一、提纯结核菌素特异性检验方法的研究（论文文献综述）
房立春[1]（2020）在《基于RNA-Seq技术的牛结核病分子标志物的筛选和验证》文中研究说明牛结核病（Bovine tuberculosis）是一种主要由牛型分枝杆菌（M.bovis）感染引起的危害严重的人畜共患病。结核病牛可通过鼻腔或泌乳等方式向外排菌,呼吸道飞沫传播是牛分枝杆菌的主要传播方式。世界动物卫生组织（OIE）推荐的巢式PCR方法可以有效检测牛鼻拭子中分枝杆菌DNA,有研究报道基于此方法发现超过15%的结核病牛向外排菌。为了筛选牛结核病特别是不同感染状态牛结核病的诊断用分子标志物,本研究采用皮内变态反应（TST）和IFN-γ释放试验（IGRA）在临床上筛选结核病阳性牛（bTB,n=40）和健康牛（NC,n=20）,并采用OIE推荐的巢式PCR方法将结核病阳性牛分为PCR阳性结核病牛（bTB PCR-P,n=20）和PCR阴性结核病牛（bTB PCR-N,n=20）。以牛型提纯结核菌素PPD-B刺激牛外周血淋巴细胞（PBMCs）6 h,并设PBS刺激组为对照。采用RNA-Seq技术对PBMCs总RNA进行高通量测序,描绘不同感染状态结核病牛的转录表达谱。结果显示在PPD-B刺激和非刺激条件下,不同感染状态结核病牛PBMCs的mRNA表达谱显着不同,组间鉴定到数目可观的差异表达基因,差异表达基因功能和所涉及的信号通路揭示了结核病牛在不同感染状态下特有的生理特征。本研究基于转录组学结果,筛选了12个有潜力的牛结核病分子标志物。以临床筛选的51头牛为独立样本,扩群验证了分子标志物的诊断能力。qRT-PCR结果表明PPD-B刺激条件下IL-8,和LTA在结核病阳性牛（包括PCR阳性和PCR阴性结核病牛）中的mRNA表达水平显着高于健康牛,受试者特征曲线（ROC曲线）显示IL-8（AUC=0.9991）和LTA（AUC=0.9343）具有较高的诊断应用价值;PPD-B刺激条件下BCL2（AUC=0.9100）,CRP（AUC=0.9619）和CHI3L1（AUC=0.8893）可以将临床上PCR阳性和PCR阴性的结核病牛进行有效区分。由于商品化的牛ELISA试剂盒的限制,我们评价了分子标志物IL-8和CRP在结核病牛血浆中的蛋白含量并确定了诊断用cutoff值。双盲试验以244头牛为实验动物,分别用TST,IGRA,nest-PCR和PPD-B刺激的IL-8与CRP ELISA进行检测,结果表明PPD-B刺激下血浆IL-8与TST（κ=0.877）和IGRA（κ=0.926）均具有很高的吻合度,可以用于区分结核病牛与健康牛;PPD-B刺激下血浆CRP与nest-PCR（κ=0.9117）有较高吻合度,可以区分临床上PCR阳性和PCR阴性的结核病牛。本研究成功构建了牛分枝杆菌BALB/c小鼠感染模型。以牛分枝杆菌AN5静脉注射小鼠,同时设对照组。连续观察56天,不论是脏器系数,组织病理学观察还是脏器载菌量均表明感染模型建模成功。利用qRT-PCR和ELISA在mRNA和蛋白水平验证了牛结核病分子标志物在小鼠模型上不同感染时间的表达情况。结果证实,LTA,CRP,BCL2等分子标志物在小鼠感染模型与牛上的表达水平基本一致,该结果进一步提高了分子标志物的可靠性。综上所述,本研究首次描绘了不同感染状态结核病牛PBMCs的转录表达谱,阐明了不同感染状态结核病牛生理状态的异质性,证实了PCR阳性与PCR阴性结核病牛不同的免疫应答反应。同时筛选并验证了IL-8、LTA、CRP、BCL2和CHI3L1是具有诊断价值的牛结核病分子标志物。本研究提供了新的视角来认识牛结核病发病进程,为牛结核病不同感染状态的区分提供了理论支持,新型分子标志物的成功筛选和验证为牛结核病的临床诊断提供了客观依据。
许芳[2]（2020）在《我国部分地区牛结核病调查与牛肺外结核病病原分离鉴定及生物学特性研究》文中研究表明牛结核病（bovine tuberculosis,bTB）是一种主要由牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis,M.bovis）感染引起的慢性消耗性人兽共患传染病。该病可通过病牛咳嗽喷出的飞沫或悬浮在空气中的带菌尘埃经呼吸道传播,也可通过摄取带菌的食物、饮水而经消化道传播。症状因发病部位不同而异,常表现为肺结核和淋巴结核,也可出现乳房结核、浆膜结核和肠结核等其他组织器官结核。我国是bTB高负担国家,流行率约为015%,资料表明,建国后,我国bTB的主要表现形式为肺结核,其他国家普遍实行牛奶巴氏灭菌后bTB表现形式也是以肺结核为主。但是,进入21世纪,全国bTB流行病学调查发现一个令人困惑的普遍现象:采用PPD方法检疫结果呈阳性的牛无咳嗽等呼吸道症状,剖检极少发现肺脏结核病变。为进一步了解我国部分地区bTB的流行情况,揭示奶牛场PPD阳性牛与剖检肺脏结核病变不对应、不吻合的原因,探究其传染源、传播途径及病原特性,本研究在14个省份及新疆生产建设兵团开展bTB流行病学调查,选取8个规模化奶牛场进行免疫学综合诊断、系统剖检、病理组织学检查、病原分离鉴定、动物致病性试验、菌株全基因组测序、系统进化分析等生物学特性研究。1.2015-2018年,采用比较皮内变态反应（SICCT）和IFN-γ试验对我国14个省份和新疆生产建设兵团进行bTB流行病学调查,并采集SICCT或IFN-γ试验阳性牛病料,进行细菌分离鉴定。利用SICCT方法,共计在6,943头牛中检出阳性1,594头,平均个体阳性率为22.96%;共计在185个场户中检出阳性场114个,平均场群阳性率为61.62%。IFN-γ试验共计在8,677头牛中检出阳性1,786头,平均个体阳性率为20.58%;共计在236个场户中检出阳性场150个,平均场群阳性率为63.56%。共计从64.44%（87/135）的bTB阳性牛中分离到细菌,分离株经结核分枝杆菌复合群两级多重PCR鉴定,其中72株为M.bovis,11株为M.avium,4株为其他分枝杆菌。流行病学调查结果显示,我国部分地区bTB阳性率仍呈高流行态势,14个省份和新疆生产建设兵团均有bTB流行。但现场调查发现,PPD或IFN-γ试验阳性牛很少表现咳嗽、呼吸困难和极度消瘦等典型肺结核症状,而且,由于上述原因,在基层出现了对bTB阳性牛扑杀正当性的怀疑及正常检疫难以实施的现象。2.为调查目前规模化奶牛场bTB的表现形式,揭示PPD阳性牛与剖检肺脏病变不吻合的真实原因,并确定其传染源及传播途径,对3个省份8个规模化奶牛场的13,345头奶牛进行SICT、SICCT、IFN-γ试验、PPD点眼反应和ELISA抗体检测5种免疫学综合诊断,剖检后期感染牛并采集病料进行病理组织学检查和病原分离鉴定。结果显示,综合判定后期感染牛752头,剖检151头,有131头（86.75%）眼观可见明显结核病变,其中119头（占90.84%）病变发生在肝脏、脾脏、肠系膜淋巴结、乳房淋巴结等肺外组织器官,仅12头（占9.16%）病变发生在肺脏。HE染色表明151头剖检牛组织切片镜下均可见不同程度的结核病理变化,Ziehl-Neelsen抗酸染色显示26头牛组织切片中可见红染的结核杆菌。并从60.26%（91/151）的剖检阳性牛中分离到细菌,且经qPCR、GeneXpert MTB/RIF和Enigma鉴定均为M.bovis。综合诊断结果表明,8个规模化奶牛场bTB主要表现为肺外结核,病变主要分布在肠系膜淋巴结、肠道、肝脏和脾脏等肺外组织器官,且值得注意的是,71.26%的肺外结核与胃肠道有关。而且现场调查、临床表现、剖检病变、病理组织学检查、病原分离鉴定结果均提示试验牛场肺外结核的传播途径可能是消化道,主要或因牛饮食被M.bovis污染的牛奶或饲草料而感染。3.为验证试验牛场肺外结核的传染源及传播途径,从8个规模化奶牛场共采集54份奶样（其中8份为来自8个牛场的产房混合乳,46份为阳性牛奶样）、54份粪便（其中8份为来自8个牛场粪便处理池的混合粪便样品,46份为阳性牛粪便样品）分别进行qPCR检测和细菌分离培养。qPCR结果显示,8份产房混合乳均为M.bovis核酸阳性,39份阳性牛奶样为M.bovis核酸阳性;8份混合粪便均为M.bovis核酸阳性,34份阳性牛粪便样品为M.bovis核酸阳性。从54份奶样中分离培养出12株M.bovis,但未从粪便中成功分离出M.bovis。结果表明,8个规模化奶牛场肺外结核是经由产房带菌的初乳和常乳以及粪口传播引起的消化道传播所致。4.为研究分离株的致病性,选择代表性分离株（113、105）和阳性对照菌株（M.bovis AN5）进行家兔感染试验。分组并经腹腔注射、口服、滴鼻3种途径感染家兔,8周后剖检,无菌采集各组家兔组织器官进行病理组织学检查和组织匀浆活菌培养。家兔病理组织学变化主要发生在肺脏、肺门淋巴结、肠系膜淋巴结和脾脏,可见典型肉芽肿病变,三层结构清晰,中心干酪样坏死层、上皮样细胞和多核巨细胞构成的特殊肉芽层和淋巴细胞构成的普通肉芽组织层,还可见马蹄样或花环状的郎罕氏巨细胞存在,其他组织镜下未见病变。Z-N抗酸染色在肺脏、肺门淋巴结、肠系膜淋巴结可见红染杆状细菌。实验组家兔剖检病变比阳性对照组家兔剖检病变累及范围更广泛,病变程度更严重,从实验组和阳性对照组家兔体内均可回收到细菌,且实验组CFU高于阳性对照组,表明肺外结核分离株表现出较强的致病性,具有感染牛并在牛群中传播的潜在风险。5.利用24位点MIRU-VNTR基因分型方法对分离株进行基因分型,并对典型菌株进行全基因组测序和系统进化分析。MIRU-VNTR基因分型结果表明,分离株聚类为三个大群,同一地区分离株亲缘关系较近,可能来自相同的进化分枝,且M.bovis具有独特的地理性差异。对10株分离株进行全基因组测序,同源性分析表明10株分离株均为M.bovis,与标准株M.bovis AF2122/97同源性在98.80%99.31%;系统发育分析表明10株分离株分为两簇,分别与M.bovis AF2122/97和M.bovis 30亲缘关系较近。综上所述,这是我国首次对bTB肺外组织器官病变分布进行详细调查,证实经消化道传播的肺外结核在我国多个省份奶牛场呈现高患病率。本研究确定了我国部分省份bTB的流行特征,建立了肺外结核综合诊断策略,并确定了肺外结核分离株的致病能力。为当前行业存在的PPD阳性牛扑杀难的问题提供了有力证据,为大型牧场快速降低bTB阳性率提供了诊断策略和防控指导,为我国bTB流行株的溯源及遗传特征分析提供了数据支持,也为我国制定bTB控制和根除计划提供了决策依据。
张强[3]（2016）在《γ-干扰素检测技术在奶牛养殖场结核病防控中的应用研究》文中研究表明奶牛结核病严重威胁着奶牛养殖业的发展壮大,影响奶牛健康、生长性能以及产奶品质等方面。每年,天津市因奶牛结核病所造成的损失非常庞大,严重影响奶制品的出口。全市每年投入大量经费用于牛结核病的防控,但总不能达到消灭疫病的要求。近年来,随着疫病检测技术的发展和推广运用,用于检测奶牛肺结核的检测技术也逐渐完善。目前,运用于奶牛肺结核疾病检测的常规检测方法为PPD变态反应检测,但这种方法在临床检测中存在一些不足,不但操作繁琐、费时耗力,而且容易出现假阳性结果,结果判定易受人为因素影响。因此,研究和探索新的适合基层推广运用的奶牛结核病检测方法并推广应用具有重要意义。奶牛结核病γ-干扰素检测技术在欧美发达国家已经逐渐运用到奶牛肺结核的检测中,有商品化试剂盒,其在检测奶牛肺结核疾病中具有检测灵敏度高、特异性强、稳定性好的特点,且操作简便,易于基层兽医使用。本文就研究建立一套利用γ-干扰素ELISA方法检测奶牛结核病的方法体系,进行方法评价;运用该方法对天津市奶牛养殖业结核病开展流行病学调查,以北辰区为例开展奶牛养殖场结核病净化技术的研究与示范。取得如下成果:1、建立了适合天津地区奶牛结核病检测的方法体系。2、确定γ-干扰素ELISA检测技术特异性强、灵敏度高、稳定性好、可批量检测,易于在基层推广运用的优点。3、掌握了天津地区的奶牛养殖场结核病流行情况和发病规律。4、形成了奶牛结核病的净化研究方案。
杨显超,吴秀娟,李凯航,王建[4]（2015）在《皮试法与ELISA法在奶牛结核病检测中的对比试验》文中指出通过单纯颈部皮内变态反应（SICT）、比较变态反应（SICCT）检测方法、γ-干扰素ELISA和ELISA 4种方法,同时检测上海2个奶牛场的222头奶牛。结果发现:阳性检出率以颈部皮内变态反应为最高（67.6%）、ELISA（44.1%）和γ-干扰素ELISA居中（31.1%）,比较变态反应最低（13.1%）;单纯的颈部皮内变态反应与2种ELISA的符合率较差,而比较变态反应与2种ELISA具有较好的符合率;在变态反应阴性牛中,仍然检出了部分ELISA阳性牛。由此认为,先以变态反应检疫牛群,再随之实施抗体检测,会更有利于结核病牛场的净化与防制。
王楠,王作友,江希玲,于钦磊,石春军[5]（2012）在《四种不同检测方法在奶牛结核病诊断中应用的比较研究》文中研究表明应用γ干扰素试验、胶体金试纸条对100头奶牛进行试验,采集这100头奶牛的肝素抗凝全血及血清,经全血培养、抗原刺激,用γ干扰素试剂盒检测上清,用胶体金试纸条检测血清。同时应用传统皮内变态反应、欧盟比较皮内变态反应,对这100头奶牛进行检测,3d后观察结果。在100头被检测的奶牛中,传统皮内变态反应检出结核阳性36头,欧盟比较皮内变态反应检测出结核阳性13头,两种γ干扰素试验试剂盒分别检出结核阳性12头和10头,两种胶体金试纸条分别检出结核阳性11头和9头。
王秀琼,李富祥,赵文华,王金萍,杨仕标[6]（2012）在《牛结核病两种活体诊断方法检测结合病原学诊断的研究》文中指出本文报道应用两种活体诊断方法检测牛结核病的试验结果。2010～2011年度,应用PPD皮内变态反应方法分3批次对5156头奶牛和奶水牛实施监测,监测阳性数57头,阳性率1.11%。采集该57头牛抗凝全血,应用γ-干扰素酶联免疫吸附试验进行检测,检出阳性样品3份,阳性率5.26%。对14头第一批PPD皮内变态反应阳性牛进行病理检验和进行细菌分离培养和PCR检测,结果3份样品分离培养呈阳性,其中1份PCR鉴定为结核分枝杆菌,2份为非分枝杆菌。PCR方法检测的14份组织样品中,2份为结核分枝杆菌阳性,1份为牛结核分枝杆菌阳性。结合病理剖检和病原PCR诊断,分析比较PPD皮内变态反应试验和γ-干扰素酶联免疫吸附试验的敏感性和特异性,由于PPD纯度、非特异性反应、结果判定的主观性等因素,导致PPD皮内变态反应监测检出假阳性率较高。
徐贤坤,黄小武,蓝纪,黄胜斌,熊毅,刘棋,韦正吉,黄益泓[7]（2011）在《两种奶牛结核病检测方法的比较研究》文中提出皮内变态反应（TST）曾被作为牛结核病检测的金标准。在本研究中采用常规皮内变态反应（TST）对广西南宁、柳州共计2818头黑白花奶牛进行牛结核病检测,采用抗原特异性IFN-γ试验方法对PPD检测结果为阳性牛、可疑牛以及部分阴性牛进行复检。将抗原特异性IFN-γ试验与TST检测结果相比,其敏感性为0～60%,特异性为80～100%,符合率为54.8～80%。本研究证实单独使用PPD皮内变态反应方法在牛结核病的诊断方面存在非特异性强等缺点,易造成假阳性牛的误杀;用抗原特异性IFN-γ试验对TST试验阳性和可疑牛进行复检可以提高特异性,该方法在临床上有重要应用价值。
邱美珍,周望平,肖兵南,杜丽飞,胡述光,刘毅,陈江[8]（2011）在《诊断抗原的纯化在牛γ-干扰素ELISA法中的应用》文中进行了进一步梳理比较皮内变态反应（TST）、抗酸染色、牛结核ELISA（PPD-ELISA）和γ-干扰素ELISA法（IFN-γ-ELISA）对牛结核的检测结果,并通过比较牛PPD、禽PPD、亲和层析牛PPD（牛PPD’）的IFN-γ-ELISA检测结果,探索诊断抗原的纯化在牛IFN-γ-ELISA法中的应用.结果表明,与抗酸染色相比,IFN-γ-ELISA的敏感性、特异性和符合率都比较高,分别为83.33%（5/6）,98.14%（53/54）,98.33%（58/60）;牛PPD、禽PPD、牛PPD’3种特异性抗原刺激产生IFN-γ释放反应的结果表明,1例抗酸染色阳性的牛,未经亲和层析处理牛PPD的IFN-γ-ELISA检测OD值偏高,判为牛结核阳性,亲和层析纯化牛PPD的IFN-γ-ELISA检测OD值较低,判为牛结核阴性,表明亲和层析处理能排除环境分支杆菌对试验的干扰,IFN-γ-ELISA法有望替代TST法在中国推广使用。
王金果,刘爱林,周向梅,苑方重,尹晓敏,杨建民,杨利峰,赵德明[9]（2010）在《牛结核病诊断方法的研究进展》文中认为牛结核病是由牛分支杆菌、结核分支杆菌、禽分支杆菌等引起的一类慢性消耗性疾病,是牛各种传染病中致死率最高的疾病之一,该病在人畜之间可以相互传染,很难根治,是影响养牛业和全人类健康的重大疾病,因此控制本病的传播和蔓延迫在眉睫。控制牛结核病的主要措施是及时检疫和根除病牛,定期对牛群进行检疫监控。近年来,随着生命科学的发展,进一步将传统细菌检测法、免疫学检测法和分子生物学检测法3种方法相结合,特别是分子水平上科学技术的发展,使牛结核病的诊断方法逐渐得到完善,同时获得了许多牛分支杆菌的特异性抗原及其基因,对于阐明结核分支杆菌和牛分支杆菌的分子进化和遗传变异规律等方面都具有重要的流行病学意义。
王文秀,杨启元,李爱巧,何克明,徐敏,王六合,孙国林,呼西旦,徐志光,刘思国,张喜悦[10]（2010）在《奶牛结核病皮内变态反应与病理剖检对比实验》文中研究指明奶牛结核病是一种人畜共患病,皮内变态反应是检验牛结核病国家规定的检验方法和有效手段,本文阐述了皮内变态反应与病理剖检的相关性和符合率,对确诊结核病阳性牛具有一定的指导作用。
二、提纯结核菌素特异性检验方法的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、提纯结核菌素特异性检验方法的研究（论文提纲范文）
（1）基于RNA-Seq技术的牛结核病分子标志物的筛选和验证（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 牛结核病的概述 |
| 1.2 牛结核病的危害与防控 |
| 1.2.1 牛结核病的危害 |
| 1.2.2 国内外牛结核病的防控现状 |
| 1.3 牛结核病的诊断方法 |
| 1.3.1 临床诊断 |
| 1.3.2 尸检诊断 |
| 1.3.3 组织病理学诊断 |
| 1.3.4 免疫学诊断 |
| 1.3.5 分子生物学诊断 |
| 1.4 牛结核病诊断标志物的研究进展 |
| 1.5 RNA测序技术概况 |
| 1.6 目的与意义 |
| 第二章 不同感染状态结核病牛外周血淋巴细胞转录组学分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要试剂与耗材 |
| 2.1.2 主要仪器与设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 样品制备 |
| 2.2.2 测序文库构建和转录组测序 |
| 2.2.3 高通量测序数据处理及差异表达基因的筛选 |
| 2.2.4 不同感染状态结核病牛差异表达基因分析 |
| 2.2.5 应用qRT-PCR验证转录组数据 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 实验动物的筛选及测序样品的制备 |
| 2.3.2 高通量测序相关质控结果 |
| 2.3.3 差异表达基因的识别 |
| 2.3.4 非刺激条件下不同感染状态结核病牛PBMCs差异表达基因的筛选与分析 |
| 2.3.5 PPD-B刺激条件下不同感染状态结核病牛PBMCs差异表达基因的筛选与分析 |
| 2.4 小结与讨论 |
| 第三章 牛结核病分子标志物的筛选及验证 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 主要试剂与耗材 |
| 3.1.2 主要设备和仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 牛结核病分子标志物的筛选 |
| 3.2.2 牛结核病分子标志物的扩群验证 |
| 3.2.3 统计分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 牛结核病分子标志物的筛选 |
| 3.3.2 牛结核病分子标志物的扩群验证 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 第四章 牛分枝杆菌感染BALB/c鼠模型的建立及分子标志物的验证 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 主要试剂耗材 |
| 4.1.3 主要设备和仪器 |
| 4.1.4 主要试剂的配置 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 菌株的复苏与定量 |
| 4.2.2 感染模型的建立 |
| 4.2.3 样品采集及处理 |
| 4.2.4 脏器载菌量测定 |
| 4.2.5 小鼠脾淋巴细胞分离及体外刺激培养 |
| 4.2.6 脾细胞总RNA提取 |
| 4.2.7 反转录 |
| 4.2.8 荧光定量PCR |
| 4.2.9 小鼠IL-8 ELISA |
| 4.2.10 小鼠CRP ELISA |
| 4.2.11 小鼠C1q ELISA |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 体重及主要脏器系数监测 |
| 4.3.2 主要脏器病变及组织病理学观察 |
| 4.3.3 感染小鼠肺、脾的载菌量 |
| 4.3.4 牛结核病分子标志物验证 |
| 4.4 小结与讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（2）我国部分地区牛结核病调查与牛肺外结核病病原分离鉴定及生物学特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| SUMMARY |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 概述 |
| 2 牛结核病病原学 |
| 2.1 病原 |
| 2.2 基因组学 |
| 2.3 进化关系 |
| 2.4 毒力因子 |
| 2.5 抗分枝杆菌感染的作用机制 |
| 3 牛结核病的流行病学、发病学及其诊断 |
| 3.1 牛结核病的流行病学 |
| 3.1.1 传播途径 |
| 3.1.2 牛分枝杆菌的流行病学特征 |
| 3.1.3 家畜中的牛分枝杆菌 |
| 3.1.4 人源牛分枝杆菌 |
| 3.2 肺结核与肺外结核的发病学 |
| 3.3 牛结核病的诊断 |
| 3.3.1 皮内变态反应 |
| 3.3.2 基于血液的试验方法 |
| 4 国内外防控模式 |
| 4.1 牛结核病的防控现状 |
| 4.2 国外发达国家牛结核病的防控模式 |
| 4.2.1 欧盟等发达国家基本策略和主要措施 |
| 4.2.2 英国的牛结核病防控策略 |
| 4.3 我国牛结核病的防控策略 |
| 第二章 2015-2018年我国部分地区牛结核病流行病学调查 |
| 第一节 2015-2018年我国部分地区牛结核病免疫学检测 |
| 1 材料 |
| 1.1 样品 |
| 1.2 主要试剂耗材 |
| 1.2.1 试剂 |
| 1.2.2 耗材 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 现场问卷调查 |
| 2.2 现场采样调查 |
| 2.2.1 比较皮内变态反应(SICCT) |
| 2.2.2 IFN-γ试验 |
| 3 结果和分析 |
| 3.1 现场调查结果 |
| 3.1.1 检疫情况 |
| 3.1.2 症状和剖检情况 |
| 3.2 SICCT检测结果 |
| 3.3 IFN-γ试验检测结果 |
| 3.4 时间分布 |
| 3.5 区间分布 |
| 3.6 群间分布 |
| 3.7 重点省份bTB流行情况 |
| 3.8 禽分枝杆菌等的感染情况 |
| 4 讨论 |
| 4.1 群发性特征 |
| 4.2 流行率 |
| 4.3 区域分布 |
| 4.4 非特异性干扰 |
| 5 结论 |
| 第二节 牛分枝杆菌的分离鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 病料 |
| 1.2 培养基 |
| 1.2.1 丙酮酸钠培养基 |
| 1.2.2 罗氏培养基 |
| 1.2.3 7H11培养基 |
| 1.2.4 7H9培养基 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 病料的采集 |
| 2.2 病料的处理 |
| 2.3 分枝杆菌的分离培养 |
| 2.4 临床分离株的萋尼氏抗酸染色 |
| 2.5 细菌DNA的提取及浓度测定 |
| 2.6 临床分离株的种属多重PCR鉴定 |
| 2.6.1 引物的合成 |
| 2.6.2 反应体系与程序 |
| 2.6.3 判定标准 |
| 2.7 临床分离株MTBC群内PCR鉴定 |
| 2.7.1 引物合成 |
| 2.7.2 反应体系与程序 |
| 2.7.3 判定标准 |
| 3 结果 |
| 3.1 剖检病变 |
| 3.2 分枝杆菌的分离培养结果 |
| 3.3 临床分离株的萋尼氏抗酸染色观察 |
| 3.4 细菌DNA的提取及其浓度 |
| 3.5 分枝杆菌种属鉴定结果 |
| 3.6 MTBC鉴定结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三章 牛肺外结核的综合诊断与病原分离鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 试剂和培养基 |
| 1.2 耗材 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 试验牛场背景 |
| 2.2 综合诊断策略 |
| 2.2.1 免疫学检测方法 |
| 2.2.2 剖检 |
| 2.2.3 病料的采集 |
| 2.2.4 奶样和粪便的采集 |
| 2.2.5 病理学诊断 |
| 2.2.6 病原分离培养 |
| 2.2.7 分子生物学鉴定 |
| 2.3 针对性防控措施及效果评价 |
| 2.3.1 针对性防控措施 |
| 2.3.2 防控效果评价 |
| 3 结果 |
| 3.1 免疫学综合检测结果 |
| 3.2 剖检结果 |
| 3.3 病理学诊断结果 |
| 3.3.1 HE染色 |
| 3.3.2 Z-N抗酸染色 |
| 3.4 病原分离鉴定结果 |
| 3.4.1 组织病料分离鉴定结果 |
| 3.4.2 奶样和粪便样品分离鉴定结果 |
| 3.5 综合诊断结果 |
| 3.6 防控效果评价 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第四章 牛肺外结核临床分离株致病性研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物及菌株 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 菌株 |
| 1.2 主要试剂耗材 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 动物分组 |
| 2.2 攻毒程序 |
| 2.3 剖检 |
| 2.4 组织病理学观察 |
| 2.5 靶器官组织匀浆的活菌培养 |
| 3 结果 |
| 3.0 实验兔生理状况 |
| 3.1 剖检结果 |
| 3.2 组织病理学结果 |
| 3.2.1 HE染色 |
| 3.2.2 Z-N抗酸染色 |
| 3.3 组织匀浆活菌培养结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第五章 牛肺外结核分离株基因分型与全基因组测序及系统进化分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株 |
| 1.1.1 分型菌株 |
| 1.1.2 测序菌株 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 MIRU-VNTR |
| 2.1.1 引物的设计合成 |
| 2.1.2 反应体系与程序 |
| 2.1.3 聚类分析 |
| 2.1.4 各位点分辨率的计算 |
| 2.2 全基因组测序与分析 |
| 2.2.1 核酸的提取 |
| 2.2.2 全基因组测序 |
| 2.2.3 标准参考序列和数据分析所用的其他MTBC菌株序列的获得 |
| 3 结果 |
| 3.1 MIRU-VNTR基因分型多态性结果 |
| 3.1.1 检测样品结果重复性和准确性 |
| 3.1.2 不同VNTR位点的基因多态性结果 |
| 3.1.3 牛分枝杆菌VNTR位点的等位基因多态性 |
| 3.1.4 MIRU-VNTR聚类分析结果 |
| 3.2 全基因组测序结果 |
| 3.2.1 测序数据评估结果 |
| 3.2.2 全基因组测序数据的初步分析 |
| 3.2.3 基于WGS-SNP的系统发育分析 |
| 3.2.4 全基因组数据的初步比对分析 |
| 3.3 肺结核和肺外结核差异基因研究 |
| 3.3.1 差异基因的比对分析结果 |
| 3.3.2 差异基因的PCR扩增结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 在读期间发表论文和研究成果等 |
| 导师简介 |
（3）γ-干扰素检测技术在奶牛养殖场结核病防控中的应用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 研究目的与意义 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 研究目的 |
| 1.3 研究意义 |
| 第2章 国内外研究现状 |
| 2.1 奶牛结核病概况 |
| 2.2 奶牛结核病的病原学 |
| 2.3 奶牛结核病的流行病学 |
| 2.4 奶牛结核病的诊断技术 |
| 2.4.1 奶牛结核病的PPD变态反应检测技术 |
| 2.4.2 奶牛结核病γ-干扰素检测技术 |
| 2.4.3 奶牛结核病PCR检测技术 |
| 2.5 奶牛结核病净化方法 |
| 第3章 研究内容和方法 |
| 3.1 研究内容 |
| 3.2 研究方法 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 利用γ-干扰素ELISA检测技术检测奶牛结核病方法体系的建立及评价 |
| 1.1 试验材料与试验动物 |
| 1.1.1 试验动物和病原 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.1.3 主要试剂与器材 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 奶牛检测血液的采集及处理 |
| 1.2.2 检测样本全血培养条件的优化 |
| 1.2.3 检测样本全血牛γ-干扰素ELISA技术检测条件的优化 |
| 1.2.4 灵敏度测定 |
| 1.2.5 稳定性评价 |
| 1.2.6 利用γ-干扰素ELISA技术检测奶牛结核病的初步运用 |
| 1.2.7 运用PPD变 态反应检测技术对奶牛结核病进行检测 |
| 1.2.8 运用PCR检测方法对奶牛结核病进行检测 |
| 1.2.9 奶牛结核病γ-干扰素ELISA检测技术与PPD、PCR检测方法的检出率、特异性比较 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 奶牛结核病γ-干扰素检测技术最佳检测条件 |
| 1.3.2 奶牛结核病γ-干扰素检测技术的灵敏度 |
| 1.3.3 奶牛结核病γ-干扰素检测技术的方法稳定性 |
| 1.3.4 奶牛结核病γ-干扰素检测技术与 PPD、PCR 检测技术的比较 |
| 1.4 讨论 |
| 1.4.1 影响γ-干扰素ELISA检测奶牛结核病结果的相关因素分析 |
| 1.4.2 γ-干扰素ELISA检测奶牛结核病的可行性分析 |
| 1.4.3 γ-干扰素ELISA检测奶牛结核病的优劣分析 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 天津地区奶牛结核病的流行病学调查及防控技术的研究 |
| 2.1 试验材料与试验动物 |
| 2.1.1 实验动物和病原 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 主要试剂与器材 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 天津市奶牛养殖场基本情况调查 |
| 2.2.2 PPD 变态反应对全市奶牛养殖场中奶牛结核病检测 |
| 2.2.3 利用γ-干扰素检测技术对全市PPD变态反应检测为结核病阳性或疑似阳性的奶牛进行结核病检测 |
| 2.2.4 以天津市北辰区为例开展奶牛养殖场结核病净化技术的研究与示范 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 奶牛结核病在天津不同区域的流行现状 |
| 2.3.2 奶牛结核病在不同规模养殖场的感染率 |
| 2.3.3 不同阶段的奶牛对奶牛结核病的感染情况 |
| 2.3.4 天津市北辰区某 3 个奶牛养殖场结核病净化结果 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及学习期间的主要研究成果 |
| 致谢 |
（4）皮试法与ELISA法在奶牛结核病检测中的对比试验（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验及采样奶牛场 |
| 1.2 试剂盒和牛型提纯结核菌素 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 牛结核变态反应试验 |
| 1.5 牛结核ELISA试验 |
| 1.5.1 样品收集: |
| 1.5.2 操作步骤: |
| 1.6 γ-干扰素试验 |
| 1.6.1 全血培养: |
| 1.6.2 γ-干扰素ELISA试验: |
| 1.6.3 γ-干扰素试验判定标准: |
| 2 结果 |
| 2.1 变态反应检测结果 |
| 2.2 比较变态反应检测结果 |
| 2.3 γ-干扰素ELISA检测结果 |
| 2.4 ELISA检测结果 |
| 2.5 几种方法符合率的比较 |
| 3 讨论 |
（5）四种不同检测方法在奶牛结核病诊断中应用的比较研究（论文提纲范文）
| 1 材料与实验动物 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验动物 |
| 2 方法 |
| 2.1 牛结核菌素皮内变态反应试验 |
| 2.2 欧盟皮内变态反应比较试验 |
| 2.3 牛结核病干扰素检测试验 |
| 2.4 牛结核分枝杆菌免疫胶体金试验 |
| 2.5 判定标准 |
| 2.5.1 中国国家标准: |
| 2.5.4 牛结核分枝杆菌免疫胶体金试验判定标准: |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
（6）牛结核病两种活体诊断方法检测结合病原学诊断的研究（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 主要试剂 |
| 1.2 试验动物 |
| 1.3 方法 |
| 1.3.1 PPD皮内变态反应试验 |
| 1.3.2 γ-干扰素ELISA检测 |
| 1.3.3 病理剖检 |
| 1.3.4 分离培养 |
| 1.3.5 PCR检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 PPD皮内变态反应试验结果 |
| 2.2 γ-干扰素ELISA检测结果 |
| 2.3 病理检验 |
| 2.4 细菌分离培养结果 |
| 2.5 PCR检测结果 |
| 3 讨论 |
（8）诊断抗原的纯化在牛γ-干扰素ELISA法中的应用（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 诊断抗原、抗体的制备 |
| 1.2.2 牛结核病的检测方法 |
| 1.2.3 结果判定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 兔抗草分支杆菌抗体的偶联率与亲和层析结果 |
| 2.2 4种方法对牛结核病的检测结果 |
| 2.3 4种方法的检测敏感性、特异性和符合率 |
| 2.4 3种抗原刺激的IFN-γ-ELISA检测结果 |
| 3 结论与讨论 |
（10）奶牛结核病皮内变态反应与病理剖检对比实验（论文提纲范文）
| 1 结核病的诊断方法及不足 |
| 1.1 细菌学检查法 |
| 1.2 分子生物学方法 |
| 1.3 免疫学方法 |
| 1.4 病理组织学 |
| 2 结核病牛的流行病学特点和临床症状 |
| 2.1 饲养基本情况和环境 |
| 2.2 流行病学特点 |
| 2.3 结核病阳性牛的临床症状 |
| 3 检疫方法 |
| 3.1 国产牛型提纯结核菌素诊断法 |
| 3.2 进口牛型和禽型提纯结核菌素诊断比较变态反应法 |
| 3.3 实验记录 |
| 4 检疫结果 |
| 4.1 变态反应比较结果 |
| 4.2 病理剖检结果 |
| 5 分析与结论 |
| 5.1 奶牛结核病感染的主要原因 |
| 5.2 不同型的结核分枝杆菌诊断液的对比试验结果 |
| 5.3 PPD实验与剖检变化的符合率 |
| 5.4 皮内变态反应不能全部检测出结核病阳性牛 |
四、提纯结核菌素特异性检验方法的研究（论文参考文献）
- [1]基于RNA-Seq技术的牛结核病分子标志物的筛选和验证[D]. 房立春. 中国农业科学院, 2020
- [2]我国部分地区牛结核病调查与牛肺外结核病病原分离鉴定及生物学特性研究[D]. 许芳. 甘肃农业大学, 2020(01)
- [3]γ-干扰素检测技术在奶牛养殖场结核病防控中的应用研究[D]. 张强. 吉林大学, 2016(09)
- [4]皮试法与ELISA法在奶牛结核病检测中的对比试验[J]. 杨显超,吴秀娟,李凯航,王建. 上海畜牧兽医通讯, 2015(02)
- [5]四种不同检测方法在奶牛结核病诊断中应用的比较研究[J]. 王楠,王作友,江希玲,于钦磊,石春军. 吉林畜牧兽医, 2012(11)
- [6]牛结核病两种活体诊断方法检测结合病原学诊断的研究[J]. 王秀琼,李富祥,赵文华,王金萍,杨仕标. 中国动物保健, 2012(04)
- [7]两种奶牛结核病检测方法的比较研究[A]. 徐贤坤,黄小武,蓝纪,黄胜斌,熊毅,刘棋,韦正吉,黄益泓. 第五届中国畜牧科技论坛论文集, 2011
- [8]诊断抗原的纯化在牛γ-干扰素ELISA法中的应用[J]. 邱美珍,周望平,肖兵南,杜丽飞,胡述光,刘毅,陈江. 湖南农业大学学报(自然科学版), 2011(01)
- [9]牛结核病诊断方法的研究进展[J]. 王金果,刘爱林,周向梅,苑方重,尹晓敏,杨建民,杨利峰,赵德明. 中国畜牧兽医, 2010(07)
- [10]奶牛结核病皮内变态反应与病理剖检对比实验[J]. 王文秀,杨启元,李爱巧,何克明,徐敏,王六合,孙国林,呼西旦,徐志光,刘思国,张喜悦. 草食家畜, 2010(02)