一、促肝细胞生长素对大鼠肝星状细胞增殖及α1(Ⅰ)胶原基因启动子活性的影响（论文文献综述）
周怡驰[1]（2021）在《柴芪益肝方治疗肝纤维化的临床和实验研究》文中认为中国是肝病大国,多种肝病高发,肝纤维化作为肝病研究和治疗的重要领域,越来越受到重视。肝纤维化是肝脏修复肝损伤引起的异常结缔组织增生和细胞外基质过度沉积的病理改变。肝纤维化存在于大多数慢性肝病中,是慢性肝病向肝硬化发展的必经阶段,甚至可持续进展为肝硬化、肝癌,给患者生命健康带来严重威胁。研究肝纤维化的病因及发病机制、寻找有效的治疗靶点,对于阻止肝病的发展、维护患者的生命健康有很大的意义。近年来,肝纤维化的病理分子生物学机制、临床诊疗技术等取得了长足发展。但目前西医对于抗纤维化疗效尚不确切,缺乏有效的治疗手段。中医药治疗肝纤维化具有确切的优势,已有多种注册适应证为肝纤维化的中成药上市。柴芪益肝方由导师胡世平教授所创,是治疗慢性乙型肝炎肝纤维化的经验方,前期临床和实验研究发现对肝纤维化有较好疗效,但其作用机制尚不清楚。胡教授现任北京中医药大学深圳医院党委书记,广东省名中医,全国基层名老中医师承项目指导老师,深圳市地方级领军人才,获评“南粤最美中医”,从事中医药防治慢性肝病的临床与科研工作30多年,擅长中医、中西医结合治疗肝脏疾病,形成了独特的学术思想体系。目的结合临床回顾性研究、网络药理学预测和动物实验探讨柴芪益肝方治疗肝纤维化的疗效与作用机制,为该方的进一步开发应用提供依据,并分析总结导师胡世平教授“推陈致新”的学术思想及其在柴芪益肝方组方思路中的应用。方法1、临床研究:通过回顾性研究方法,收集2018年1月1日至2021年2月3日期间在北京中医药大学深圳医院肝病科门诊及住院部诊断为慢性乙型肝炎患者的病例资料,并筛选出符合本研究标准的慢性乙型肝炎肝纤维化肝郁脾虚型患者。根据患者所服药物分为常规治疗组和CQYG组,收集所有患者治疗12个月前后的指标,包括主要指标:肝脏硬度值（LSM）、纤维化-4指数（FIB-4）、天门冬氨酸氨基转移酶和血小板比率指数（APRI）、乙肝病毒表面抗原（HBsAg）、乙型肝炎病毒（HBV-DNA）定量;次要指标:谷丙转氨酶（ALT）,谷草转氨酶（AST）,总胆红素（TBiL）,谷氨酰转酞酶（GGT）,白蛋白（ALB）,将所有检测指标进行治疗前后的组内与组间比较。2、网络药理学:检索 TCMSP、TCMID、Swiss Target Prediction、OMIM、Gene Cards等数据库,筛选CQYG治疗肝纤维化的活性成分和潜在作用靶点。借助Cytoscape软件和String数据库,分别构建“药物-成分-靶点-疾病”网络和蛋白互作PPI网络,并进行拓扑学分析,筛选关键药效分子和核心靶点。运用Autodock vina软件进行分子对接,并基于R语言对作用靶点进行GO和KEGG富集分析。3、动物实验:选取50只6周龄SPF级C57BL/6雄性小鼠,随机抽取10只分别纳入空白对照组（CTL）、肝纤维化模型组（Model）、柴芪益肝方低剂量组（CQYG-L）、柴芪益肝方高剂量组（CQYG-H）和水飞蓟素治疗组（Silymarin）,共5组。四氯化碳（carbontetrachloride,CCl4）腹腔注射建立小鼠肝纤维化模型:除空白对照组外,其余各组小鼠腹腔注射含15%CCl4的橄榄油5ml·kg-1,每周2次,连续注射8周。从造模第1天起,柴芪益肝方低、高剂量组小鼠分别灌胃给予0.37 g·kg-1·d-1、0.74 g·kg-1·d-1的柴芪益肝方,水飞蓟素组给予100 mg·kg-1·d-1灌胃。实验结束,摘取所有小鼠肝脏、收集血清,对各组小鼠肝组织进行HE、天狼星红、Masson染色;用自动生化分析仪检测血清AST和ALT的含量;ELISA法检测肝组织中MDA、SOD、GSH-Px和Hyp水平;免疫组化法检测肝组织中α-SMA、Collagen I、Vimentin的表达;免疫荧光法检测肝组织中Ki67+和Lgr5+细胞;提取各组肝组织RNA和蛋白,Real-time PCR和Western blot分别检测肝纤维化小鼠肝组织中NF-κB、TGF-β/Smad、Wnt/β-Catenin信号通路相关靶标mRNA和蛋白表达。结果1、临床研究:共纳入符合标准的患者203人,其中,常规治疗组纳入101人,年龄最大者76岁,最小22岁,平均年龄（41.34±0.90）岁;CQYG组纳入102人,年龄最大者67岁,最小27岁,平均年龄（43.13±0.78）岁,两组年龄无统计学差异（P>0.05）,具有可比性。（1）无创肝纤维化指标（LSM、FIB-4、APRI）在两组患者自身治疗前后比较,以及治疗后的组间比较,均无显着性差异（P>0.05）,但两组治疗后LSM均较治疗前有降低趋势。（2）两组患者自身前后比较,乙型肝炎病毒（HBV-DNA）定量和乙肝病毒表面抗原（HBsAg）治疗前和后均无显着性差异（P>0.05）;CQYG组较常规治疗组治疗后HBsAg显着性降低（P<0.05）,CQYG组治疗后HBV-DNA定量和HBsAg较治疗前均有下降趋势。（3）两组患者自身治疗前后血清肝功能指标（ALT、AST、GGT、TBiL、ALB）均在正常范围内,治疗后组间比较肝功能均无显着性差异（P>0.05）。2、网络药理学预测:共获得121种CQYG治疗肝纤维化的潜在活性成分和257个对应的作用靶点,并筛选出14种关键药效分子及28个核心靶点。点度中心性值前10的核心靶点和关键药效分子具有较好的结合活性。GO和KEGG结果主要涉及炎症反应、氧化应激、成纤维细胞增殖、内皮细胞增殖、调节脂质代谢活动、血管生成、肝再生等生物学过程及TNF信号通路、Th17细胞分化信号通路、IL-17信号通路、PI3K/Akt信号通路、Wnt信号通路、NF-κB信号通路等。3、动物实验研究:与模型组相比,CQYG各组和水飞蓟素组小鼠肝组织形态和胶原沉积较模型组改善,水飞蓟素组和CQYG-H小鼠血清ALT、AST水平均显着降低（P<0.01）;CQYG高剂量组肝组织MDA和Hyp的含量显着低于模型组（P<0.05）,SOD和GSH-Px含量显着高于模型组（P<0.05）;免疫组化结果显示,CQYG组和水飞蓟素组α-SMA、CollagenI、Vimentin阳性表达区域较模型组少;免疫荧光结果显示,柴芪益肝方组Ki67阳性细胞和Lgr5阳性细胞数量均较模型组有增多趋势;CQYG组肝组织中p-NF-κBp65、TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白表达水平较模型组显着降低（P<0.05）;与模型组相比,CQYG-H 肝组织 CollagenI、TGF-β、TNF-α、IL-1βmRNA 的表达水平以及 Collagen I、α-SMA、TIMP-1、TGF-β、磷酸化 Smad2/3、Smad2/3、Smad4、Wnt3a、β-Catenin 蛋白表达均较模型组有不同程度降低,而MMP-9、Smad7蛋白表达水平显着升高（P<0.05）。结论1、临床研究:柴芪益肝方加减联合常规治疗有降低慢乙肝肝纤维化患者肝脏硬度值、HBV-DNA和HBsAg含量的趋势,且在降低HBsAg定量上优于单纯常规治疗。2、网络药理学:柴芪益肝方可能通过槲皮素、白藜芦醇、山奈酚等活性成分作用于丝裂原激活蛋白激酶MAPK1/3/8、原癌基因酪氨酸激酶Src、激活子蛋白Jun等靶点,以及TNF信号通路、Th17细胞分化信号通路、IL-17信号通路、PI3K/Akt信号通路、HIF-1信号通路、Rap1信号通路、Wnt信号通路、NF-κB信号通路等,调节肝脏炎症反应、氧化应激、细胞增殖、肝再生等生物学过程发挥治疗肝纤维化的作用。3、动物实验研究:柴芪益肝方能显着减轻四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化,其作用机制可能减轻氧化应激反应、抑制NF-κB介导的炎症信号通路,下调炎症细胞因子IL-6、TNF-α、IL-1β的释放,减轻肝脏炎症,并通过调节TGF-β/Smad、Wnt3a/β-catenin信号通路,抑制肝星状细胞的活化,调节MMP-9和TIMP-1活性平衡,减少细胞外基质α-SMA、Collagen I、Hyp的合成,促进ECM降解相关。4、“推陈致新”学术思想:导师胡世平教授“推陈致新”的学术思想核心在于顺应人体本身的正气祛邪之势和气血津液各自的新陈代谢过程,协助人体自然排邪,促进疾病向愈。在肝纤维化治疗上,通过“推陈致新”,加强气化动力、调节气机升降,使病理产物消除的同时,人体气血津液正常化生。
施梅姐[2]（2020）在《疏肝健脾活血法治疗乙肝肝纤维化的临床回顾性研究及其作用机制的网络药理学探索》文中提出目前,慢性乙型肝炎仍然是一个全球性的公共卫生问题,严重危害人民健康。肝纤维化是慢性乙型肝炎发展到肝硬化的必经中间环节,若不及时阻断,可进一步进展至肝硬化、门静脉高压及肝癌,甚至进展至终末期肝病危及生命。因此,阻断逆转肝纤维化、防止疾病进一步进展是慢性乙型肝炎的重要防治目标之一。但肝纤维化的治疗当前仍然是慢性乙型肝炎防治的难点问题。目前,现代医学研究的各类特异性的抗纤维化药物制剂绝大多数尚处于实验研究阶段。现代医学治疗慢性乙型肝炎肝纤维化主要是针对病因的治疗,即抗病毒治疗。恩替卡韦是国内外指南推荐的一线抗病毒治疗药物,具有强力抗病毒作用和低耐药的特点,但其存在HBe Ag转换率低的缺点,并且即使抗病毒治疗后仍有相当部分的病人存在肝纤维化进展。因此,如何阻止肝纤维化进展、提高HBe Ag转换率是当前乙肝肝纤维化治疗的难点问题。而大量的研究证实,中医药治疗肝纤维化具有良好的疗效而且无副作用,其疗效及优势已得到国内外学者的广泛认可。在过去的几十年中,诸多研究者针对中医药抗乙肝肝纤维化展开了大量的临床及实验研究。尽管临床上乙肝肝纤维化的辨证分型不统一,但是纵观近十年中医药防治肝纤维化的文献资料,疏肝健脾活血法越来越得到众医家、学者的认可。本人所在科室在既往的临床实践中亦发现疏肝健脾活血法联合抗病毒药治疗可明显改善乙肝肝纤维化患者的抗肝纤维化疗效、提高HBe Ag转换率,但缺乏客观的临床疗效评价及作用机制探讨。目的:本课题第一部分采用文献研究的方法,基于频数分析、复杂网络分析法及关联规则等数据挖掘的方法分析总结疏肝健脾活血法治疗乙肝肝纤维化的用药配伍规律,以期为临床运用疏肝健脾活血法治疗乙肝肝纤维化提供用药参考。第二部分采用回顾性研究的方法观察疏肝健脾活血法对慢性乙型肝炎肝纤维化患者的病理肝纤维化分期、血清肝纤维化指标及肝脏硬度值等指标变化的影响,客观评价其临床疗效,为临床运用用提供客观依据。第三部分运用网络药理学的方法对前面研究总结的疏肝健脾活血法的五味核心药物进行研究,探讨疏肝健脾活血法治疗乙肝肝纤维化的作用靶点、信号通路,以期为后续研究疏肝健脾活血法治疗乙肝肝纤维化的实验研究提供客观的参考依据。方法:第一部分:基于数据挖掘的方法总结疏肝健脾活血法治疗乙肝肝纤维化的用药规律以“中国知网”、“中国生物医学期刊引文数据库”、“重庆维普中文期刊数据库”、“万方医学网”为检索库,检索自建库至2020年9月的疏肝健脾活血法治疗乙肝肝纤维化的现代文献,建立疏肝健脾活血法治疗乙肝肝纤维化的现代文献研究数据库,进一步采用频数分析、复杂网络分析技术、关联规则分析等数据挖掘的方法分析总结疏肝健脾活血法治疗乙肝肝纤维化的用药规律。第二部分:疏肝健脾活血法治疗乙肝肝纤维化的临床研究采用回顾性研究的方法,纳入2010年1月至2020年9月在广东省中医院肝病科门诊及住院就诊的符合纳入排除标准的乙肝肝纤维化病例,分为治疗组与对照组进行回顾性观察,其中对照组服用恩替卡韦治疗,治疗组采用疏肝健脾活血法联合恩替卡韦治疗,收集疗程至少144周的患者的临床资料,比较疏肝健脾活血法联合恩替卡韦治疗与单用恩替卡韦治疗对乙肝肝纤维化患者的病理肝纤维化分期、肝脏硬度值、血清肝纤维化指标及HBe Ag转换率等指标的不同影响,客观评价疏肝健脾活血法联合恩替卡韦治疗乙肝肝纤维化的抗纤维化疗效与抗病毒疗效。第三部分:基于网络药理学探讨疏肝健脾活血法治疗乙肝肝纤维化的作用机制通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）收集筛选疏肝健脾活血法核心药物的主要有效成分及靶点,通过检索Gene Cards、OMIM、Pharm Gkb三个数据库,收集整理乙肝肝纤维化相关的疾病靶点基因,然后运用Venn2.1在线工具绘制药物-疾病靶点的Venn图,获得中药-疾病交互靶点。然后利用STRING数据库及Cytoscape3.8.1软件绘制中药-疾病交互靶点的蛋白质相互作用（PPI）图以及筛选核心基因。最后利用DAVID数据库进行GO与KEGG通路富集分析,进一步分析探讨疏肝健脾活血法治疗乙肝肝纤维化的作用关键靶点与信号通路。结果:第一部分:文献数据挖掘研究初步检索到疏肝健脾活血法治疗乙肝肝纤维化的相关文献257篇,根据标题初筛合格的文献97篇,再根据纳入及排除标准对每一篇文献的内容进行人工筛选,剔除不合格文献后得到最终纳入合格文献48篇,涉及在乙肝肝纤维化治疗涉及处方48首、中药96味,总用药频次为537次,涉及中药种类17种。居前四位的药物种类分别是:补虚药>活血化瘀药>理气药>利水渗湿药,累计频率达88.3%。疏肝健脾活血法中使用频率最高的是补虚药,其次是活血化瘀药与理气药。其中补虚药有黄芪、白术、白芍、鳖甲、当归、党参等;活血化瘀药有丹参、赤芍、郁金、川芎、桃仁等;理气药有柴胡、枳壳、陈皮、香附等。进一步通过复杂网络分析后得到疏肝健脾活血法治疗乙肝肝纤维化的核心药物包括柴胡、丹参、白芍、白术、黄芪、鳖甲、茯苓、赤芍、当归、枳壳、郁金等,居前五位的核心中药分别是:柴胡、丹参、白芍、白术、黄芪。其中理气药与补虚药、活血化瘀药最常见的配伍组合包括柴胡与白芍、丹参相伍,柴胡与白术、白芍相伍,柴胡与黄芪、丹参相伍等,柴胡与白芍是疏肝健脾活血法治疗乙肝肝纤维化最常见的药对。第二部分:临床研究初筛接受恩替卡韦抗病毒初始治疗的乙肝肝纤维化患者898例,二次筛选后共纳入385例接受恩替卡韦治疗144周的乙肝肝纤维化患者。其中完成治疗前后二次肝脏病理学评价患者共81例,完成治疗前后Fibro Scan检测的共83例,完成治疗前后血清肝纤维化指标检测的共114例。运用倾向性评分匹配两组患者的基线资料使两组具有可比性,结果纳入病理疗效分析44例,纳入血清肝纤维指标疗效分析102例,纳入肝脏硬度值疗效分析66例。在病理肝纤维化分期疗效评估方面,疏肝健脾活血法联合恩替卡韦治疗组的肝纤维化逆转率明显高于单用恩替卡韦组（95.5%vs 18.2%,P<0.001）。在肝纤维化进展方面,治疗组无一例发生肝纤维化进展,而对照组仍有50%的患者发生肝纤维化进展。在血清肝纤维化指标疗效评估方面,对照组的透明质酸（HA）水平较治疗前后无明显变化（40.9 vs 46.6,P=0.744）,而治疗组较治疗前下降（55.2 vs 41.4,P=0.003）,且治疗组治疗前后的差值明显高于对照组（P=0.02）。在Fibro Scan肝脏硬度值疗效评估方面,两组患者的肝脏硬度值均较治疗前下降（P均<0.05）,但与对照组相比,治疗组LSM值较治疗前下降的差值更大,但两组患者治疗前后的变化差值无统计学差异（P=0.142）。为进一步观察疏肝健脾活血法对乙肝肝纤维化患者抗病毒疗效的影响,选取70例ALT<2ULN的HBe Ag阳性乙肝肝纤维化患者为研究对象,结果发现两组患者的HBe Ag血清学转换率均逐年上升,但治疗组的HBe Ag转换率增加趋势高于对照组,治疗组48周、96周、144周的HBe Ag转换率分别为17.1%、26.5%、28.6%,高于对照组的2.9%、12.9%、10.3%;其中两组在48周时的HBe Ag转换率存在统计学差异（P=0.046）。第三部分:网络药理学研究基于以上文献与临床研究共同发现的疏肝健脾活血法的五味核心药物为柴胡、丹参、白芍、白术、黄芪,收集这五味核心药物的有效化学成分及靶点,并进一步获取乙肝肝纤维化的疾病靶点。结果共发现疏肝健脾活血法核心药物与乙肝肝纤维化疾病的交互靶点基因共有205个。PPI蛋白质互作网络分析发现疏肝健脾活血法核心药物治疗乙肝肝纤维化的关键靶点在于AKT1、TP53、CDK1、CCNA2、CCNB1、TOP2A、BIRC5、VEGFA、EGFR、CASP3等核心基因。GO分析发现6个最相关的生物过程,包括DNA转录、促进RNA聚合酶II启动子转录、促进DNA转录、炎症反应、抑制凋亡过程与促进细胞增殖;7个最相关的细胞成分,涉及细胞浆、细胞外间隙、细胞核、细胞膜的组成部分、胞外体、细胞质、细胞核仁等;9个最相关的分子功能,包括同源二聚体蛋白质活化、序列特异性DNA结合之转录因子活化、序列特异性DNA结合、血红素结合、序列特异性DNA结合之RNA聚合酶Ⅱ核心启动子近端区、DNA结合、染色质结合、锌离子结合、ATP结合。KEGG分析发现最相关的前10条通路分别是HIF-1、PI3K-Akt、Toll样受体、NF-kappa B、细胞凋亡、p53、NOD样受体、MAPK、VEGF、Fox O信号通路。结论:文献研究发现疏肝健脾活血法治疗乙肝肝纤维化存在一定的配伍规律,其中使用频率最高的是补虚药,其次是活血化瘀药与理气药。补虚药有黄芪、白术、白芍、鳖甲、当归、党参等;活血化瘀药有丹参、赤芍、郁金、川芎、桃仁等;理气药有柴胡、枳壳、陈皮、香附等。疏肝健脾活血法居前五位的核心中药分别是:柴胡、丹参、白芍、白术、黄芪。临床回顾性研究发现疏肝健脾活血法的中药治疗可协同提高恩替卡韦治疗乙肝肝纤维化的抗纤维化疗效与HBe Ag血清学转换率,但仍需下一步开展前瞻性、多中心、大样本的临床研究进一步。网络药理学研究发现疏肝健脾活血法的核心药物能通过多种细胞分子、多种生物过程、多条信号通路参与抗纤维化的过程,其主要作用于细胞浆、细胞外间隙、细胞核等多组分,通过调控HIF-1、PI3K-Akt、Toll样受体、NF-kappa B、细胞凋亡、p53、NOD样受体、MAPK、VEGF、Fox O等多条信号通路,参与同源二聚体蛋白质活化、序列特异性DNA结合、染色质结合、ATP结合等分子功能,调控DNA转录、促进RNA聚合酶II启动子转录、参与炎症反应、抑制凋亡过程与促进细胞增殖等生物过程发挥抗纤维化的治疗作用。但其具体的作用机制仍需下一步开展深入的实验研究进行验证。
蔡碧莲[3]（2020）在《基于蛋白质组学的荔枝核总黄酮抗大鼠肝纤维化的机制研究》文中研究指明目的:观察荔枝核总黄酮（total flavone of Litchi chinensis Sonn,TFL）对体外HSC-T6细胞抗肝纤维化的作用机制的研究,为其进一步开发利用提供参考。方法:利用荔枝核总黄酮、荔枝核总黄酮含药血清干预HSC-T6 14d后,提取细胞的蛋白,利用蛋白DDA建库和定量DIA技术筛选出表达的差异蛋白,并且利用GO数据库对差异蛋白进行富集分析和注释、Pathway数据库进行信号转导通路分析、蛋白互作分析、亚细胞定位;利用TCMSP数据库筛选TFL的有效成分,在STRING10.5数据库构建TFL化学成分靶点蛋白互作网络,通过Gene Cards数据库获得TFL与肝纤维化相关靶点并对其进行生物信息学分析。结果:质谱数据检索鉴定出荔枝核总黄酮组与模型对照组共有6011个差异蛋白,上调蛋白有168个,下调蛋白有203个。通过GO分析差异蛋白主要参与了结合、催化活性、分子功能调节剂、转录调节活性等10种分子功能,细胞组件主要存在于细胞内、细胞器、细胞外、细胞膜上主要参与细胞过程、代谢过程、生物调节、调节生物过程等27种生物过程;通过KEGG分析,发现其主要涉及代谢途径、补体和凝血级联、肿瘤中的转录失调、NF-κB（核转录因子-κB）信号通路、PPAR（过氧化物酶体增殖物激活受体）信号通路、HIF-1（缺氧诱导因子1）信号通路等30条信号通路;通过对差异蛋白亚细胞定位发现上调蛋白主要分布在细胞外、线粒体、过氧化物酶、内质网、细胞质溶胶-过氧化物酶中,下调蛋白主要分布在细胞核、细胞质溶胶、细胞质膜、细胞质溶胶-核中。从TFL中筛选得到2个活性成分:分别为表儿茶素和槲皮素,共有72个潜在作用靶点,经与肝纤维化相关发病机制靶点进行核查对比,得出TFL与肝纤维化相关发病机制的15个作用靶点基因,其中包括MMP2（基质金属蛋白酶）、CCL2（趋化因子CC亚家族）、TP53（肿瘤抑制蛋白）、HMOX1（血红素加氧酶1）、IFNG（干扰素γ基因）等。上述靶点主要分布在细胞间质、分泌颗粒、蛋白质细胞外基质中,且主要通过免疫反应、趋化因子生物合成过程的正调控、T细胞增殖的正调控、RNA聚合酶II启动子转录的正调控等分子功能来发挥对肝纤维化的治疗作用;上述靶点共涉及32条信号通路,其中基于目前研究显示与肝纤维化相关的信号通路有9条,分别为肿瘤信号通路、HIF-1信号通路、细胞因子与细胞因子受体的相互作用、TNF（肿瘤坏死因子）信号通路、癌症中的Micro RNA、PI3K-Akt信号通路、NOD（核苷酸结合寡聚化结构域）样受体信号通路、NF-κB信号通路、MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）信号通路。TFL治疗肝纤维化的“成分-靶点-通路”网络中IL1B（重组人白介素1beta）、IL6（白细胞介素6）、IFNG等基因是TFL有效成分治疗肝纤维化网络中的核心靶点（节点度值≥15,介数中心性>0.8）;肿瘤信号通路、TNF信号通路、细胞因子与细胞因子受体的相互作用信号通路是TFL有效成分治疗肝纤维化核心作用通路（节点度值≥5,介数中心性>0.001）。结论:蛋白DDA建库和定量DIA能快速筛选出差异蛋白,结合GO分析、KEGG分析能够以整体观阐释TFL体外抗肝纤维化的作用机制;HMOX1、NQO1,ACACA、CDK1蛋白发生异常表达时,能起到抗肝纤维化的作用。由此可推测TFL抗肝纤维化的作用机制可能与这4个差异蛋白的表达有关,这4个蛋白有可能是TFL抗肝纤维化的靶点蛋白。
许杰[4]（2020）在《基于肝窦毛细血管化探讨抗纤软肝颗粒抗肝纤维化的临床疗效与作用机制》文中提出目的:1.从中医学“痰瘀”的角度,评估抗纤软肝颗粒抗肝纤维化的临床疗效及相关数据,为抗纤软肝颗粒抗肝纤维化提供最新的循证医学证据。2.基于网络药理学运用网络数据挖掘技术筛选抗纤软肝颗粒治疗肝纤维化活性成分,并对成分作用潜在靶点与机制进行整合与分析,探究抗纤软肝颗粒抗肝纤维化的药理学机制,为抗纤软肝颗粒抗肝纤维化提供科学依据,以及为后续实验研究提供一定基础。3.通过细胞实验与动物实验,基于肝窦毛细血管化,探讨抗纤软肝颗粒抗肝纤维化的作用机制。方法:1.采用临床回顾性对照研究的方法,从“痰瘀”的角度,研究抗纤软肝颗粒对痰瘀互结型肝纤维化患者临床疗效。将60例慢性乙型肝炎（CHB）肝纤维化患者,分为2组:治疗组患者利用抗纤软肝颗粒联合恩替卡韦（entecavir,ETV）治疗,对照组仅予ETV抗病毒治疗。治疗6个月,比较治疗前后中医证候积分、血清部分肝功能指标、血清肝纤维化及肝脏弹性等指标变化情况。2.采用网络药理学的研究方法,借助Bioinformatics Analysis Tool for Molecular mechANism of Traditional Chinese Medicine（BATMAN-TCM）结合DisGeNET,Genecard,HPO,OMIM疾病靶点数据库,通过构建抗纤软肝颗粒活性成分作用靶点网络与肝纤维化疾病相关靶点网络相互映射来挖掘抗纤软肝颗粒抗肝纤维化作用靶点,利用STRING进行生物过程和通路富集分析,探究抗纤软肝颗粒抗肝纤维化作用机制的通路研究。3.分别采用细胞实验与动物实验的方法:（1）细胞实验中,采取二次重复给药的方式,通过Wistar雄性大鼠制备和提取抗纤软肝颗粒和对照组含药血清,分别处理原代肝窦内皮细胞模型。采用Western-blotting方法检测肝窦内皮标志物分化抗原簇31（CD31）和血管性血友病因子（vWF）的蛋白表达水平,分析抗纤软肝颗粒对肝窦内皮细胞分子水平的影响;采用免疫组织化学的方法检测细胞中CD31、vWF细胞因子表达水平;通过扫描电镜检测肝窦内皮细胞窗孔的变化。（2）动物实验中,通过CCl4--橄榄油混合溶液皮下注射与低蛋白高脂饲料喂养Wistar雄性大鼠诱导肝纤维化动物模型,运用拆方研究的方法,以索拉非尼作为对照药物,研究抗纤软肝颗粒（母方,MF）、母方去鳖甲方（QJ）和鳖甲（BJ）对肝纤维化大鼠一般情况、血清肝功能、肝组织和血清MMP13和TIMP-1分子、肝组织病理学、肝组织肝窦毛细血管化、肝组织肝窦毛细血管化分子水平的影响。另外,对肝组织中NO、NOS、MDA、T-SOD和HYP分子进行测量,观察抗纤软肝颗粒组及其拆方各组对肝组织细胞膜脂质过氧化和酶促防御系统的影响的影响,进而观察其对肝窦毛细血管化的影响。采用生化检测大鼠血清部分肝脏功能ALT、AST、ALB、IgG水平;采用qRT-PCR方法检测大鼠肝组织中MMP-13、TIMP-1和VEGF的mRNA表达水平;采用Western-blotting方法检测肝组织中CD31、vWF、CollagenⅠ和CollagenⅣ的蛋白表达水平;分别采用H&E染色和天狼星红染色检测肝大鼠肝组织病理变化;通过扫描电镜检测大鼠肝组织肝窦内皮细胞窗孔及基底膜的变化;用ELISA法检测大鼠血清中MMP-13、TIMP-1的表达水平;采用生化检测方法检测大鼠肝组织NO、NOS、MDA、T-SOD和HYP指标。结果:1.临床研究结果:抗纤软肝颗粒对慢性乙型肝炎（CHB）肝纤维化痰瘀互结型患者临床研究共收集病例60例,其中男29例,女31例,年龄18-65岁,平均52.5岁,治疗组32例,对照组28例。（1）两组病例在性别、年龄、肝纤维化程度、治疗前主要症状和舌脉积分分布等方面行x2检验,差异无统计学意义（P>0.05）。（2）抗纤软肝颗粒对CHB肝纤维化痰瘀互结型患者临床症状总疗效的影响,结果显示:与对照组相比,治疗组总有效率（84.375%vs60.7 1%）、显效率（53.125%vs28.57%）,差异具有显着统计学意义（P<0.05）。（3）抗纤软肝颗粒对CHB肝纤维化痰瘀互结型患者症候积分的影响及单项症状总有效率比较,结果显示:治疗前两组比较,治疗组与对照组的中医证候积分（23.40±4.14vs22.80±3.85,t=0.5786,P>0.05）;治疗后两组比较,治疗组与对照组的中医证候积分（8.75±3.28vs15.84±4.24,t=7.2916,P<0.01）。两组治疗前后组内比较,治疗后治疗组与对照组中医证候积分均较治疗前下降,差异有显着统计学意义（t=15.6901,P<0.01）。两组对肝纤维化单项症状积分总有效率影响,与对照组比较,治疗组各项单项症状总有效率均显着增高,差异有显着统计学意义（t=11.406,P<0.01）。与对照组相比,抗纤软肝颗粒联合ETV治疗组能显着减轻患者临床症候:右胁隐痛、腹胀、乏力、纳差、便溏、舌暗红/淡暗、苔白腻、脉滑涩等。（4）抗纤软肝颗粒对CHB肝纤维化痰瘀互结型患者部分肝功能指标的影响,结果显示:对照组与治疗组在治疗前后进行组内比较,两组ALT、AST、TBIL、GGT各项指标治疗后均较治疗前下降明显,差异有显着统计学意义（P<0.01）。另外,治疗后两组间比较,治疗组较对照组指标下降幅度更为明显,差异有显着统计学意义（P<0.05）。（5）抗纤软肝颗粒对CHB肝纤维化痰瘀互结型患者肝纤维化指标的影响,结果显示:两组治疗前后进行组内比较,两组HA、PCⅢ、Ⅳ-C、LN指标治疗后均较治疗前下降,差异有显着统计学意义（P<0.01）。治疗后两组组间比较,治疗组较对照组指标下降幅度更为明显,差异有显着统计学意义（P<0.01）。（6）抗纤软肝颗粒对CHB肝纤维化痰瘀互结型患者肝脏弹性的影响,结果显示:两组治疗前后进行组内比较,可见对照组治疗前后指标比较差异无统计学意义（P>0.05）,而治疗组在治疗前后比较,肝脏硬度指标明显下降,差异有显着统计学意义（P<0.01）。另外,两组治疗后组间比较,治疗组较对照组明显降低肝脏硬度指标,差异有显着统计学意义（P<0.01）。2.网络药理学分析结果:在Batman-TCM中输入抗纤软肝颗粒的7种药物,分别搜索到鳖甲1个,丹参39个,地骷髅2个,莪术6个,海藻1个,牡蛎5个,生山楂30个化合物信息,共计84个。通过DisGeNET,Genecard,OMIM,HPO检索并筛选821个肝纤维化疾病相关的靶点,整合筛选出抗纤软肝颗粒成分和肝纤维化交集关键靶点。利用Cytoscape3.7.1软件构建成分-靶点-疾病网络,以大于平均自由度为筛选条件筛选出核心网络,获得95个抗纤软肝颗粒抗肝纤维化的相关靶点。通过STRING的GO功能和途径/通路富集分析得到2203条生物过程,181个分子功能和包括MAPK、JAK-STAT、PI3K-AKT、Toll受体等在内的162条KEGG通路,这些通路为抗纤软肝颗粒在临床中的使用提供更为有力的、可靠的药理学证据。3.实验研究结果:实验一:基于肝窦毛细血管化探讨抗纤软肝颗粒抗肝纤维化作用机制的细胞实验研究,结果显示:（1）抗纤软肝颗粒对肝窦内皮细胞中形态的影响:肝窦内皮细胞经经免疫荧光单标、荧光显微镜观察鉴定。倒置相差显微镜下观察,与对照血清组（Control组）比较,抗纤软肝颗粒含药血清组（MF组）肝窦内皮细胞形态学无明显变化。（2）抗纤软肝颗粒对肝窦内皮细胞窗孔结构的影响:对照组肝窦内皮细胞窗孔狭小,窗孔结构将近闭塞,数量较少,而抗纤软肝方组可见肝窦内皮细胞窗孔结构清晰,窗孔增多增大,明显可见。（3）抗纤软肝颗粒对肝窦内皮细胞CD31和vWF细胞因子的影响:抗纤软肝颗粒组原代肝窦内皮细胞CD31、vWF细胞因子的表达水平较对照组明显降低,差异有显着统计学意义（CD31:0.0688±0.0150vs0.1151±0.0114,t=4.2565,P<0.05;vWF:0.0920±0.0089vs0.1319±0.0135,t=4.2740,P<0.05）。（4）抗纤软肝颗粒对肝窦内皮细胞CD31、vWF蛋白表达的影响:与对照组相比,抗纤软肝颗粒组原代肝窦内皮细胞CD31、vWF的蛋白表达水平明显降低,差异有显着统计学意义（CD31:0.3337±0.0290vs0.4480±0.0128,t=6.2454,P<0.01;vWF:0.5603±0.0472vs0.7093±0.0448,t=3.9658,P<0.05）。实验二:基于肝窦毛细血管化探讨抗纤软肝颗粒抗肝纤维化作用机制的动物实验研究,结果显示:（1）抗纤软肝颗粒对大鼠一般情况的影响:造模组体重增长受到抑制,其它治疗组大鼠体重均有增加。与模型组比较,抗纤软肝颗粒母方组大鼠体重明显增加,差异有统计学意义（P<0.05）。母方组肝纤维化死亡率和腹水发生率明显降低,差异有统计学意义（P<0.05）。肝脏指数和脾脏指数各组比较无明显统计学差异（P>0.05）。（2）抗纤软肝颗粒对大鼠肝功能的影响:经抗纤软肝颗粒组及其拆方各组治疗后血清ALT、AST、IgG水平显着下降,而血清ALB的水平显着上升,差异有显着统计学意义（P<0.05）。（3）抗纤软肝颗粒对大鼠肝组织及血清MMP13、TIMP-1分子的影响:分别用qRT-PCR和ELISA法测定后显示,抗纤软肝颗粒组及其拆方各组可降低肝组织TIMP-1的mRNA表达水平和血清TIMP-1分子水平,而升高肝组织MMP13的mRNA表达水平和血清MMP13的分子水平,差异有显着统计学意义（P<0.01）。与Sor组比较,母方组可明显调节肝组织和血清MMP13、TIMP-1的表达水平,差异有显着统计学意义（P<0.05）。（4）抗纤软肝颗粒对大鼠肝组织病理学的影响:H&E染色中,抗纤软肝颗粒组及其拆方各组可明显改善大鼠肝组织病理变化、肝细胞变性坏死程度、抑制肝组织内结缔组织增生,尤其是母方组。与Sor组相比,母方组（MF组）肝纤维化改善程度更为明显。在天狼星红染色中,与模型组比较,抗纤软肝颗粒组及其拆方各组纤维组织成分含量明显减少,母方组纤维组织含量降低最为明显。（5）抗纤软肝颗粒对大鼠肝组织肝窦毛细血管化的影响:与模型组相比,抗纤软肝颗粒及其拆方各组肝组织,尤其是抗纤软肝颗粒组可见肝细胞索和肝窦结构较清晰,肝窦沟可显现,肝窦扭曲、狭窄程度明显减轻,甚至消失,基底膜较薄或不连续,有的肝窦结构接近正常,肝窦壁内皮细胞窗孔明显可见,与Sor组相比,母方组大鼠肝组织可见肝窦扭曲、狭窄程度改善最为显着。（6）抗纤软肝颗粒对大鼠肝组织肝窦毛细血管化分子水平的影响:抗纤软肝颗粒组及其拆方各组可显着降低VEGF的mRNA表达水平,与Sor组比较,抗纤软肝颗粒组差异有统计学意义。抗纤软肝颗粒组及其拆方各组可显着降低CD31、vWF、CollagenI、CollagenIV的蛋白水平,尤其是抗纤软肝颗粒组。与Sor组比较,抗纤软肝颗粒对于降低CD31、vWF、CollagenI、CollagenIV的蛋白水平效果更为显着,差异具有统计学意义（P<0.05）。（7）抗纤软肝颗粒对大鼠肝组织中NO、NOS、MDA、T-SOD和HYP分子的影响:抗纤软肝颗粒组及其拆方各组可显着降低MDA、NO、NOS和HYP表达水平,而升高T-SOD表达水平,差异具有统计学意义。与Sor组比较,母方组可明显调节MDA、T-SOD、NO、NOS和HYP的表达水平,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论:1.对于治疗CHB肝纤维化痰瘀互结证,抗纤软肝颗粒联合ETV与单用ETV治疗比较,两组均显示一定疗效,均可改善患者临床证候、肝功能和肝纤维化指标。对单用ETV对照组比较,抗纤软肝颗粒联合ETV治疗组对于改善肝纤维化患者临床证候,部分肝功能和肝纤维化指标有明显优势,尤其在改善肝脏硬度方面。抗纤软肝颗粒在肝纤维化“痰瘀互结”证的治疗中起到明显软坚消痰、活血化瘀的抗肝纤维化作用。2.通过网络药理学预测分析发现抗纤软肝颗粒作用肝纤维化的相关机制可能跟MAPK、PI3K-AKT、JAK-STAT、Toll样受体等信号通路密切相关,抗纤软肝颗粒具有抗肝纤维化的药理学依据。3.细胞实验与动物实验研究结果表明,抗纤软肝颗粒对体外原代肝窦内皮细胞和体内大鼠肝纤维化组织肝窦毛细血管化有积极的治疗作用。同时,动物实验中发现,中药复方抗纤软肝颗粒、去鳖甲方与鳖甲均具有明显的抗肝纤维化作用,尤其是母方（抗纤软肝颗粒）疗效最佳。抗纤软肝颗粒对肝纤维化的作用机制,可能是通过抑制肝窦毛细血管化而防治肝纤维化。
谯明[5]（2020）在《转录—蛋白质组学的芹菜子抗肝纤维化物质基础及机制研究》文中认为目的:筛选芹菜子和芹菜根抗肝纤维化有效部位及单体活性成分;构建芹菜子活性成分-作用靶点网络和蛋白互作网络,初步预测芹菜子活性成分抗肝纤维化作用机制;阐明芹菜素对CCl4诱导的肝纤维化大鼠的影响及作用机制,为后续新药研发提供理论基础。方法:1)采用TGF-β1诱导HSC-LX2细胞活化,建立体外肝纤维化模型。通过检测细胞增殖、凋亡及肝纤维化指标含量比较芹菜子和芹菜根不同提取物及其萃取部位体外抗肝纤维化活性;2)通过检测HSC-LX2细胞增殖、凋亡及肝纤维化指标含量,观察芹菜子60%乙醇提取物的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水部位体外抗肝纤维化活性;采用GC-TOF-MS和UHPLC-MS/MS技术对芹菜子有效成分进行识别分析,共同考察芹菜子抗肝纤维化活性与有效成分之间的相关性;3)采用硅胶柱色谱、Sephadex LH-20、ODS和聚酰胺柱色谱等方法对芹菜子化学成分进行分离纯化,利用1H-NMR和13C-NMR鉴定化合物结构,并对所有单体化合物进行体外抗肝纤维化活性筛选;4)通过TCMSP数据库、文献挖掘和本实验室已有研究获取芹菜子活性成分,Swiss Target Prediction平台和BATMAN-TCM数据库获取成分靶点,Gene Cards和OMIM数据库预测和筛选肝纤维化的作用靶点。采用Cytoscape软件构建活性成分-作用靶点网络,String和Cytoscape软件绘制蛋白互作网络。采用DAVID对靶点进行GO功能富集分析及KEGG通路富集分析,结合相关文献分析芹菜子活性成分抗肝纤维化的作用机制;5)雄性Wistar大鼠适应性饲养1周后随机分为正常组、模型组、阳性对照组(复方鳖甲软肝片,0.60g·kg-1)及芹菜素高剂量组(0.60g·kg-1)、中剂量组(0.30g·kg-1)和低剂量组(0.15g·kg-1),每组15只。除正常组外,其余各组灌胃给予40%CCl4花生油溶液(1m L·kg-1),正常组给予相应体积花生油,每周2次,连续9周。从造模第5周起,给药组分别灌胃给予相应的受试药物,正常组和模型组给予等量溶媒,每天1次,连续5周。给药结束后收集大鼠血清和肝、脾组织,采用全自动生化仪检测大鼠血清ALT、AST、ALB、TP、ALP和LDH水平;试剂盒测定大鼠血清TB、DB、GSH-PX、Hyp、SOD和MDA水平;ELISA法检测大鼠血清中HA、LN、PCIII和IV-C含量;HE和Masson染色观察肝脏病理组织学变化;免疫组化法测定肝组织中TGF-β1和COL-I蛋白的表达;6)采用转录组学和蛋白质组学方法筛选大鼠肝组织中差异表达的基因和蛋白质,对差异表达的基因和蛋白质进行生物信息学分析。整合转录组学和蛋白质组学分析结果,对差异m RNA-protein进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析,并采用q RT-PCR和Western blot对富集程度高的靶蛋白进行验证,进一步阐明芹菜素抗肝纤维化的作用机制。结果:1)芹菜子60%乙醇提取物和芹菜根95%乙醇提取物及其石油醚部位可有效抑制HSC-LX2细胞活化,降低LN、HA和PCIII的含量,促进细胞凋亡,其中芹菜子60%乙醇提取物石油醚部位体外抗肝纤维化作用最强,故将芹菜子作为后续研究对象;2)芹菜子60%乙醇提取物的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水部位高剂量对HSC-LX2细胞增殖抑制率分别为75.14%、73.52%、54.09%和43.36%,细胞凋亡率分别为37.5%、4.3%、0.7%和0.1%,石油醚部位细胞上清液中肝纤维化指标含量更接近于正常组。石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水部位中共鉴定识别出122个化学成分,石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水部位体外抗肝纤维化活性呈现由强到弱的趋势,与所含芹菜素、芹菜甲素、秦皮乙素及其含量呈正相关;3)从芹菜子中共分离鉴定了9个单体化合物,分别为芹菜素、佛手柑内酯、芹菜苷、芦丁、山柰酚、木犀草素、槲皮素、大叶茜草素和芹菜甲素。芹菜素、芹菜苷、芦丁、山柰酚、槲皮素和芹菜甲素对HSC-LX2细胞增殖抑制率分别为71.32%、30.87%、15.81%、22.02%、48.28%和61.93%;4)筛选得到芹菜子17个活性成分,其中apigenin、aesculetin和3-n-butylphthalide具有较多的作用靶点,可能在芹菜子的药理作用中起到较为核心的作用。芹菜子活性成分作用的69个靶点主要涉及collagen catabolic,inflammatory response和negative regulation of cholesterol storage等生物过程,通过调节TGF-β,NF-κB和PI3K/AKT等信号通路来发挥抗肝纤维化作用;5)与模型组相比,芹菜素各剂量组大鼠血清肝纤维化四项指标HA、LN、PCIII和IV-C含量均显着降低（P<0.05）;血清肝功能指标AST、ALT、ALP、MDA、LDH、Hyp、TP、TB和DB水平显着下降（P<0.05）,ALB、SOD和GSH-PX水平显着升高（P<0.05）;大鼠的肝脾指数明显降低（P<0.05）。病理组织学及免疫组化结果显示,芹菜素低、中、高剂量组大鼠肝纤维化及炎性程度逐渐减轻;6)通过转录组学分析,芹菜素组中有161个基因上调,891个基因下调,涉及的信号通路主要包括Cytokine-cytokine receptor interaction,PPAR signaling pathway,Focal adhesion和Cell adhesion molecules。通过蛋白质组学分析,芹菜素组中正调控蛋白207个,负调控蛋白332个,涉及的信号通路主要包括HIF-1/VEGF/MAPK signaling pathway,Focal adhesion和ECM-receptor interaction。转录组学和蛋白质组学数据整合分析结果显示,芹菜素可能通过HIF-1/MAPK/e NOS/VEGF/PI3K/AKT signaling pathway,Focal adhesion和Regulation of actin cytoskeleton发挥抗肝纤维化作用。q RT-PCR和Western blot验证实验结果显示,大鼠肝组织中TGF-β1、α-SMA、HIF-1α、VEGF、i NOs、FAK和p38 MAPK m RNA和蛋白表达受到抑制,肝组织炎症及纤维化程度明显减轻。结论:1)从芹菜子中分离得到9个化合物,其中佛手柑内酯和大叶茜草素为首次从芹菜子中分离得到,大叶茜草素为首次从该属植物中分离得到。芹菜子有效成分识别分析结合单体化合物体外药效实验,确定了芹菜素、芹菜甲素和秦皮乙素是芹菜子抗肝纤维化的主要活性成分,其中芹菜素生物活性最强;2)网络药理学初步预测了芹菜子活性成分抗肝纤维化主要涉及的生物过程和信号通路,体现了芹菜子“多成分-多靶点-多途径”的作用特点,为进一步开展芹菜子活性成分抗肝纤维化作用的药理学研究提供了新思路和新方法;3)转录组学和蛋白质组学联合分析,从整体水平探讨了芹菜素抗肝纤维化作用机制,建立了“多靶点-多通路”复杂网络关系,从系统层面探析芹菜素抗肝纤维化机制为通过TGF-β、HIF-1、MAPKs、PI3K/AKT、e NOS和VEGF介导的FAK磷酸化途径来改善CCl4诱导的大鼠肝纤维化。
陈姗[6]（2019）在《荔枝核总黄酮对大鼠肝星状细胞TGF-β1/Smads通路及PPAR-r/c-Ski通路的影响》文中研究指明目的:荔枝核总黄酮对大鼠肝星状细胞增殖抑制作用,并从TGF-β1/Smad通路及PPAR-r/c-Ski通路探讨荔枝核总黄酮抗肝纤维化的可能作用机制。方法:体外培养大鼠肝星状细胞,分为空白对照组、TFL浓度20ug/ml组、40ug/ml组、80ug/ml组、160ug/ml组、320ug/ml组,分别干预48h后,运用CCK-8法检测各组细胞的增殖情况;再设置为空白组、秋水仙碱对照组、TFL低剂量组、TFL中剂量组、TFL高剂量组ELISA法检测各组细胞上清液中PPAR-r、c-Ski的含量;qPCR法检测各组TGF-β1、Smad3/4 mRNA的表达。结果:CCK-8结果显示,随着TFL作用浓度的增加,药物对细胞的增殖的抑制率增高;ELISA结果显示,与空白组比较,各组细胞上清液中PPAR-r、c-Ski的含量均显着升高（P<0.01）,并在TFL高剂量组中含量达到最高（P<0.01）;与秋水仙碱对照组比较,TFL高剂量组中的细胞上清液PPAR-r、c-Ski含量均高于秋水仙碱对照组（P<0.01）,TFL中剂量组中的细胞上清液PPAR-r含量相对高于秋水仙碱对照组（P<0.05）,TFL中剂量组中的细胞上清液c-Ski含量高于秋水仙碱对照组（P<0.01）,TFL低剂量组中的细胞上清液PPAR-r含量低于秋水仙碱对照组（P<0.01）,TFL低剂量组中的细胞上清液c-Ski含量相对高于秋水仙碱对照组（P<0.05）;qPCR结果显示,与空白组比较,各组细胞中TGF-β1、Smad3/4 mRNA的表达量均显着降低（P<0.01）,并在TFL高剂量组中达到最低（P<0.01）;与秋水仙碱对照组比较,TFL高剂量组中的细胞中TGF-β1、Smad3/4 mRNA的表达量均明显低于秋水仙碱对照组（P<0.01）,TFL中剂量组中的细胞中Smad3 mRNA的表达量明显低于秋水仙碱对照组（P<0.01）,TFL中剂量组中的细胞中TGF-β1、Smad4mRNA的表达量相对低于秋水仙碱对照组（P<0.05）,TFL低剂量组中的细胞中TGF-β1mRNA的表达量相对低于秋水仙碱对照组（P<0.05）,TFL低剂量组中的细胞中Smad3/4 mRNA的表达量相对高于秋水仙碱对照组（P<0.05）。结论:荔枝核总黄酮能够抑制大鼠肝星状细胞增殖,降低细胞外基质分泌,该机制可能与增加大鼠肝星状细胞上清液中PPAR-r、c-Ski的含量,抑制TGF-β1、Smad3/4 mRNA表达有关。
王晓翔[7]（2019）在《HDAC靶向抑制剂N2E的抗肝纤维化作用及其机制研究》文中研究说明目的:小分子化合物N2E（N-（2-乙氧基苯基）-N’-羟基辛二酰胺）是SAHA的同源异羟肟酸衍生物,对HDAC的抑制作用较SAHA强。本实验将应用于治疗肝纤维化的相关研究,评价N2E的治疗肝纤维化作用效果,阐明其可能的作用机制,为今后的药物研究打下一定的实验和理论基础。方法:1.N2E抗动物肝纤维化模型实验:C57小鼠70只,随机均分7组,即阴性对照组、肝纤维化模型组、N2E三个剂量治疗组（10mg/kg、20 mg/kg、40mg/kg）、阳性药物对照组SAHA（40mg/kg）以及阳性药物对照组水飞蓟宾（40mg/kg）。除阴性对照组外,其它组小鼠腹腔注射20%CCl4,每周2次,持续6周,同时治疗组隔天同体积灌胃给药,直至6周实验结束停止给药。实验结束后24h,收集血样,检测其血清ALT、AST的活力;收集肝脏标本,检测肝组织的羟脯氨酸水平以及通过组织病理观察、天狼星红染色观察肝纤维化的情况;通过免疫组化检测肝纤维化进程。2.流式细胞仪检测N2E对细胞周期和凋亡的影响;Annexin V-FITC/PI双染法检测N2E诱导LX-2细胞凋亡的作用;再通过线粒体膜电位检测以及Caspase-3活性试剂盒检测N2E对LX-2细胞凋亡作用。3.利用免疫组化染色方法在肝纤维化临床样本中,验证HDAC3基因的蛋白水平,并进一步分析HDAC3表达水平与肝纤维化的相关性;通过LX-2的总RNA提取和荧光定量PCR验证N2E作用后的mRNA表达水平。4.Western blotting检测N2E对LX-2细胞肝纤维化相关蛋白的表达影响;使用PDGF-BB对LX-2刺激激活后,免疫印迹法检测其对HDAC3、以及TGF-β1信号通路相关蛋白表达的影响。结果:1.HE染色和天狼星红染色均显示了N2E显着减弱CCl4引起的慢性肝纤维化,与模型组比较,N2E组纤维化程度有了明显的下降趋势（p<0.001）,N2E修复程度强于阳性药物SAHA组以及水飞蓟宾组;相较于模型组,N2E能明显降低肝纤维化小鼠血清ALT和AST水平以及组织羟脯氨酸的含量,差异具有统计学意义（p<0.01）,胶原纤维含量接近正常水平;IHC检测肝星状细胞活化标志物α-SMA的表达情况,N2E组较模型组有明显下调。2.细胞周期分析实验显示,N2E对LX-2细胞的细胞周期影响是通过阻滞于S期,而发挥抑制细胞增殖作用,且呈现浓度依赖性作用。与阳性药物SAHA结果一致;凋亡检测实验结果显示,N2E（2.5μM、5.0μM及10.0μM）及10μM SAHA均能显着诱导LX-2细胞的凋亡发生（p<0.05）,且呈现浓度依赖性。高浓度（10μmol/L）的N2E能明显下调线粒体膜电位,差异具有统计学意义（p<0.01）。N2E能明显提升LX-2中Caspase-3的活性,且强于阳性药SAHA。3.对收集的20例肝病组织标本进行HDAC3的免疫组化染色检测,与正常肝对照组织比较,肝纤维化组织中HDAC3的表达升高显着。荧光定量PCR检测技术显示,通过特异性抑制HDAC3,TGF-β1表现出明显的下调趋势（p<0.05）,同时,肝星状细胞活化标志物α-SMA以及胶原纤维Collagen-α1也呈现出明显的表达下调。4.免疫蛋白印记结果显示,与Control组相比,N2E组下调了HDAC3、α-SMA、TGF-β1以及促进Cleaved-Caspase-3蛋白的表达水平;在用PDGF-BB刺激LX-2细胞进行激活后,使用RGFP966特异性抑制HDAC3对TGF-β1以及α-SMA具有下调作用,而N2E对TGF-β1和α-SMA表达下调作用不明显,SAHA结果类似。结果表明,异羟肟酸类HDAC抑制剂对PDGF-BB体外肝纤维化模型没有明显作用。同时,根据HDAC3特异性抑制剂RGFP966的作用结果提示,N2E可能通过抑制HDAC3来下调TGF-β1,进而抑制LX-2细胞的增殖和细胞外基质的积累。结论:本文通过体内外的实验,首次揭示了N2E对四氯化碳诱导肝纤维化模型具有抗肝纤维化作用和保护肝脏功能的作用;阻滞肝星状细胞周期于S期和诱导其凋亡作用。其作用机制可能通过抑制HDAC3,影响TGF-β1信号通路来发挥其抗肝纤维化的作用。
王绍展[8]（2011）在《苦参碱结构修饰物-19抗大鼠实验性肝纤维化作用及机制研究》文中提出【研究背景及目的】肝纤维化（hepatic fibrosis,HF）是指在各种致病因子如炎症、损伤、药物、遗传因素等的作用下,活化的成纤维细胞或肌成纤维细胞（myofibroblasts, MFs）增多,细胞外基质（extracellular matrix, ECM）大量沉积的病理改变。它是继发于各种形式慢性肝损伤之后组织修复过程中的代偿反应,亦是慢性肝病发展为肝硬化必经的病理过程。肝纤维化为一动态过程,属可逆性病变,因此,阻断、抑制或逆转肝纤维化是治疗慢性肝病的一个重要目标。既往认为,肝星状细胞（hepatic stellate cell,HSC）是肌成纤维细胞（myofibroblasts）的最主要来源。但是,晚近研究表明原位间质细胞、上皮细胞及内皮细胞,尤其是胆管细胞和肝细胞也被证明可通过上皮细胞间质转型（epithelial-to-mesenchymal transition, EMT）向肌成纤维细胞转化,表明肝实质的上皮细胞也参与肝纤维化进程。苦参碱是从中国传统中药苦参中提取的一种生物碱,目前的研究发现其抗炎,免疫调节,对小鼠急性肝损伤具有保护作用,并能抗大鼠实验性肝纤维化作用。虽然苦参碱的药理作用广泛,但是活性不高,需要对其进行结构改造,得到活性更强、毒性更低的衍生物。再者,苦参碱的药理作用机制不明确,特别是其靶标蛋白的研究仍是空白。本课题组前期研究发现,苦参碱的羰基氧原子被硫原子取代后,其药理活性大为增强,为此我们对苦参碱进行结构改造,得到40多个苦参碱衍生物。本研究首先对部分苦参碱衍生物进行抗RAW264.7细胞释放TNF-α作用和抑制NF-кB转录活性的筛选,挑选出药效高,毒性低的苦参碱衍生物-19（M-19）;接着对M-19治疗BDL和DMN诱导的大鼠实验性肝纤维化效果进行评价,并初步探讨M-19阻遏EMT进程是其抗肝纤维化的作用机制之一;对M-19抑制TGF-β1诱导原代培养肝细胞、原代培养肝星状细胞和肝星状细胞系HSC-T6细胞EMT进程的阻断,以及对HSC-T6细胞增殖抑制、凋亡诱导作用的研究,阐释M-19抗肝纤维化的多环节机制;通过连续亲和色谱法、竞争亲和色谱法结合MALDI-TOF-TOF质谱鉴定等技术,确证Mat及M-19的特异结合蛋白为核糖体蛋白S5（RPS5）。通过免疫组化和Real-time PCR检测RPS5在纤维化模型大鼠组织中表达变化,以及RPS5在原代肝星状细胞和HSC-T6细胞EMT中的作用研究,推测Mat及M-19可能通过抑制肝脏细胞RPS5的降解或表达水平的下降,而发挥抗肝纤维化作用。【实验方法】一、苦参碱衍生物抗RAW264.7细胞释放TNF-α和抑制NF-кB转录活性筛选（一）采用MTT法测定不同浓度的苦参碱及苦参碱衍生物处理24h,对RAW264.7细胞增殖活性的影响,以比较药物的细胞毒性作用,并确定安全的药理作用浓度范围。（二）分别采用细胞毒结晶紫法和ELISA法对LPS刺激的RAW264.7细胞上清中的TNF-α生物学活性和含量进行测定,比较苦参碱和一系列苦参碱衍生物对RAW264.7细胞释放TNF-α的抑制作用,筛选出高活性衍生物。（三）采用双荧光素酶报告基因法,测定苦参碱衍生物对LPS刺激的RAW264.7细胞NF-кB转录活性的抑制作用,进一步比较药物的药理活性。二、苦参碱及苦参碱衍生物-19抗大鼠实验性肝纤维化作用研究（一）苦参碱及苦参碱衍生物-19对BDL大鼠肝纤维化的抑制作用将雄性SD大鼠随机分为7组,假手术组6只,其余各组10只,分设假手术组、胆总管结扎组、苦参碱衍生物-19 :12.5mg/kg、25mg/kg和50mg/kg治疗组,苦参碱50mg/kg治疗组,氧化苦参碱50mg/kg治疗组。钝性分离并结扎胆总管,制备BDL肝纤维化模型。术后3d ,各药物组灌胃给予相应药物处理,假手术组和胆总管接扎组灌胃生理盐水。于接扎后第25d处死大鼠,碱水解法测定各组肝组织羟脯氨酸含量;HE染色观察纤维化程度,Masson和Sirius red染色以计算ECM含量。Real time RT-PCR及免疫组织化学法测定肝组织Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、α-平滑肌激动蛋白（α-SMA）、钙粘附蛋白（E-cadherin）、HNF4α和TGF-β1等EMT相关基因的表达。（二）苦参碱及苦参碱衍生物-19对DMN损伤大鼠肝纤维化的抑制作用将雄性SD大鼠随机分为7组,对照组7只,其余各组每组10只,分设假手术组、胆总管结扎组、苦参碱衍生物-19 :12.5mg/kg、25mg/kg和50mg/kg治疗组,苦参碱50mg/kg治疗组,氧化苦参碱50mg/kg治疗组。除空白对照组外,其余各组予1%DMN溶液按照10μg/kg的剂量腹腔注射,每周连续注射3次,共注射5w,制备DMN诱导的大鼠肝纤维化模型。于DMN注射第5w起各组灌胃给予相应药物治疗,空白对照组和模型对照组灌胃生理盐水处理。药物治疗3w后处死,观察指标同BDL模型。三、M-19体外抗肝纤维化作用机制研究（一）M-19对原代肝细胞EMT抑制作用研究分离制备原代培养SD大鼠肝细胞,培养2 d后,换成含有2ng/ml TGF-β1无血清培养基,同时设立空白对照组和M-19: 5 ,10,20 umol/L处理组。刺激48h后,提取细胞总RNA。Real time RT-PCR法检测肝细胞核因子4α（HNF4α）、上皮细胞钙粘蛋白（E-cadherin）等基因mRNA水平。（二）M-19对原代肝星状细胞EMT抑制作用研究分离制备原代培养SD大鼠肝细胞,培养2 d后,换成含有2ng/ml TGF-β1无血清培养基,同时设立空白对照组和M-19: 5 ,10,20 umol/L处理组。刺激24h后,提取细胞总RNA。Real time RT-PCR法检测α-SMA、Vimentin和Collagen I等基因mRNA水平。（三）M-19对肝星状细胞系HSC-T6 EMT抑制作用研究HSC-T6细胞1.5×105/well分于6孔细胞培养板,培养24h后,加入2ng/ml TGF-β1刺激24h,同时设立空白对照组、苦参碱衍生物-19: 2.5,5,,10umol/L处理组。收集细胞,提取总RNA,Real time RT-PCR检测E-cadherin、α-SMA、CollagenI和CollagenIII基因的mRNA水平（四）M-19对肝星状细胞系HSC-T6增殖抑制作用研究HSC-T6细胞1.5×104/well分于96孔细胞培养板,培养24h后,加入终浓度为0.8 , 4 , 10, 20, 40, 100 umol/L M-19,继续处理24h或48h。MTT法测定细胞的增殖活性（五）M-19诱导肝星状细胞系HSC-T6凋亡作用研究HSC-T6细胞1.5×104/well分于6孔细胞培养板,培养24h后,加入终浓度为10,20,40 umol/L的M-19,继续处理24h,收集细胞,流式细胞术检测凋亡率四、MAT和M-19特异结合蛋白的研究（一）连续亲和色谱法和竞争亲和色谱法分离苦参碱特异结合蛋白采用苦参碱共价结合树脂,从RAW264.7细胞和Jurkat细胞裂解液中分离苦参碱的特异结合蛋白;采用MALDI-TOF-TOF质谱鉴定特异结合蛋白的多肽序列,数据库分析特异结合蛋白为核糖体蛋白S5（RPS5）;再通过RPS5的抗体免疫印迹检测确证。（二）生物素亲和素系统分离M-19特异结合蛋白RPS5构建M-19共价结合生物素,与HSC-T6细胞共孵育6h,利用亲和素从细胞裂解液中分离M-19特异结合蛋白;通过RPS5的抗体免疫印迹检测确证（三）M-19与RPS5共定位分析构建M-19共价结合生物素（biotin-M-19）,与HSC-T6细胞共孵育6h,免疫细胞化学特异性双标biotin-M-19和RPS5,激光共聚焦共定位分析五、RPS5与肝纤维化关系研究（一）RPS5在肝纤维化模型中表达水平变化采用免疫组织化学和Real time RT-PCR技术,检测BDL和DMN致大鼠肝纤维化模型中RPS5蛋白和基因mRNA水平表达变化（二）RPS5在原代肝星状细胞活化过程中表达水平变化采用Real time RT-PCR技术,检测原代分离肝细胞在体外培养自发活化过程中,RPS5基因mRNA表达水平变化（三）TGF-β1刺激下HSC-T6细胞RPS5表达水平变化采用Western blot检测TGF-β1刺激HSC-T6细胞1,3,5,7d RPS5蛋白表达水平变化情况（四）RPS5 siRNA对HSC-T6细胞EMT的影响转染RPS5 siRNA序列si335于HSC-T6细胞,48h后检测E-cadherin和Vimentin蛋白表达情况【实验结果】一、苦参碱及其衍生物抗RAW264.7细胞释放TNF-α和抑制NF-кB转录活性研究30μM的苦参碱衍生物-19,24,对RAW细胞增殖没有抑制作用,且在此浓度时对LPS刺激的RAW264.7细胞释放TNF-α的抑制率分别为70.0%和83.6%（P<0.001）,效果高于其余药物。30μM的苦参碱衍生物-19,24处理组RAW264.7细胞NF-кB转录活性分别降低为LPS刺激组的48.2% （P=0.002）和52%（ P=0.002）。二、苦参碱及苦参碱衍生物-19抗大鼠实验性肝纤维化作用研究（一）苦参碱及苦参碱衍生物-19对BDL大鼠肝纤维化的抑制作用M-19 50mg/kg治疗组与BDL模型组相比:肝组织羟脯氨酸含量（387.74±59.41μg/g） ,较模型对照组（564.18±104.27μg/g）显着减少（ P =0.0003）;肝组织胶原面积减少37% （P<0.001）;免疫组织化学检测显示TGF-β1、α-SAM和Desmin等蛋白表达显着下调,HNF4α的蛋白表达显着上调;Real-time PCR检测结果表明α-SAM、CollagenIII、TGF-β1等基因mRNA显着下降（P<0.05）,同时HNF4αmRNA水平显着上调（P<0.05）。（二）苦参碱及苦参碱衍生物-19对DMN大鼠肝纤维化的抑制作用M-19 50mg/kg治疗组肝组织羟脯氨酸含量（414.97±182.5μg/g） ,较模型对照组（720.3±289.3μg/g）显着减少（ P =0.021）。胶原面积较模型组减少64.5%（P =0.023）。免疫组织化学结果表明,M-19 50mg/kg治疗3w,能显着下调TGF-β1、α-SAM和Desmin的表达,同时上调HNF-4α,E-cadherin的表达。Real-time PCR检测结果表明M-19 50mg/kg治疗组与模型组相比α-SMA水平显着下降（P =0.013）,而Ecadherin水平显着上升（P =0.004）。三、M-19体外抗肝纤维化作用机制研究Real-time PCR检测结果表明:原代肝细胞经M-19 20μM处理48h, HNF4α和Ecadherin的mRNA水平分别为（87.8±3.7%）和（91.41±5.4%）,与TGF-β1 2ng/ml诱导组相比（68.3±6.9%, P =0.007 ）和（78.9±6.1%, P =0.006）显着升高。M-19能剂量依赖性的下调TGF-β1 2ng/ml诱导原代肝星状细胞α-SMA（P <0.001）、Vimentin（P =0.021）和CollagenImRNA（P =0.017）水平升高。对于TGF-β1 2ng/ml刺激的HSC-T6细胞,M19-10umol/L处理组能显着降低α-SMA（P =0.022）和CollagenII（IP<0.001）的mRNA水平,同时上调E-cadherin mRNA水平（P =0.007）。MTT检测结果表明M-19可浓度依赖性的抑制HSC-T6增殖,40umol/L的M-19分别处理HSC-T6细胞24h和48h,对细胞的增殖抑制率分别为79%和94.5%。流式细胞术检测HSC-T6细胞凋亡率发现,M-19 40umol/L处理24h,能诱导21.14%的HSC-T6细胞凋亡。四、MAT和M-19特异结合蛋白的研究采用连续亲和色谱法和竞争色谱法从Jurkat或RAW264.7细胞裂解液中分离出23KD的特异性结合蛋白条带;MALDI-TOF-TOF质谱鉴定特异结合蛋白的多肽序列片段YLPHSAGR ,LTNSMMMHGR,QAVDVSPLR等,与人核糖体蛋白S5（Ribosomal protein S 5,RPS5）匹配,Western blot检测结果确证RPS5为23KD处特异结合蛋白条带。由M-19共价结合生物素分离得到的HSC-T6细胞中特异结合蛋白,经Western blot确证同样为RPS5;免疫细胞化学双标技术检测表明,在HSC-T6细胞内M-19与RPS5特异性结合。五、RPS5与肝纤维化关系研究免疫组织化学和Real-time PCR检测结果表明,肝纤维化过程中RPS5表达下调,而M-19治疗组能显着抑制其下调。原代培养肝星状细胞自发活化过程中,RPS5 mRNA水平在第3d就降至64%,之后维持该水平至第7d。免疫印迹检测结果表明,TGF-β1 2ng/ml刺激7天,HSC-T6细胞RPS5的表达逐渐下调。转染RPS5 siRNA 335后,HSC-T6细胞Vimentin蛋白表达上调,同时E-cadherin表达下调。【结论】一、M-19和M-24对RAW264.7细胞的增殖活性抑制作用较小,对LPS刺激RAW细胞释放TNF-α抑制作用好于苦参碱及同类苦参碱衍生物,并具有抑制NF-кB转录活性作用。二、M-19可抑制BDL或DMN肝纤维化大鼠肝组织EMT进程,降低肝脏ECM沉积,具有抗肝纤维化作用。三、M-19抗肝纤维化作用机制与其抑制肝细胞和肝星状细胞的EMT进程,抑制肝星状细胞增殖,诱导肝星状细胞凋亡有关。四、核糖体蛋白S5是苦参碱和M-19的特异结合蛋白。五、核糖体蛋白S5的降低可促进EMT发生,导致肝纤维化。
余帮[9]（2011）在《周期性张应变对肝星状细胞生物活性的影响》文中进行了进一步梳理研究背景生物体在从器官、组织到细胞等各个层次上的生命活动均离不开一定的力学环境。作为生命基本组成单元的细胞,其生存的力学环境非常复杂。肝星状细胞（hepatic stellate cells, HSC）是肝脏分泌细胞外基质的主要细胞,在肝纤维化的发病机制中占有重要的地位。如何控制HSC的活性从而逆转肝纤维化的进程是抗肝纤维化研究的重点之一。慢性肝炎往往伴随着门脉高压症,高门脉压力会使肝窦扩张,HSC受到的牵张力增大。国内外对机械牵张对HSC生物性状的影响的研究甚少。本研究通过应用程序化细胞牵拉装置Flexercell Strain Unit 2000,对体外培养的HSC施与循环机械牵拉造成周期性张应变,并研究其对HSC生物学活性的影响,探讨张应变在HSC活化、增殖、生成ECM等功能改变中所起的作用及其作用机制。方法采用酶消化—密度梯度离心法分离大鼠HSC。实验分为对照Control组（Con）、单纯牵拉Stretch组（MS）、牵拉+ cRGDfV （AM100）组（AM）、牵拉+SB202190组（SB）、牵拉+wortmannin组（wort）、牵拉+ PD98059组（PD）共六组。细胞培养于BioFlex六孔板,生长至合适密度后,换成含1% FBS的DMEM培养液同步化24小时,含抑制剂的四组细胞用含相应工作浓度的抑制剂工作液处理,对照组与单纯牵拉组细胞用含0.5‰DMSO和1% BSA的DMEM培养液处理;1小时后给除对照组外的其他组细胞施加周期性张应变（牵拉条件为10%幅度,0.5 Hz频率,24 h时间）。牵拉完毕后检测细胞的增殖、迁移等功能,提取总RNA行PCR检测各种细胞活化相关因子的基因表达,提取总蛋白行western blot检测多种信号蛋白表达。实验重复三次。数据用均数±标准差表示,应用SPSS 18.0软件进行统计学分析,方法采用单因素方差分析,显着性P<0.05认为总体差异有统计学意义,多重比较选用Tukey检验。结果一、HSC的分离与鉴定:应用密度梯度离心法成功分离出静止期大鼠HSC,台盼蓝染色鉴定HSC存活率95%以上; Desmin、α-SMA免疫荧光鉴定静止与活化HSC细胞纯度达95%以上。细胞正常培养5-7天左右自行活化,生长繁殖明显增强,传代培养5次后生长繁殖能力下降。二、不同牵拉条件对HSC的影响当牵拉参数设置为10%幅度、0.5 Hz频率、24小时的时候,牵拉组HSC的胶原基因生成不仅比对照组显着增加,也是各种条件中差异比较明显而稳定的一个状态。故后续实验中均使用10%幅度、0.5赫兹、24小时的牵拉条件。三、周期性张应变对HSC生物活性的影响周期性张应变能显着促进HSC增殖,给予整合素αvβ3抑制剂cRGDfV能够抑制周期性张应变的促增殖效应。周期性张应变明显促进了HSC的α-SMA的表达,同时也促进TGF-beta 1与CTGF等促纤维化因子的表达,提示周期性张应变促进HSC的增殖与活化,是部分通过促进TGF-β1与CTGF表达实现的。另外本实验未能检测到周期性张应变影响PDGF-B及其受体PDGFR-B表达,提示周期性张应变的促增殖活化作用与PDGF-B通路无关。周期性张应变能够显着促进HSC的I型胶原α1链（COL1A1）和III型胶原α1链（COL3A1）的mRNA表达,其中以COL3A1更为明显;该作用能够被cRGDfV所抑制。通过划痕与Transwell实验发现,周期性张应变单独作用对HSC的迁移影响不明显,但是能够增强PDGF所诱导的HSC迁移。而通过抑制αvβ3整合素的活化,周期性张应变的促增殖、活化与迁移影响明显减弱。综合前述结果,本部分研究发现提示在肝纤维化发生发展过程中,一方面直接通过整合素途径,促进TGF-beta、CTGF等促纤维化因子,促使HSC的增殖活化,从而直接参与了肝纤维化的发生;另一方面,通过激活整合素途径,协同细胞因子PDGF增强HSC的迁移能力,加快肝纤维化的进展。肝硬化门脉高压症引起HSC受到的张应变增加,而张应变通过促进HSC的纤维生成作用而反馈加重门脉高压,提示张应变对门脉高压症状的维持和发展可能起到一定的作用。四、周期性张应变调节HSC功能的机制研究结果说明周期性张应变能够明显增强整合素β3、p38、Akt、ERK1/2的磷酸化。cRGDfV不能抑制HSC的整合素β3亚基磷酸化,但能抑制细胞内粘附斑激酶FAK的磷酸化水平。Akt、p38、ERK1/2磷酸化抑制剂wortmannin、SB202190、PD98059分别能够明显降低HSC相应蛋白磷酸化水平。周期性张应变能够明显增强HSC增殖蛋白PCNA的表达,并促进α-SMA、COL1A1和COL3A1的基因表达;应用cRGDfV或能够明显抑制张应变的这些促增殖活化效应;而应用SB202190,Wortmannin ,PD98059能够部分抑制张应变的这些效应。这些结果提示周期性张应变对HSC的影响是通过激活整合素αvβ3,活化FAK这条信号转导途径实现的;而αvβ3,FAK之后的通路可能与MAPK和Akt通路相关。结论1、成功在体外分离出大鼠静止HSC,分离出的静止HSC能够传代培养多次并在培养过程中自行活化。2、周期性张应变能明显促进HSC的I型胶原α1链的基因表达,特别是在牵拉幅度为10%,牵拉频率为0.5 Hz,牵拉时间为24小时的牵拉条件下促进效果最显着。3、周期性张应变能明显促进HSC的增殖和活化,并促进了PDGF-BB介导下的HSC迁移,提示张应变能够增强HSC的促纤维化效应。4、周期性张应变能促进HSC胞膜上的整合素αvβ3的表达和活化,致FAK磷酸化,激活MAPK、Akt等信号转导通路,导致后续生物学效应。提示整合素αvβ3是周期性张应变作用于HSC的重要信号分子。
李锋[10]（2008）在《促肝细胞生长素靶向脂质体的制备及其抗肝纤维化作用的研究》文中研究指明肝纤维化以及肝硬化代表着各种慢性肝病的最终共同转归。肝星状细胞（hepatic stellate cells,HSC）是肝纤维化过程中肝脏内合成大量胶原纤维的首要细胞,因此是抗纤维化治疗的靶细胞。增加药物对于HSC的靶向性可以增加药物的抗纤维化效果。含有精氨酸—甘氨酸—天门冬氨酸（Arg-Gly-Asp,RGD）系列的环肽可以特异地识别位于活化HSC表面的Ⅵ型胶原受体,因此可以用来修饰作用于活化HSC的药物。立体稳定脂质体（sterically stabilized liposomes,SSL）由于表面被聚乙二醇修饰从而避免被网状内皮系统识别和清除,因此可以延长脂质体内包封药物的作用时间。促肝细胞生长素（promoting hepatocyte growth factor,pHGF）属于促肝细胞生长因子类物质（该类物质还包括重组的肝细胞生长因子）,体内外实验发现具有抗肝纤维化的作用;但是由于半衰期短,并且可作用于其它细胞引起不利作用如促进肝肿瘤生长,因此在临床应用中未表现出满意的抗纤维化治疗效果。本研究的主要目的是制备RGD环肽修饰的包封pHGF的SSL（RGD-SSL-pHGF）,拟通过SSL的包封延长pHGF的作用时间,并通过RGD环肽的修饰增加pHGF对活化HSC的靶向性。通过体内外实验评价RGD-SSL-pHGF的抗纤维化作用及可能的作用机制。本研究的主要内容包括:促肝细胞生长素和重组肝细胞生长因子对肝星状细胞作用的比较;RGD环肽修饰的包封pHGF的立体稳定脂质体的制备及其理化性质的检测;RGD-SSL-pHGF对活化肝星状细胞的作用;RGD-SSL-pHGF对大鼠肝纤维化的治疗作用。第一部分促肝细胞生长素和重组肝细胞生长因子对肝星状细胞作用的比较目的:比较国产的促肝细胞生长素（商品名威佳）和国外进口的重组人肝细胞生长因子（recombinant human hepatocyte growth factor,rh-HGF）对活化的HSC生长和凋亡的作用。方法:采用链酶蛋白酶E/Ⅳ型胶原酶灌注——密度梯度离心的方法从正常雄性SD大鼠（400～450g,14周龄）肝脏分离HSC,培养传代后检测α—平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）表达的情况。四甲基偶氮唑蓝(3-（4,5-dimethylthiazo（-z-y1）-3,5 diphenytetrazoliumromide,MTT）法检测pHGF和rh-HGF对HSC生长的影响,TUNEL（TdT-mediated dUTP Nick-EndLabeling）法检测这两种生长因子对活化的HSC凋亡诱导的情况。结果:从正常大鼠肝脏分离HSC,平均每只大鼠分得的细胞数为2×107,细胞活力为96%。通过培养时形态的观察和免疫组化检测α-SMA的表达,提示传代培养24小时的细胞为活化的HSC。pHGF和rh-HGF都能抑制HSC的生长并且随着药物浓度的增加,抑制作用逐渐增强;相同药物浓度时,rh-HGF的抑制作用强于pHGF;pHGF的IC50为165.67±7.09ng/ml,高于rh-HGF（132.00±4.20ng/ml）（P=0.02）。150ng/ml的pHGF和rh-HGF都诱导活化的HSC发生凋亡,HSC的凋亡率为分别为33.67%±1.34%和43.96%±2.79%（P=0.05）。结论:pHGF和rh-HGF都抑制了HSC的生长和促进活化HSC凋亡,rh-HGF的作用强于pHGF。第二部分RGD环肽修饰的包封pHGF的立体稳定脂质体的制备及其理化性质的检测目的:制备包封pHGF的RGD环肽修饰的立体稳定脂质体（stericallystabilized lliposomes,SSL）（RGD-SSL-pHGF）,评价其理化性质。方法:采用薄膜法结合膜挤压法制备包封pHGF的SSL,RGD环肽通过与位于脂质体表面的二油酰磷脂酰乙醇胺—聚乙二醇—马来酰亚胺（DOPE-PEG-MAL）结合后修饰脂质体,从而制备RGD-SSL-pHGF,评价该脂质体的粒径、包封率和稳定性等重要指标。此外,制备包封钙黄绿素（calcein,CF）的无RGD环肽修饰的SSL（SSL-CF）和有RGD环肽修饰的SSL（RGD-SSL-CF）,含有SSL-CF、RGD-SSL-CF和单纯CF溶液的培养液培养活化HSC24小时后,流式细胞仪检测HSC内荧光强度从而评价RGD环肽的靶向性。结果:制得的RGD-SSL-pHGF粒径为92.7nm,表面电位为—18.49mv;包封率为32.38%±0.09%,即每ml脂质体溶液约含有pHGF 5μg,RGD环肽10nmol;在4℃以下条件保存,该脂质体稳定;制备过程中磷脂损失6.58%。RGD-SSL-CF、SSL-CF和CF与HSC培养24小时后,RGD-SSL-CF组的HSC内荧光强度显着高于SSL-CF组和CF组（P＜0.05）。结论:成功制备了粒径均一的RGD-SSL-CF,RGD修饰的SSL延长了所包封药物的作用时间并具有HSC靶向性。第三部分RGD-SSL-pHGF对活化肝星状细胞的作用目的:利用体外培养的HSC比较RGD-SSL-pHGF、无RGD环肽修饰的包封pHGF的SSL（SSL-pHGF）、pHGF和不包封pHGF的RGD环肽修饰的SSL（RGD-SSL）对活化的HSC的作用。方法:照第二部分的方法制备RGD-SSL-pHGF、SSL-pHGF和RGD-SSL。MTT法比较三种脂质体和pHGF对HSC生长的抑制情况,TUNEL法比较对活化的HSC凋亡诱导情况,荧光定量RT-PCR比较对HSC内α-SMA、α1（Ⅰ）型前胶原（procollagenα1（Ⅰ））、组织金属蛋白酶抑制物—1（tissue inhibitor ofmetalloproteinase-1,TIMP-1）、TIMP-2、基质金属蛋白酶-2（matrixmetalloproteinase-2,MMP-2）、转化生长因子—β1（transforming growthfactor-β1,TGF-β1）的mRNA表达的抑制情况,Western blot比较对α-SMA和Ⅰ型胶原生成的抑制情况。结果:pHGF在150ng/ml浓度条件下,与大鼠HSC培养48小时后,促进HSC的凋亡并抑制HSC内α-SMA、TGF-β1、α1（Ⅰ）型前胶原、TIMP-1、TIMP-2和MMP-2的mRNA表达,同时抑制了α-SMA和Ⅰ型胶原的生成。与SSL-pHGF、pHGF和RGD-SSL相比,RGD-SSL-pHGF更显着地抑制HSC的生长,诱导更多活化HSC发生凋亡,同时更显着地抑制了HSC内相关检测基因的表达以及α-SMA和Ⅰ型胶原的生成。结论:RGD环肽的修饰和SSL的包封增强了pHGF对活化HSC的抗纤维化作用。第四部分RGD-SSL-pHGF对大鼠肝纤维化的治疗作用目的:评价RGD-SSL-pHGF对大鼠肝纤维化的治疗作用及作用机制。方法:腹腔注射硫代乙酰胺10周诱导大鼠出现肝纤维化。休息3周后,60只肝纤维化大鼠分成六组（n=10）:RGD-SSL-pHGF组、SSL-pHGF组、pHGF组、RGD-SSL组、pHGF+RGD-SSL组和注射生理盐水的模型对照组。每隔一天注射一次相应的药物,共4周。比较每组的肝脏病理分期、胶原纤维面积百分比、每克肝组织羟脯氨酸的含量、α-SMA阳性细胞凋亡率和α1（Ⅰ）型前胶原、α1（Ⅲ）型前胶原mRNA的表达情况。结果:与其他组相比,注射RGD-SSL-pHGF的大鼠肝纤维化明显缓解,胶原纤维面积百分比显着下降,每克肝组织的羟脯氨酸含量明显减少。RGD-SSL-pHGF诱导更多的α-SMA阳性细胞发生凋亡,更明显抑制了α1（Ⅰ）型前胶原mRNA的表达。结论:RGD-SSL-pHGF通过诱导α-SMA阳性细胞凋亡、促进胶原纤维的降解和抑制Ⅰ型胶原的生成从而促进肝纤维化的逆转。
二、促肝细胞生长素对大鼠肝星状细胞增殖及α1(Ⅰ)胶原基因启动子活性的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、促肝细胞生长素对大鼠肝星状细胞增殖及α1(Ⅰ)胶原基因启动子活性的影响（论文提纲范文）
（1）柴芪益肝方治疗肝纤维化的临床和实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 中西医治疗肝纤维化的研究进展 |
| 第一节 西医诊断和治疗肝纤维化的研究进展 |
| 第二节 中医药治疗肝纤维化的研究进展 |
| 第二章 柴芪益肝方治疗肝郁脾虚型慢性乙型肝炎肝纤维化的临床回顾性研究 |
| 前言 |
| 第一节 临床资料 |
| 第二节 分组与治疗 |
| 第三节 结果分析 |
| 第四节 讨论与小结 |
| 第三章 基于网络药理学探讨柴芪益肝方治疗肝纤维化的作用机制 |
| 前言 |
| 第一节 资料与方法 |
| 第二节 结果 |
| 第三节 讨论与小结 |
| 第四章 柴芪益肝方对四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化的作用及机制研究 |
| 前言 |
| 第一节 材料与研究方法 |
| 第二节 指标检测 |
| 第三节 结果 |
| 第四节 讨论与小结 |
| 结语 |
| 创新点 |
| 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
（2）疏肝健脾活血法治疗乙肝肝纤维化的临床回顾性研究及其作用机制的网络药理学探索（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 第一节 慢性乙型肝炎肝纤维化的西医研究进展 |
| 一、现代医学对乙肝肝纤维化发病机制的认识 |
| 二、乙肝肝纤维化相关的信号通路研究现状 |
| 三、乙肝肝纤维化的现代诊断技术 |
| 四、乙肝肝纤维化的西医治疗现状 |
| 五、展望与体会 |
| 第二节 慢性乙型肝炎肝纤维化的中医研究进展 |
| 一、慢性乙型肝炎肝纤维化的病因病机研究 |
| 二、慢性乙型肝炎肝纤维化的中医辨证分型 |
| 三、慢性乙型肝炎肝纤维化的中医药治疗 |
| 四、展望 |
| 第三节 疏肝健脾活血法治疗乙肝肝纤维化的理论依据与临床应用概况 |
| 一、疏肝健脾活血法治疗乙肝肝纤维化的理论依据 |
| 二、疏肝健脾活血法治疗乙肝肝纤维化的临床应用概况 |
| 第四节 数据挖掘技术在中医药研究领域的运用现状 |
| 一、频数分析技术 |
| 二、关联规则挖掘技术 |
| 三、聚类分析技术 |
| 四、复杂网络分析技术 |
| 五、贝叶斯网络 |
| 六、因子分析技术 |
| 第五节 网络药理学在中医药研究领域运用的研究进展 |
| 一、网络药理学的研究方法 |
| 二、网络药理学在中医药领域的运用 |
| 三、不足与展望 |
| 第二章 疏肝健脾活血法治疗乙肝肝纤维化的用药规律探讨 |
| 一、资料与方法 |
| (一)资料来源 |
| (二)文献纳入标准 |
| (三)文献排除标准 |
| (四)文献检索策略 |
| (五)资料提取 |
| (六)数据预处理 |
| (七)统计方法 |
| 二、结果 |
| (一)一般情况 |
| (二)单味中药选用频数及频数分布 |
| (二)药物种类频数及频数分布 |
| (三)基于复杂网络技术分析疏肝健脾活血法治疗乙肝肝纤维化的核心药物 |
| (四)基于关联规则技术分析疏肝健脾活血法治疗乙肝肝纤维化的常用药物配伍规律 |
| 三、讨论 |
| 第三章 疏肝健脾活血法治疗乙肝肝纤维化的临床研究 |
| 一、研究目的 |
| 二、研究内容 |
| 三、研究方法 |
| 四、研究方案 |
| 五、研究结果 |
| (一)一般情况 |
| (二)疏肝健脾活血法治疗乙肝肝纤维化患者的抗纤维化疗效分析 |
| (三)疏肝健脾活血法对乙肝肝纤维化患者抗病毒疗效的影响 |
| (四) 安全性分析 |
| 六、讨论 |
| 第四章 基于网络药理学探讨疏肝健脾活血法治疗乙肝肝纤维化的作用机制 |
| 一、研究概要 |
| 二、材料与方法 |
| 三、结果 |
| (一)疏肝健脾活血法核心药物的潜在有效成分及相关靶点 |
| (二) “中药-疾病”交互靶点的筛选 |
| (三) “中药-疾病”交互靶点PPI网络的构建及核心基因的筛选 |
| (四) “中药-疾病”交互靶点的GO和KEGG富集分析 |
| 四、讨论 |
| 结语 |
| 一、主要结论 |
| 二、创新点 |
| 三、不足之处 |
| 四、展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 统计学审核证明 |
（3）基于蛋白质组学的荔枝核总黄酮抗大鼠肝纤维化的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验对象 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 主要试剂配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 大鼠肝纤维化模型的建立与鉴定 |
| 2.1.1 大鼠肝纤维化模型的建立 |
| 2.1.2 大鼠肝纤维化模型的鉴定 |
| 2.2 实验分组及用药 |
| 2.3 HSC-T6细胞的培养 |
| 2.3.1 准备工作 |
| 2.3.2 HSC-T6细胞的传代 |
| 2.3.3 HSC-T6细胞的换液 |
| 2.3.4 HSC-T6细胞的冻存 |
| 2.3.5 HSC-T6细胞的复苏 |
| 2.4 细胞计数方法 |
| 2.5 MTT法测定荔枝核总黄酮、荔枝核总黄酮含药血清对HSC最大无毒浓度(TC0) |
| 2.6 各组药物和含药血清对肝星形细胞的干预 |
| 2.7 肝星形细胞蛋白的提取 |
| 2.8 肝星形细胞蛋白提取质控 |
| 2.9 肝星形细胞蛋白酶解 |
| 2.10 DDA建库和DIA定量检测(Nano-LC-MS/MS) |
| 2.11 信息分析流程 |
| 2.12 TFL有效成分及有效成分潜在靶点的筛选 |
| 2.13 TFL化学成分靶点蛋白质相互作用(PPI)网络的构建 |
| 2.14 TFL与肝纤维化相关靶点的筛选 |
| 2.15 TFL对肝纤维化作用靶点的生物信息学分析 |
| 2.16 TFL“成分-靶点-通路”网络构建及核心靶点筛选 |
| 2.17 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 肉眼及镜下对大鼠肝纤维化病变观察 |
| 3.2 荔枝核总黄酮、荔枝核总黄酮含药血清对HSC-T6细胞的增殖抑制作用 |
| 3.3 荔枝核总黄酮组和模型对照组蛋白质组学 |
| 3.4 荔枝核总黄酮组和模型对照组的差异蛋白基因功能GO分析 |
| 3.4.1 荔枝核总黄酮组和模型对照组的差异蛋白基因生物过程(BP)分析 |
| 3.4.2 荔枝核总黄酮组和模型对照组的差异蛋白基因细胞组件(CC)分析 |
| 3.4.3 荔枝核总黄酮组和模型对照组的差异蛋白基因分子功能(MF)分析 |
| 3.5 荔枝核总黄酮组和模型对照组差异蛋白Pathway富集分析 |
| 3.6 荔枝核总黄酮组和模型对照组的差异蛋白互作分析(PPI) |
| 3.7 荔枝核总黄酮组和模型对照组的差异表达蛋白亚细胞定位 |
| 3.8 TFL有效成分及有效成分潜在靶点的筛选 |
| 3.9 肝纤维化靶点筛选及与TFL靶点的对比分析 |
| 3.10 TFL对肝纤维化作用靶点的生物信息学分析 |
| 3.11 TFL“成分-靶点-通路”网络分析及核心靶点 |
| 4 讨论 |
| 4.1 肝星状细胞与肝纤维化 |
| 4.2 荔枝核总黄酮抗肝纤维化的理论依据 |
| 4.3 中医药对肝纤维化的防治 |
| 4.4 网络药理学与中医药 |
| 4.5 蛋白质组学与肝纤维化 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 综述 蛋白质组学在中医药抗肝纤维化中的应用 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介及攻读学位期间获得的科研成果 |
（4）基于肝窦毛细血管化探讨抗纤软肝颗粒抗肝纤维化的临床疗效与作用机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词表(Abbreviations) |
| 前言 |
| 第一部分 :抗纤软肝颗粒治疗慢性乙型肝炎(CHB)肝纤维化痰瘀互结型临床回顾性对照研究 |
| 1 临床资料 |
| 2 研究方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 :基于网络药理学探讨抗纤软肝颗粒抗肝纤维化药理作用机制 |
| 1 实验方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三部分 基于肝窦毛细血管化探讨抗纤软肝颗粒抗肝纤维化作用机制实验研究 |
| 实验一 :基于肝窦毛细血管化探讨抗纤软肝颗粒抗肝纤维化作用机制的细胞实验研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 实验二 :基于肝窦毛细血管化探讨抗纤软肝颗粒抗肝纤维化作用机制的动物实验研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附件一:攻读学位期间的研究成果 |
| 附件二:综述 肝纤维化中西医诊断与防治最新研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（5）转录—蛋白质组学的芹菜子抗肝纤维化物质基础及机制研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 芹菜子和芹菜根抗肝纤维化物质基础研究 |
| 实验一 芹菜子和芹菜根不同提取物及萃取部位体外抗肝纤维化活性筛选 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 仪器与试药 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 实验二 基于GC-TOF-MS和 UHPLC-MS/MS的芹菜子化学成分及抗肝纤维化活性相关性研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 仪器与试药 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 实验三 芹菜子单体化合物的分离纯化及其体外抗肝纤维化活性 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 仪器与试药 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 基于网络药理学的芹菜子活性成分抗肝纤维化作用机制预测 |
| 1 研究内容与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 芹菜素对CCl_4诱导的肝纤维化大鼠的保护作用 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 仪器与试药 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四部分 基于转录组学和蛋白质组学的芹菜素抗肝纤维化作用机制研究 |
| 实验一 基于转录组学的芹菜素抗肝纤维化作用机制研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 仪器与试药 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 数据分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 实验二 基于蛋白质组学的芹菜素抗肝纤维化作用机制研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 仪器与试药 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 数据分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 实验三 转录组学和蛋白质组学联合分析及验证实验 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 仪器与试药 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 数据分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 芹菜化学成分及药理作用的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（6）荔枝核总黄酮对大鼠肝星状细胞TGF-β1/Smads通路及PPAR-r/c-Ski通路的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 主要实验试剂 |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 1.3 主要实验试剂配制 |
| 1.4 实验细胞样本 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 HSC细胞培养 |
| 2.2 细胞计数方法 |
| 2.3 实验分组 |
| 2.4 CCK-8 法检测不同浓度TFL作用下HSC的生长活力 |
| 2.5 各实验组中细胞上清液里的PPARr、c-Ski含量 |
| 2.6 qPCR法检测细胞内TGF-β1、Smad3/4 m RNA的表达 |
| 3.结果 |
| 3.1 HSC细胞的生长活力 |
| 3.2 各组细胞上清液中PPAR-r、c-Ski的含量比较 |
| 3.3 各组细胞中TGF-β1、Smad3/4 m RNA的表达比较 |
| 4.讨论 |
| 4.1 现代医学与肝纤维化 |
| 4.2 中医药与肝纤维化 |
| 4.2.1 中医与肝纤维化 |
| 4.2.2 中药与肝纤维化 |
| 4.3 TFL抗肝纤维化的研究 |
| 4.4 PPARγ-c-Ski通路与肝纤维化 |
| 4.5 TGF-β1/Smads信号通路与肝纤维化 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 略缩词表 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历及攻读学位期间发表的学术论文 |
（7）HDAC靶向抑制剂N2E的抗肝纤维化作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 第一章 N2E治疗四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化作用 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 N2E诱导人肝星状细胞LX-2 凋亡的作用研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 肝组织HDAC3 的表达与N2E抗肝纤维化作用的基因表达 |
| 3.1.材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 N2E影响TGF-β1 信号通路的作用 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 讨论 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 缩略词表 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（8）苦参碱结构修饰物-19抗大鼠实验性肝纤维化作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词对照表 |
| 前言 |
| 第一部分 苦参碱及其衍生物抗炎活性筛选 |
| 一、材料与方法 |
| 二、试验结果 |
| 三、 讨论 |
| 第二部分 苦参碱衍生物-19 抗实验性大鼠肝纤维化作用研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二 、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 第三部分 苦参碱及苦参碱衍生物-19 特异性结合蛋白的研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二、 实验结果 |
| 三、讨论 |
| 结论 |
| 论文参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 在读期间科研成果 |
| 致谢 |
（9）周期性张应变对肝星状细胞生物活性的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 肝星状细胞的分离与鉴定 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 不同牵拉条件对肝星状细胞的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 周期性张应变对肝星状细胞的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 周期性张应变调节肝星状细胞功能的相关机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表或待发表文章 |
| 在读期间参加科研课题 |
| 致谢 |
（10）促肝细胞生长素靶向脂质体的制备及其抗肝纤维化作用的研究（论文提纲范文）
| 英文缩略语 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 促肝细胞生长素和重组肝细胞生长因子对肝星状细胞作用的比较 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 RGD环肽修饰的包封促肝细胞生长素的立体稳定脂质体(RGD-SSL-pHGF)的制备及其理化性质的检测 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 RGD-SSL-pHGF对活化肝星状细胞的作用 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 RGD-SSL-pHGF对大鼠肝纤维化的治疗作用 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 总结 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
四、促肝细胞生长素对大鼠肝星状细胞增殖及α1(Ⅰ)胶原基因启动子活性的影响（论文参考文献）
- [1]柴芪益肝方治疗肝纤维化的临床和实验研究[D]. 周怡驰. 北京中医药大学, 2021(01)
- [2]疏肝健脾活血法治疗乙肝肝纤维化的临床回顾性研究及其作用机制的网络药理学探索[D]. 施梅姐. 广州中医药大学, 2020(09)
- [3]基于蛋白质组学的荔枝核总黄酮抗大鼠肝纤维化的机制研究[D]. 蔡碧莲. 广西中医药大学, 2020(02)
- [4]基于肝窦毛细血管化探讨抗纤软肝颗粒抗肝纤维化的临床疗效与作用机制[D]. 许杰. 湖北中医药大学, 2020(08)
- [5]转录—蛋白质组学的芹菜子抗肝纤维化物质基础及机制研究[D]. 谯明. 新疆医科大学, 2020(03)
- [6]荔枝核总黄酮对大鼠肝星状细胞TGF-β1/Smads通路及PPAR-r/c-Ski通路的影响[D]. 陈姗. 广西中医药大学, 2019(03)
- [7]HDAC靶向抑制剂N2E的抗肝纤维化作用及其机制研究[D]. 王晓翔. 广东药科大学, 2019(02)
- [8]苦参碱结构修饰物-19抗大鼠实验性肝纤维化作用及机制研究[D]. 王绍展. 第二军医大学, 2011(09)
- [9]周期性张应变对肝星状细胞生物活性的影响[D]. 余帮. 第二军医大学, 2011(09)
- [10]促肝细胞生长素靶向脂质体的制备及其抗肝纤维化作用的研究[D]. 李锋. 复旦大学, 2008(02)