一、E-1胶技术鉴定报告（论文文献综述）
高帅[1]（2021）在《激活NF-κB信号通路鲑甲病毒蛋白的筛选及致病机制的研究》文中提出鲑甲病毒（Salmonid Alphavirus）感染鲑科鱼类引起胰脏病（Pancreas disease,PD）和昏睡病（Sleeping disease,SD）,在欧洲养殖场广泛暴发,死亡率在60%～90%之间,幸存鱼通常生长发育迟缓,给鲑科鱼类养殖业造成巨大损失。宿主感染病毒首先启动天然免疫应答,并通过宿主细胞的模式识别受体（Pattern recognition receptor,PRR）识别病毒,激活下游信号传导途径,通过产生炎性细胞因子,I型干扰素（IFN）和其它介质来诱导先天免疫应答,而NF-κB信号通路是宿主发挥抗病毒作用的机制之一。本研究将探究SAV激活NF-κB信号通路的分子机制,及其介导炎症反应的关键蛋白,并对其作用位点进行确定,分析SAV蛋白激活NF-κB信号通路介导炎症反应的分子机制,进一步阐明SAV蛋白与宿主细胞蛋白互作激活NF-κB信号通路介导炎症反应的分子机制。通过SAV感染CHSE-214细胞,利用双荧光素酶报告系统验证SAV激活NF-κB的能力,同时应用双荧光素酶报告系统筛选激活NF-κB的SAV蛋白及其关键功能域,及上游模式识别受体,验证筛选出的蛋白对NF-κB信号通路的激活作用及其产生的下游相关炎症因子;通过质谱筛选与SAV关键蛋白相互作用的CHSE-214宿主细胞蛋白,并采用CO-IP技术、激光共聚焦共定位、双荧光素酶报告系统验证病毒与宿主细胞之间的互作,分析SAV蛋白激活NF-κB通路的分子机制及其对病毒复制的影响。结果如下:1.首先利用双荧光素酶报告系统检测SAV对NF-κB的激活能力,发现SAV V4640感染CHSE-214细胞后可以显着性的激活NF-κB,且随着SAV感染CHSE-214细胞的时间和滴度的增加,双荧光素酶活性值显着上调,表明SAV能够激活NF-κB信号通路,且与感染时间和病毒滴度呈现出时间和剂量依赖性。进一步筛选SAV激活NF-κB信号通路介导炎症反应的关键蛋白,发现SAV非结构编码蛋白Nsp2在激活NF-κB的能力上效果显着,且与Nsp2转染质粒的浓度呈现剂量依赖性,而其它蛋白激活能力明显低于Nsp2。2.利用Western Blot分析发现Nsp2在蛋白水平上可以使NF-κB核转移、p65磷酸化、及IκBα降解,利用实时荧光定量PCR分析发现SAV Nsp2激活NF-κB信号通路后促使下游炎性因子IL-6、IFN-1和Mx1的表达;在将Nsp2转染于CHSE-214细胞时使用NF-κB抑制剂,能够显着性降低下游炎症因子的产生。结果解析了非结构蛋白Nsp2致使NF-κB核转移,诱导产生下游炎症因子的机制。3.将Nsp2全长进行截短,构建重组质粒pCMV-Nsp2-A、pCMV-Nsp2-B、pCMV-Nsp2-C、pCMV-Nsp2-A1、pCMV-Nsp2-A2、pCMV-Nsp2-B1、pCMV-Nsp2-C1、pCMV-Nsp2-ML和pCMV-Nsp2-Zf-AD;利用NF-κB双荧光素酶报告系统对Nsp2激活NF-κB的关键功能域位点进行精确定位。结果表明,SAV Nsp2基因的A2（1-279aa）、ML（279-421aa）、Zf（398-495aa）3段均能够激活NF-κB,其中ML截短蛋白为关键功能域,激活NF-κB的能力最强。4.将SAV感染CHSE-214细胞,同时设置Nsp2重组质粒转染CHSE-214细胞试验组,通过实时荧光定量PCR检测CHSE-214细胞内的TLR信号通路以及关键的接头蛋白的表达。结果显示,SAV V4640和Nsp2均可以显着上调宿主细胞CHSE-214病原模式识别受体TLR3、TLR7和TLR8以及接头蛋白TRAF6、MAVS的表达。证明SAV和Nsp2可以在宿主中引起固有性免疫反应并可以触发机体的抗病毒防御机制。激活宿主细胞的上游分子机制为TLR7和TLR8作用于TRAF6蛋白,RIG-Ⅰ作用于MAVS蛋白招募TRAF6蛋白后作用于IKK家族激活NF-κB促使下游炎性细胞因子的产生。说明SAV V4640及Nsp2是通过TLR3、TLR7、TLR8信号通路和RIG-Ⅰ信号通路共同激活NF-κB信号通路。5.为研究Nsp2是否能够影响SAV的复制,利用实时荧光定量PCR检测Nsp2转染CHSE-214细胞后24 h、48 h和72 h细胞内SAV的病毒载量。结果表明,与对照组相比,转染Nsp2实验组在72 h产生的病毒载量被显着性抑制,推断是由于转染Nsp2激活NF-κB信号通路在72 h时产生的大量IFN-1对SAV的繁殖有抑制作用。6.利用IP技术钓取与SAV Nsp2蛋白相互作用的宿主细胞CHSE-214的蛋白,利用质谱分析筛选出174个与Nsp2互相作用的宿主蛋白。通过NCBI blast分析注释将筛选出的宿主细胞蛋白进一步采用GO注释及KEGG代谢通路的注释。结果表明,根据GO注释分析结果显示这174个蛋白中与Nsp2互作的蛋白参与了动物器官发育,生物发育,泛素ERAD途径,内质网内泛素机制,对内质网的应激反应,翻译,肽生物合成过程,核糖核蛋白复合物的产生等生物过程。KEGG分析结果表明与炎症反应相关的蛋白共有5个,其中与NF-κB信号通路相关的Toll样受体信号通路和RIG-Ⅰ信号通路的富集蛋白基因编号分别是A0A060YTB0（IKK）和A0A2P1K3U9（DDX3）。进而初步判定SAV Nsp2蛋白与相应的宿主细胞CHSE-214中的IKK和DDX3蛋白的相互作用可以介导NF-κB信号转导途径。7.将A0A060YTB0（IKK）和A0A2P1K3U9（DDX3）宿主蛋白放入数据库中进行富集,根据蛋白互作的网络结果分析可知RIG-Ⅰ信号通路中A0A2P1K3U9（DDX3）蛋白富集程度高。进一步利用激光共聚焦和免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,CO-IP）方法验证了Nsp2与DDX3在CHSE-214细胞中互作的真实性。此外,双荧光素酶报告系统试验结果显示DDX3与Nsp2互作会降低双荧光素酶活性,DDX3会抑制NF-κB的激活。表明Nsp2与DDX3结合后解除DDX3对NF-κB的抑制,从而激活NF-κB的信号传导。综上所述,本研究首次确定了SAV能够感染宿主细胞显着激活NF-κB信号通路,并且非结构蛋白Nsp2蛋白能够单独激活NF-κB信号通路,鉴定了非结构蛋白Nsp2激活NF-κB的关键结构域位于第279-421氨基酸之间。确定了TLR3、TLR7、TLR8和RIG-Ⅰ介导的信号通路共同参与了Nsp2及SAV对NF-κB信号通路的激活,并且Nsp2可以激活NF-κB产生下游炎症因子IL-6、Mx1和IFN-1从而引起炎症反应,阐明了Nsp2激活NF-κB信号通路的传导途径。IFN-1具有抑制SAV病毒的复制的能力。Nsp2通过与宿主DDX3蛋白互作激活NF-κB信号通路,参与病毒蛋白的翻译和复制的过程,推测病毒利用宿主细胞合成自身病毒元件,进一步表明Nsp2蛋白与病毒复制相关。Nsp2在SAV复制和致病机制中均发挥重要作用,为研究抗病毒的基因靶向药物及抗病育种提供理论依据。
肖凯[2]（2021）在《水牛精浆外泌体蛋白质组的初步研究》文中研究说明水牛（Bubalus bubalis）是我国南方亚热带地区一种优良的乳肉兼用型大家畜,具有广泛的产业开发价值,但相比地处中温带的牛属物种,水牛的繁殖率较低,精子活力低下是其中重要影响因素之一,极大的限制了奶水牛业的发展和本地水牛品种改良的步伐。精子是一种高度特化和浓聚的已不能生长和分裂的细胞,基因组的转录和翻译功能几乎处于沉默状态,主要依赖于精浆发育内环境调节其成熟过程。正常的受精不仅取决于精子发育的内在因素,还受到精浆等外部因素的影响,这些因素会影响精子的功能。精浆外泌体是来源于雄性生殖道内众多附属性腺分泌的胞外囊泡,在精子成熟和受精过程中扮演重要角色。蛋白质组学技术是研究哺乳动物精子成熟与发育的重要手段,可以高通量寻找影响精子受精的功能蛋白质,有助于筛选关键基因或生物标志物,目前,精浆外泌体的蛋白质组研究报道较少。本研究通过蛋白质组学技术探索水牛精浆外泌体与精子功能的关系,发现外泌体调节精子功能的关键因子并进行分析,有助于解释水牛活力低下的成因,阐明水牛雄性生殖机制。本文研究的主要内容如下:一、水牛精浆外泌体的分离与鉴定。使用改良后的差速离心+蔗糖垫法分离提取精浆外泌体,通过蛋白质印迹（Western blot）验证外泌体蛋白标志物CD81、TSG101和ALIX,结果均阳性表达。通过纳米颗粒跟踪分析仪（NTA）分析外泌体粒径大小,结果显示粒径集中于119.4 nm附近,占比99.2%;通过透射电子显微镜（TEM）观察外泌体形态,结果显示其具有明显的茶托状结构。二、水牛精子、精浆及精浆外泌体蛋白质表达谱的构建和生物信息学分析。利用液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）蛋白质组学策略在精子、精浆和精浆外泌体中分别鉴定到1894种、1247种和1343种蛋白质。对蛋白质表达谱进行GO分析,结果显示精子、精浆和外泌体蛋白质主要参与氧化还原过程和蛋白质转运过程,具有ATP、GTP结合能力,定位于胞外外泌体、细胞质、线粒体上。KEGG分析显示,精子、精浆和精浆外泌体蛋白质富集最丰富的均为代谢通路;精子在能量代谢相关的通路上参与的蛋白质数量最多;精浆通过补体系统和蛋白酶体通路起到稳定内环境的作用;外泌体中蛋白质参与了蛋白酶体通路,说明蛋白酶体通路可能是外泌体发挥保护功能的主要方式。三、水牛高低活力精浆外泌体的定量蛋白质组学分析。利用i TRAQ结合液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）蛋白质组学策略对高低活力精浆外泌体进行定量分析。以高活力水牛精浆外泌体表达蛋白质作为对照组,筛选到差异表达蛋白质160个（差异倍数>1.2）,包括下调表达蛋白质119个,上调表达蛋白质41个,低活力精浆外泌体中差异蛋白质变化总体呈现下降趋势。对差异蛋白质进行GO分析,结果显示大部分差异蛋白质定位于精子和囊泡,具有水解酶、金属蛋白酶活性,参与精卵识别、受精、单受精、精子与透明带的结合、单生物生殖、细胞识别等过程。KEGG分析结果显示,差异蛋白质主要参与PPAR信号通路、钙信号通路、c AMP信号通路等,其中IZUMO1等10种蛋白质表达量在低活力精浆外泌体显着下调。综上所述,本研究首次分离并鉴定水牛精浆外泌体,构建了水牛精子、精浆和精浆外泌体蛋白质表达谱,获得水牛高低活力精浆外泌体差异蛋白质表达谱,通过比较水牛高低活力精浆外泌体的差异表达蛋白质,筛选出了一批可能与精子功能相关的外泌体蛋白质,分析外泌体与水牛精子活力维持的关系,为水牛雄性生殖机理研究提供新的视角。
郜明强[3]（2021）在《苎麻脱胶菌株Dickeya dadantii DCE-01功能基因与关键脱胶酶关联分析》文中研究表明Dickeya dadantii DCE-01菌株是由中国农业科学院麻类研究所生物加工研究室筛选到的一株高效苎麻脱胶菌株,在不辅以其它条件下仅需8 h就能够完成苎麻脱胶,同时对多种麻纤维原料也具有良好的脱胶效果,其脱胶效率和性能处于国内外领先水平。本论文以DCE-01菌株为研究对象,对该菌株进行全基因组测序、Tandem Mass Tag标记定量蛋白质组和关键脱胶酶分析,为解析DCE-01菌株的高效脱胶机制提供科学依据和发掘优异生物脱胶菌种资源奠定基础。获得结果如下:1.DCE-01菌株基因组共5.1 Mb,GC含量为56.64%,编码基因为4361个,基因长度为4.4 Mb,平均长度为1005 bp,DCE-01基因组的非编码RNA共246个,包括22个r RNA、148个s RNA和76个t RNA。对DCE-01菌株基因组进行注释和分析,筛选到21个苎麻关键脱胶酶基因,其中果胶酶基因18个,甘露聚糖酶基因1个,木聚糖酶基因基因2个。首次在该菌株中发现四个果胶酶基因pel207、pel225、pel G32、pel027并成功克隆。2.利用TMT标记定量蛋白质组学技术对苎麻生物脱胶过程中蛋白质的表达情况进行分析,共鉴定到蛋白质1474个,肽段数8038条,二级谱图总数242275张,其中有效谱图数29205张。在不同脱胶时间点筛选到的差异蛋白如下:8 h-0 h比较差异蛋白质总数为698个,16 h-0 h比较差异蛋白质总数为720个,24 h-0 h比较差异蛋白质总数为728个,16 h-8 h比较差异蛋白质总数为96个,24 h-8 h比较差异蛋白质总数为199个,24 h-16 h比较差异蛋白质总数为79个。3.GO和KEGG富集分析表明,DCE-01菌株胞外分泌的差异蛋白具有多种功能,参与多种代谢调控过程。对14个苎麻脱胶关键酶进行聚类分析表明,与0 h相比,1个甘露聚糖酶在8 h、16 h、24 h时下调,1个木聚糖酶在8 h时下调,16 h、24 h时上调,2个果胶酶在在8 h时下调、10个上调,3个果胶酶在16 h时下调、9个上调,7个果胶酶在24 h时下调、5个上调;与8 h相比,1个甘露聚糖酶在16 h、24 h时下调,1个木聚糖酶在16 h、24 h时上调,8个果胶酶在16 h时上调、4个下调,5个果胶酶在24 h时上调、9个下调;与16 h相比,1个甘露聚糖酶在8h、16 h、24 h时下调,1个木聚糖酶在8 h时下调,16 h、24 h时上调,5个果胶酶在24 h上调、7个下调。4.构建了四个果胶酶基因原核表达体系,分析了四个果胶酶基因的基因序列信息和预测了蛋白质的3D模型,四个果胶酶的二级结构均具有典型的α螺旋、延伸链和无规则卷曲结构;经酶活测定,四个重组菌株p EASY-E1-207、p EASY-E1-225、p EASY-E1-G32、p EASY-E1-027的果胶酶活力分别为17.76 U/m L、18.37 U/m L、20.88 U/m L、19.84 U/m L。
程蕾[4]（2020）在《牛早期妊娠的生物标志物鉴定及分子调控机制研究》文中认为牛人工授精后早期阶段的妊娠识别和妊娠建立对于成功妊娠并产犊具有决定作用,早期妊娠诊断可以及时鉴别妊娠牛和空怀牛,有助于妊娠牛的精细化管理和空怀牛的复配,对于提高牛群的繁殖力具有重要意义。但截至目前,牛繁殖力性状相关的候选基因鉴定比较有限,妊娠早期的分子调控机制尚不甚清楚,精准、简便、快捷的早期妊娠诊断技术开发在牛业生产中显得十分迫切。基于此,本研究在对妊娠牛与妊娠失败牛生理生化和免疫相关指标充分比较分析的基础上,利用转录组测序和定量蛋白质组学技术对参与早期妊娠的关键候选基因和蛋白进行了筛选鉴定,探讨了它们介导妊娠识别和妊娠建立的分子调控机制,初步对基于干扰素刺激基因的牛早期妊娠诊断技术体系进行了研究。研究为深入解析牛早期妊娠的分子调控机制提供了理论依据,为新的牛妊娠诊断生物标志物开发应用提供了技术支撑,为高繁殖力牛群的分子遗传繁育奠定了基础。内容如下:1、早期妊娠阶段水牛血液参数表型分析与候选基因筛选（1）妊娠水牛与空怀水牛血液激素水平、血细胞五分类与细胞因子水平分析比较分析了29头实验牛（6头妊娠水牛,23头空怀水牛）于早期妊娠阶段的血液参数（血细胞五分类、孕酮、细胞因子）,发现:人工授精后18d至30d,妊娠水牛外周血单核细胞（MONO）绝对值和百分比均显着高于0d,人工授精后23d妊娠水牛MONO百分比显着高于空怀水牛;人工授精后14d妊娠水牛嗜酸性粒细胞（EOS）绝对值和百分比显着高于0d,但与空怀牛无显着差异。人工授精后14d至30d,妊娠水牛孕酮均显着高于空怀水牛。妊娠水牛孕酮与淋巴细胞（LYMPH）百分比呈中等负相关,与EOS绝对值以及百分比呈较强正相关。人工授精后0d至20d,妊娠水牛IFN-γ、TNF-α以及IL-1α的表达水平总体上呈下降趋势,IL-13以及IL-10总体上呈上升趋势,但与0d相比差异不显着;人工授精后18d妊娠水牛血液中ANG-1的表达水平极显着高于0d。结果提示,妊娠早期血液中MONO百分比、孕酮以及ANG-1含量的增加有助于妊娠建立。（2）水牛早期妊娠阶段的候选基因筛选对4头妊娠水牛人工授精后0d、14d、18d、20d这4个时间点的外周血液白细胞进行了转录组测序分析,共鉴定到相对于0d的差异表达基因（DEGs）74个,其中人工授精后18d的DEGs最多（52个）,为血液细胞转录组变化最为显着的时间点,而且18d转录组的差异情况与IFNT的水平变化同步。经典信号通路分析表明,人工授精后18d血液中差异基因主要参与介导干扰素信号通路（IFI6、IFIT1、IFITM3、ISG15、MX1以及OAS1）和被胞质模式识别受体激活IRF信号通路等;功能富集分析结果显示,HBA1/HBA2、HBB、NUPR1、IFIT1、IFIT3、ITGA4以及ISG15是早期妊娠阶段参与调节胚胎发育以及繁殖系统发育与功能的关键候选基因。2、妊娠识别标志基因在奶牛早期妊娠诊断中的应用研究结合前期研究,进一步利用荧光定量PCR技术对人工授精后0d至28d妊娠奶牛（n=11）和空怀奶牛（n=8）外周血中ISG15、OAS1和RSAD2基因的表达进行了检测。通过扩大分析群体（妊娠牛19头,空怀牛17头）,用受试者工作曲线（ROC）系统评估了单独或联合利用这3个基因的表达进行妊娠诊断的效果。最后,对准确性最高的组合通过设计荧光探针引物和双重荧光定量PCR技术进行了妊娠诊断的检测效果评估。结果表明,人工授精后18d妊娠奶牛外周血中ISG15、OAS1和RSAD2基因的表达量均显着高于空怀奶牛;3个基因单独或联合应用于早期妊娠诊断时,RSAD2单基因的敏感性（即灵敏性）为100%,特异性为88.2%;ISG15与RSAD2基因联合应用的敏感性为94.7%,特异性为100%。双重定量PCR扩增的结果显示:尽管ISG15基因单独应用于妊娠诊断的敏感性为100%,但特异性仅为88.2%（截断值为1.402）;RSAD2基因单独应用的敏感性为89.5%,特异性为88.2%;二者联合应用于妊娠诊断的敏感性、特异性以及诊断的临界值与单重定量PCR一致。本研究初步建立了基于双重荧光定量PCR的早期妊娠诊断技术体系。3、早期妊娠阶段牛血清差异蛋白表达谱与关键候选蛋白筛选研究利用标记与定量蛋白质组学技术（i TRAQ）,结合IPA?生信分析以及RT-q PCR、Western blot等技术,共获得早期妊娠阶段（人工授精后28d之内）奶牛血清中的差异表达蛋白114个,其中妊娠牛血清中特有的差异蛋白64个,空怀牛血清中特有的差异蛋白33个,妊娠牛和空怀牛血清中共有的差异蛋白17个。对妊娠牛和空怀牛在人工授精后不同时间点的蛋白质表达谱进行了比较分析,构建了妊娠牛与空怀牛血清中的蛋白质表达谱。其中,参与胚胎发育、繁殖系统发育与功能改变的差异蛋白28个。研究基于hub protein筛选结果进一步采用Western blot技术对其中的部分关键蛋白（EFEMP1、CD44、KRT18、NRF2和BRCA2）进行了验证,结果与i TRAQ检测一致,可以作为奶牛妊娠诊断的候选生物标志物。4、关键候选基因介导牛早期妊娠的分子机制以牛子宫内膜上皮细胞为研究模型,采用si RNA技术抑制NRF2表达24h至96h后检测细胞增殖以及HO-1、HOXA10基因的表达情况。结果显示,NRF2抑制表达后导致细胞增殖能力明显减弱,HO-1以及HOXA10在m RNA和蛋白水平均显着下调。研究进一步结合IFNT刺激和si RNA抑制实验对未折叠蛋白反应（unfolded protein response,UPR）通路相关基因表达进行了分析,结果表明:牛子宫内膜上皮细胞经IFNT刺激后,NRF2以及内质网应激反应相关基因（GRP78、CHOP、PERK和ATF6）的表达量显着上调,提示IFNT可诱导牛子宫内膜上皮细胞发生ERS,并通过激活ATF6和PERK来引发UPR;而si RNA抑制NRF2表达后,牛子宫内膜上皮细胞中IFNT诱导的UPR被抑制,并导致CHOP基因的转录水平显着上调,BCL2与BAX m RNA的表达量以及表达量的比值显着下降,并导致细胞凋亡发生。因此推测,NRF2可能通过UPR通路参与IFNT调节的牛母体妊娠识别过程。
张瑞[5]（2020）在《GhDGK基因家族生物信息学分析及GhDGK7b的抗逆功能研究》文中研究表明二酰基甘油激酶（DGK）可以磷酸化二酰基甘油（DAG）进而生成磷脂酸（PA）,DAG与PA都是信号分子,DGK可能在涉及调控DAG与PA的信号传导中发挥重要作用。为研究DGK基因在植物体内作用,有必要对棉花DGK基因家族成员进行研究。本论文克隆了陆地棉DGK基因的相关家族成员,对基因结构、表达和进化进行分析,并对GhDGK7b的生物学功能进行了初步研究。利用棉花基因组测序资料,建立陆地棉（Gossypium hirsutum L.）基因组本地数据库,以拟南芥DGK的序列为“种子”进行电子克隆。依据电子克隆结果设计引物,使用陆地棉“中9807”cDNA作为模板进行PCR扩增,测序后确定基因的碱基序列,获得DGK基因序列后进行相关基因结构、表达特性及进化分析。结果表明,陆地棉DGK基因家族（GhDGKs）由15个基因组成,GhDGKs于染色体上的分布不完全对称,D13染色体上含有2个GhDGK,其余染色体上含有1个GhDGK。所有GhDGKs都含有二酰基甘油激酶催化域,催化域包含一个假定的ATP连接位点,序列为GXGXXG（G代表甘氨酸,X代表任何其他氨基酸）。DGKs 可以分为 I（DGK1）、II（DGK3、DGK4）、III（DGK5）3个亚家族。7对 GhDGK基因（GhDGK1c 和 GhDGK1d、GhDGK1e 和 GhDGK1f、GhDGK4a和 GhDGK7a、GhDGK4b和 GhDGK4c、GhDGK7b和GhDGK7c、GhDGK5a 和GhDGK5b、GhDGK5j和GhDGK5e）Ka/Ks结果的比值小于1,表明它们经历了纯化选择。GhDGKs在棉花不同组织中表达存在差异,主要在叶片和根组织中表达,叶片组织中总体表达水平较高。在旱、盐、冷等非生物胁迫和ABA处理下GhDGKs也表现出不同水平的表达,存在差异。不同基因有不同类型和数量的顺式元件,如MBS（干旱）、LTR（低温）等胁迫相关顺式作用元件,表明不同的GhDGKs具有不同逆境胁迫响应机制。盐或甘露醇胁迫下,过表达GhDGK7b的拟南芥较野生型对照和dgk7突变体系（salk059060）有更高的萌发率。150mmol/L盐处理下,过表达GhDGK7b株系OE1、OE2萌发率分别比WT提高37.60%和28.19%。在300mmol/L甘露醇处理下,OE2萌发率比WT提高4.24%。盐或甘露醇处理下,过表达GhDGK7b基因拟南芥较野生型对照与dgk7有更长的主根长度。150 mmol/L盐处理后,过表达GhDGK7b株系OE1、OE2主根长度显着高于野生型对照和dgk7,分别比WT提高17.27%和28.30%,在300 mmol/L甘露醇处理下,OE1、OE2的主根长度分别比WT提高56.09%和51.18%。在干旱胁迫至14d,过表达GhDGK7b的拟南芥株系OE1、OE2较野生型的相对水含量分别提高106.26%和162.80%。复水3d后发现,OE2植株叶片转绿恢复生长,OE1植株部分恢复生长,而野生型和dgk7突变体植物则无法恢复生长状态。干旱或盐处理14d,过表达GhDGK7b拟南芥与野生型对照和dgk7相比具有更低的离子渗漏、MDA及H2O2含量;过表达GhDGK7b植株叶片具有更高CAT、SOD、POD等抗氧化酶活性。过表达GhDGK7b拟南芥在干旱或盐处理胁迫下细胞受到的膜损伤程度更低且维持了更好的抗氧化能力。因此,过表达GhDGK7b能够提高拟南芥对于盐和干旱胁迫下的耐性。综上所述,通过对陆地棉中9807的DGKs基因家族的初步分析和GhDGK7b的初步功能研究,发现GhDGKs基因家族可能参与了一些植物非生物胁迫应答过程。过表达GhDGK7b基因拟南芥的耐盐、耐旱性能力提高,表明GhDGK7b基因可作为棉花耐盐耐旱基因工程的候选基因。此外,本论文还对实验室获得过表达ZmPIS基因棉花株系MP1、MP2和MP3的耐旱性进行了评价。在大田自然干旱条件下,过表达ZmPIS基因棉花的叶片较野生型对照具有更高的碳同化能力和更好的PSⅡ性能,并且籽棉产量也显着提高。盆栽干旱处理下过表达棉花叶片的ABA水平较野生型对照显着提高,且ABA合成的相关基因GhNCED、GhABA2、GhAAO3的表达水平更高、ABA降解相关基因GhCYP707A的表达水平更低,推测ZmPIS可通过提高棉花叶片中ABA含量来调控过表达植株对干旱胁迫的应答。
郑光来[6]（2020）在《MERTK促进猪瘟病毒复制的分子机制》文中进行了进一步梳理病毒不能在细胞外繁殖,只有入侵到宿主细胞后才能复制并产生子代病毒粒子。病毒入侵宿主细胞时需要宿主细胞膜上受体蛋白的参与,同时,这些受体蛋白也决定了不同病毒的宿主范围及组织嗜性。因此,鉴定病毒的细胞受体,明确病毒的入侵机制,可为设计新型抗病毒药物提供靶标,为疫苗研发提供新的思路,对病毒的防控和治疗具有重要意义。猪瘟是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）引起的一种急性、烈性传染病,在多个国家流行,给世界养猪业造成了严重的经济损失。目前,在CSFV入侵方面的研究,仅发现了硫酸乙酰肝素酶（Heparan sulfate,HS）和层粘连蛋白（Laminin receptor,LamR）两个吸附受体,且这两个吸附受体都与CSFV的Erns蛋白存在相互作用。然而,E1和E2蛋白足以介导CSFV的入侵,证明Erns蛋白对CSFV的入侵不是必需的。同时,还有研究表明,E2蛋白可能和某种细胞膜蛋白相互作用进而促进CSFV的入侵,但具体是哪种细胞膜蛋白尚不清楚。为了寻找影响CSFV入侵的细胞膜蛋白,我们分析了两组CSFV感染猪体后的转录组数据,并从中筛选出了12个候选膜蛋白,结合表达海肾荧光素酶报告基因的重组病毒rCSFV-Rluc,通过siRNA下调试验发现,下调MERTK、TYRO3、CD97和CD69这四个蛋白后可显着地抑制CSFV报告基因的表达,随后我们选取抑制效果最明显的MERTK进行了深入研究。结果显示,在PK-15细胞中过表达MERTK后可以促进CSFV的感染;抗MERTK的多克隆抗体和可溶性的MERTKED-His蛋白均可呈剂量依赖性的阻断CSFV的感染;同时,抗MERTK的多克隆抗体也可呈剂量依赖性的抑制基因2型CSFV的感染;随后通过免疫共沉淀和表面等离子共振试验结果发现,MERTK和CSFV的E2蛋白之间存在相互作用;病毒入侵试验结果发现,MERTK可促进CSFV对PK-15细胞的入侵;另外,我们发现,MERTK胞质尾区酪氨酸激酶的抑制剂LDC1267也可呈剂量依赖性的抑制CSFV的感染。在LDC1267或siMERTK处理后的PK-15细胞中,CSFV感染后与对照组相比,发现I型干扰素mRNA的转录水平均有显着上升,证明CSFV通过MERTK的激酶活性抑制了宿主细胞的固有免疫;而LDC1267处理对CSFV的入侵没有影响,证明MERTK的酪氨酸激酶活性不影响CSFV的入侵过程;值得一提的是,可溶性的MERTKED-His蛋白也可以阻断牛病毒性腹泻病毒的感染。综上所述,CSFV可通过E2蛋白与MERTK直接相互作用以促进其对PK-15细胞的入侵,同时CSFV也通过MERTK的激酶活性抑制宿主细胞的固有免疫来促进其本身的复制。另外,MERTK在基因2型CSFV和牛病毒性腹泻病毒的感染过程中也发挥着重要作用。
何延华[7]（2020）在《非致细胞病变牛病毒性腹泻病毒抑制Ⅰ型干扰素产生的分子机制探索》文中进行了进一步梳理牛病毒性腹泻-黏膜病（Bovine viral diarrhea-mucosal disease,BVD-MD）是由牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）感染引起的一种重要的牛传染性疾病,其隐秘性、长时间一过性感染以及持续感染动物形成的病毒存储库使得BVD-MD在全球牛群中肆虐,给世界养牛业造成了巨大的经济损失。NCP（noncytopathic）BVDV感染能够引起牛免疫力下降,继发其它病原微生物感染,其主要原因是NCP BVDV感染不能很好地诱导细胞产生固有免疫应答。Ⅰ型干扰素（type I interferon,IFN-Ⅰ）通路是固有免疫的主要组成部分,在机体控制并清除病原体的过程中扮演关键角色。目前,BVDV免疫抑制及持续感染的分子机制仍然不清楚,为了进一步明确NCP BVDV的致病机理,了解病毒与宿主之间的相互作用关系,本论文对NCP BVDV抑制IFN-Ⅰ产生的分子机制进行探索性研究。目的:（1）通过转录组测序技术获得NCP BVDV感染宿主细胞的m RNA文库,以生物信息学为平台分析NCP BVDV诱导的差异表达基因（Differentially Expressed Genes,DEGs）富集的通路和参与的细胞过程,为理解病毒与宿主之间的相互作用奠定基础（2）构建牛IFN-β（Bo IFN-β）启动子荧光素酶报告系统分析了NCP BVDV及其非结构蛋白对干扰素表达的影响,鉴定NCP BVDV抑制宿主干扰素生成的靶标。同时,为今后研究病毒抑制Bo IFN-β的作用机理提供便利工具。（3）对NCP BVDV诱导宿主细胞上调表达的牛SIKE1（Bo SIKE1）基因进行功能研究,确定Bo SIKE1与BVDV增殖的关系,为阐明SIKE1在固有免疫应答中作用机制提供依据。方法:（1）首先,利用牛外周血单核细胞分离液分离了牛外周血单核细胞,经流式细胞仪检测单核细胞表面抗原CD14的表达水平,然后用NCP BVDV感染牛单核细胞,在感染不同时期收集样本。在Illumina Hiseq 2500测序平台测序,测序结果利用生物信息学方法分析DEGs,随后对DEGs进行GO和KEGG聚类分析,筛选IFN-Ⅰ信号通路相关的DEGs进行荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR,q RT-PCR）验证。（2）其次,利用分子生物学技术克隆牛的IFN-β启动子功能元件序列,构建荧光素酶报告系统,利用荧光素酶报告基因分析方法检测NCP BVDV及其非结构蛋白对poly（I:C）诱导的IFN-β、NF-κB和IRSE的荧光素酶活性,采用蛋白免疫印迹法检测IFN-Ⅰ通路相关分子IRF7、IRF7磷酸化和RIG-I蛋白的表达情况,验证NCP BVDV及非结构蛋白对抑制宿主IFN-Ⅰ产生的影响。（3）最后,克隆及表达Bo SIKE1基因,制备相应的多克隆抗体,通过q RT-PCR和蛋白质免疫印迹法验证过表达和干扰Bo SIKE1对BVDV增殖的影响。采用LC-MS/MS和Co-IP等方法筛选Bo SIKE1的互作蛋白。结果:（1）NCP BVDV感染牛单核细胞后,细胞免疫荧光检测显示成功构建了NCP BVDV体外原代细胞感染模型;对转录组测序分析,在感染2 h后,筛选出DEGs 9959个,其中4968个DEGs上调;在感染24 h后,筛选出DEGs 7977个,其中4184个DEGs表达上调;进一步分析免疫应答途径相关DEGs,对感染2 h与24 h的DEGs进行比较,感染2 h与免疫反应或抗病毒活性相关的DEGs明显高于24 h;利用KEGG聚类分析筛选95个Ⅰ型干扰素信号通路相关的DEGs,利用q RT-PCR证实了筛选的干扰素信号通路、干扰素刺激基因（Interferon（IFN）-stimulated genes,ISGs）和参与固有免疫应答的基因（IRF7、DDX3X、TLR13、DDX 58、MVAS、TLR9、TRAF6、IRF1、IFIT1、STAT1、ISG20、TRIM25、Mx1、NLRX1、CYLD、SIKE1和ZAP70）的差异表达水平与转录组测序结果基本一致。（2）克隆Bo IFN-β的启动子功能元件序列,成功的构建Bo IFN-β基因启动子荧光素酶报告系统;利用抗性基因筛选获得Bo IFNβ3-Luc-MDBK细胞系,用NCP BVDV感染Bo IFNβ3-Luc–MDBK细胞发现NCP BVDV毒株感染可明显抑制poly（I:C）诱导的IFN-β3的转录活性,同时也抑制了下游抗病毒基因的表达;基因合成NCP BVDV的7个非结构蛋白(Npro、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)基因并连接慢病毒载体,酶切鉴定和测序表明重组慢病毒载体构建成功,并且包装的慢病毒感染MDBK后能够表达目的基因;通过荧光素酶报告系统检测NCP BVDV及7个非结构蛋白对Hu IFN-β、Hu NF-κB、Hu IRSE和Bo IFN-β的荧光素酶活性,结果表明,NCP BVDV能够抑制IFN-β的转录表达,其中非结构蛋白Npro和NS4B对IFN-β的转录表达有显着的抑制作用;在HEK293T细胞中过表达NS4B蛋白,可以显着抑制IRF7的表达以及磷酸化水平,对RIG-I的表达没有抑制作用。（3）克隆到Bo SIKE1基因的ORF为642 bp,同源性分析发现,Bo SIKE与羊、猪、人和鼠的氨基酸相似度分别为99%、96.1.0%、94.2%和91.1%;构建原核重组表达质粒p ET22b-Bo SIKE1,转化大肠杆菌并表达了约为25 k Da的目的条带,通过诱导条件优化Bo SIKE1融合蛋白均以包涵体形式表达,纯化Bo SIKE1蛋白并成功制备了兔多克隆抗体,抗体ELISA效价检测抗体滴度达到1:128000以上;通过过表达和干扰验证了Bo SIKE对BVDV增殖的影响,Bo SIKE1过表达后引起BVDV复制增强,干扰Bo SIKE1的表达会引起BVDV复制降低,Bo SIKE具有抑制抗病毒免疫的作用。LC-MS/MS和Co-IP数据显示Bo SIKE1与微管蛋白TUBA1D之间存在直接相互作用。推测SIKE可能介导固有免疫所需的细胞骨架重排,是联系细胞骨架结构与固有免疫信号通路的桥梁。结论:（1）成功构建NCP BVDV感染牛原代免疫细胞模型并获得不同感染时间转录组差异表达谱,筛选了95个IFN-Ⅰ信号通路相关的DEGs。（2）通过干扰素启动子荧光素酶报告系统检测发现,NCP BVDV非结构蛋白Npro和NS4B对IFN-Ⅰ的产生具体抑制作用。（3）Bo SIKE1能够影响NCP BVDV的增殖,Bo SIKE1与TUBA1D之间存在直接相互作用,推测Bo SIKE1蛋白可能是联系细胞骨架结构与固有免疫信号通路的桥梁。
杨蕾[8]（2020）在《在CHO-K1细胞基因组内定点整合表达人血清白蛋白的研究》文中进行了进一步梳理中国仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovary,CHO）已是应用最为广泛的生物技术药物生产细胞,构建稳定表达治疗性生物制品的CHO工程细胞系一直是研究工作的热点。课题组前期组合应用慢病毒示踪报告基因及染色体步移技术,在CHO-K1基因组内发现6个可持续表达报告基因的位点。本研究对其中一个位点进行了表达稳定性的验证工作,并分别实现了绿色荧光蛋白（Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP）基因和人血清白蛋白（Human serum albumin,HSA）基因在该位点的定点整合和稳定表达。一、以整合了Zs Green1报告基因的CHO-K1-ZsGreen1-2C6细胞为研究材料,组合使用倒置荧光显微镜和流式细胞术,定量分析了ZsGreen1报告基因的表达情况。按照主细胞库到2000 L细胞生产罐放大培养的细胞代次需求,连续传代培养50代次,发现100%的CHO-K1-Zs Green1-2C6贴壁和悬浮细胞均可稳定表达ZsGreen1报告基因,提示CHO-K1细胞LOC103162981基因NW＿003626341.1内第1689碱基（上下游1614～1763碱基范围内）可作为整合位点用于外源基因的稳定表达。二、基于CRISPR/Cas9基因编辑技术和同源定向修复途径,设计了含有嘌呤霉素和荧光蛋白双重筛选标签的供体片段。以CHO-K1细胞及凋亡相关基因BAK和BAX双敲除的突变株BAK-/BAX--CHO-K1为出发细胞株,在细胞基因组NW＿003626341.1内第1642碱基处分别定点敲入EGFP报告基因和HSA基因,经PCR扩增验证,共获得9株CHO-K1-EGFP单克隆细胞,11株BAK-/BAX--CHO-K1-EGFP单克隆细胞,5株CHO-K1-HSA单克隆细胞和4株BAK-/BAX--CHO-K1-HSA单克隆细胞。统计分析提示,准确敲入EGFP基因的单克隆细胞占比19%～23%,敲入HSA基因的占比8.5%～12%。三、悬浮驯化定点敲入目的基因的贴壁细胞,流式细胞术分别观察CHO-K1-EGFP和BAK-/BAX--CHO-K1-EGFP细胞内EGFP基因的表达情况,发现在连续悬浮传代培养50代次的过程中,100%的EGFP报告基因敲入细胞可以稳定表达EGFP蛋白,且单位荧光强度不低于初始细胞,验证了该整合位点表达外源基因的稳定性。批次培养HSA基因敲入细胞,与出发细胞株比较,所有敲入细胞株的生长状态均与其出发细胞株基本同步变化。获得2株蛋白表达量较高的CHO-K1-HSA细胞:CHO-K1-HSA-7和CHO-K1-HSA-50细胞,经批次培养8天蛋白积累量分别为228.50 mg×L-1和219.25 mg×L-1;获得1株蛋白表达量较高的BAK-/BAX--CHO-K1-HSA细胞:BAK-/BAX--CHO-K1-HSA-9细胞,在批次培养第9天蛋白积累量达97.24 mg×L-1。经稳定性验证和表达水平分析,确定LOC103162981基因NW＿003626341.1内第1642碱基处,可作为整合位点成为研究人员构建稳定表达治疗性蛋白质的CHO工程细胞株的可靠选择。
胡俊[9]（2020）在《谷氨酸/天冬氨酸选择性探针的发展与应用》文中提出化学选择性修饰是研究蛋白质表达与功能的重要方法;近年来,研究人员发展了系列针对半胱氨酸,赖氨酸,甲硫氨酸等氨基酸残基的选择性修饰分子。将这类分子探针与活性导向蛋白谱学分析技术（activity-based protein profiling,ABPP）相结合,发现了系列高活性的氨基酸位点与新的药物作用靶标,为药物发现与疾病治疗提供了重要基础。生物体内酸性氨基酸残基包括谷氨酸和天冬氨酸,其残基数量占生物体系总氨基酸残基的比例高达12.1%,并且部分酸性氨基酸残基对维持蛋白质结构与功能起着关键的作用。然而,由于酸性氨基酸残基的亲核能力相对较弱,要在复杂的生物体内对酸性氨基酸残基实现选择性修饰仍然是一大挑战性课题。本论文结合课题组前期在酸性氨基酸修饰方面的研究基础,考察了各类含有羧酸作为反应物的化学反应。我们发现3-苯基-2H-氮杂环丙烯能够在温和条件下与羧酸发生分子间偶联反应。通过羧酸将氮杂环丙烯质子化,亲核加成和分子内的重排反应后生成稳定的N-乙酰基酰胺偶联产物。而其他的氨基酸残基不能使氮杂环丙烯质子化,由此我们推测氮杂环丙烯可以作为生物体内针对酸性氨基酸的选择性探针。为了验证这一设想,我们合成了一系列基于氮杂环丙烯的分子探针AZ-1～AZ-11,区别主要在于氮杂环丙烯的2、3位引入烷基或芳基,考察不同取代基对探针的标记效率和选择性的影响。我们首先通过核磁共振仪测试了探针在生理条件下的化学稳定性,实验结果证明探针室温下可以在水溶液中保存至少3天不降解。再利用高效液相色谱仪研究了AZ-11与各氨基酸侧链的反应活性,经核磁图谱确证,AZ-11与Boc保护的谷氨酸在PBS/四氢呋喃混合溶液中的反应产物是和我们设想一致的稳定N-乙酰基酰胺产物。然后通过高效液相色谱仪验证了AZ-11与多肽在2小时内即可完成反应,LC-MS/MS确证了探针修饰的位点是谷氨酸和天冬氨酸,证明了探针良好的标记效率与选择性。随后我们考察了探针在纯蛋白中的标记情况,标记实验显示多数探针能够在1小时内,2.5μM探针浓度显着标记各种重组蛋白,并且加入竞争剂能够有效减弱标记强度,证明了探针标记的有效性。细胞水平的标记实验证明AZ-9的标记能力要显着强于其他探针,说明2-位取代基团一定程度上能影响探针在细胞中对蛋白质的标记。并且在1小时内,2.5μM探针浓度依然能显着标记细胞中各类蛋白,证明了探针在细胞水平的良好标记效率。通过亲和层析（pull-down）结合生物质谱检测,证明了探针能够选择性标记蛋白质和活细胞中的酸性氨基酸位点,3-苯基-2H-氮杂环丙烯可以作为酸性氨基酸残基的选择性修饰探针。通过蛋白质晶体结构分析,我们发现探针标记的位点主要位于蛋白的口袋中,并且能够高选择性修饰功能性谷氨酸残基。通过与定量活性导向蛋白质谱学分析技术（ABPP）相结合,我们在乳腺癌细胞中发现了系列高活性的酸性氨基酸位点,为乳腺癌相关的药物开发提供了重要基础,这提示我们发展的新型反应基团—3-苯基-2H-氮杂环丙烯—可用于构建新型共价小分子抑制剂。
罗鑫[10]（2020）在《水稻BILs群体粒型和粒重与灌浆速率QTL定位分析》文中指出水稻（Oryza sativa L.）是中国、亚洲乃至全球的主要粮食作物之一,稳定并提高水稻产量对于保障国家粮食安全具有重要作用。挖掘影响产量相关性状的数量性状位点,对于利用现代生物技术提高水稻产量有重要指导作用。因此,本研究以优质籼稻昌恢891和广亲和粳稻02428构建的回交重组自交系（BILs）群体为材料,在两个环境（2018年海南、2019年南昌中稻）进行了粒型（粒长、粒宽、长宽比、粒厚）和粒重分析与QTL定位;同时,在两个环境（2019年早稻和2019年中稻）下,利用该群体对灌浆关键期的灌浆速率进行了考察与QTL定位,以期为水稻粒型、粒重与灌浆速率基因的克隆和功能分析奠定基础。主要研究结果如下:1、2018年海南和2019年南昌两个环境下,共检测到37个与水稻粒型与粒重相关的QTL。其中,两个环境重复检测到的QTL有7个,分别是:千粒重QTL q TGW2、粒长QTL q GL12、粒宽QTL q GW2.2和q GW5、长宽比QTL q LWR5和q LWR8.3及粒厚QTL q GT4.2,它们分布于水稻第2、4、5、8和12号染色体上,2018年海南环境下的LOD值是3.27～28.74,贡献率4.45%～22.55%;2019年南昌中稻环境下的LOD值是2.79～23.89,贡献率7.61%～23.97%。这些粒型和粒重QTL的定位为后续QTL的克隆和育种利用奠定了基础。2、2019年早稻和2019年中稻两个环境下,亲本昌恢891和02428灌浆速率的整体趋势一致,在S1阶段（花后1到5天）和S3阶段（花后10到15天）灌浆速率较高,S2阶段（花后5到10天）灌浆速率相对较低,表现出灌浆速率先快后慢再快的特点,但两个亲本灌浆速率却存在显着差异。表明昌恢891和02428灌浆速率的差异很可能是导致二者粒重存在差异的主要原因之一。3、通过对昌恢891和02428构建的BILs群体开花后第一天、第五天、第十天和第十五天籽粒鲜重换算的灌浆速率进行了QTL检测。2019年早稻和2019年中稻两个环境下,共检测到6个与水稻灌浆速率密切相关的QTL。其中,灌浆S1阶段检测到1个QTL,为q GFR1.1;灌浆S2阶段检测到3个QTL,分别是q GFR3、q GFR5和q GFR7.2;灌浆S3阶段检测到2个QTL,分别是q GFR1.2和q GFR7.1;早中稻两个环境未能检测到稳定表达的QTL,表明环境条件对水稻灌浆影响较大。4、比较粒型和粒重QTL与灌浆速率QTL,发现位于水稻第1染色体的分子标记bin1-71和bin1-72之间,既存在控制灌浆速率QTL q GFR1.2,也存在控制籽粒千粒重的QTL q TGW1.1;其中,q GFR1.2的LOD值为3.23,贡献率为14.72%,增效等位基因来自轮回亲本02428;q TGW1.1的LOD值为4.40,贡献率为6.17%,增效等位基因来自供体亲本昌恢891。其他粒型和粒重QTL和灌浆速率QTL不存在重叠的染色体区段,这表明控制水稻灌浆过程与粒型和粒重的分子调控机制可能存在差异。
二、E-1胶技术鉴定报告（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、E-1胶技术鉴定报告（论文提纲范文）
（1）激活NF-κB信号通路鲑甲病毒蛋白的筛选及致病机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 引言 |
| 1.1 SAV的流行危害及临床症状 |
| 1.1.1 SAV的流行危害 |
| 1.1.2 SAV的临床症状及组织病理 |
| 1.2 SAV的病原学 |
| 1.2.1 SAV的分类及特性 |
| 1.2.2 SAV的基因组结构 |
| 1.2.3 SAV的结构与非结构蛋白及功能 |
| 1.2.4 SAV的基因型 |
| 1.3 TLRS的概述 |
| 1.3.1 TLRs种类、结构与功能 |
| 1.3.2 TLRs识别病原相关分子模式 |
| 1.3.3 TLRs在病毒感染中引起免疫反应的作用 |
| 1.3.4 TLRs信号转导途径 |
| 1.3.5 TLRs与病毒识别 |
| 1.4 NF-κB信号转导途径 |
| 1.4.1 NF-κB系统 |
| 1.4.2 NF-κB激活的分子机制 |
| 1.5 病毒与NF-κB信号通路的关系 |
| 1.5.1 NF-κB在病毒感染中的作用 |
| 1.5.2 NF-κB和炎症反应 |
| 1.5.3 NF-κB与炎性细胞因子 |
| 1.6 研究蛋白质与蛋白质互作的方法 |
| 1.6.1 噬菌体展示技术 |
| 1.6.2 酵母双杂交系统 |
| 1.6.3 免疫共沉淀技术 |
| 1.7 本试验研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 病毒、细胞、抗体 |
| 2.1.2 质粒与菌株 |
| 2.1.3 主要试剂和耗材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 SAV的增殖及紫外灭活 |
| 2.2.2 SAV的 E1、E2、E3、6K、cp、Nsp1、Nsp2、Nsp3、Nsp4基因的扩增 |
| 2.2.3 重组质粒的获得 |
| 2.2.4 重组真核表达质粒的转染与表达 |
| 2.2.5 Nsp2截短蛋白的构建 |
| 2.2.6 仙台病毒的繁殖与滴度检测 |
| 2.2.7 双荧光素酶检测NF-κB的活性 |
| 2.2.8 SAV激活NF-κB信号通路的检测 |
| 2.2.9 SYBR Green实时定量PCR |
| 2.2.10 Nsp2对SAV复制的影响 |
| 2.2.11 DAPI染色 |
| 2.2.12 激光共聚焦 |
| 2.2.13 免疫共沉淀 |
| 2.2.14 PAGE胶考染实验 |
| 2.2.15 质谱分析和鉴定 |
| 2.2.16 宿主蛋白的生物信息学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 SAV激活NF-κB信号通路的研究结果 |
| 3.1.1 SAV的增殖及紫外灭活的结果 |
| 3.1.2 SAV感染CHSE-214细胞对NF-κB活性的影响 |
| 3.1.3 SAV激活NF-κB上游信号通路 |
| 3.2 激活NF-κB信号通路的SAV关键蛋白的筛选结果 |
| 3.2.1 SAV各段基因的真核表达载体的构建与鉴定 |
| 3.2.2 细胞表达SAV E1、E2、E3、6k、cp、Nsp1、Nsp2、Nsp3和Nsp4蛋白的鉴定结果 |
| 3.2.3 仙台病毒的滴度测定结果 |
| 3.2.4 激活NF-κB的 SAV蛋白的筛选结果 |
| 3.3 SAV NSP2激活NF-κB信号通路的分子机制 |
| 3.3.1 过表达Nsp2蛋白对NF-κB活性的影响 |
| 3.3.2 Nsp2对IκBα降解、NF-κB核转移及p65磷酸化影响 |
| 3.3.3 Nsp2激活NF-κB信号通路下游的细胞因子的检测结果 |
| 3.3.4 Nsp2激活下游细胞因子依赖于NF-κB信号通路的检测结果 |
| 3.3.5 Nsp2激活NF-κB上游信号通路的检测结果 |
| 3.3.6 Nsp2激活NF-κB信号通路的转导途径的检测结果 |
| 3.4 NSP2对SAV病毒复制的影响 |
| 3.5 SAV NSP2激活NF-κB的功能域的确定 |
| 3.5.1 SAV Nsp2截短突变体的构建及鉴定结果 |
| 3.5.2 Nsp2截短突变体真核表达质粒的转染与表达结果 |
| 3.5.3 激活NF-κB信号通路的Nsp2截短功能域的筛选结果 |
| 3.6 与NSP2相互作用的宿主蛋白的筛选结果 |
| 3.6.1 免疫共沉淀及考染的结果 |
| 3.6.2 质谱分析的结果 |
| 3.6.3 与Nsp2互作的宿主细胞蛋白的GO功能分析结果 |
| 3.6.4 与Nsp2互作的宿主细胞蛋白的KEGG通路分析结果 |
| 3.6.5 与Nsp2互作的宿主蛋白的RIG-Ⅰ信号通路 |
| 3.6.6 与Nsp2互作的宿主蛋白的分析 |
| 3.7 NSP2与DDX3相互作用激活NF-κB的试验结果 |
| 3.7.1 CO-IP验证Nsp2与DDX3的相互作用的结果 |
| 3.7.2 激光共聚焦验证Nsp2与DDX3的相互作用 |
| 3.7.3 Nsp2与DDX3 的互作对NF-κB的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 SAV激活NF-κB信号通路关键蛋白的分析 |
| 4.2 SAV通过TLRS依赖的信号通路激活NF-κB信号通路 |
| 4.3 NSP2激活NF-κB下游细胞因子对病毒复制影响的分析 |
| 4.4 NSP2激活NF-κB的信号途径分析 |
| 4.5 NSP2与宿主蛋白的相互作用及其生物学活性分析 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（2）水牛精浆外泌体蛋白质组的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 精子发生与成熟 |
| 1.1.1 精子结构 |
| 1.1.2 精子的发生 |
| 1.1.3 精子的成熟 |
| 1.2 外泌体的研究背景 |
| 1.2.1 外泌体的发现、定义和组成 |
| 1.2.2 外泌体的生物发生 |
| 1.2.3 外泌体的功能 |
| 1.2.4 外泌体的分离与鉴定 |
| 1.3 外泌体与精子活力 |
| 1.3.1 精浆外泌体 |
| 1.3.2 精浆外泌体在精子成熟过程中的作用 |
| 1.4 蛋白质组学概况 |
| 1.4.1 蛋白质组学研究概况 |
| 1.4.2 蛋白质组学在精浆外泌体中的应用 |
| 1.5 本研究的目的、意义及技术路线 |
| 第二章 水牛精浆外泌体的分离鉴定与蛋白质表达谱的构建 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 精液的处理 |
| 2.1.3 精子和精浆总蛋白的提取 |
| 2.1.4 基于超高速差速离心结合蔗糖垫纯化方法对精浆外泌体的分离和提取 |
| 2.1.5 精浆外泌体蛋白的提取 |
| 2.1.6 BCA法测定蛋白质浓度 |
| 2.1.7 蛋白免疫印迹法检测精浆外泌体的蛋白标志物 |
| 2.1.8 透射电子显微镜(TEM)观察精浆外泌体形态 |
| 2.1.9 纳米颗粒跟踪分析仪(NTA)分析外泌体颗粒尺寸 |
| 2.1.10 蛋白质的还原烷基化和酶切 |
| 2.1.11 反相高效液相色谱(RP-HPLC)预分离 |
| 2.1.12 肽段脱盐 |
| 2.1.13 LC-MS/MS分析 |
| 2.1.14 数据检索与生物信息学分析 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 基于超高速差速离心结合蔗糖垫提取水牛精浆外泌体的鉴定 |
| 2.2.2 水牛精子活力的检测 |
| 2.2.3 精子、精浆和精浆外泌体蛋白质的质谱鉴定结果及Venn分析 |
| 2.2.4 蛋白质的理化性质统计 |
| 2.2.5 高丰度蛋白质分析 |
| 2.2.6 精子、精浆和精浆外泌体的基因本体论(GO)分析 |
| 2.2.7 精浆外泌体中生殖相关蛋白质的挖掘 |
| 2.2.8 精子、精浆和精浆外泌体的信号通路分析 |
| 2.2.9 精浆外泌体蛋白质互作网络(PPI) |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 水牛高低活力精浆外泌体的差异蛋白质组学分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 精液的采集及处理 |
| 3.1.3 水牛精浆外泌体的分离和提取 |
| 3.1.4 水牛精浆外泌体蛋白质的提取与浓度测定 |
| 3.1.5 水牛精浆外泌体的鉴定 |
| 3.1.6 蛋白质的还原烷基化和酶切 |
| 3.1.7 iTRAQ标记 |
| 3.1.8 反相高效液相色谱(RP-HPLC)预分离 |
| 3.1.9 肽段脱盐 |
| 3.1.10 LC-MS/MS分析 |
| 3.1.11 数据检索与生物信息学分析 |
| 3.2 实验结果与分析 |
| 3.2.1 高低活力水牛精液的检测 |
| 3.2.2 质谱鉴定结果及质量控制 |
| 3.2.3 差异表达蛋白质(DEPs)分析 |
| 3.2.4 基因本体论分析 |
| 3.2.5 KEGG通路分析 |
| 3.2.6 差异表达蛋白质的互作网络(PPI)分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 全文结论 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
（3）苎麻脱胶菌株Dickeya dadantii DCE-01功能基因与关键脱胶酶关联分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 苎麻概述 |
| 1.2 苎麻脱胶研究进展 |
| 1.2.1 苎麻脱胶种类 |
| 1.2.2 苎麻脱胶菌株 |
| 1.2.3 苎麻生物脱胶酶 |
| 1.3 苎麻生物脱胶机理 |
| 1.4 基因组学 |
| 1.5 蛋白质组学 |
| 1.6 技术路线 |
| 1.7 研究目的与意义 |
| 第二章 DCE-01 菌株基因组测序及注释 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要培养基 |
| 2.1.4 主要设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 菌株活化 |
| 2.2.2 基因组DNA提取 |
| 2.2.3 基因组DNA质检 |
| 2.2.4 菌株16S r RNA鉴定与分析 |
| 2.2.5 基因组测序数据组装 |
| 2.2.6 基因组组分分析 |
| 2.2.7 基因功能注释分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 基因组DNA提取 |
| 2.3.2 基因组DNA质控分析 |
| 2.3.3 菌株16S r RNA鉴定结果 |
| 2.3.4 基因组组装结果 |
| 2.3.5 基因组组分分析 |
| 2.3.6 基因功能注释分析 |
| 2.3.7 基因组圈图 |
| 2.4 小结与讨论 |
| 2.4.1 讨论 |
| 2.4.2 小结 |
| 第三章 不同脱胶时间DCE-01 菌株胞外分泌蛋白差异蛋白质组学分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要培养基 |
| 3.1.4 主要设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 菌株活化 |
| 3.2.2 样品分组 |
| 3.2.3 蛋白提取及质量检测 |
| 3.2.4 胰蛋白酶酶解 |
| 3.2.5 TMT标记 |
| 3.2.6 色谱及质谱条件 |
| 3.2.7 数据分析搜库 |
| 3.2.8 生物信息学分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 蛋白质样品抽提质量 |
| 3.3.2 高p H反向色谱分离 |
| 3.3.3 可信蛋白分析及数据质控 |
| 3.3.4 蛋白鉴定结果 |
| 3.3.5 差异蛋白表达分析 |
| 3.3.6 Venn分析 |
| 3.3.7 差异蛋白功能富集分析 |
| 3.3.8 差异蛋白聚类分析 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 3.4.1 讨论 |
| 3.4.2 小结 |
| 第四章 DCE-01 菌株果胶酶基因克隆及表达分析 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要培养基 |
| 4.1.4 主要设备 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 菌株活化 |
| 4.2.2 菌株基因组DNA提取 |
| 4.2.3 引物设计 |
| 4.2.4 果胶酶基因扩增 |
| 4.2.5 目的片段回收 |
| 4.2.6 重组质粒构建与转化 |
| 4.2.7 重组子筛选与鉴定 |
| 4.2.8 酶的诱导表达 |
| 4.2.9 SDS-PAGE蛋白电泳分析 |
| 4.2.10 标准曲线绘制 |
| 4.2.11 果胶酶活力测定 |
| 4.2.12 果胶酶基因生物信息学分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 基因组DNA提取 |
| 4.3.2 果胶酶基因扩增 |
| 4.3.3 质粒检测与转化 |
| 4.3.4 SDS-PAGE蛋白电泳分析 |
| 4.3.5 重组菌株酶活力测定 |
| 4.3.6 果胶酶基因生物信息学分析 |
| 4.4 小结与讨论 |
| 4.4.1 讨论 |
| 4.4.2 小结 |
| 第五章 结论和展望 |
| 5.1 研究结果 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 A |
| 附录 B |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（4）牛早期妊娠的生物标志物鉴定及分子调控机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表(Abbreviation) |
| 第一部分 文献综述 |
| 1 前言 |
| 1.1 研究问题的由来 |
| 1.2 文献综述 |
| 1.2.1 牛早期胚胎发育与胚胎损失 |
| 1.2.2 妊娠诊断直接检测方法 |
| 1.2.3 妊娠诊断间接检测方法 |
| 1.2.4 妊娠识别的分子机制 |
| 1.2.5 妊娠识别阶段的新型生物标志物研究 |
| 1.3 研究目的和意义 |
| 实验一 牛早期妊娠血液生理生化指标分析以及相关候选基因的鉴定研究 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 主要试剂和仪器设备 |
| 2.2.1 主要试剂 |
| 2.2.2 主要仪器设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 技术路线 |
| 2.3.2 实验牛同期发情、人工授精及妊娠诊断 |
| 2.3.3 血常规检测 |
| 2.3.4 P_4含量检测 |
| 2.3.5 血清PAG检测 |
| 2.3.6 血清细胞因子检测 |
| 2.3.7 水牛妊娠识别标志基因鉴定 |
| 2.3.8 奶牛外周血中妊娠识别标志基因的表达分析 |
| 2.3.9 妊娠识别标志基因的诊断价值分析 |
| 2.3.10 妊娠识别标志基因双重荧光定量PCR体系的建立 |
| 2.3.11 数据分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 水牛妊娠诊断 |
| 3.2 水牛妊娠早期白细胞参数变化 |
| 3.3 水牛妊娠早期P_4水平 |
| 3.4 水牛妊娠早期白细胞参数与P_4的相关性 |
| 3.5 水牛妊娠早期血液细胞因子水平分析 |
| 3.6 水牛妊娠识别标志基因的发掘 |
| 3.6.1 水牛妊娠早期血液中差异基因分析 |
| 3.6.2 差异基因的生物学功能分析 |
| 3.6.3 差异基因定量PCR验证 |
| 3.7 妊娠识别标志基因在奶牛早期妊娠诊断中的应用研究 |
| 3.7.1 妊娠识别标志基因在奶牛外周血中的表达规律 |
| 3.7.2 干扰素刺激基因ISG15、OAS1和RSAD2 单独或联合应用于奶牛早期妊娠的诊断效能分析 |
| 3.7.3 基于双重荧光定量PCR的妊娠诊断技术体系 |
| 3.7.4 利用双重荧光定量PCR进行妊娠诊断的准确性分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 妊娠牛与空怀牛的血液生理生化指标差异 |
| 4.2 妊娠水牛血液细胞转录组测序鉴定差异表达基因 |
| 4.3 基于妊娠识别标志基因的早期妊娠诊断 |
| 5 小结 |
| 实验二 牛血清妊娠相关差异蛋白筛选及功能研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 细胞 |
| 2.2 主要试剂和仪器设备 |
| 2.2.1 主要试剂 |
| 2.2.2 仪器设备 |
| 2.2.3 主要试剂的配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 技术路线 |
| 2.3.2 iTRAQ实验 |
| 2.3.3 iTRAQ测序数据分析 |
| 2.3.4 iTRAQ测序数据的实验验证 |
| 2.3.5 siRNA抑制牛子宫内膜上皮细胞NRF2 基因表达实验 |
| 2.3.6 NRF2 介导UPR信号通路的功能研究 |
| 2.3.7 荧光定量PCR实验数据分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 奶牛妊娠早期血清差异蛋白鉴定 |
| 3.1.1 实验牛样本中血清孕酮水平分析 |
| 3.1.2 高丰度蛋白的去除 |
| 3.1.3 iTRAQ实验质控分析 |
| 3.1.4 总差异蛋白 |
| 3.1.5 差异表蛋白参与的生物学功能分析 |
| 3.2 妊娠早期血清差异蛋白的验证 |
| 3.2.1 差异蛋白的定量PCR检测 |
| 3.2.2 Western blot检测妊娠或空怀差异蛋白在血清中的表达 |
| 3.3 NRF2功能验证 |
| 3.3.1 siRNA抑制NRF2 对子宫内膜上皮细胞增殖的影响 |
| 3.3.2 siRNA抑制NRF2 表达对HO-1和HOXA10 表达的影响 |
| 3.3.3 IFNT对 NRF2 基因及UPR通路相关基因m RNA表达的影响 |
| 3.3.4 siRNA抑制NRF2 表达对IFNT调节UPR通路及凋亡相关基因m RNA表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 基于iTRAQ技术的早期妊娠奶牛血清差异蛋白 |
| 4.2 差异蛋白NRF2功能验证 |
| 4.2.1 牛子宫内膜上皮细胞中抑制NRF2对HO-1和HOXA10 表达的影响 |
| 4.2.2 子宫内膜上皮细胞中NRF2 抑制表达对IFNT调节UPR通路的影响 |
| 5 小结 |
| 创新点 |
| 下一步计划 |
| 参考文献 |
| 附表论文补充数据 |
| 已发表文章 |
| 致谢 |
（5）GhDGK基因家族生物信息学分析及GhDGK7b的抗逆功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第1章 前言 |
| 1.1 植物对盐、干旱胁迫响应机制 |
| 1.1.1 盐、干旱胁迫对植物的危害 |
| 1.1.2 植物响应盐、干旱胁迫的生理和分子机制 |
| 1.1.3 棉花应对盐和干旱胁迫的研究 |
| 1.2 二酰甘油激酶(DGK)的研究进展 |
| 1.3 本研究的目的及意义 |
| 第2章 棉花DGK家族成员的克隆和表达分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 载体与菌株 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 陆地棉(Gossypium hirsutum)、亚洲棉(Gossypium arboreum)和雷蒙德氏棉(Gossypium raimondii)DGK基因的电子克隆 |
| 2.2.2 陆地棉DGK基因的克隆 |
| 2.2.3 GhDGKs生物信息学分析 |
| 2.2.4 GhDGK基因表达模式分析 |
| 2.3 结果分析 |
| 2.3.1 GhDGKs、GaDGKs、GrDGKs基因的电子克隆 |
| 2.3.2 棉花DGK基因家族的基因克隆与注释 |
| 2.3.3 GhDGKs的生物信息学分析 |
| 2.3.4 GhDGKs基因于棉花不同组织中的表达具有一定的组织特异性 |
| 2.3.5 GhDGKs参与了低温、盐、干旱胁迫和ABA处理的应答 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 GhDGKs生物学抗逆功能研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 菌株及载体 |
| 3.1.3 试剂及培养基等溶液配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 植物表达载体构建 |
| 3.2.2 GhDGKs亚细胞定位 |
| 3.2.3 拟南芥DNA的提取 |
| 3.2.4 拟南芥半定量RT-PCR及实时荧光定量PCR |
| 3.2.5 拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定 |
| 3.2.6 过表达GhDGK1e、GhDGK4b、GhDGK5a、GhDGK7b基因拟南芥阳性株系筛选 |
| 3.2.7 过表达GhDGK7b拟南芥阳性植株的Western blot检测 |
| 3.2.8 过表达GhDGK7b拟南芥盐、干旱胁迫下耐受性鉴定 |
| 3.3 结果分析 |
| 3.3.1 P35S::GhDGK:YFP和pCAMBIA1302-P35S::GhDGK1e:GFP植物表达载体构建 |
| 3.3.2 GhDGK1e、GhDGK4b、GhDGK5a、GhDGK7b亚细胞定位 |
| 3.3.3 拟南芥dgk突变体的鉴定 |
| 3.3.4 过表达GhDGK1e、GhDGK4b、GhDGK5a、GhDGK7b拟南芥植株的获得 |
| 3.3.5 过表达GhDGK7b基因影响了在干旱、盐处理下拟南芥种子的萌发率和主根长度 |
| 3.3.6 干旱、盐胁迫下过表达GhDGK7b拟南芥的生理生化指标测定结果 |
| 3.4 讨论 |
| 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 ZmPJS基因的过表达通过增加ABA合成可提髙棉花对干旱胁迫的耐受性 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（6）MERTK促进猪瘟病毒复制的分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 猪瘟与猪瘟病毒 |
| 1.1.1 猪瘟 |
| 1.1.2 猪瘟病毒 |
| 1.2 猪瘟病毒囊膜蛋白的结构及功能 |
| 1.2.1 猪瘟病毒囊膜蛋白的结构 |
| 1.2.2 猪瘟病毒囊膜蛋白中的二硫键及其功能 |
| 1.2.3 猪瘟病毒囊膜糖蛋白的糖基化修饰及其与病毒毒力的关系 |
| 1.2.4 猪瘟病毒囊膜糖蛋白中的抗原表位 |
| 1.3 猪瘟病毒入侵机制的研究进展 |
| 1.3.1 猪瘟病毒的吸附 |
| 1.3.2 猪瘟病毒的入侵方式 |
| 1.3.3 猪瘟病毒潜在的膜融合机制 |
| 1.4 TAM受体蛋白 |
| 1.4.1 TAM受体蛋白及其配体结构特点 |
| 1.4.2 TAM受体的功能多样性 |
| 1.4.3 TAM受体蛋白与病毒感染 |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 第二章 MERTK促进猪瘟病毒感染的机制研究 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 细胞、毒株和载体 |
| 2.1.2 其他实验材料 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 主要试剂的配制 |
| 2.1.5 候选分子的siRNA设计及其序列 |
| 2.1.6 siRNA下调及CSFV感染试验 |
| 2.1.7 rCSFV-Rluc报告病毒的Rluc活性检测 |
| 2.1.8 细胞总RNA的提取及反转录 |
| 2.1.9 荧光定量RT-qPCR检测不同靶基因的mRNA转录水平 |
| 2.1.10 CSFV毒价的测定 |
| 2.1.11 间接免疫荧光检测CSFV试验 |
| 2.1.12 内源性MERTK蛋白的流式试验验证 |
| 2.1.13 稳定过表达MERTK的 PK-15 细胞系的构建 |
| 2.1.14 MERTK抗体封闭试验 |
| 2.1.15 可溶性MERTK~(ED)-His蛋白和pGas6 蛋白的表达及纯化 |
| 2.1.16 可溶性MERTK~(ED)-His蛋白和LDC1267 对细胞活力的影响试验 |
| 2.1.17 可溶性MERTK~(ED)-His蛋白阻断试验 |
| 2.1.18 猪源Gas6 蛋白和胎牛血清对CSFV感染影响的试验 |
| 2.1.19 MERTK和 E2 蛋白的免疫共沉淀试验 |
| 2.1.20 Western blotting试验 |
| 2.1.21 可溶性MERTK~(ED)-His和 E2 蛋白的表面等粒子体共振(Surface plasmon resonance,SPR)试验 |
| 2.1.22 MERTK和 CSFV E2 蛋白在293T细胞中的共定位试验 |
| 2.1.23 可溶性MERTK~(ED)-His蛋白处理后对IFN-βmRNA转录水平的影响 |
| 2.1.24 抗MERTK多克隆抗体处理后对IFN-βmRNA转录水平的影响 |
| 2.1.25 MERTK在 CSFV入侵过程中的作用 |
| 2.1.26 LDC1267抑制剂的处理试验 |
| 2.1.27 MERTK在 MDBK和 BHK-21 细胞中的受体重建试验 |
| 2.1.28 可溶性MERTK~(ED)-His对 BVDV复制影响的检测 |
| 2.1.29 可溶性MERTK~(ED)-His对猪PRV TJ复制影响的检测 |
| 2.1.30 数据统计学分析 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 siRNA筛选结果 |
| 2.2.2 确认下调MERTK对 CSFV复制的影响 |
| 2.2.3 过表达MERTK对 CSFV复制的影响 |
| 2.2.4 抗体封闭对CSFV复制的影响 |
| 2.2.5 可溶性MERTK~(ED)-His对 CSFV复制的影响 |
| 2.2.6 MERTK对基因2型CSFV复制的影响 |
| 2.2.7 猪源Gas6 蛋白和胎牛血清对CSFV感染无影响 |
| 2.2.8 MERTK与 CSFV E2 蛋白存在相互作用 |
| 2.2.9 MERTK可促进CSFV的入侵 |
| 2.2.10 LDC1267对CSFV复制的影响 |
| 2.2.11 LDC1267在CSFV感染后对宿主固有免疫的影响 |
| 2.2.12 LDC1267对CSFV入侵的影响 |
| 2.2.13 MERTK对 PRV TJ和 BVDV复制的影响 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（7）非致细胞病变牛病毒性腹泻病毒抑制Ⅰ型干扰素产生的分子机制探索（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1 研究的目的和意义 |
| 2 国内外研究进展 |
| 2.1 牛病毒性腹泻病毒-黏膜病(BVDV-MD) |
| 2.1.1 BVDV流行病学 |
| 2.1.2 BVDV分子生物学特征 |
| 2.1.3 BVDV基因组及其编码蛋白 |
| 2.1.4 BVDV感染机制 |
| 2.1.5 BVDV持续性感染 |
| 2.1.6 BVDV免疫逃避 |
| 2.2 RNA-Seq技术筛选病毒相关宿主基因 |
| 2.2.1 RNA-Seq技术的发展 |
| 2.2.2 RNA-Seq技术的应用 |
| 2.2.3 单细胞测序技术(Sc RNA-Seq) |
| 2.3 抗病毒固有免疫 |
| 2.3.1 TLRs及其介导的信号通路 |
| 2.3.2 RLRs及其介导的信号通路 |
| 2.4 Ⅰ型干扰素(IFN-I) |
| 2.4.1 JAK-STAT通路 |
| 2.4.2 ISGs的抗病毒作用 |
| 2.5 病毒逃避Ⅰ型干扰素信号通路 |
| 2.5.1 病毒抑制Ⅰ型干扰素上游信号通路 |
| 2.5.2 病毒抑制Ⅰ型干扰素下游信号通路 |
| 2.6 IFN信号的复杂性和宿主趋向性 |
| 3 研究内容 |
| 3.1 NCP BVDV感染牛单核细胞模型的建立及转录组测序分析 |
| 3.2 牛IFN-β启动子报告载体的构建及NCP BVDV对干扰素信号通路的影响 |
| 3.3 牛SIKE1 蛋白对NCP BVDV复制的影响及互作蛋白筛选 |
| 4 技术路线 |
| 第二章 试验研究 |
| 试验一 NCP BVDV感染牛单核细胞模型的建立及转录组测序分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 病毒分离株和实验动物 |
| 1.1.2 重要仪器和设备 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 牛外周血单核细胞的分离及鉴定 |
| 1.2.2 免疫荧光实验(IFA) |
| 1.2.3 NCP BVDV-LC病毒TCID50测定 |
| 1.2.4 BVDV感染牛外周血单核细胞 |
| 1.2.5 RNA提取 |
| 1.2.6 建库及测序 |
| 1.2.7 生物信息学分析 |
| 1.2.8 qRT-PCR验证差异表达基因 |
| 1.2.9 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 流式细胞术鉴定牛单核细胞 |
| 2.2 NCP BVDV感染牛外周血单核细胞免疫荧光检测 |
| 2.3 差异表达基因(DEGs)的筛选 |
| 2.4 GO聚类分析 |
| 2.5 KEGG分析 |
| 2.6 Ⅰ型干扰素信号通路相关DEGs分析 |
| 2.7 qRT-PCR验证部分DEGs |
| 3 讨论 |
| 3.1 牛外周血单核细胞的分离及鉴定 |
| 3.2 NCP BVDV感染牛单核细胞DEGs分析 |
| 4 小结 |
| 试验二 牛IFN-β启动子报告载体的构建及NCP BVDV对干扰素信号通路的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞和毒株 |
| 1.1.2 重要仪器和设备 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 质粒 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 牛Ⅰ型干扰素IFN-β启动子报告载体的构建和分析 |
| 1.2.2 BoIRF7和Bo DDX58 真核表达载体的构建及对干扰素启动子活性的影响 |
| 1.2.3 NCP BVDV对干扰素信号通路的影响 |
| 1.2.4 NCP BVDV非结构蛋白慢病毒载体构建及对干扰素信号通路的影响 |
| 1.2.5 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 牛Ⅰ型干扰素IFNβ的启动子报告载体构建及活性分析 |
| 2.1.1 牛IFN-β启动子序列的克隆 |
| 2.1.2 BoIFN-β启动子报告载体的构建 |
| 2.1.3 BoIFNβ3-Luc-MDBK细胞的制备 |
| 2.1.4 BoIFNβ3-Luc MDBK细胞对BVDV复制的影响 |
| 2.1.5 ploy(I:C)对BoIFNβ3-Luc转录活性的影响 |
| 2.2 BoIRF7和Bo DDX58 真核载体构建及对BoIFNβ3 启动子活性的影响 |
| 2.2.1 BoIRF7和Bo DDX58 真核载体构建 |
| 2.2.2 BoIRF7和Bo DDX58对BoIFNβ3-Luc转录活性的影响 |
| 2.3 NCP BVDV在 MDBK细胞对干扰素信号通路的影响 |
| 2.3.1 NCP BVDV在 MDBK细胞上对干扰素通路相关分子转录的影响 |
| 2.3.2 NCP BVDV感染对BoIFNβ3-Luc转录活性的影响 |
| 2.4 NCP BVDV非结构蛋白对干扰素信号通路的影响 |
| 2.4.1 NCP BVDV非结构蛋白真核表达载体构建 |
| 2.4.2 NCP BVDV非结构蛋白慢病毒的包装及感染MDBK细胞 |
| 2.4.3 NCP BVDV非结构蛋白对Hu IFN-β、Hu NF-κB、Hu-IRSE、BoIFN-β转录活性的影响 |
| 2.4.4 NCP BVDV非结构蛋白NS4B对 poly(I:C)诱导的IFN-Ⅰ通路蛋白表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 细胞转染效率 |
| 3.2 病毒抑制IFN-Ⅰ信号通路的机制 |
| 3.3 BVDV非结构蛋白对IFN-Ⅰ通路的影响 |
| 4 小结 |
| 试验三 牛SIKE1 蛋白对NCP BVDV复制的影响及互作蛋白筛选 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 试验动物、细胞和毒株 |
| 1.1.2 重要仪器和设备 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 质粒 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 BoSIKE1 基因的克隆及表达载体构建 |
| 1.2.2 BoSIKE1 基因的原核表达及多克隆抗体制备 |
| 1.2.3 NCP BVDV病毒感染MDBK细胞后对BoSIKE1 表达的影响 |
| 1.2.4 BoSIKE1 过表达和干扰对NCP BVDV复制的影响 |
| 1.2.5 LC-MS/MS蛋白质组分析 |
| 1.2.6 BoSIKE1 与互作蛋白的Co-IP实验 |
| 1.2.7 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 BoSIKE1 基因的克隆及同源性分析 |
| 2.2 BoSIKE1 基因的原核表达及多克隆抗体制备 |
| 2.2.1 BoSIKE1 基因的原核表达 |
| 2.2.2 BoSIKE1 抗体的制备与鉴定 |
| 2.3 BVDV病毒感染宿主细胞后对BoSIKE1 表达的影响 |
| 2.4 BoSIKE1 过表达和干扰细胞的构建 |
| 2.5 BoSIKE1 过表达和干扰对BVDV复制的影响 |
| 2.6 LC-MS/MS蛋白质组分析 |
| 2.7 BoSIKE1与TUBA1D蛋白互作验证 |
| 3 讨论 |
| 3.1 BoSIKE对 NCP BVDV复制的影响 |
| 3.2 BoSIKE1 互作蛋白的鉴定及分析 |
| 4 小结 |
| 全文结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
| 石河子大学博士研究生学位论文导师评阅表 |
（8）在CHO-K1细胞基因组内定点整合表达人血清白蛋白的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 工程细胞简介 |
| 1.1.1 常用的工程细胞 |
| 1.1.2 CHO细胞简介 |
| 1.2 CHO工程细胞的构建 |
| 1.2.1 CHO细胞的表达优势 |
| 1.2.2 CHO工程细胞构建的传统方法 |
| 1.2.3 CHO工程细胞的存在问题 |
| 1.3 CHO工程细胞的研究进展 |
| 1.3.1 抗凋亡工程 |
| 1.3.2 基因位点特异性整合 |
| 1.4 本文研究背景和研究内容 |
| 1.4.1 研究背景 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞株和菌株 |
| 2.1.2 质粒 |
| 2.1.3 引物 |
| 2.1.4 培养基 |
| 2.1.5 主要试剂及溶液 |
| 2.1.6 仪器和设备 |
| 2.1.7 分析软件 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养与保藏 |
| 2.2.2 MTT法检测CHO-K1-ZsGreen1-2C6 贴壁细胞的倍增时间 |
| 2.2.3 倒置荧光显微镜观察ZsGreen1 蛋白表达情况 |
| 2.2.4 流式细胞仪检测细胞平均荧光强度 |
| 2.2.5 Zsgreen1 蛋白转录水平分析 |
| 2.2.6 sgRNA设计与质粒构建 |
| 2.2.7 sgRNA可编辑性验证 |
| 2.2.8 供体质粒的设计与构建 |
| 2.2.9 细胞转染和单克隆筛选 |
| 2.2.10 目的基因定点整合的鉴定 |
| 2.2.11 目的蛋白质的表达鉴定 |
| 2.2.12 目的蛋白细胞表达水平的检测 |
| 第三章 结果与讨论 |
| 3.1 CHO-K1-ZsGreen1-2C6 细胞生长曲线 |
| 3.2 CHO-K1-ZsGreen1-2C6 细胞表达ZsGreen1 报告基因的稳定性评价 |
| 3.2.1 CHO-K1-ZsGreen1-2C6 贴壁细胞内ZsGreen1 基因的表达情况 |
| 3.2.2 CHO-K1-ZsGreen1-2C6 悬浮细胞内ZsGreen1 基因的表达情况 |
| 3.2.3 不同代次CHO-K1-ZsGreen1-2C6 细胞内ZsGreen1 基因转录水平检测 |
| 3.3 sgRNA质粒的验证及阳性克隆筛选 |
| 3.4 sgRNA编辑效率验证 |
| 3.5 定点整合基因的鉴定 |
| 3.5.1 定点整合EGFP基因细胞株的鉴定 |
| 3.5.2 定点整合HSA基因细胞株的鉴定 |
| 3.6 目的蛋白表达的鉴定 |
| 3.6.1 EGFP基因表达的鉴定 |
| 3.6.2 HSA基因表达的鉴定 |
| 3.7 EGFP报告基因的表达稳定性评价 |
| 3.8 HSA基因表达水平检测 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 :作者在攻读硕士学位期间发表的论文 |
（9）谷氨酸/天冬氨酸选择性探针的发展与应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩写对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究背景介绍 |
| 1.2 国内外研究现状 |
| 1.3 课题研究目的及意义 |
| 第二章 基于氮杂环丙烯结构探针的设计合成与初步验证 |
| 2.1 基于氮杂环丙烯结构的探针设计合成 |
| 2.2 探针稳定性及反应性考察 |
| 2.3 探针与多肽修饰考察 |
| 第三章 探针对酸性氨基酸残基选择性修饰研究 |
| 3.1 探针在纯蛋白水平的修饰研究 |
| 3.2 探针在活细胞水平的修饰研究 |
| 3.3 定量评估探针修饰残基的反应及功能性 |
| 第四章 实验部分 |
| 4.1 实验仪器、试剂 |
| 4.2 细胞培养与蛋白提取 |
| 4.3 化学实验 |
| 4.4 生物学实验 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录1 生物质谱 |
| 附录2 化合物核磁图谱 |
| 在学期间发表论文清单 |
| 致谢 |
（10）水稻BILs群体粒型和粒重与灌浆速率QTL定位分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 水稻籽粒的分类 |
| 1.2 水稻粒型和粒重的遗传分析 |
| 1.3 水稻粒型和粒重与灌浆QTL定位 |
| 1.3.1 粒型和粒重QTL定位现状 |
| 1.3.2 灌浆QTL定位现状 |
| 1.4 水稻粒型和粒重与灌浆主效基因的克隆与研究进展 |
| 1.4.1 控制粒长和千粒重的基因 |
| 1.4.2 控制粒宽和千粒重的基因 |
| 1.4.3 控制籽粒长宽比的基因 |
| 1.4.4 控制粒厚和千粒重的基因 |
| 1.4.5 控制籽粒灌浆充实度和灌浆速率的基因 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 第二章 水稻BILs群体粒型和粒重分析与QTL定位 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 材料种植 |
| 2.1.3 数据考察 |
| 2.1.4 数据分析和QTL检测 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 BILs群体亲本粒型和粒重情况 |
| 2.2.2 BILs群体粒型和粒重 |
| 2.2.2.1 BILs群体千粒重分布情况 |
| 2.2.2.2 BILs群体粒型分布情况 |
| 2.2.2.3 BILs群体粒型与粒重的相关性分析 |
| 2.2.3 BILs群体粒型和粒重QTL定位分析 |
| 2.2.3.1 千粒重 |
| 2.2.3.2 粒长 |
| 2.2.3.3 粒宽 |
| 2.2.3.4 长宽比 |
| 2.2.3.5 粒厚 |
| 2.2.3.6 BILs群体两个环境重复检测的QTL |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 粒型各性状和粒重间相关性与遗传 |
| 2.3.2 粒型和粒重QTL的相互比较 |
| 2.3.3 其他粒型性状的QTL检测 |
| 第三章 水稻BILs群体灌浆速率分析与QTL定位 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 材料种植 |
| 3.1.3 数据考察 |
| 3.1.4 数据分析和QTL检测 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 BILs群体亲本灌浆情况 |
| 3.2.2 BILs群体亲本及群体灌浆速率情况 |
| 3.2.2.1 亲本灌浆速率 |
| 3.2.2.2 早稻环境下群体灌浆速率 |
| 3.2.2.3 中稻环境下群体灌浆速率 |
| 3.2.3 BILs群体灌浆速率QTL定位分析 |
| 3.2.3.1 灌浆S1阶段 |
| 3.2.3.2 灌浆S2阶段 |
| 3.2.3.3 灌浆S3阶段 |
| 3.2.3.4 灌浆速率QTL小结 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 亲本和BILs群体的灌浆特点 |
| 3.3.2 灌浆速率QTL与粒型和粒重QTL比较分析 |
| 3.3.3 与已定位的灌浆QTL比较 |
| 3.3.4 灌浆速率动态QTL定位分析 |
| 3.3.5 灌浆速率QTL应用前景 |
| 第四章 总结与展望 |
| 4.1 全文总结 |
| 4.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
四、E-1胶技术鉴定报告（论文参考文献）
- [1]激活NF-κB信号通路鲑甲病毒蛋白的筛选及致病机制的研究[D]. 高帅. 东北农业大学, 2021
- [2]水牛精浆外泌体蛋白质组的初步研究[D]. 肖凯. 广西大学, 2021(12)
- [3]苎麻脱胶菌株Dickeya dadantii DCE-01功能基因与关键脱胶酶关联分析[D]. 郜明强. 中国农业科学院, 2021
- [4]牛早期妊娠的生物标志物鉴定及分子调控机制研究[D]. 程蕾. 华中农业大学, 2020(04)
- [5]GhDGK基因家族生物信息学分析及GhDGK7b的抗逆功能研究[D]. 张瑞. 山东大学, 2020(04)
- [6]MERTK促进猪瘟病毒复制的分子机制[D]. 郑光来. 中国农业科学院, 2020
- [7]非致细胞病变牛病毒性腹泻病毒抑制Ⅰ型干扰素产生的分子机制探索[D]. 何延华. 石河子大学, 2020
- [8]在CHO-K1细胞基因组内定点整合表达人血清白蛋白的研究[D]. 杨蕾. 江南大学, 2020(01)
- [9]谷氨酸/天冬氨酸选择性探针的发展与应用[D]. 胡俊. 暨南大学, 2020(03)
- [10]水稻BILs群体粒型和粒重与灌浆速率QTL定位分析[D]. 罗鑫. 江西农业大学, 2020