrombospondin-related anonymous protein,TRAP）的帮助进行滑动运动,突破皮肤的机械障碍进入肝脏[9];能穿过枯否细胞（kupffer cell,KC）逃避吞噬,同时还能调节KC细胞因子表达谱,导致Th1细胞因子的下调和Th2细胞因子的上调以确保安全通过[10]。此外,子孢子表面环子孢子蛋白（circumsporozoite protein,CSP）可与KC表面的低密度脂蛋白受体相关蛋白（low-density lipoprotein receptor-related protein,LRP-1）和蛋白多糖相互作用,增加细胞内cAMP/EPAC水平,阻止活性氧的形成[11]。子孢子还能迫使KC发生凋亡,或通过下调KC表面MHC-Ⅰ类分子及共刺激分子的表达水平进而抑制KC的抗原提呈能力[12];穿越完成后,子孢子能利用肝细胞表面受体硫酸肝素蛋白多糖（heparin sulfate proteoglycans,HSPGs）发生识别并启动入侵信号[13],其顶端微线体释放的蛋白P52和P36能与肝细胞肾上腺素A2受体（EphA2）相互作用,对形成纳虫空泡作用关键[14,15];侵入肝细胞后,子孢子隐匿在肝细胞来源的纳虫空泡膜（parasitophorous vacuole membrane,PVM）包围的纳虫空泡（parasitophorous vacuole,PV）中,假定的致密颗粒蛋白UIS3和UIS4被释放并运输到PVM,UIS3能协助子孢子逃避肝细胞自噬[16]。在红内期,疟原虫的免疫逃避和免疫抑制手段更加丰富多样。一方面,它能通过多种手段隐匿自己躲避宿主免疫识别。比如胞内寄生就是最原始但最有效的一种躲藏方式,这能使疟原虫与宿主免疫细胞隔离开来。其次,红内期疟原虫能在感染红细胞表面表达PfEMP-1分子,通过与宿主血管内皮细胞表面相关受体ICAM-1或CD36等分子结合,粘附在宿主各重要脏器逃避脾脏的免疫监视[17];另外,感染疟原虫红细胞还能“纠集”正常红细胞和血小板分别形成花环状凝集物[18]和团块[19],躲避免疫细胞的识别杀伤。最后,红内期原虫还能通过竞争性抗原结构域阻止疟原虫特异性抗体的结合[20]、通过分子模拟减弱疟原虫蛋白的免疫原性[21]等方式逃避机体免疫攻击。疟原虫在红内期不同阶段通过Var基因表达可变抗原蛋白,有助于它们在宿主免疫系统中的伪装[22]。另一方面,红内期疟原虫非常擅长操纵宿主自身免疫功能元件为己所用。比如具有较强免疫调节作用的调节性T细胞（regulatory cell,Treg）,来自人疟的研究显示,红内期感染将导致机体Treg细胞的数量不断增加,较低的Treg细胞频率与较少的寄生虫载量和更有利的疾病结局有关[23,24]。纵向研究表明,临床疟疾患者的Treg细胞频率高于感染前或恢复期患者[23],感染前较高的Treg细胞频率与凶险型疟疾风险增加相关[25]。此外,广泛表达于DC细胞、B细胞和T细胞表面的PD-1,是机体另一种具有免疫抑制作用的负向调控分子,也常被红内期原虫利用抑制机体抗疟免疫应答。来自人疟的研究显示,流行区患者体内的CD4+T细胞高表达PD-1将引起其功能衰竭。鼠疟研究发现,CD4+T细胞的功能在阻断PD-1后得到显着增强并能快速清除红内期感染[26]。另外,PD-1还参与了红内期原虫对B细胞的耗竭,因为研究发现阻断PD-1可使CD4+Tfh和生发中心B细胞（germinal center B cell,GC B）数量显着增多并产生更高滴度的疟原虫特异性抗体。新近发现的纤维蛋白原样蛋白2（fibrinogen-like protein 2,FGL2）,是机体另一种具有较强免疫抑制能力的负向调控分子,越来越多的证据表明FGL2参与了多种疾病的发病机制,如妊娠失败[27]、肿瘤生长[28]、病毒感染[29-31]、同种异体排斥反应[32]和自身免疫性疾病[33,34]。FGL2有两种不同的结构形式:膜结合型FGL2（membrane FGL2,mFGL2）和可溶性FGL2（soluable FGL2,sFGL2）。mFGL2主要表达于巨噬细胞和内皮细胞表面,是一种具有丝氨酸蛋白酶活性的直接凝血酶原酶,它能通过一种非特异途径将凝血酶原切割成凝血酶,从而在免疫相关凝血中发挥促凝作用[35-37]。相比之下,sFGL2主要由CD4+CD25+调节性T细胞表达[34,38-40],功能上不同于mFGL2,sFGL2具有免疫调节能力[41,42]。那么,疟原虫是否可能通过FGL2抑制或逃避机体的免疫攻击呢?在本论文研究之前,课题组对FGL2在红内期疟原虫感染中的作用进行了调查,结果显示,红内期感染能显着诱导sFGL2表达,后者可促进红内期原虫增殖。后续的机制研究发现,sFGL2在疟疾红内期中存在与其他疾病不同的作用机制,表现为s FGL2并不抑制宿主抗红内期感染的适应性免疫（抗体、CD4+T细胞和CD8+T细胞在FGL2缺失后功能并未增强）。相反,sFGL2通过表达于细胞表面的FcγRIIB受体,抑制巨噬细胞产生趋化因子MCP-1,使募集到脾脏的NK细胞和NKT细胞显着减少,致使IFN-γ表达降低,从而使机体抗疟原虫感染的固有免疫变得微弱,进而促进红内期疟原虫增殖（博士论文,FGL2在红内期疟原虫发育中的作用和机制研究）。虽然我们理清了sFGL2抑制抗红内期固有免疫的作用主线,但其中还有许多部分需要进一步完善补充。比如其它种属疟原虫感染是否诱导sFGL2分泌,以及sFGL2的促进红内期原虫增殖的作用是否在其它种属疟原虫感染中具有普遍性,sFGL2的表达与原虫率的相关性,MCP-1产生的分子机制,以及s FGL2抑制巨噬细胞产生MCP-1的胞内分子机制等等。因此,在本论文研究中,我们将通过第一部分的研究内容回答上述系列问题。此外,鉴于FGL2在红内期的重要作用,课题组还进一步调查了FGL2是否在红外期感染时发挥作用并初步探讨了作用机制,这是本课题第二部分的研究内容。第一部分FGL2在红内期疟原虫感染中的作用及机制研究一、红内期疟原虫感染诱导sFGL2表达上调,后者显着促进红内期原虫增殖1、红内期疟原虫感染显着诱导sFGL2表达上调,且sFGL2的表达水平与疟原虫载量呈正相关课题组前期研究发现夏氏疟原虫感染将引起sFGL2过度分泌,在本论文研究中我们对这一现象的普遍性进行了调查,结果显示其它种属疟原虫感染（无论是伯氏疟原虫ANKA株还是约氏疟原虫BY265株感染）,也能显着诱导血清中sFGL2表达上调,sFGL2表达水平的变化与原虫增殖曲线的起伏较吻合,与夏氏疟原虫感染结果一致。相关性分析实验结果更加表明,sFGL2的表达水平与疟原虫载量均呈正相关。2、sFGL2是红内期疟原虫逃避宿主杀伤的新途径FGL2缺失后能使约氏疟原虫和伯氏疟原虫红内期原虫增殖受到显着抑制,而通过回补rFGL2,将使红内期原虫增殖能力恢复至WT小鼠水平,该结果与夏氏疟原虫实验结果一致,进一步充分证明了s FGL2在红内期疟原虫发育中的促进作用。另外,对FGL2敲除小鼠的凝血功能进行分析,免疫荧光实验比较两种感染小鼠脾脏纤维蛋白的沉积时发现,无论是在红内期感染前还是感染进行时,fibrin在两种小鼠脾脏中的表达均无显着性差异。3、调节性T细胞（CD4+Foxp3+CD25+regulatory T cell,Treg）是分泌sFGL2的主要细胞来源之一课题组前期通过系列实验证明CD4+Foxp3+CD25+Treg是分泌sFGL2的主要细胞来源之一。为进一步验证此结论,我们随后进行了Treg细胞的过继转移实验。通过将来自WT小鼠和FGL2敲除小鼠的Treg细胞分别过继到FGL2敲除的感染小鼠体内,发现接受WT小鼠来源的Treg细胞的FGL2-/-感染小鼠,其红内期原虫增殖能力恢复至WT感染小鼠水平,而接受FGL2敲除小鼠来源的Treg细胞的FGL2-/-感染小鼠,其原虫率并未发生显着性改变。二、sFGL2显着抑制抗红内期感染的固有免疫1、特异耗竭巨噬细胞后,FGL2-/-小鼠增强的抗红内期感染的免疫保护力消失课题前期研究已证实,FGL2-/-感染小鼠中巨噬细胞作用关键,是机体抗感染的固有免疫得到增强的始动因素之一,但我们并没有进行反向实验验证其作用。在本节实验中,通过对FGL2-/-小鼠注射Clodronate Liposomes[43]特异耗竭巨噬细胞,发现当巨噬细胞缺失后,FGL2-/-小鼠体内原虫增殖能力显着增强,其原虫率恢复至WT感染小鼠水平,并在感染10天后原虫造成FGL2-/-小鼠死亡。此外,缺失巨噬细胞的FGL2-/-感染小鼠,血清中MCP-1和IFN-γ的含量急剧下降,甚至显着低于WT感染小鼠。以上结果再次证明,巨噬细胞在FGL2-/-小鼠增强的抗红内期感染的固有免疫中作用十分关键。2、红内期疟原虫代谢产物可被TLR2识别,而不是TLR9,诱导巨噬细胞分泌MCP-1接下来课题组对巨噬细胞产生MCP-1的分子机制作了研究。通过分离WT小鼠和TLR2敲除小鼠的BMDM（Bone marrow-derived macrophages,BMDM）,加入感染疟原虫红细胞裂解产物pRBC进行刺激并检测MCP-1的表达,发现当TLR2缺失后,其BMDM受pRBC刺激后分泌MCP-1的能力较WT BMDM相比,显着降低,而TLR9拮抗剂ODN 2088的加入,则对WT BMDM产生MCP-1的能力没有明显影响。3、红内期疟原虫利用sFGL2,通过FcγRIIB受体抑制巨噬细胞分泌MCP-1课题前期通过构建巨噬细胞条件缺失FcγRIIB受体小鼠(FcγRIIBfl/fl Lyz2-cre),在体外实验证实,sFGL2通过FcγRIIB受体抑制巨噬细胞分泌MCP-1。为再次巩固这一结论,我们对FcγRIIBfl/fl Lyz2-cre小鼠进行了夏氏疟原虫红内期感染实验,以FcγRIIBfl/fl小鼠作为对照,收集了两种小鼠感染后第6天的血清,检测其中MCP-1和IFN-γ的表达,发现与FcγRIIBfl/fl小鼠相比,FcγRIIBfl/fl Lyz2-cre小鼠血清中MCP-1和IFN-γ的含量均显着增加。4、sFGL2-FcγRIIB信号通过抑制TLR2信号通路下游JNK分子磷酸化,阻碍巨噬细胞分泌MCP-1课题前期研究已知晓,红内期原虫代谢产物可被TLR2识别进而活化巨噬细胞分泌MCP-1,TLR2下游NF-κB信号通路和MAPK信号通路均参与MCP-1的产生。通过检测两条信号通路上游共同的信号分子TAK1,下游信号分子p65、MKK4、MKK7、JNK和ERK的活化情况,发现只有MAPK信号通路的JNK分子的磷酸化受到显着抑制,说明sFGL2-FcγRIIB抑制信号作用的胞内位点在JNK分子上。为进一步验证此结论,我们利用FcγRIIBfl/fl Lyz2-cre小鼠中进行了相同实验。结果与RAW264.7细胞株实验一致,在对照小鼠的BMDM中,JNK分子的活化在rFGL2存在时受到显着抑制。而在FcγRIIBfl/fl Lyz2-cre小鼠的BMDM中,JNK的磷酸化不受rFGL2的影响,这同时也进一步证实了前面已得出另一结论:sFGL2通过FcγRIIB受体发挥抑制作用。5、sFGL2在人疟中可能通过相同的分子机制发挥重要作用鉴于人疟患者中sFGL2的表达水平在感染后显着升高,课题组接下来探讨了sFGL2在人疟中的作用机制。通过在人巨噬细胞株THP-1中进行的刺激实验和Western Blot实验,发现sFGL2同样通过FcγRIIB受体发挥抑制作用,且sFGL2-FcγRIIB信号同样显着抑制了JNK信号分子的磷酸化。以上实验提示,sFGL2在恶性疟中可能通过相同的分子机制发挥重要作用,促进疟原虫增殖。第二部分FGL2在红外期疟原虫感染中的作用及机制研究一、红外期疟原虫感染将显着诱导宿主FGL2表达上调1、WT小鼠肝脏FGL2 mRNA表达水平在红外期疟原虫感染后显着上调通过按蚊叮咬和子孢子接种两种感染方式,观察了感染42小时后,实验小鼠肝脏FGL2 mRNA表达水平有无变化。结果显示,无论哪种感染方式,红外期疟原虫均显着诱导实验小鼠肝脏FGL2 mRNA表达上调,且随子孢子接种剂量的升高而升高。2、红外期疟原虫感染可能诱导mFGL2,而不是sFGL2,的表达通过设置不同剂量,多个时间点,收集子孢子感染小鼠血清,检测其中sFGL2的含量。结果发现无论哪个剂量的子孢子感染,sFGL2的浓度在疟原虫红外期整个发育周期内始终没有发生变化,而当疟原虫进入红内期感染后,sFGL2的表达水平却显着升高。鉴于子孢子感染小鼠肝脏总体FGL2 mRNA水平明显升高,提示红外期疟原虫感染可能诱导mFGL2,而不是sFGL2,的表达。二、FGL2促进疟原虫红外期的发育1、红外期原虫在FGL2缺失后其增殖受到显着抑制随后我们应用约氏疟原虫BY265株子孢子感染了FGL2敲除小鼠,采用定量PCR的方法检测了感染小鼠肝脏疟原虫载量,结果发现FGL2缺失后,疟原虫在肝脏的增殖与正常对照相比受到显着抑制,说明FGL2确实能促进疟原虫红外期的发育。2、子孢子感染的FGL2敲除小鼠,红内期出现时间晚于WT小鼠且初始原虫率更低为进一步确定FGL2的作用,我们还对红外期感染的FGL2敲除小鼠其红内期原虫出现时间及初始原虫血症进行了观察,结果显示,当使用低剂量的子孢子感染时,FGL2敲除小鼠体内红内期原虫出现时间明显晚于对照WT小鼠,甚至有的FGL2敲除小鼠不会出现红内期感染。此外,出现红内期原虫的FGL2敲除小鼠,其初始原虫率显着低于WT小鼠。三、FGL2通过抑制IFN-γ分泌促进红外期疟原虫的发育1、FGL2缺失后,感染小鼠肝脏促炎细胞因子mRNA表达水平显着升高感染小鼠缺失FGL2后,肝脏促炎因子IFN-γ和TNF-α的转录水平较对照小鼠显着升高,IL-12在两组小鼠之间没有显着性差异,而抗炎因子IL-10 mRNA的表达水平在两组小鼠间也无明显差异。此结果提示,FGL2敲除小鼠体内降低的肝脏虫荷可能是其表达升高的促炎因子作用的结果。2、FGL2缺失后,感染小鼠血清中促炎细胞因子含量显着增加通过CBA法流式检测了两组子孢子感染小鼠血清中,包括促炎因子和抗炎因子在内共6种细胞因子的浓度。实验结果与肝脏定量检测一致,促炎因子IFN-γ、TNF-α、IL-12及MCP-1的浓度在FGL2-/-感染小鼠中显着升高。FGL2-/-感染小鼠中抗炎因子IL-10的含量也明显高于对照小鼠。此结果进一步证明升高的促炎因子可能在FGL2-/-感染小鼠中发挥抗疟作用。3、IFN-γ是FGL2敲除小鼠抑制肝期疟原虫增殖的主要效应分子随后选取了抗红外期免疫中作用最重要的IFN-γ进行反向验证实验。通过对FGL2敲除小鼠注射抗IFN-γ抗体（anti-IFN-γmAb）,发现当FGL2敲除小鼠缺失IFN-γ后,其肝脏虫荷恢复至WT感染小鼠水平。此外,耗竭IFN-γ后,FGL2-/-感染小鼠红内期出现时间提前,甚至还要早于WT感染小鼠,红内期初始原虫率也显着升高并高于WT感染小鼠。这些结果充分说明,IFN-γ是FGL2敲除小鼠抑制肝期疟原虫增殖的主要效应分子。
张翠[2]（2018）在《约氏疟原虫CRISPR/Cas9技术的建立和ApiAP2转录因子家族基因功能分析》文中提出疟疾是由疟原虫感染导致的疾病,目前仍然是严重的全球公共卫生负担。虽然疟原虫基因组已经完成测序,但是多数基因的功能仍然未知。迄今为止,疟原虫基因功能研究依然缺乏高效的分析工具。新兴的基因编辑技术——规律成簇间隔短回文重复（CRISPR）和Cas9核酸蛋白酶系统（CRISPR/Cas9）,已成功应用到多个物种的基因组编辑和修饰。本工作中,我们利用疟疾模型—鼠约氏疟原虫,建立了基于CRISPR/Cas9技术的单基因和多基因的修饰系统。首先,我们构建了单质粒表达系统pYC,实现了 Cas9蛋白、sgRNA和同源重组模板的共同导入。Cas9/sgRNA在基因组特异位点精确产生DNA双链断裂,然后通过同源修复,实现了三种常用类型的基因修饰。我们实现了 100%效率的基因敲除（Pysera2,PyPDH/E1α）,22%-45%效率的基因加标签（PY03652）和核苷酸替换（Pyhsp70）。pYC系统修饰后虫株因为有质粒残留,不能进行下一轮的遗传修饰。针对疟原虫基因功能研究中多基因修饰的技术需求,在pYC质粒基础上,引入负筛选基因——胞嘧啶脱氨酶和尿苷磷酸转移酶双功能酶（yfcu）,和正筛选基因——人二氢叶酸还原酶（hdhfr）融合表达,建立了 pYCm单质粒系统。通过乙胺嘧啶正筛选和5氟胞嘧啶负筛选的顺序操作,可以获得没有细胞内质粒残留的基因修饰虫株。通过pYCm系统,我们首先给内源基因Pyp28加了mCherry标签,进一步在Pyp28::mCherry虫株上敲除了动合子运动相关基因Pyctrp和Pycdpk3。CRISPR/Cas9技术的建立为疟原虫基因功能研究提供了高效工具。疟原虫生活史包括哺乳动物和按蚊两个宿主的多个发育阶段,每一个发育阶段都有独特的基因表达。令人意外的是,除了和植物中Apetala2转录因子类似的转录因子家族ApiAP2,疟原虫缺乏真核生物普遍存在的转录因子种类。虽然已知某些ApiAP2基因对于疟原虫发育有影响,但是仍有很多基因功能尚未阐明。我们系统地分析了约氏疟原虫中PyApiAP2的基因功能。利用CRISPR/Cas9技术的pYC质粒或者pYCm质粒系统,我们对26个PyApiAP2基因家族成员中的24个进行了尝试敲除,其中12个可以获得敲除克隆。然后对敲除克隆进行了全生活周期的表型分析,12个成功敲除的基因有10个在有性期和蚊期发育有功能,有两个基因之前在任何种属疟原虫中都没有研究过,它们是Pyap2-g3（PY17X1417400）和Pyap2-o5（PY17X1317000）。有 7 个基因成功加了标签,蛋白表达分析显示出和功能的一致性。我们给PyAP2-G3在N端融合了 6×HA标签,发现它大部分在细胞质中定位,少量在细胞核中定位。红细胞期和配子体时期都是类似的情况;同样的,我们也给PyAP2-05加了 6×HA标签并通过间接免疫荧光检测蛋白表达,PyAP2-05在裂殖体时期主要是细胞核定位,少量胞质定位,在配子体、合子和发育中的动合子都是完全细胞核定位,在成熟动合子中不表达（或者是表达量低检测不到）。另外,有两个基因（PY17X0523100和PY17X1323500）可以被成功敲除,但是没有发现表型缺陷,基因敲除虫株可以完成整个生活史。PY17X0523100在伯氏疟原虫的同源基因没有被成功敲除。我们的工作首次在约氏疟原虫中对PyApiAP2基因家族进行了系统地功能研究,揭示了疟原虫在有性阶段和蚊期传播的关键PyApiAP2,为深入理解转录因子介导的疟原虫基因表达调控提供了新角度。
高涵[3]（2018）在《鸟苷酸环化酶beta调控疟原虫动合子运动的分子机制的研究》文中研究说明疟疾是经蚊虫为媒介传播的由疟原虫感染引起的寄生虫传染病。动合子是疟原虫在蚊期进行有性生殖发育形成的特殊细胞形态阶段。动合子的定向运动能力是疟原虫建立蚊期感染的关键。鸟苷酸环化酶beta（GCβ）-cGMP信号通路对于动合子运动必不可少,然而GCβ是如何启动动合子运动,以及GCβ本身是如何被调控的到目前为止尚不明确。疟原虫的GCβ作为一个双功能蛋白,具有N端P4-ATPase结构域（ALD）和C端的鸟苷酸环化酶结构域（GCD）,构成一个双功能蛋白。这种N端ALD + C端GCD的结构形式在多种原生动物物种中普遍存在,但是具体原因仍然未知。本研究使用约氏疟原虫作为模型,通过利用CRISPR/Cas9基因修饰技术,首次揭示了疟原虫GCβ是在动合子时期唯一表达的鸟苷酸环化酶。GCβ蛋白在动合子时期具有的奇特的顶背侧（ADS）集中定位。GCβ的ADS集中快速发生于动合子发育成熟以后,决定了动合子运动的起始。GCD的突变实验显示,ADS集中的GCβ依赖其cGMP合成活性,促进了 PKG的激活和动合子运动。利用内源cGMP探针Green cGull我们进一步证实了 GCβ的cGMP合成活性。通过对负调控cGMP信号的关键基因PDEδ的敲除,以及Zaprinast处理实验,结合PKG抑制剂Compound 2共处理实验,我们揭示了 GCβ-cGMP信号通路必须在疟原虫动合子发育过程中被PDEδ沉默,以防止PKG过早激活对于动合子发育和形态维持的不利影响。动合子成熟后GCβ的ADS转移集中,通过与PDEδ蛋白实现时空分离,激活下游PKG促进动合子运动。为了解释GCβ的ADS定位机制,进一步的,通过T2A介导的蛋白分离,我们证实了 ALD结构域对于GCβ在ADS的集中定位与动合子运动是必须的。然而,序列分析结构显示ALD在P4-ATPase的关键功能位点上存在突变,因此并不具有磷脂翻转酶Fliββase的活性。通过对于P4-ATPase的辅因子CDC50的筛选,我们找到了与GCβ直接结合的调控蛋白,命名为CDC50A。CDC50A与GCβ的基因敲除表型和蛋白表达定位与完全一致,机制研究显示CDC50A直接调控了 GCβ的蛋白稳定性,但是并不直接接介导GCβ的ADS集中。进一步的,Tryβsin实验和2-BMP处理等实验显示疟原虫的内膜复合物IMC可能介导了 GCβ的集中。针对未知IMC蛋白的筛选发现ISP1对于GCβ的ADS集中和动合子运动具有关键作用。ISP1与GCβ具有相同的ADS聚集,并形成蛋白复合物。我们首次成功敲除了 ISP1,从功能上证实了 ISP1对GCβ的ADS定位的调控作用。进一步的,我们发现通过酰化修饰的ISP1锚定于IMC膜上,介导了质膜（PPM）定位的GCβ的ADS集中。本论文的工作系统的揭示了动合子运动的上游调控机制。首先在动合子发育的过程中,CDC50A通过结合稳定GCβ,调控了 GCβ的阶段特异性表达,防止GCβ的降解并（可能）促进了 GCβ的转运。此时cGMP-PKG信号通路被PDEδ沉默。动合子成熟后,GCβ转运到PPM膜上,被通过酰化修饰在IMC集中定位的ISP1捕获并锚定下来,形成ADS集中。GCβ的ADS集中在空间上与PDE8实现分离,打破cGMP的合成分解平衡,导致局部cGMP合成活性提高并激活PKG信号通路,启动动合子的方向性运动。本论文的工作揭示的 GCβ促进 ODGM（The ookinete directional gliding motility,动合子定向迁移运动）的新的分子机制,进一步揭示的GCβ的ALD的功能,鉴定出来的新的基因家族CDC50,以及揭示的ISP1的功能为阻断疟原虫蚊期传播途径的策略开发,提供了新靶点。
王盼[4]（2020）在《青蒿素对斯氏按蚊传疟能力的影响及其分子机制研究》文中研究表明疟疾（malaria）是一种由疟原虫感染,通过按蚊叮咬为主要传播途径的严重危害人类健康的传染病。青蒿素（artemisinin,ART）类药物不仅是恶性疟治疗的首选药物,还常用于出现疟疾疫情区域的全民服药以消除潜在传染源。在全球很多疟疾流行区,当疟疾疫情出现或加重时,除了加大监测力度、及早发现疟疾感染者外,疫情流行区域的全民服药策略已被广泛推广。在全民服药中当按蚊叮咬了已服青蒿素类药物的正常人后,其体内的青蒿素及其代谢产物将有机会进入按蚊体内。如果该按蚊再次叮咬疟疾感染者时,其体内已吸入的青蒿素及其代谢产物是否影响该按蚊的疟疾传播能力,目前尚未见相关报道。因此,阐明青蒿素对按蚊传疟能力的影响对于判断青蒿素全民服药策略是否合理具有重要的现实意义和科学价值。天然免疫系统是斯氏按蚊（Anopheles stephensi）抵御外源病原体和有害刺激的主要途径,也是影响其传播疟疾能力的重要因素。Toll样受体（toll-like receptor,TLR）是目前发现最重要的模式识别受体,通过接头蛋白分子将胞外刺激信号传递至细胞内,活化髓样分化因子88（Myeloid differentiation factor 88,MyD88）并促进Rel 1核移位,激活斯氏按蚊体液免疫,产生抗菌肽（Antimicrobial peptide,AMPs）等效应分子,抑制疟原虫侵染从而降低按蚊传疟能力。同时,人群和动物研究发现,疟疾感染后可改变宿主肠道微生物群落构成,重塑宿主肠道菌群可影响蚊天然免疫状态和疟原虫的发育。然而,关于天然免疫系统和肠道菌群在青蒿素影响斯氏按蚊传疟能力中的作用和机制,目前尚无相关研究报道。本研究聚焦这一科学问题开展研究。方法:1、第一部分:青蒿素预处理对斯氏按蚊传疟能力的影响利用斯氏按蚊-约氏疟原虫动物模型,用青蒿素灌胃预处理的正常小鼠供3～5天龄斯氏按蚊饲血,3天后让该按蚊吸食约氏疟原虫感染的小鼠进行疟疾攻击感染,感染后第9天解剖蚊胃,检查疟原虫卵囊的发育情况并计数,分析比较两组按蚊的疟原虫感染率和感染度差异。2、第二部分:天然免疫Toll信号通路在青蒿素对按蚊传疟能力影响中的作用研究首先利用生物信息学方法对MyD88基因进行序列分析,并利用Real-time PCR方法比较分析斯氏按蚊在不同时期及疟原虫感染前后MyD88分子的转录水平,以探讨MyD88分子在斯氏按蚊抗约氏疟原虫感染中的作用;继而,利用Real-time PCR方法比较分析Toll信号通路抗疟关键分子MyD88、Rel 1和Cactus等在青蒿素处理组和对照组间的转录水平差异,以期阐明斯氏按蚊Toll信号通路在青蒿素对按蚊传疟能力影响中的作用。3、第三部分:肠道菌群在青蒿素对按蚊传疟能力影响中的作用研究利用16S rDNA高通量测序法对斯氏按蚊肠道菌群进行研究,比较分析青蒿素处理组和正常对照组在吸感染血前后肠道菌群变化情况;并根据蚊肠道菌群变化,分析肠道菌群是否参与了青蒿素对按蚊传疟能力的影响。结果:1、青蒿素预处理显着降低斯氏按蚊传疟能力。青蒿素处理组的感染率（88.15%）略低于对照组（90.4%）,两组间无统计学显着性差异（P=0.558）。但青蒿素处理组斯氏按蚊的疟原虫感染度显着低于对照组（P<0.001）。提示,青蒿素预处理可降低斯氏按蚊对约氏疟原虫的传播能力。2、天然免疫Toll信号通路在青蒿素对按蚊传疟能力影响中具有重要作用。本部分研究结果显示,MyD88是斯氏按蚊Toll信号通路的上游关键分子,在疟原虫感染后的多个时间点表达上调,提示该分子在蚊抗疟原虫感染中发挥重要作用。在青蒿素预处理及疟原虫感染后的不同时间点,斯氏按蚊Toll信号通路中的活化关键分子MyD88和Rel 1的转录水平在青蒿素处理组较对照组均有上调,而抑制分子Cactus则有下调趋势。该研究结果提示,青蒿素预处理可通过上调按蚊Toll信号通路而增强其对疟原虫的抵抗力,从而抑制按蚊的传疟能力。3、肠道菌群参与了青蒿素对按蚊传疟能力的影响。实验发现,青蒿素处理后按蚊肠道菌群发生明显变化,且部分抗疟菌群（如沙雷氏菌属等）显着增加,提示青蒿素可能通过改变肠道菌群影响按蚊的传疟能力。结论:1、本研究首次证实青蒿素预处理可降低按蚊传疟能力。2、蚊天然免疫Toll信号通路参与了青蒿素对按蚊传疟能力的影响。3、青蒿素可能通过改变蚊肠道菌群增强按蚊抗疟原虫能力。上述研究结果将有利于明确青蒿素的应用对按蚊传疟能力的影响及其分子机制,以指导青蒿素类药物的合理推广应用和制定相应的对策,为通过媒介防制阻断疟疾传播奠定理论基础。本研究也将为我国在消除疟疾行动中的策略制定提供参考,进一步巩固我国的疟疾防控成果。
智媛[5]（2018）在《约氏疟原虫鸟苷酸环化酶GCα调控配子体激活的功能和蛋白结构分析》文中研究表明疟疾是按蚊叮咬人体而感染疟原虫所引起的传染性疾病,每年造成数亿感染病例和数十万死亡病例。疟原虫具有复杂的生活史,脊椎动物和按蚊两个宿主,无性生殖和有性生殖两种生殖方式。疟原虫在不同的发育阶段展现出不同的细胞形态和生理状态。按蚊吸食含有配子体的血液后,配子体进入中肠并在按蚊代谢物黄尿酸（xanthurenic acid,XA）的诱导下开始有性生殖,即配子体—配子—合子—动合子—卵囊—子孢子等发育过程。雌雄配子体激活形成雌雄配子是有性生殖的第一步,也是疟原虫完成全生活周期和病原传播的重要阶段。尽管已有研究证明在人疟原虫（恶性疟）和鼠疟原虫（伯氏疟）中,3’,5’-环化鸟苷一磷酸（cyclic guanosine monophosphate,cGMP）信号通路参与调控配子体的激活,但仍没有直接证据证明鸟苷酸环化酶α（Guanylate Cyclase α,GCα）是该信号通路中催化GTP产生cGMP的鸟苷酸环化酶。本课题基于对PyGCα蛋白结构和功能的分析,证明GCα蛋白在配子体激活过程中所起到的调控作用。首先我们构建了 gcα基因内源加标签虫株,对GCα蛋白进行全生活周期的表达分析显示,该蛋白在红内期的滋养体、裂殖体、配子体和蚊期的卵囊和子孢子阶段都有表达,在细胞膜和细胞质中均有定位并且主要呈点状分布。接着我们对gcα基因进行启动子替换,以研究GCα蛋白在疟原虫有性发育过程中所起的作用,结果表明在配子体激活过程中,cGMP信号通路中是由GCα,催化GTP产生第二信使cGMP,从而调控下游一系列的细胞反应,GCβ并不参与此过程。GCα蛋白的拓扑结构分析,结果发现该蛋白可能存在翻译后修饰,导致了剪切的发生,产生了具有N端P4型ATP酶结构域（P4-type ATPase Domain,AD）和鸟苷酸环化酶催化结构域（Guanylate Cyclase Domain,GCD）两个蛋白,在疟原虫生活周期中行使功能。本研究以约氏疟原虫17XNL为模型,运用CRISPR/Cas9系统对GCα蛋白进行研究,证实该蛋白在配子体激活过程中的调控作用,并揭示了其独特的拓扑结构可能存在剪切。本研究为进一步研究GCα蛋白打下了基础,也为开发疟疾传播阻断疫苗提供了新的靶标。
洪仁杰[6]（2019）在《约氏疟原虫微管蛋白结合辅助因子A（TBCA）的功能初步研究》文中进行了进一步梳理疟疾是一种通过蚊媒传播的传染性寄生虫病,在世界多国造成上亿的感染病例和数十万的死亡病例。疟原虫作为低等单细胞生物,存在有性生殖和无性生殖两种生殖方式。而细胞骨架蛋白在疟原虫各个生活时期均有表达,是潜在的抗疟靶点。少数疟原虫无性期细胞会有性生殖阶段的雌雄配子体,该细胞进入按蚊体内后受到刺激会发生激活,形成雌雄配子。雄配子体激活的标志为鞭毛丝的组装和伸出,此过程涉及微管的组装。尽管已有文献报道微管蛋白结合辅助因子A（TBCA）参与微管的组装,但仍没有直接证据证明TBCA蛋白与疟原虫雄配子体的激活有关。本课题基于对基因tbca的功能分析,揭示了TBCA蛋白参与雄配子体激活过程。首先将约氏疟原虫TBCA蛋白与不同种类疟原虫进行多序列比对后发现其存在一个保守的TBCA domain。我构建了tbca基因内源加标签虫株,对TBCA蛋白进行全生活周期的表达分析,显示该蛋白在疟原虫的全生活周期中均有表达,且在配子体时期与Tubulin α或者是β蛋白呈现出部分共定位情况。通过三次独立敲除获得三个tbca敲除单克隆虫株,结果表明,tbca敲除的疟原虫不能经蚊媒在全新的健康小鼠上建立疟疾的感染,并且通过回补约氏疟原虫tbca基因可回复表型缺陷。进一步的实验表明,基因tbca敲除导致雄配子体出丝率较之野生型雄配子体出丝率显着下,且并非出丝延迟,而是出丝阻滞。免疫荧光结果表明tbca基因的敲除不影响配子体激活时破裂红细胞膜和疟原虫囊膜的能力。通过蚊传杂交实验和免疫荧光标记激活后的雌配子体P28蛋白表达实验,验证tbca敲除后造成的表型缺陷为单雄配子体缺陷造成,雌配子体功能正常。本论文的工作以约氏疟原虫17XNL为模型,运用CRISPR/Cas9系统对TBCA进行研究,考察其在配子体激活时的作用,并尝试揭示该蛋白与微管蛋白之间的相互关系。本研究为进一步研究TBCA蛋白打下基础,并为抗疟靶点的药物研发提供了新靶点。
刘聪[7]（2019）在《约氏疟原虫双荧光配子体报告虫株的构建和应用》文中研究表明疟疾是由疟原虫感染哺乳动物引起并经按蚊传播的传染性疾病。疟原虫具有复杂的生活周期,在脊椎动物和按蚊两种宿主交替寄生发育,包括无性阶段和有性阶段。疟原虫有性阶段发育起始于配子体,且配子体是疟原虫从脊椎动物宿主向按蚊传播的唯一和必要细胞阶段。疟原虫有性阶段的发生发育是目前疟原虫生物学研究的热点,但由于在红细胞阶段疟原虫雌配子体和雄配子体形成比例低（低于0.1%）,单性别配子体难以独立分离和收集,限制了疟原虫配子体生物学研究的深入开展。前人在恶性疟原虫和伯氏疟原虫中,通过转染导入荧光蛋白基因,获得雌雄配子体荧光报告虫株,结合流式细胞术分离获得较高纯度的雌雄配子体细胞,用于相关研究的开展。但是,上述转基因都是在基因组中特定座位插入启动子驱动的荧光蛋白编码基因的表达元件。这种转基因方式,是否能够实现精确的单性别雌雄配子体荧光蛋白表达,依然存在不确定性。本研究基于CRSIPR/Cas9基因修饰方法,在约氏疟原虫中,选择雌配子体特异表达的基因ccp2和雄配子体特异表达的基因Dhcl,分别内源融合mCherry标签和GFP标签。免疫荧光实验和活细胞荧光观察证实,ccp2:;mCherry虫株在雌配子体中特异表达红色荧光蛋白;Dhcl::gfp虫株在雄配子体中特异表达绿色荧光蛋白。进一步将两个虫株通过蚊传实验进行遗传杂交,成功获得雌/雄配子体分别表达特异荧光的DFsc7双荧光报告虫株。分析比较三个荧光虫株生长和发育的能力,结果表明,标签虫株在脊椎动物宿主（无性期增殖速率、配子体生成）和按蚊媒介（卵囊、唾液腺子孢子）的生长均与野生型一致;三个标签虫株均无质粒残留,可在其基础上进行其他靶位点的遗传修饰。配子体阶段荧光特异性表达的标签虫株被用于以下三个方面:1.通过流式细胞仪分析疟原虫在雄配子体激活过程DNA倍性的变化;2.分析雌雄配子受精过程DNA倍性的变化;3.通过流式分选收集到高纯度的单性别配子体。本研究中制备的三个标签虫株,丰富了约氏疟原虫有性发育阶段生物学研究的细胞平台和实验工具。
李贞魁[8]（2018）在《疟原虫在按蚊早期发育过程中ApiAP2转录因子的功能研究》文中进行了进一步梳理疟疾是一种由疟原虫感染引起并经按蚊传播的寄生虫病,每年造成40余万人死亡。疟原虫是单细胞原虫,生活周期经历两个宿主:雌性按蚊和哺乳动物。在这两个宿主体内的交替寄生和发育过程中,伴随着疟原虫多种细胞形态的转化,这些转化依赖于基因表达的精确调控。疟原虫在按蚊体内发育的早期,出现了三次细胞形态转化。当疟疾病人被按蚊叮咬时,雌雄配子体进入按蚊消化道中。在此,雌/雄配子体被激活成雌/雄配子,雌/雄配子受精后形成合子,这是第一次形态转化;第二次形态转化发生在合子转化成动合子的过程中;动合子穿越中肠上皮定殖于体腔侧,形成卵囊,完成第三次形态转化。上述细胞形态转化过程中,调控基因表达的转录因子和相关机制尚未阐述清楚。ApiAP2蛋白是疟原虫中最主要的转录因子家族,包含26个成员,参与了疟原虫生活史不同阶段的基因转录调控。在之前的研究中,我们使用CRISPR/Cas9技术,通过反向遗传学的手段,系统分析了鼠约氏疟原虫17XNL虫株26个ApiAP2成员的表达和功能。本文将对影响约氏疟原虫在按蚊体内发育的三个转录因子（AP2-O3、AP2-O4和AP2-O2）,进行详细功能阐述。ap2-o3基因敲除后,配子体生成和雄配子体出丝过程正常;但动合子转化能力显着降低,且没有成熟动合子产生;重要的是,△ap2-o3虫株不能建立按蚊感染,致使疟原虫按蚊传播阻断。蛋白表达分析显示,AP2-O3只在配子体时期表达,无性期和动合子时期不表达;此外,AP2-03特定表达于雌配子体,并且定位于细胞核。将△ap2-o3虫株分别与雌/雄配子体缺陷虫株杂交发现,AP2-O3只影响了雌配子体的激活,雄配子体激活不受影响。ap2-o3敲除后,雌配子体激活过程中P28基因转录本翻译抑制的解除受到影响,进一步确认了 AP2-O3在雌配子体激活中的作用。此外,在另一个虫株敲除ap2-o3,也重复出相同结果。疟原虫生活周期的蛋白表达分析发现,AP2-O3表达阶段和疟原虫生活周期不同发育阶段的基因组DNA复制呈现明显的负相关:AP2-O3只表达在雌配子体和成熟卵囊两个阶段,正好是疟原虫缺失DNA复制的两个阶段。野生型和△ap2-o3虫株的雌配子体转录组比较发现,DNA复制和修复通路多数基因的转录水平在ap2-o3敲除后上调,荧光定量PCR分析了上调的26个基因,结果和转录组分析一致。在雌配子体激活形成的合子细胞中,AP2-O3阴性的细胞核倍性明显高于AP2-O3阳性的细胞核;进一步在合子细胞中过表达AP2-O3,导致细胞核倍性停止从2N向4N增加,与此同时,合子转化为成熟动合子显着下降。上述结果表明,AP2-O3转录抑制DNA复制和修复的基因表达,从而调控疟原虫DNA复制。在ap2-o3敲除后转录水平显着下调的270个基因中,我们选择了两个功能未知的基因（lc6和zk11）进行了深入分析。ap2-o3敲除后,雌配子体中lc6和zk11基因的转录水平和蛋白水平均显着下调。进一步分析发现,基因敲除虫株△ lc6和△ zk11均具有正常的配子体生成和雄配子体出丝能力,但动合子转化能力显着降低,蚊期中肠卵囊发育严重受阻,这与△ap2-o3表型一致。上述结果表明,AP2-O3通过转录激活lc6和zk1 1调控动合子发育。ap2-o4敲除虫株的表型分析显示,其无性期,配子体和动合子发育均与野生型一致;然而,感染按蚊后完全没有卵囊形成。从p28::mCherry出发的ap2-o4敲除虫株进入按蚊中肠后,其卵囊数量随着发育时间而减少,最终不能形成卵囊。生活周期蛋白表达分析表明,AP2-O4在除无性期以外的整个生活周期均有表达,且定位于细胞核。这表明AP2-O4可能调控了参与动合子转化成卵囊这一阶段的基因转录。对17XNL和△ap2-o4的配子体和动合子时期样本进行转录组分析发现,ap2-o4敲除后有数百个基因的转录水平发生了变化。荧光定量PCR分析部分ap2-o4敲除后转录下调的基因,确认了转录组分析结果。ap2-o2敲除后,无性期、配子体及动合子发育均与野生型一致,感染按蚊后卵囊数量和唾液腺子孢子数量显着下降。在p28::mCherry虫株敲除ap2-o2,其进入按蚊寄生的早期具有正常数量的卵囊,发育到中期时卵囊数量较野生型显着降低。生活周期蛋白表达分析表明,AP2-O2表达于除成熟动合子以外的其他时期,且是细胞核定位。以上结果表明,AP2-O2可能参与调控了疟原虫蚊期发育必需基因的表达。AP2-O2,AP2-O3和AP2-O4这三个转录因子调控疟原虫在按蚊寄生的早期发育。疟原虫蚊期发育是疟疾传播的必需过程,该阶段特别是早期阶段的基因表达调控的深入研究,有助于寻找疟原虫发育的关键基因,为疟疾药物的研发提供新的作用靶标。
刘燕婧[9]（2019）在《5’非编码区内含子在约氏疟原虫基因表达调控中的作用和功能》文中研究表明疟疾（Malaria）是全球三大传染病之一,每年仍有40万以上的人口因疟疾死亡。疟疾的病原体疟原虫有十分复杂的生活史,在雌性按蚊（Anopheles）和脊椎动物之间交替发生有性生殖与无性生殖。在不同发育阶段中复杂的基因表达调控是疟原虫适应不同宿主环境的关键。疟原虫的基因表达调控受转录因子、启动子、增强子、非编码RNA和表观遗传学等因素调控。本课题组之前在约氏疟原虫（Plasmodium yoelii）的研究中发现300多个5’或3’非翻译区（untranslated region,UTR）内含子,但UTR内含子对疟原虫基因表达的影响与功能尚未研究。本研究中,我们构建了双荧光素酶报告基因质粒,选择约氏疟原虫5’UTR部分只含单一内含子的四个基因,通过电击穿孔将质粒转染到约氏疟原虫17XL中,利用荧光素酶报告基因分析包含和不包含内含子的5’UTR活性。我们发现其中三个基因,包含5’UTR内含子质粒的电转虫株表达量约为不包含5’UTR内含子质粒的1-3倍,这一结果表明5’UTR内含子可以增加约氏疟原虫的基因表达。我们在不同亚型的约氏疟原虫虫株中发现了一致的结果,通过电击转染编码可调控翻译肿瘤蛋白基因（translationallly-controlled tumor protein,PyTCTP）包含与不包含5’UTR内含子的质粒,发现包含5’UTR内含子的电转虫株表达量明显更高,约为不包含内含子质粒的3倍。接着我们构建了Pytctp基因5’UTR部分四个嵌合型内含子的双荧光素酶报告基因质粒,其中包括1)和2)将内含子片段设计为原序列的一半;3)颠倒内含子的原序列;4)打乱内含子的原序列。然后我们将质粒电击转染到约氏疟原虫17XL虫株中,并观察不同结构的内含子对基因表达的影响。我们发现电转包含原序列一半的内含子嵌合质粒对表达有显着影响,而颠倒原序列与打乱原序列的内含子嵌合质粒则对表达没有显着影响,结果表明,5’UTR内含子的大小可以影响基因表达。为了进一步研究5’UTR内含子对蛋白表达的影响,我们利用CRISPR/Cas9系统在PyTCTP蛋白N端插入了3×HA标签,同时修饰5’UTR内含子部分,产生包含与不包含内含子的两种虫株。通过电击转染、药物筛选和克隆,我们分别获得了包含与不包含5’UTR内含子并且插入3×HA标签的克隆。与野生型虫株17XL相比,基因修饰的克隆对红内期疟原虫的生长并没有显着影响。但通过蛋白免疫印迹发现,具有5’UTR内含子的克隆蛋白表达较高,约为不包含5’UTR内含子的5-7倍。通过免疫荧光分析也发现不包含5’UTR内含子在红内期的各个阶段的荧光信号显着降低。本研究表明,5’UTR内含子可以增强约氏疟原虫的基因表达,为研究UTR内含子在疟原虫基因调控中的作用提供了重要的思路。
陈佩惠,屠呦呦,王凤芸,李凤舞,杨岚[10]（1998）在《双氢青蒿素对约氏疟原虫在蚊体内发育的影响》文中进行了进一步梳理目的：观察双氢青蒿素（ｄｉｈｙｄｒｏｑｉｎｇｈａｏｓｕ，ＤＱＨＳ）对约氏疟原虫在斯氏按蚊体内发育的影响。方法：受染疟原虫小鼠一次性经口灌喂不同浓度ＤＱＨＳ药液后，供蚊虫吸血，应用光镜和电镜观察对照组和用药组的疟原虫在蚊体内的发育情况。结果：ＤＱＨＳ对疟原虫配子体有一定的抑制作用，其作用强度与配子体成熟程度和用药剂量不同有关。未成熟配子体对药物较敏感；随着药物剂量的增加，卵囊和子孢子的阳性率和密度随之逐渐下降；但１８０ｍｇ或２４０ｍｇ／ｋｇ用药组对子孢子密度的影响的差别无显着性意义。电镜观察６０ｍｇ／ｋｇ作用１６ｈ后，用药组的蚊胃上卵囊（１２ｄ－１３ｄ解剖蚊），出现膜受损，甚至胞质空泡化。１２０ｍｇ／ｋｇ药量对蚊体内３日龄卵囊作用１６ｈ，卵囊仍继续发育，比较对照组和用药组的卵囊和子孢子密度，两组间差别无显着意义（Ｐ＞０．０５）；两组卵囊超微结构形态亦无明显差异。结论：ＤＱＨＳ影响约氏疟原虫配子体感染性而减少蚊媒传播，但对蚊体内子孢子增殖期不起直接的抑制作用
二、约氏疟原虫孢子增殖的影响因素观察（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、约氏疟原虫孢子增殖的影响因素观察（论文提纲范文）
（1）FGL2在疟原虫感染中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一部分 FGL2在红内期疟原虫感染中的作用及机制研究 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 红内期疟原虫感染诱导SFGL2表达上调并促进原虫增殖 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 SFGL2显着抑制抗红内期感染的固有免疫 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 FGL2在红外期疟原虫感染中的作用及机制研究 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 红外期疟原虫感染显着诱导宿主FGL2表达上调 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 红外期疟原虫感染在FGL2缺失后受到显着抑制 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 FGL2 抑制IFN-Γ分泌促进红外期疟原虫的发育 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 抗疟疾红外期感染免疫与疟原虫免疫逃避 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间发表的文章 |
| 致谢 |
（2）约氏疟原虫CRISPR/Cas9技术的建立和ApiAP2转录因子家族基因功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 疟疾 |
| 1.2 疟原虫的生活史 |
| 1.3 疟原虫的分子遗传学 |
| 1.4 CRISPR/Cas9技术在疟原虫领域的发展 |
| 1.5 疟原虫的配子体发育 |
| 1.5.1 配子体发生过程 |
| 1.5.2 配子体发生的相关基因 |
| 1.5.3 配子体发生的多层次调控 |
| 1.6 疟原虫的蚊期发育 |
| 1.6.1 配子发育和动合子形成 |
| 1.6.2 动合子穿越按蚊中肠上皮细胞 |
| 1.6.3 卵囊的发育 |
| 1.6.4 卵囊子孢子的释放 |
| 1.6.5 子孢子入侵按蚊唾液腺 |
| 1.7 疟原虫的转录调控 |
| 1.8 本研究的目的和意义 |
| 第二章 疟原虫CRISPR/Cas9单基因修饰方法的建立 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 疟原虫虫株、实验小鼠以及按蚊 |
| 2.2.2 质粒的构建 |
| 2.2.3 疟原虫的电击转染 |
| 2.2.4 RNA的提取和RT-PCR |
| 2.2.5 蛋白免疫印迹(Western blotting) |
| 2.2.6 活细胞荧光观察 |
| 2.2.7 间接免疫荧光 |
| 2.2.8 流式细胞术 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 pYC质粒构建:Cas9和sgRNA的表达 |
| 2.3.2 基因敲除(knock out) |
| 2.3.3 基因加标签(knock in) |
| 2.3.4 核苷酸替换(nucleotide replacement) |
| 2.3.5 脱靶效应(off target)分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 本研究的创新点 |
| 2.4.2 本研究的优势 |
| 2.4.3 本研究的局限性 |
| 第三章 疟原虫CRISPR/Cas9多基因修饰方法的建立 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 疟原虫虫株、实验小鼠以及按蚊 |
| 3.2.2 载体构建 |
| 3.2.3 疟原虫的电击转染 |
| 3.2.4 质粒的负筛选 |
| 3.2.5 红期生长曲线的测定 |
| 3.2.6 动合子的体外培养 |
| 3.2.7 动合子运动能力检测 |
| 3.2.8 mCherry荧光检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 pYCm质粒构建:引入yfcu负筛选元件 |
| 3.3.2 pYCm和pYC比较:以Pyp28基因加mCherry标签为例 |
| 3.3.3 pYCm实现多基因顺序修饰 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 本研究的创新点 |
| 3.4.2 本研究的应用性 |
| 第四章 疟原虫转录因子ApiAP2家族基因的功能研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 疟原虫虫株、实验小鼠以及按蚊 |
| 4.2.2 载体的构建 |
| 4.2.3 疟原虫的电击转染及克隆虫株的鉴定 |
| 4.2.4 蚊媒感染 |
| 4.2.5 蚊期发育表型分析 |
| 4.2.6 红期生长曲线的测定 |
| 4.2.7 纯化配子体 |
| 4.2.8 雄配子体出丝率的统计 |
| 4.2.9 成熟动合子转化率的统计 |
| 4.2.10 动合子运动能力检测 |
| 4.2.11 间接免疫荧光 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 转录因子PyApiAP2家族基因的敲除 |
| 4.3.2 转录因子PyApiAP2家族基因的加标签 |
| 4.3.3 配子体时期的关键基因功能分析 |
| 4.3.4 动合子和卵囊时期的关键基因功能分析 |
| 4.3.5 PY17X_0523100和PY17X_1323500功能分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 本研究的主要发现和结论 |
| 4.4.2 本研究的思考 |
| 第五章 总结 |
| 参考文献 |
| 缩略语及中英文对照 |
| 攻读学位期间发表论文 |
| 致谢 |
（3）鸟苷酸环化酶beta调控疟原虫动合子运动的分子机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 疟疾与疟原虫背景介绍 |
| 1.1.1 疟疾与疟疾的分布 |
| 1.1.2 疟原虫生活周期和动合子阶段 |
| 1.2 动合子的发育与结构 |
| 1.2.1 动合子的发育过程 |
| 1.2.2 动合子的特殊结构特征 |
| 1.3 动合子的运动与调控 |
| 1.3.1 动合子运动的特征--改锥状 |
| 1.3.2 动合子运动的分子机器--滑动体(glideosome) |
| 1.4 动合子运动的调控 |
| 1.4.1 动合子运动调控信号通路的发现 |
| 1.4.2 动合子运动的调控通路具有保守性 |
| 1.4.3 cGMP-PKG信号通路与动合子发育的不兼容性 |
| 1.4.4 动合子运动调节信号通路的缺失环节 |
| 1.5 鸟苷酸环化酶beta与动合子运动 |
| 1.5.1 鸟苷酸环化酶研究概况 |
| 1.5.2 特定种类原虫鸟苷酸环化酶具有特殊结构 |
| 1.5.3 疟原虫鸟苷酸环化酶的特点 |
| 1.5.4 cGMP信号转导对动合子调控的未解之谜 |
| 1.6 本课题的立题意义与概况 |
| 第二章 GCβ在动合子具有顶背侧ADS集中的特殊定位 |
| 2.1 对GCβ进行不同位置的6HA原位标签整合 |
| 2.1.1 利用CRISPR/Cas9对GCβ内源加标签的策略和检测 |
| 2.1.2 GCβ内源加标签虫株的Western blot检测 |
| 2.2 GCβ生活周期表达的检测 |
| 2.2.1 GCβ在疟原虫各生活阶段的表达分析 |
| 2.2.2 GCβ在雌雄配子体阶段的性别特异表达特征 |
| 2.2.3 GCβ是动合子阶段唯一表达的鸟苷酸环化酶 |
| 2.3 GCβ在动合子顶背侧ADS具有特殊定位 |
| 2.3.1 GCβ集中于动合子的ADS区域 |
| 2.3.2 GCβ位于ADS区域的PPM膜上 |
| 2.3.3 GCβ在PM膜上的分布符合拓扑结构的预测 |
| 2.4 GCβ的ADS定位具有特殊性 |
| 2.4.1 ADS区域无特殊的细胞器结构 |
| 2.4.2 GCβ在ADS区域无特殊的共定位蛋白标记 |
| 2.4.3 GCβ在ADS的集中可能依赖于IMC定位的超级蛋白结构 |
| 第三章 GCβ在ADS的集中启动了动合子运动 |
| 3.1 GCβ在动合子ADS集中与动合子运动起始具有正相关 |
| 3.1.1 GCβ在ADS集中随着动合子发育动态变化 |
| 3.1.2 GCβ在动合子发育过程中的蛋白转运变化 |
| 3.1.3 GCβ在ADS的集中与动合子运动能力呈正相关 |
| 3.2 GCβ::mScarlet揭示GCβ的ADS聚集启动ODGM |
| 3.2.1 利用mScarlet荧光蛋白示踪动合子GCβ方法的建立 |
| 3.2.2 GCβ的ADS集中启动ODGM |
| 3.2.3 动合子运动过程中,GCβ一直维持ADS聚集 |
| 3.3 GCβ的ADS集中保证了动合子发育与PKG的激活的完美协调 |
| 3.3.1 PKG的提前激活干扰动合子发育过程 |
| 3.3.2 动合子发育成熟以后可以耐受PKG的持续激活 |
| 3.3.3 GCβ的定位不受PKG激活与否的影响 |
| 第四章 GCβ在ADS的集中通过激活PKG促进动合子运动 |
| 4.1 cGMP-PKG-CDPK信号通路的验证 |
| 4.1.1 GCβ敲除显示其对动合子运动的重要性 |
| 4.1.2 cGMP-PKG-CDPK信号通路在约氏疟原虫中是保守的 |
| 4.2 动合子运动依赖ADS集中的GCβ具有酶活性 |
| 4.2.1 GCβ的GCD的酶活性位点的分析 |
| 4.2.2 GCβ酶失活虫株GCDm的构建 |
| 4.2.3 GCDm虫株显示GCβ酶活对于ODGM的必须性 |
| 4.3 GCβ在ADS集中产生局部cGMP高浓度激活PKG |
| 4.3.1 GCβ在ADS集中打破了cGMP合成-分解平衡 |
| 4.3.2 动合子单细胞cGMP检测方法的建立 |
| 4.3.3 基于Green cGull的cGMP活性分析 |
| 4.3.4 使用光激活的BeCyclOp进行动合子ODGM回补的尝试 |
| 4.3.5 PKG位于cGMP信号转导的下游 |
| 第五章 GCβ在ADS的集中需要ALD结构域 |
| 5.1 GCβ的N端具有P4-ATPase相关的ALD |
| 5.1.1 GCβ的N端具有P4-ATPase-like domain (ALD) |
| 5.1.2 P4-ATPase的背景介绍 |
| 5.1.3 ALD的存在是真核单细胞寄生原虫GC蛋白的普遍现象 |
| 5.2 GCβ的ALD并不通过与PS结合介导ADS集中 |
| 5.2.1 GCβ的ALD是一个puse-P4-ATPase |
| 5.2.2 ALD通过脂筏介导GCβ在ADS集中——一个有趣的猜想 |
| 5.2.3 GCβ在ADS并无脂筏结构存在 |
| 5.3 ALD对于GCβ的ADS集中是必须的 |
| 5.3.1 T2A结果显示ALD对于GCβ的ADS定位必不可少 |
| 5.3.2 T2An结果显示GCβ的ALD与GCD需要直接的分子连接 |
| 5.3.3 ALD促进ADS定位的可能机制总结 |
| 第六章 ALD辅因子CDC50A是GCβ的直接调控蛋白 |
| 6.1 疟原虫CDC50家族基因的筛选 |
| 6.1.1 CDC50家族的背景介绍 |
| 6.1.2 疟原虫CDC50家族基因的分析 |
| 6.1.3 定位分析显示疟原虫CDC50A可能是GCβ互作蛋白 |
| 6.2 疟原虫CDC50A与GCβ共同发挥作用 |
| 6.2.1 CDC50A与GCβ表达定位高度一致 |
| 6.2.2 CDC50A与GCβ表型高度一致 |
| 6.2.3 CDC50A基因回补显示50A敲除的表型是可信的 |
| 6.2.4 多基因敲除实验揭示CDC50A与GCβ功能上的一致性 |
| 6.2.5 CDC50A与GCβ共同作用于cGMP信号通路的源头 |
| 6.3 CDC50A调控GCβ稳定性 |
| 6.3.1 CDC50A与GCβ直接结合 |
| 6.3.2 CDC50A调控GCβ蛋白稳定性而非转录 |
| 6.3.3 CDC50A回补重构了GCβ的稳定和ADS定位 |
| 6.4 CDC50A不是GCβ在ADS集中的直接决定因素 |
| 6.4.1 GCβ对CDC50A无反向调控 |
| 6.4.2 CDC50A不需要去ADS集中 |
| 6.4.3 CDC50A可能具有通过Rab调控GCβ蛋白转运的功能 |
| 6.5 CDC50A调控GCβ机制的模型 |
| 第七章 GCβ在ADS集中依赖于ISP1和IMC结构 |
| 7.1 细胞骨架介导了GCβ后脑勺集中 |
| 7.1.1 STORM结果揭示了GCβ/CDC50A在ADS区域的精细结构 |
| 7.1.2 GCβ/CDC50A定位于PPM,且定位一旦形成,高度稳定 |
| 7.1.3 IMC可能是支撑GCβ“后脑勺”定位的细胞骨架 |
| 7.2 IMCβ研究状况简介以及相关基因的筛选 |
| 7.2.1 IMC与IMCp背景介绍 |
| 7.2.2 疟原虫IMCp基因的分析与定位筛选 |
| 7.3 ISP1与GCβ在成熟动合子共定位 |
| 7.3.1 ISP1与GCβ定位在动合子发育过程中的动态变化 |
| 7.3.2 ISP1与GCβ在成熟动合子后脑勺共定位 |
| 7.4 ISP1介导了GCβ动合子后脑勺定位 |
| 7.4.1 ISP1是GCβ的互作蛋白 |
| 7.4.2 ISP1敲除影响了GCβ在ADS的正确定位 |
| 7.4.3 ISP1回补重塑了GCβ的ADS聚集 |
| 7.5 GCβ动合子ADS定位是一个受调控的协同的过程 |
| 7.5.1 ISP1是棕榈酰化调控的蛋白 |
| 7.5.2 棕榈酰化修饰决定了ISP1的IMC定位和对GCβ的锚定 |
| 7.5.3 其他细胞骨架蛋白协同参与了GCβ在ADS定位形成 |
| 7.6 ISP1介导GCβ在ADS定位形成的模型 |
| 第八章 总结和展望 |
| 8.1 论文总结 |
| 8.2 本论文的主要发现和结论 |
| 8.3 本论文的启示与思考 |
| 8.3.1 疟原虫CDC50是生活阶段性调控的Master |
| 8.3.2 疟原虫GC-cGMP-PKG-Ca~(2+)-CDPK通路具有保守性 |
| 8.3.3 调控cGMP平衡—小心控制的潘朵拉魔盒 |
| 8.3.4 疟原虫PKG激活具有时间-空间可控性 |
| 8.3.5 疟原虫细胞极化,结构与蛋白的定位调控与关键激酶的激活具有相关性 |
| 8.3.6 IMC蛋白酰化修饰调控着疟原虫的生活周期 |
| 附录 |
| S1 缩略词对照表 |
| S2 基因修饰引物 |
| S3 基因修饰虫株表 |
| S4 基因修饰与检测示意图 |
| S5 Western Blot原始数据 |
| S6 试剂,抗体与药品 |
| S7 仪器设备 |
| S8 详细的实验操作和方法 |
| 参考文献 |
| 在学期间主要成果 |
| 致谢 |
（4）青蒿素对斯氏按蚊传疟能力的影响及其分子机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 青蒿素预处理对斯氏按蚊传疟能力的影响 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 天然免疫Toll信号通路在青蒿素对按蚊传疟能力影响中的作用研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 肠道菌群在青蒿素对按蚊传疟能力影响中的作用研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 全文总结 |
| 本研究的不足和下一步研究计划 |
| 参考文献 |
| 文献综述一 青蒿素及其衍生物在相关疾病中的免疫调节作用 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 蚊先天免疫的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（5）约氏疟原虫鸟苷酸环化酶GCα调控配子体激活的功能和蛋白结构分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 疟疾概况 |
| 1.1.1 疟疾病原体 |
| 1.1.2 疟疾的传播媒介 |
| 1.2 疟原虫的生活史 |
| 1.2.1 红细胞外期(exoerythrocytic stage) |
| 1.2.2 红细胞内期(intraerythrocytic stage) |
| 1.2.3 配子体形成 |
| 1.2.4 蚊期 |
| 1.3 鸟苷酸环化酶的研究 |
| 1.3.1 疟原虫中细胞信号转导和第二信使 |
| 1.3.2 鸟苷酸环化酶(guanylate cyclase,GC) |
| 1.3.2.1 哺乳动物鸟苷酸环化酶 |
| 1.3.2.2 疟原虫鸟苷酸环化酶 |
| 1.3.3 cGMP信号调控的疟原虫生理过程 |
| 1.3.3.1 配子体激活 |
| 1.3.3.2 动合子发育和运动 |
| 1.3.3.3 肝期裂体增殖 |
| 1.3.3.4 红内期裂体增殖 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 第二章 GCα蛋白表达阶段与亚细胞定位分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.1.1 疟原虫虫株、动物和实验按蚊 |
| 2.2.1.2 菌株和质粒 |
| 2.2.1.3 分子生物学试剂 |
| 2.2.1.4 网站和分析软件 |
| 2.2.2 实验方法和步骤 |
| 2.2.2.1 gcα基因内源加标签载体构建 |
| 2.2.2.2 虫株复苏和感染 |
| 2.2.2.3 疟原虫体外培养和电击转染 |
| 2.2.2.4 克隆虫株的鉴定和阳性克隆的获得 |
| 2.2.2.5 虫株冻存 |
| 2.2.2.6 红内期生长速率分析 |
| 2.2.2.7 雄配子体出丝实验 |
| 2.2.2.8 蚊媒感染和蚊期表型分析 |
| 2.2.2.9 配子体纯化 |
| 2.2.2.10 免疫荧光实验(Immuno Fluorescence Assay，IFA) |
| 2.2.2.11 蛋白质免疫印迹试验(Western blot) |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 gcα基因内源加C端标签 |
| 2.3.2 gcα::6HA虫株的构建和分子鉴定 |
| 2.3.3 gcα::6HA虫株蛋白水平鉴定 |
| 2.3.4 gcα::6HA虫株生活周期表型分析 |
| 2.3.5 GCα蛋白全生活周期表达分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 条件性敲低gcα基因对蚊期发育的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.1.1 疟原虫虫株、动物和实验按蚊 |
| 3.2.1.2 菌株、质粒、试剂、网站和分析软件 |
| 3.2.2 实验方法和步骤 |
| 3.2.2.1 负筛选(Negative Selection)去除细胞内质粒 |
| 3.2.2.2 gcα基因内源启动子替换载体构建 |
| 3.2.2.3 虫株复苏和感染 |
| 3.2.2.4 疟原虫体外培养和电击转染 |
| 3.2.2.5 克隆虫株的鉴定和阳性克隆的获得 |
| 3.2.2.6 虫株冻存 |
| 3.2.2.7 红内期生长速率分析 |
| 3.2.2.8 疟原虫表型分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 gcα::6HA-c1虫株负筛 |
| 3.3.2 gcα基因内源启动子替换 |
| 3.3.3 P_(amal)-gcα::6HA载体构建和基因修饰效率 |
| 3.3.4 P_(clag)-gcα::6HA虫株的构建和分子鉴定 |
| 3.3.5 P_(clag)-gcα::6HA虫株蛋白水平鉴定 |
| 3.3.6 IFA检测P_(clag)-GCα::6HA表达情况 |
| 3.3.7 P_(clag)-gcα:: 6HA虫株红内期表型分析 |
| 3.3.8 P_(clag)-gcα:: 6HA虫株的蚊期表型分析 |
| 3.3.9 P_(clag)-gcα:: 6HA虫株血饲按蚊的小鼠感染分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 GCα蛋白结构的初步分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.1.1 疟原虫虫株、动物和实验按蚊 |
| 4.2.1.2 菌株、质粒、试剂、网站和分析软件 |
| 4.2.2 实验方法和步骤 |
| 4.2.2.1 gcα基因N端加标签修饰载体构建 |
| 4.2.2.2 gcα基因linker处内源修饰载体构建 |
| 4.2.2.3 虫株复苏和感染 |
| 4.2.2.4 疟原虫体外培养和电击转染 |
| 4.2.2.5 克隆虫株的鉴定和阳性克隆的获得 |
| 4.2.2.6 虫株冻存 |
| 4.2.2.7 红内期生长速率分析 |
| 4.2.2.8 疟原虫后期表型分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 GCα蛋白N端和linker处修饰示意图和电击转染结果表 |
| 4.3.2 3 V5::gcα::6HA虫株的构建和分子鉴定 |
| 4.3.3 蛋白水平检测gcα基因融合3V5短肽标签 |
| 4.3.4 3V5::gcα::6HA虫株生活周期表型分析 |
| 4.3.5 Western blot确定GCα蛋白剪切 |
| 4.3.6 ad:6HA::gcd虫株的构建和分子鉴定 |
| 4.3.7 蛋白水平检测gcα基因内源融合6×HA标签 |
| 4.3.8 ad::6HA::gcd虫株生活周期表型分析 |
| 4.3.9 ad::T2A::gcd::6HA虫株的构建和分子鉴定 |
| 4.3.10 蛋白水平检测gcα基因融合T2A短肽 |
| 4.3.11 ad::T2A::gcd:;6HA虫株生活周期表型分析 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 总结与讨论 |
| 参考文献 |
| 附表 |
| 缩略语及中英文对照 |
| 攻读学位期间发表论文 |
| 致谢 |
（6）约氏疟原虫微管蛋白结合辅助因子A（TBCA）的功能初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 疟疾概况 |
| 1.1.1 疟疾的传播媒介 |
| 1.2 疟原虫的生活史 |
| 1.2.1 红细胞前期 |
| 1.2.2 红细胞内期 |
| 1.2.3 配子体 |
| 1.2.4 蚊期 |
| 1.3 细胞骨架的研究 |
| 1.3.1 细胞骨架的分类 |
| 1.3.2 中间丝 |
| 1.3.3 肌动蛋白丝 |
| 1.3.4 微管 |
| 1.3.5 微管蛋白结合辅助因子 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 约氏疟原虫虫株、实验动物和斯氏按蚊 |
| 2.1.2 菌株和质粒 |
| 2.1.3 分子生物学试剂 |
| 2.1.4 网站和分析软件 |
| 2.2 实验方法和步骤 |
| 2.2.1 tbca基因内源加标签载体构建 |
| 2.2.2 虫株复苏和感染 |
| 2.2.3 体外培养疟原虫和疟原虫转染 |
| 2.2.4 转染效率的鉴定和基因修饰疟原虫单克隆的获得 |
| 2.2.5 虫株冻存 |
| 2.2.6 疟原虫生长曲线绘制 |
| 2.2.7 疟原虫雄配子体激活 |
| 2.2.8 疟原虫蚊传传播和蚊期表型分析 |
| 2.2.9 体外纯化疟原虫配子体 |
| 2.2.10 疟原虫的免疫荧光 |
| 2.2.11 蛋白质免疫印迹 |
| 2.2.12 负筛选去除疟原虫中残余质粒 |
| 第三章 疟原虫微管蛋白结合辅助因子A (TBCA)的功能研究 |
| 3.1 TBCA蛋白序列多序列比对和其在疟原虫全生活周期的表达情况 |
| 3.1.1 约氏疟原虫、伯氏疟原虫和恶性疟中TBCA蛋白序列多序列比对 |
| 3.1.2 约氏疟原虫、小鼠和人类TBCA蛋白氨基酸序列多序列比对 |
| 3.1.3 约氏疟原虫中Tubulin α,β,γ,δ蛋白的多序列比对 |
| 3.1.4 tbca基因内源加N端标签 |
| 3.1.5 6HA::tbca标签虫株的蛋白水平鉴定 |
| 3.1.6 标签虫株6HA::tbca生活周期的表型分析 |
| 3.1.7 TBCA蛋白全生活周期表达分析 |
| 讨论 |
| 3.2 基因tbca的敲除对疟原虫生长发育的影响 |
| 3.2.1 △tbca虫株的载体构建和分子鉴定 |
| 3.2.2 △tbca虫株红内期表型分析 |
| 3.2.3 △tbca虫株的蚊期表型分析 |
| 3.2.4 6HA::Comp. Pytbca::△tbca虫株载体构建和分子鉴定 |
| 3.2.5 6HA::Comp.Pytbca::△tbca虫株蛋白水平鉴定 |
| 3.2.6 6HA::Comp. Pytbca::△tbca虫株生活周期表型分析 |
| 3.3 基因tbca的敲除对配子体激活后双膜破裂能力的影响 |
| 3.3.1 △tbca虫株激活后的雄配子体破裂红细胞膜能力鉴定 |
| 3.3.2 △tbca::sep1::4Myc虫株的构建和分子鉴定 |
| 3.3.3 △tbca::sep1::4Myc虫株激活后的雄配子体破裂疟原虫囊膜能力鉴定 |
| 3.4 △tbca虫株为单雄配子体缺陷 |
| 3.4.1 △tbca虫株雌配子体激活后P28表达情况 |
| 3.4.2 Atbca虫株蚊传杂交实验 |
| 3.5 △tbca虫株Tubulin蛋白的表达情况 |
| 3.5.1 △tbca虫株雄配子体激活后Tubulinα蛋白表达分析 |
| 3.5.2 蛋白水平检测△tbca虫株无性期Tubulin α/β蛋白表达水平 |
| 3.5.3 蛋白水平检测△tbca虫株配子体时期Tubulin α/β蛋白表达水平 |
| 第四章 总结与讨论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文 |
| 致谢 |
（7）约氏疟原虫双荧光配子体报告虫株的构建和应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 疟疾的概况 |
| 1.2 疟疾的防治 |
| 1.3 疟原虫生活史 |
| 1.3.1 红细胞外期 |
| 1.3.2 红细胞内期 |
| 1.3.3 配子体发育 |
| 1.3.4 蚊期发育 |
| 1.4 疟原虫荧光报告虫株在全生活周期的应用 |
| 1.4.1 蚊期 |
| 1.4.2 肝期 |
| 1.4.3 红细胞内期无性繁殖阶段 |
| 1.4.4 配子体 |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 第二章 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 疟原虫虫株、小鼠和按蚊 |
| 2.1.2 菌株和质粒 |
| 2.1.3 分子生物学试剂和仪器 |
| 2.1.4 网址和分析软件 |
| 2.2 实验方法和步骤 |
| 2.2.1 标签载体的构建 |
| 2.2.2 疟原虫冻存和复苏 |
| 2.2.2.1 冻存 |
| 2.2.2.2 复苏 |
| 2.2.3 质粒与疟原虫的共转染 |
| 2.2.3.1 裂殖体体外培养与纯化 |
| 2.2.3.2 电击转染 |
| 2.2.4 修饰虫株的分子鉴定和阳性克隆获得 |
| 2.2.4.1 药物筛选 |
| 2.2.4.2 重组效率的分子鉴定 |
| 2.2.4.3 阳性克隆获得 |
| 2.2.5 负筛选 |
| 2.2.6 红细胞内期生长速率 |
| 2.2.7 配子体率计算 |
| 2.2.7.1 配子体诱导 |
| 2.2.7.2 配子体率计算 |
| 2.2.8 蚊期感染和定量统计 |
| 2.2.8.1 中肠卵囊数量统计 |
| 2.2.8.2 唾液腺子孢子数量统计 |
| 2.2.9 标签虫株的荧光观察 |
| 2.2.9.1 活细胞荧光观察 |
| 2.2.9.2 免疫荧光实验 |
| 2.2.10 蛋白质免疫印迹 |
| 2.2.11 流式细胞术 |
| 2.2.11.1 流式分析 |
| 2.2.11.2 流式分选 |
| 第三章 配子体特异荧光报告虫株的构建和应用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 雌配子体红色荧光虫株 |
| 3.2.1.1 雌配子体荧光虫株的分子鉴定 |
| 3.2.1.2 雌配子体荧光虫株的蛋白检测 |
| 3.2.1.3 雌配子体荧光虫株特异性分析 |
| 3.2.1.4 雌配子体荧光虫株的表达时期 |
| 3.2.1.5 雌配子体荧光虫株的负筛 |
| 3.2.2 雄配子体绿色荧光虫株 |
| 3.2.2.1 雄配子体荧光虫株的分子鉴定 |
| 3.2.2.2 雄配子体荧光虫株的蛋白检测 |
| 3.2.2.3 雄配子体荧光虫株特异性分析 |
| 3.2.2.4 雄配子体荧光虫株的表达时期 |
| 3.2.2.5 雄配子体荧光虫株的负筛 |
| 3.2.3 配子体双荧光虫株 |
| 3.2.3.1 虫株杂交实验 |
| 3.2.3.2 配子体双荧光虫株的分子和蛋白鉴定 |
| 3.2.4 三个荧光虫株的应用 |
| 3.2.4.1 荧光虫株的生长分析 |
| 3.2.4.2 流式细胞术 |
| 3.2.4.3 DFsc7虫株雄配子体激活过程DNA含量分析 |
| 3.2.4.4 DFsc7虫株受精过程DNA含量分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 ccp2::mCherry虫株 |
| 3.3.2 Dhc1::gfp虫株 |
| 3.3.3 DFsc7虫株 |
| 第四章 总结 |
| 参考文献 |
| 附表 |
| 攻读学位期间发表文章 |
| 致谢 |
（8）疟原虫在按蚊早期发育过程中ApiAP2转录因子的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 疟疾的现状和传播 |
| 1.1.1 疟疾的现状 |
| 1.1.2 疟疾的传播 |
| 1.2 疟原虫生活史 |
| 1.2.1 肝细胞期 |
| 1.2.2 红细胞内期 |
| 1.2.3 有性生殖期 |
| 1.3 疟原虫细胞周期 |
| 1.4 疟原虫转录组 |
| 1.5 ApiAP2转录因子家族及研究进展 |
| 1.6 疟原虫按蚊早期发育的相关研究 |
| 1.6.1 雄配子体激活成雄配子 |
| 1.6.2 雌配子体激活成雌配子 |
| 1.6.3 合子向动合子转化 |
| 1.6.4 动合子的运动和穿越 |
| 1.6.5 按蚊中肠因子对动合子发育的影响 |
| 1.7 本研究的目的和意义 |
| 第二章 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 疟原虫虫株、实验动物和按蚊 |
| 2.1.2 菌株和质粒 |
| 2.1.3 实验所用分子生物学试剂 |
| 2.1.4 实验所用网站和分析软件 |
| 2.2 实验方法和步骤 |
| 2.2.1 基于PYCm质粒的基因修饰载体 |
| 2.2.1.1 疟原虫基因组快速提取 |
| 2.2.1.2 同源臂扩增 |
| 2.2.1.3 sgRNA靶向序列退火 |
| 2.2.2 啮齿类动物疟原虫复苏和冻存 |
| 2.2.2.1 疟原虫复苏 |
| 2.2.2.2 疟原虫冻存 |
| 2.2.3 疟原虫电击转染及单克隆虫株的获得 |
| 2.2.3.1 体外培养无性期疟原虫 |
| 2.2.3.2 纯化裂殖体 |
| 2.2.3.3 疟原虫电击转染 |
| 2.2.3.4 基因修饰虫株药物筛选和重组效率鉴定 |
| 2.2.3.5 基因修饰虫株单克隆 |
| 2.2.3.6 负筛和多基因位点修饰 |
| 2.2.4 配子体诱导、计数和纯化 |
| 2.2.4.1 配子体诱导和计数 |
| 2.2.4.2 配子体纯化 |
| 2.2.5 雄配子体出丝检测 |
| 2.2.6 体外培养动合子 |
| 2.2.7 动合子运动检测 |
| 2.2.8 蚊媒感染和蚊期虫荷定量分析 |
| 2.2.8.1 卵囊数量分析 |
| 2.2.8.2 中肠子孢子数量分析 |
| 2.2.8.3 唾液腺子孢子数量分析 |
| 2.2.9 荧光观察 |
| 2.2.9.1 活细胞荧光观察 |
| 2.2.9.2 间接免疫荧光 |
| 2.2.10 蛋白质提取与定量 |
| 2.2.10.1 疟原虫蛋白质提取 |
| 2.2.10.2 大肠杆菌蛋白质提取 |
| 2.2.10.3 BCA蛋白定量 |
| 2.2.11 蛋白质免疫印迹(western blot) |
| 2.2.11.1 SDS-PAGE电泳和转膜 |
| 2.2.11.2 封闭和抗体孵育 |
| 2.2.11.3 化学发光 |
| 2.2.12 流式细胞术(Flow CytoMetry) |
| 2.2.12.1 流式分析 |
| 2.2.12.2 流式分选 |
| 2.2.13 RNA提取和实时荧光定量PCR |
| 2.2.13.1 RNA提取 |
| 2.2.13.2 反转录PCR |
| 2.2.13.3 实时荧光定量PCR |
| 2.2.14 RNAseq |
| 第三章 转录因子AP2-O3表达和基因功能分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 本章节所用载体 |
| 3.2.1 ap2-o3基因敲除载体 |
| 3.2.2 ap2-o3和ap2-o短肽标签敲入载体 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 基因敲除单克隆虫株的分子鉴定 |
| 3.3.2 基于17XNL虫株的△ap2-o3表型分析 |
| 3.3.3 基于P28::mCherry虫株的△ap2-o3表型分析 |
| 3.3.4 AP2-O3的蛋白表达与定位 |
| 3.3.5 AP2-O3只影响雌配子体的发育 |
| 3.3.6 AP2-O3影响雌配子体P28翻译抑制状态的解除 |
| 3.3.7 AP2-O3不影响雌配子体AP2-O的表达 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 AP2-O3转录抑制DNA复制和修复相关基因的表达 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 本章所用载体 |
| 4.2.1 启动子替换载体 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 AP2-O3全生活周期表达 |
| 4.3.2 DFsc7和△ap2-o3虫株转录组分析 |
| 4.3.2.1 转录组分析样本来源 |
| 4.3.2.2 RNAseq数据总览 |
| 4.3.2.3 RNAseq差异分析与验证 |
| 4.3.3 合子阶段的AP2-O3表达和DNA倍性 |
| 4.3.4 按蚊早期发育阶段AP2-O3的表达 |
| 4.3.5 合子阶段AP2-O3过表达和表型分析 |
| 4.3.6 △ap2-o3虫株雌配子体细胞核变化 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 AP2-O3转录激活动合子发育的关键基因 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 本章所用载体 |
| 5.2.1 本章涉及靶基因敲除载体 |
| 5.2.2 本章靶基因短肽标签敲入载体 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 △ap2-o3虫株lc6和zk11的转录水平分析 |
| 5.3.2 基因敲入6HA短肽标签示意图和单克隆鉴定 |
| 5.3.3 小鼠红细胞期和配子体时期lc6的蛋白表达 |
| 5.3.4 无性期和配子体时期zk11的蛋白表达 |
| 5.3.5 基因敲除示意图和单克隆鉴定 |
| 5.3.6 基因敲除虫株表型分析 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 转录因子AP2-O4功能和表达分析 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 本章基因敲除和敲入载体 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 基因敲除和敲入单克隆虫株的分子鉴定 |
| 6.3.2 基于17XNL虫株的△ap2-o4表型分析 |
| 6.3.3 基于P28::mCherry虫株的△ap2-o4表型分析 |
| 6.3.4 AP2-O4的表达与定位 |
| 6.3.5 AP2-O4转录组分析 |
| 6.4 讨论 |
| 第七章 转录因子AP2-O2的功能和表达分析 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 本章基因敲除和敲入载体 |
| 7.3 结果 |
| 7.3.1 基因敲除和敲入单克隆虫株的分子鉴定 |
| 7.3.2 基于17XNL虫株的△ap2-o2表型分析 |
| 7.3.3 基于P28::mCherry虫株的△ap2-o2表型分析 |
| 7.3.4 AP2-O2的表达与定位 |
| 7.4 讨论 |
| 第八章 总结 |
| 参考文献 |
| 图表索引 |
| 图注说明 |
| 缩略语及中英文对照 |
| 攻读学位期间发表论文 |
| 致谢 |
（9）5’非编码区内含子在约氏疟原虫基因表达调控中的作用和功能（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 疟疾 |
| 1.1.1 疟疾发展现状 |
| 1.1.2 疟原虫及其生活史 |
| 1.1.3 疾病防治 |
| 1.2 基因表达调控 |
| 1.2.1 5'UTR对基因表达调控的影响 |
| 1.2.2 内含子影响基因表达调控的研究进展 |
| 1.2.3 疟原虫的基因表达调控 |
| 1.3 TCTP蛋白 |
| 1.4 研究目的与意义 |
| 第二章 5'UTR内含子对约氏疟原虫基因表达的影响 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 疟原虫虫株及实验小鼠 |
| 2.2.2 实验试剂配制 |
| 2.2.3 主要仪器设备 |
| 2.2.4 双荧光素酶报告基因质粒载体的构建 |
| 2.2.5 电击转染 |
| 2.2.6 电转虫株鉴定 |
| 2.2.7 荧光素酶表达量的测定 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 双荧光素酶报告基因质粒的构建 |
| 2.3.2 5'UTR内含子对不同基因表达的影响 |
| 2.3.3 5'UTR内含子对不同虫株基因表达的影响 |
| 2.3.4 5'UTR内含子大小与序列对基因表达的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 Pytctp 5'UTR内含子对基因表达的作用与功能 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验试剂配制 |
| 3.2.2 主要仪器设备 |
| 3.2.3 质粒构建 |
| 3.2.4 电击转染及药物处理 |
| 3.2.5 免疫荧光分析 |
| 3.2.6 蛋白提取及免疫印迹 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 质粒构建与电击转染虫株鉴定 |
| 3.3.2 插入3×HA标签对疟原虫生长情况的影响 |
| 3.3.3 5'UTR内含子对蛋白表达影响的分析 |
| 3.3.4 敲除5'UTR内含子对疟原虫生长情况的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 小结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
四、约氏疟原虫孢子增殖的影响因素观察（论文参考文献）
- [1]FGL2在疟原虫感染中的作用及机制研究[D]. 丁艳. 中国人民解放军陆军军医大学, 2020(01)
- [2]约氏疟原虫CRISPR/Cas9技术的建立和ApiAP2转录因子家族基因功能分析[D]. 张翠. 厦门大学, 2018(08)
- [3]鸟苷酸环化酶beta调控疟原虫动合子运动的分子机制的研究[D]. 高涵. 厦门大学, 2018(12)
- [4]青蒿素对斯氏按蚊传疟能力的影响及其分子机制研究[D]. 王盼. 中国人民解放军陆军军医大学, 2020
- [5]约氏疟原虫鸟苷酸环化酶GCα调控配子体激活的功能和蛋白结构分析[D]. 智媛. 厦门大学, 2018(02)
- [6]约氏疟原虫微管蛋白结合辅助因子A（TBCA）的功能初步研究[D]. 洪仁杰. 厦门大学, 2019(10)
- [7]约氏疟原虫双荧光配子体报告虫株的构建和应用[D]. 刘聪. 厦门大学, 2019(10)
- [8]疟原虫在按蚊早期发育过程中ApiAP2转录因子的功能研究[D]. 李贞魁. 厦门大学, 2018(06)
- [9]5’非编码区内含子在约氏疟原虫基因表达调控中的作用和功能[D]. 刘燕婧. 厦门大学, 2019(09)
- [10]双氢青蒿素对约氏疟原虫在蚊体内发育的影响[J]. 陈佩惠,屠呦呦,王凤芸,李凤舞,杨岚. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 1998(06)