一、鼻咽癌细胞株中Epstein-Barr病毒编码的RNAs的检测（论文文献综述）
蔡隆梅[1]（2015）在《EBV-miR-BART7-3p在鼻咽癌中的功能及分子机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景鼻咽癌是发生于鼻咽上皮的恶性肿瘤,好发于中国华南地区和亚洲东南部。鼻咽癌发病隐匿,恶性程度较高,早期即可出现颈部淋巴结转移,其发生是一个多阶段、多途径、多机制、多遗传变异积累的复杂过程,目前认为主要与EB病毒的感染、遗传易感性及环境因素有关。虽然放疗能有效地控制早期鼻咽癌,但是晚期患者的平均5年生存率仍低于30-40%。更严重的是,由于早期没有显着的症状,临床上超过60%的鼻咽癌患者容易被忽视而发展为晚期阶段。因此,有必要寻找新的有效治疗鼻咽癌的治疗靶点和干预措施。MicroRNAs（miRNAs）是一类内源性的非编码RNAs,主要通过靶向特定基因的3’UTR而抑制基因的转录后翻译。它们作为人类生理机能和疾病发生的重要调节因子,已成为有重要潜能的治疗靶标。许多miRNAs的异常表达与人类疾病包括癌症的发生有关。目前研究表明,一些miRNAs的异常表达与许多肿瘤的发生有关（包括鼻咽癌）。例如miR-184、miR-34b、miR-92a、miR-93、miR-27a、miR-101、miR-497和miR-663等的异常表达与细胞增殖、细胞周期和肿瘤发生等多种细胞反应有关。另外,有研究报道miR-148a、miR-155、miR-377、miR-92a、miR-200c、miR-23a、miR-130b、miR-30a、miR-149 和 miR-93 等 miRNAs参与调控多种肿瘤的转移和EMT,其中只有三个miRNAs被报道与鼻咽癌的EMT 有关。查阅最新文献显示,miR-22、miR-135a、miR-29c、miR-124、miR-142、miR-499、miR-133、miR-103/107 家族、miR-24 和 miR-200a 等 miRNAs 的异常表达与肿瘤的“干性”和耐药性有关,其中只有miR-200a这一个miRNA被报道可以促进鼻咽癌细胞的“干性”。因此,不断深入探究miRNAs在疾病及肿瘤发生发展中的作用及机制,对于找寻疾病治疗的新靶点至关重要。EB病毒（EBV）感染与鼻咽癌发生密切相关,在大部分角化鳞状上皮细胞癌和几乎所有未分化的鳞状细胞癌都有EB病毒的存在。EB病毒作为鼻咽癌的主要发病因素,它可编码25种miRNA前体,其中包括3种BHRF1 miRNAs前体和22种BART miRNAs前体。许多研究逐渐表明,该病毒能积极释放其编码的BART miRNAs从而有效的调节病毒和宿主细胞的功能。许多EB病毒编码的BART miRNAs被报道与病毒的潜伏感染、免疫逃逸、细胞存活、细胞增殖和凋亡有关。例如,在鼻咽癌中EBV-miR-BARTl可影响多个代谢相关基因的表达;EBV-miR-BART2通过抑制病毒DNA聚合酶BALF5的表达而减少EBV的裂解复制;EBV-miR-BART5-5p和miR-BART19-5p可以抑制病毒编码的LMP1蛋白的表达,而EBV-miR-BART22可以减少病毒编码的LMP2A蛋白的表达;EBV-miR-BART15-3p通过抑制凋亡抑制因子BRUCE的表达而促进细胞凋亡;在鼻咽癌中miR-BART3*能靶向肿瘤抑制因子DICE1进而促进细胞的生长和转化。这些研究和发现为鼻咽癌的治疗方案开辟了新的前景,鼓励更多的研究来开发新的以miRNA为靶标的治疗方法。EBV-miR-BART7-3p作为BART-miRNA家族的一员,是鼻咽癌的潜在调控因子之一。已经有两篇文献报道EBV-miR-BART7-3p在鼻咽癌组织和病人血清样本中高表达,并且在体外与鼻咽癌细胞的增殖相关,但是其在鼻咽癌发生发展中潜在的分子机制仍不清楚。在本研究中,我们首先利用in-house高通量miRNAs表达谱芯片检测并筛查出鼻咽癌组织（NPC）和慢性鼻咽炎组织（NP）中差异表达倍数较高的EBV miRANs;同时,通过荧光定量PCR（qPCR）实验发现高表达的EBV-miR-BART7-3p与鼻咽癌患者的T分期（肿瘤大小）、N分期（局域淋巴结转移）和临床分期呈正相关,这揭示EBV-miR-BART7-3p可能在鼻咽癌的发生发展中扮演了某种重要角色。于是我们构建慢病毒载体,感染鼻咽癌细胞,建立稳定过表达EBV-miR-BART7-3p的鼻咽癌细胞株,检测其对鼻咽癌细胞增殖、转移、侵袭和干性等生物学行为的影响;更有意义的是,我们通过查阅文献和生物信息学预测,进一步寻找并确认EBV-miR-BART7-3p调控的宿主靶基因及相关信号通路,探讨其发挥生物学作用的分子机制。基于以上研究,我们还针对性地开展以EBV-miR-BART7-3p为靶标的治疗实验,试图为鼻咽癌治疗的新策略提供理论和实验依据。研究目的1、明确EBV-miR-BART7-3p在鼻咽癌中的生物学功能,为进一步探讨EBV-miR-BART7-3p在鼻咽癌中的作用机制及靶向治疗提供依据。2、明确EBV-miR-BART7-3p靶向调控的宿主基因。3、探究EBV-miR-BART7-3p通过靶向宿主基因及下游信号通路而发挥生物学作用的分子机制。4、以EBV-miR-BART7-3p作为靶标进行体内外治疗实验,探究其能否作为鼻咽癌患者治疗的新靶标。方法与结果第一章 EBV-miR-BART7-3p靶向抑制PTEN的表达进而促进鼻咽癌细胞的转移及EMT方法1、应用miRNAs表达谱芯片技术,检测出差异表达倍数最高的EBV miRNA,qPCR验证这一结果。2、构建慢病毒载体,感染鼻咽癌细胞,建立稳定过表达EBV-miR-BART7-3p的鼻咽癌细胞株（CNE1-BART7-3p 和 5-8F-BART7-3p）。3、通过一系列体外（transwell、boyden小室实验）和体内实验（裸鼠肝包膜注射成瘤实验）检测EBV-miR-BART7-3p对鼻咽癌细胞侵袭及转移的影响。通过形态学观察及western blot、免疫组化（IHC）实验检测EBV-miR-BART7-3p对鼻咽癌细胞EMT的影响。4、通过文献检索及生物信息学预测初步确定EBV-miR-BART7-3p调控的宿主靶基因,利用荧光素梅报告基因实验及western blot、IHC实验进一步确定EBV-miR-BART7-3p调控的宿主靶基因,同时应用qPCR检测EBV-miR-BART7-3p与靶基因在鼻咽癌组织中表达量之间的相关性。5、应用 western blot、IHC、免疫荧光（IFC）确定 EBV-miR-BART7-3p 调控靶基因的下游信号通路,同时利用siRNA靶向沉默鼻咽癌细胞中靶基因的表达及在稳定表达EBV-miR-BART7-3p鼻咽癌细胞中转染靶基因（不含3’UTR）表达载体后检测相关表型及基因功能的变化。6、在EBV阳性的鼻咽癌细胞中,沉默内源性EBV-miR-BART7-3p表达,并进行表型和功能检测。结果1、通过对广东省中山市16例鼻咽癌组织和20例非癌鼻咽癌组织进行miRNAs表达谱芯片分析,发现EBV-miR-BART7-3p差异表达倍数最高。同时在新收集的42例有TNM分期的鼻咽癌标本中通过qPCR验证芯片的结果,发现EBV-miR-BART7-3p不仅高度表达,还与鼻咽癌患者的N分期和临床分期呈正相关。2、为了进一步探究EBV-miR-BART7-3p对鼻咽癌发生发展的作用,我们用订制的携带EBV-miR-BART7-3p的慢病毒载体（上海吉玛公司）感染鼻咽癌细胞CNE1和5-8F,建立稳定过表达EBV-miR-BART7-3p的鼻咽癌细胞株（CNE1-BART7-3p和5-8F-BART7-3p）,同时建立了相应的对照细胞株（CNE1-NC和5-8F-NC）。以鼻咽癌组织为阳性对照,qPCR检测证实CNEl-BART7-3p和5-8F-BART7-3p中EBV-miR-BART7-3p的表达水平与鼻咽癌组织中相当。3、Transwell和boyden小室实验显示,与对照组相比,CNE1-BART7-3p和5-8F-BART7-3p细胞穿膜细胞数更多,说明EBV-miR-BART7-3p能够促进鼻咽癌细胞的转移和侵袭。沉默EBV-miR-BART7-3p的表达则转移和侵袭能力下降。同时,裸鼠肝包膜注射成瘤实验也显示,与对照组相比,实验组中肝内和淋巴结转移的数量比对照组更多。4、Western blot结果显示,EMT相关上皮标志物E-cadherin在实验组表达下调,而间充质标志物Vimentin和Fibronectin表达上调;同时观察到实验组细胞发生了上皮间充质转化,即细胞间隙变大,形态由椭圆形变为长梭形。对体内实验中固定的肿瘤组织进行免疫组化实验检测EMT相关标志物的表达,结果显示 E-cadherin 表达下调,而 Vimentin、Fibronectin 和 FOXM1 表达上调。5、文献调研和生物信息学预测结果显示,EBV-miR-BART7-3p与肿瘤抑制基因PTEN的3’ UTR能很好的匹配。荧光素酶报告基因实验结果显示PTEN wild-type 3’ UTR与EBV-miR-BART7-3p mimics共转染后,荧光素酶活性降低,差异有统计学意义;Western blot及IHC结果显示PTEN在实验组表达下调;qPCR实验显示与NP组织标本相比,PTEN在NPC组织标本中表达显着下调,并且与EBV-miR-BART7-3p 的表达呈负相关（r=-0.3823,P=0.0125）。6、Western blot显示EBV-miR-BART7-3p可以通过靶向PTEN的表达而激活PI3K/Akt/GSK-3 β 信号通路,同时 IHC、IFC 结果显示 EBV-miR-BART7-3p 可以促进转录因子Snail和β-catenin的核聚集从而促进鼻咽癌细胞的转移和侵袭。用siRNA靶向沉默鼻咽癌细胞中PTEN的表达后,transwell和boyden小室实验结果显示鼻咽癌细胞的转移及侵袭能力增强,western blot实验结果显示信号通路也发生相应的变化。稳定表达EBV-miR-BART7-3p鼻咽癌细胞中转染PTEN（不含3’ UTR）表达载体后鼻咽癌细胞的转移及侵袭能力减低,鼻咽癌细胞的EMT表型改变部分逆转,并下调PI3K/Akt/GSK-3 β信号通路。7、沉默 HONE1-EBV 细胞中 EBV-miR-BART7-3p 表达后,transwell 和 boyden 小室实验结果显示鼻咽癌细胞的转移及侵袭能力下降,PI3K/Akt/GSK-3 β信号通路下调。在HONE1-EBV细胞中转染PTEN（不含3’UTR）表达载体后,细胞的转移及侵袭能力减低。第二章EBV-miR-BART7-3p通过促进转录因子c-Myc和c-Jun的表达进而促进鼻咽癌细胞的生长及增殖方法1、通过MTT、平板克隆形成实验、细胞周期实验及小鼠皮下成瘤实验检测EBV-miR-BART7-3p对鼻咽癌细胞生长及增殖能力的影响。2、通过western blot、qPCR实验进一步确认EBV-miR-BART7-3p通过调控靶基因而影响下游信号通路的分子机制。同时采用siRNA靶向沉默PTEN的表达,检测鼻咽癌细胞功能及机制的变化。结果1、MTT结果显示,与对照组细胞相比,CNE1-BART7-3p和5-8F-BART7-3p生长速度更快,稳定细胞株中转染inhibitor之后,则生长速度下降;平板克隆形成实验结果显示实验组克隆形成数量更多,转染inhibitor之后,则克隆形成数量减少;细胞周期实验结果显示实验组处于G1期的细胞数量减少,而处于S期及G2期的细胞数量增多,转染inhibitor之后则结果相反。2、小鼠皮下成瘤实验结果显示,注射5-8F-BART7-3p细胞的裸鼠要比注射对照组细胞的裸鼠的肿瘤生长更快,体积更大。IHC结果显示,实验组肿瘤的细胞增殖指标Ki67和PCNA表达增强。3、Western blot 结果显示,EBV-miR-BART7-3p 通过上调 PTEN/PI3K/Akt 信号通路而促进转录因子c-Myc和c-Jun的表达;qPCR结果显示实验组中细胞周期相关蛋白表达上调,细胞周期抑制因子表达下调;在稳转细胞株中抑制EBV-miR-BART7-3p表达后则结果相反。4、用siRNA靶向沉默鼻咽癌细胞中PTEN的表达后,与对照组相比:MTT显示细胞生长速度更快;平板克隆形成实验显示克隆形成数量更多;细胞周期结果显示,处于G1期的细胞数量减少,而处于S期及G2期的细胞数量增多;Western blot结果也显示,PTEN/PI3K/Akt/c-Myc和c-Jun信号通路表达上调。第三章EBV-miR-BART7-3p靶向抑制Smad7的表达进而促进鼻咽癌细胞的“干性”及降低化疗药物敏感性方法1、利用病毒感染的方法构建新的稳定过表达EBV-miR-BART7-3p的鼻咽癌细胞株（CNE2-BART7-3p和5-8F-BART7-3p）,用NPC组织做阳性对照,qPCR实验检测转染效率。2、通过一系列体外（肿瘤球的培养、侧群细胞的分选、western blot、qPCR）和体内实验（裸鼠皮下成瘤率实验）检测EBV-miR-BART7-3p对鼻咽癌细胞“干性”的影响。3、利用药物敏感性实验检测CNE2-BART7-3p和5-8F-BART7-3p及其对照组细胞对临床一线化疗药物（顺铂、氟尿嘧啶、紫杉醇）的敏感性,同时在EBV 阳性的鼻咽癌细胞中（HONE1-EBV）沉默EBV-miR-BART7-3p的表达后,考察其对以上三个化疗药物的敏感性。应用腹腔注射化疗药物的方法治疗皮下成瘤的裸鼠,考察其治疗效果。4、芯片分析、调研文献及生物信息学预测确定EBV-miR-BART7-3p是否调控其他宿主靶基因,再利用荧光素酶报告基因实验及western blot、qPCR实验进一步确定靶基因。5、应用 western blot、IHC、IFC 进一步确定 EBV-miR-BART7-3p 调控的相关信号通路,同时在EBV 阳性细胞中进一步验证。采用siRNA靶向沉默靶基因的表达及稳定表达EBV-miR-BART7-3p鼻咽癌细胞中转染靶基因（不含3’UTR）表达载体,分析相关机制、表型及功能的变化。结果1、利用病毒感染的方法建立一个新的稳转细胞株（CNE2-BART7-3p）,以NPC组织为阳性对照,qPCR实验验证CNE2-BART7-3p中EBV-miR-BART7-3p的表达量与NPC组织中相当。2、与对照组细胞相比,CNE2-BART7-3p和5-8F-BART7-3p细胞株中:肿瘤球培养实验结果显示肿瘤球的成球个数及大小均增加;侧群实验显示侧群细胞的数量增多（HONE1-EBV及HK1-EBV细胞中转染inhibitor之后,则侧群细胞的数量减少）;Western blot 及 qPCR 表明干性相关标志物（ABCG2、Oct4、Nanog、Sox-2）表达上调。裸鼠皮下成瘤率实验显示,将不同数量级的CNE2-NC和CNE2-BART7-3p细胞注射进裸鼠皮下,CNE2-BART7-3p细胞组的肿瘤形成率更高,肿瘤体积更大。3、药物敏感性细胞实验显示:与对照组相比,CNE2-BART7-3p和5-8F-BART7-3p细胞株的死亡细胞数量更少,细胞生长更快;在HONE1-EBV细胞中沉默EBV-miR-BART7-3p的表达后,则死亡细胞数量更多,细胞生长更慢。体内实验显示,裸鼠腹腔注射顺铂后,与对照组相比,CNE2-BART7-3p细胞组的肿瘤生长仍更迅速,体积更大。4、生物信息学及荧光素酶报告实验确定EBV-miR-BART7-3p调控的的另一宿主靶基因Smad7;Western blot和qPCR结果显示,EBV-miR-BART7-3p过表达细胞中Smad7的表达下调;qPCR验证发现,与NP组织相比,NPC组织标本中的Smad7表达下调,并且与EBV-miR-BART7-3p的表达呈负相关（r=-0.7229,p<0.001）。5、Western blot显示EBV-miR-BART7-3p可以通过抑制Smad7的表达进而激活TGF-β信号通路;IFC结果证实EBV-miR-BART7-3p可以促进p-Smad2和p-smad3的入核而促进鼻咽癌细胞的干性。6、用siRNA靶向沉默Smad7的表达后,肿瘤球实验显示细胞的成球能力增强;Western blot实验显示信号通路也发生相应的变化。在CNE2-BART7-3p和5-8F-BART7-3p细胞中转染Smad7（不含3’ UTR）表达载体,即恢复Smad7的表达后,则细胞的成球能力下降,并下调TGF-β信号通路。第四章利用纳米技术构建EBV-miR-BART7-3p的反义核苷酸从而抑制EBV阳性的鼻咽癌细胞的生长方法1、应用纳米技术层层包裹的方法构建携带EBV-miR-BART7-3p反义核苷酸（带有绿色荧光）的纳米金颗粒（nano-anti-miR）,同时利用透射电镜及动态光散射检测其形态、稳定性及电位。2、利用激光共聚焦显微镜观察纳米金颗粒的转染效率,并利用qPCR实验进一步验证。3、在EBV 阳性的鼻咽癌细胞中转染携带EBV-miR-BART7-3p反义核苷酸的纳米金颗粒,通过一系列体外实验（qPCR、MTT、western blot）检测细胞生长和增殖能力的变化。4、用EBV 阳性的鼻咽癌细胞进行裸鼠皮下注射成瘤后,通过瘤内注射的方法将携带EBV-miR-BART7-3p反义核苷酸的纳米金颗粒注射进裸鼠肿瘤内,观察肿瘤生长变化,从而考察其治疗效果。结果1、用层层包裹法构建好带绿色荧光的携带EBV-miR-BART7-3p反义核苷酸的纳米金颗粒后,动态光散射（DLS）检测显示大部分粒子的粒径大小均为20-30nm之间;Zeta电位测定表明构建好的gold-PEI的电位值大约为+20mV;透射电镜（TEM）显示nano-anti-miR的形态为类圆形,大小均一,分布均匀。2、激光共聚焦显微镜显示绿色荧光较强,表明携带EBV-miR-BART7-3p反义核苷酸的纳米金颗粒的转染成功,效率较高。qPCR实验证实,转染nano-anti-miR后,HONE1-EBV细胞中EBV-miR-BART7-3p表达显着下调。3、在HONE1-EBV细胞中转染nano-anti-miR后,MTT实验显示细胞生长速度减弱;Western blot结果显示,PTEN/PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达下调。4、将HONE1-EBV细胞注射进裸鼠皮下成瘤后,每隔三天瘤内注射nano-anti-miR,肿瘤生长变慢,体积及重量变小。取肿瘤组织做western blot分析,结果显示PTEN/PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达下调。结论1、EBV-miR-BART7-3p在鼻咽癌组织中显着高表达,并且与患者的TNM分期和临床分期呈正相关。2、EBV-miR-BART7-3p通过靶向PTEN及调节下游PI3K/Akt/GSK-3 β信号通路进而促进鼻咽癌细胞的转移、侵袭及EMT;3、EBV-miR-BART7-3p通过靶向PTEN及促进转录因子c-Myc和c-Jun的表达影响细胞周期进程从而促进鼻咽癌细胞生的长及增殖。4、EBV-miR-BART7-3p通过靶向抑制Smad7表达及调节下游TGF-β信号通路进而促进鼻咽癌细胞干性,并降低鼻咽癌细胞对化疗药物的敏感性。5、利用纳米技术构建的携带EBV-miR-BART7-3p反义核苷酸的纳米金颗粒可以在体外及体内抑制EBV阳性的鼻咽癌细胞的生长。
许元基[2]（2017）在《EBV miR-BART13参与鼻咽癌免疫逃逸和侵袭转移的机制研究》文中研究说明【目的】鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma,NPC）是东南亚和我国南方地区高发的癌症之一,放疗为其治疗首选。目前,早期NPC 5年生存率可达95%以上,由于NPC早期症状隐匿,75%以上的初诊患者被确诊为晚期,而局部晚期NPC 5年总生存率只有78.480%,且有2030%患者发生局部治疗失败或远处转移。因此,研究NPC的发病机制,探索理想的肿瘤标志物用以早期诊断NPC具有重要意义。miRNAs在癌症中的表达失调,已逐渐成为癌症诊断的重要标志。NPC和EBV感染联系紧密,EBV在NPC细胞中仅表达少数病毒蛋白,但大量表达BARTs miRNA。本课题组前期研究发现miR-BART13在C666-1细胞中高表达,并可分泌到细胞外;miR-BART13在NPC患者的血浆中特异高表达,其表达水平与其N分期、临床分期显着正相关,且在放疗完成时降至接近0。因此,血浆miR-BART13有可能作为NPC的早期诊断、疗效评估及预后判断指标,进一步研究miR-BART13在NPC发生发展中的分子机制,可为NPC肿瘤标志物和治疗新靶点的应用研究提供理论依据。基于此,本研究主要从细胞水平初步探讨miR-BART13对NPC细胞的免疫逃逸及侵袭转移的影响及其可能的作用机制。【材料和方法】1.将LV-miR-BART13慢病毒感染不含EBV的NPC细胞株CNE-1或将LV-miR-BART13 sponge慢病毒感染含有EBV的NPC细胞株C666-1后,使CNE-1稳定过表达miR-BART13或C666-1细胞稳定下调miR-BART13,分别与NK细胞共培养4h,通过流式细胞术和LDH检测NK细胞对各靶细胞的杀伤活性,用ELISA法和流式细胞术分别检测各靶细胞诱导NK细胞分泌IFN-γ和表达CD107a的能力。2.利用双荧光素酶基因报告系统、RT-qPCR、Western Blot及流式细胞术检测miR-BART13对ULBP4的调控作用。利用RT-qPCR和免疫组化检测ULBP4在NPC和正常鼻咽黏膜组织的mRNA和蛋白表达,分析111例NPC患者的ULBP4蛋白表达高低与患者临床特点及预后的相关性;利用LV-ULBP4慢病毒分别感染5-8F、C666-1细胞后,LDH检测NPC细胞过表达ULBP4对NK细胞杀伤功能的影响。将LV-ULBP4慢病毒感染CNE-1-BART13细胞或将LV-si-ULBP4慢病毒感染C666-1-BART13 sponge细胞,分别回复ULBP4表达,与NK细胞共培养4h,通过流式细胞术检测NK细胞对各靶细胞的杀伤活性,用ELISA和流式细胞术分别检测各靶细胞诱导NK细胞分泌IFN-γ和表达CD107a的能力。3.利用细胞划痕、Transwell迁移及Transwell侵袭实验检测CNE-1稳定过表达miR-BART13或C666-1稳定下调miR-BART13后对NPC细胞迁移和侵袭能力的影响;通过细胞形态学变化观察miR-BART13表达对NPC细胞EMT的影响;通过Western Blot检测miR-BART13表达对NPC细胞侵袭转移和EMT相关分子蛋白的影响。4.利用生物信息学软件预测结合细胞蛋白质谱检测行交叉分析,探讨miR-BART13可能直接调控的且与转移密切相关的靶基因,并对可能靶基因进行细胞水平上的RT-qPCR和Western Blot检测。Western Blot检测miR-BART13过表达或下调对可能靶基因相关的NPC转移通路蛋白的影响。【结果】1.CNE-1细胞稳定过表达miR-BART13后和NK细胞共培养4h后,与对照组比较,效靶比10:1时流式检测示NK细胞对其杀伤率降低,ELISA法和流式检测示其诱导NK细胞分泌IFN-γ和表达CD107a能力下降,不同效靶比（10:1,20:1,40:1）时LDH检测示其对NK细胞杀伤的敏感性均降低。C666-1细胞稳定下调miR-BART13后和NK细胞共培养4h后,与对照组比较,其结果与上述相反。2.通过双荧光素酶基因报告系统、RT-qPCR、Western Blot及流式检测表明ULBP4为miR-BART13直接下调的靶点。RT-qPCR和免疫组化分析ULBP4 mRNA和蛋白水平在鼻咽癌组织中较低表达,患者ULBP4蛋白表达水平与临床特点无明显相关性,但ULBP4低表达是潜在影响患者总生存（OS）、无瘤生存（DFS）及无远处转移生存（DMFS）的独立预后因素;采用3种效靶比（10:1,20:1,40:1）时,LDH检测示5-8F和C666-1细胞过表达ULBP4后,均可增强NK细胞的杀伤活性。进一步行“Rescue”实验,即CNE-1-BART13细胞过表达ULBP4后与NK细胞共培养4h后,与对照组比,效靶比10:1时流式检测示NK细胞对其杀伤率增强,其诱导NK细胞分泌IFN-γ和表达CD107a的能力增强;C666-1-BART13sponge细胞上敲降ULBP4后与NK细胞共培养4h后,与对照组比,其结果与上述相反。3.CNE-1细胞过表达miR-BART13后,表现为迁移和侵袭能力增强,MMP9蛋白表达上调,TIMP2蛋白表达下调;形态纤长,E-cadherin蛋白表达降低,N-cadherin、Vimentin、β-catenin、ZEB1蛋白表达上升。然而,C666-1下调miR-BART13后,表现为与上述相反的变化,形态类椭圆。4.通过交叉分析,结果显示NKIRAS2可能为miR-BART13直接调控的转移靶点。C666-1细胞下调miR-BART13后,NKIRAS2的mRNA和蛋白水平表达上调。进一步分析miR-BART13对NF-κB信号通路的影响,C666-1细胞下调miR-BART13后,表现为IκBα、IκBβ蛋白表达上调,磷酸化NF-κB（p65）及细胞核NF-κB（p65）蛋白表达降低。然而,CNE-1细胞过表达miR-BART13后,表现为与上述相反的变化。【结论】1、miR-BART13通过下调ULBP4的表达促使NPC细胞逃避NK细胞的杀伤。2、NPC组织中的ULBP4 mRNA和蛋白水平为较低表达,ULBP4低表达是潜在影响NPC患者OS、DFS及DMFS的独立预后因素。3、miR-BART13通过活化NF-κB信号通路促进NPC细胞的迁移、侵袭和EMT进展。
周琳[3]（2017）在《EBV-miR-BART7-3p参与鼻咽癌免疫逃逸的初步机制探讨》文中研究表明背景与目的:鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma,NPC）好发于中国南方地区和东南亚国家。放射治疗是早期和局部晚期鼻咽癌的主要治疗方式。近年来随着放疗技术的进步,以及联合使用化疗和分子靶向治疗等治疗,鼻咽癌的生存率显着提高。然而仍有大约20%的鼻咽癌患者由于局部复发和远处转移而导致治疗失败。研究表明EB病毒感染与鼻咽癌的发生发展密切相关。EBV在鼻咽癌中可编码44种成熟的BARTS mi RNA,其中EBV-mi R-BART7-3p在鼻咽癌中表达上调程度最突出,说明其在鼻咽癌发生发展中可能发挥着重要的作用。已有研究表明EBV-mi R-BART7-3p可促进鼻咽癌细胞增殖、侵袭和转移。肿瘤细胞可通过多因素多机制逃避宿主免疫系统的监视攻击,进而促进肿瘤细胞侵袭、转移,也可能是肿瘤产生治疗抵抗和复发的原因。EBV-mi R-BART7-3p在鼻咽癌细胞免疫逃逸这一过程中是否发挥作用目前尚未见文献报道。本研究旨在探讨EBV-mi R-BART7-3p在鼻咽癌免疫逃逸中的作用及其机制,为鼻咽癌的诊断与治疗提供新的靶点奠定实验和理论基础。方法:首先利用Real-time PCR技术检测19例正常人鼻咽黏膜组织（NP）及23例人鼻咽癌组织EBV-mi R-BART7-3p的差异表达。然后在鼻咽癌细胞系CNE1中稳定过表达EBV-mi R-BART7-3p。Ficoll法分离健康志愿者外周血单个核细胞,并联合使用“IL-2+IL-12+IL-15+IL-18”细胞因子扩增NK细胞,利用磁珠分选系统分选和纯化NK细胞。通过ELISA法及流式细胞分析技术检测,比较EBV-mi R-BART7-3p过表达CNE1细胞及其对照组诱导NK细胞释放IFNγ和表达CD107a的能力。LDH释放法评估NK细胞对EBV-mi R-BART7-3p过表达CNE1细胞及其对照组的杀伤率。综合应用targetscan及mi Randa软件,预测EBV-mi R-BART7-3p可能作用于ULBP4 m RNA的3’UTR序列。并利用荧光素酶报告载体实验验证EBV-mi R-BART7-3p以3’UTR依赖的方式靶向作用于ULBP4。通过real-time PCR、Western blot和抗体标记流式细胞分析技术检测鼻咽癌细胞CNE1中EBV-mi R-BART7-3p过表达后靶基因m RNA和蛋白水平的表达变化,Real-time PCR检测人鼻咽癌组织和正常鼻咽组织中ULBP4 m RNA的差异表达,采用Real-time PCR和Western blot技术检测4种鼻咽癌细胞系中ULBP4表达情况,进一步验证EBV-mi R-BART7-3p对靶基因ULBP4的调控作用。通过Rescue实验进一步验证EBV-mi R-BART7-3p通过调控ULBP4的表达参与鼻咽癌免疫逃逸。结果:Real-time PCR结果显示,EBV-mi R-BART7-3p在NPC组织中的表达水平明显高于NP组织。在鼻咽癌细胞CNE1中过表达EBV-mi R-BART7-3p后,对NK细胞的杀伤敏感性降低。生物信息学分析发现ULBP4为EBV-mi R-BART7-3p的靶基因。荧光素酶报告载体实验表明,EBV-mi R-BART7-3p可以直接结合ULBP4 m RNA的3’UTR,real-time PCR及Western blot分析表明,EBV-mi R-BART7-3p可下调ULBP4 m RNA,进而使ULBP4蛋白表达下调。而且在NPC组织中ULBP4 m RNA明显高于NP组织,ULBP4在EBV阴性的鼻咽癌细胞株中表达均高于EBV阳性的鼻咽癌细胞株。在CNE1-BART7细胞中上调ULBP4表达,能够部分挽回EBV-mi R-BART7-3p过表达鼻咽癌细胞对NK细胞的杀伤敏感性。Recuse实验从另一方面证实了在鼻咽癌中ULBP4确实是EBV-mi R-BART7-3p的靶基因。结论:鼻咽癌组织中EBV-mi R-BART7-3p表达水平明显高于正常鼻咽黏膜组织,EBV-mi R-BART7-3p过表达鼻咽癌细胞对NK细胞杀伤敏感性降低。EBV-mi R-BART7-3p可通过3’UTR依赖的方式靶向作用于ULBP4,使ULBP4表达下调。鼻咽癌细胞通过上调EBV-mi R-BART7-3p来下调ULBP4的表达,进而逃避宿主免疫系统的识别,这可能是促进鼻咽癌发生发展的一个途径。这一通路可为进一步探索鼻咽癌的诊断与治疗提供潜在的靶点。
刘康[4]（2019）在《miR-34a-5p靶向调控NOTCH1对鼻咽癌生物学功能的影响及机制研究》文中研究指明第一部分 miR-34a-5p在鼻咽癌组织中的表达及与鼻咽癌患者预后间的关系目的:探讨和分析miR-34a-5p在鼻咽癌组织的表达情况及与鼻.咽癌患者诊断、预后间可能的关系。方法:收集于2010年3月至2012年5月在广西医科大学第一附属医院确诊为鼻咽癌及鼻咽部炎症患者的病理蜡块组织,鼻咽癌患者105例（鼻咽癌组）,鼻咽部炎症患者30例（非肿瘤组）。对鼻咽癌组随访时间为13～60月,中位随访时间为47个月。采用qRT-PCR检测鼻咽癌组、非肿瘤组患者组织中miR-34a-5p的基因表达,对鼻咽癌组和非肿瘤组做ROC曲线,并对鼻咽癌组患者生存资料进行Kaplan-Meier分析。结果:（1）鼻咽癌组患者组织中miR-34a-5p的基因表达水平低于非肿瘤组（P<0.001）,差异有统计学意义。（2）鼻咽癌组和非肿瘤组ROC曲线结果 AUC=0.7894,95%CI=0.6968-0.8821,说明miR-34a-5p有较好的诊断效能。（3）Kaplan-Meier分析结果表明,miR-34a-5p低表达鼻咽癌患者生存时间较miR-34a-5p高表达鼻咽癌患者生存时间降低（P<0.05）。结论:miR-34a-5p在鼻咽癌患者组织中低表达。miR-34a-5p有成为诊断及预测鼻咽癌患者预后的肿瘤标志物的潜在可能。第二部分 miR-34a-5p在体外对鼻咽癌细胞生物学功能的影响目的:通过体外细胞实验研究探讨miR-34a-5p对鼻咽癌细胞生物学功能的影响。方法:采用荧光定量qRT-PCR法检测C666-1、CNE1中的miR-34a-5p表达情况;采用慢病毒包装的miR-34a-5p、PCDH感染C666-1、CNE1,将感染后细胞分为CNE1 PCDH对照组（A组）、CNE1 miR-34a-5p感染组（B 组）、C666-1 PCDH 对照组（C 组）、C666-1 miR-34a-5p 感染组（D组）,qRT-PCR法检测上述细胞中miR-34a-5p表达;CCK8法检测各组细胞增殖率,细胞集落形成实验检测各组细胞克隆形成能力;细胞侵袭实验（Transwell法）检测各组细胞侵袭能力;细胞迁移实验检测各组细胞迁移能力;流式细胞术检测各组细胞凋亡率。结果:（1）鼻咽癌细胞株C666-1、CNE1中的miR-34a-5p呈低表达。（2）miR-34a-5p感染组（B组和D组）的miR-34a-5p的基因表达较C666-1、CNE1细胞表达高,差异有统计学意义（P<0.05）。（3）B组和D组的细胞增殖率、细胞克隆形成能力、细胞侵袭能力、细胞迁移能力较A组和C组下降,差异有统计学意义。（4）B组和D组的细胞凋亡率较A组和C组升高,差异有统计学意义。结论:miR-34a-5p表达上升可以促进鼻咽癌细胞凋亡,抑制鼻咽癌细胞的增殖、生长、克隆形成和侵袭能力,提示miR-34a-5p在鼻咽癌细胞中可能是一种起重要作用的抑癌因子。第三部分 miR-34a-5p在体内对鼻咽癌细胞裸鼠移植瘤生长的影响目的:探讨miR-34a-5p在体内对鼻咽癌细胞裸鼠移植瘤生长的影响。方法:采用慢病毒包装的miR-34a-5p、PCDH感染C666-1,裸鼠随机分为 C666-1 miR-34a-5p 感染组（5 只）、C666-1 PCDH 对照组（5 只）,将感染后细胞悬液注射到裸鼠左腋皮下,构建裸鼠鼻咽癌移植瘤模型。结果:与C666-1 PCDH对照组比较,C666-1 miR-34a-5p转染组裸鼠移植瘤的重量和体积减少,差异有统计学意义。结论:miR-34a-5p高表达可以抑制裸鼠鼻咽癌细胞移植瘤的生长,提示miR-34a-5p在鼻咽癌细胞裸鼠移植瘤中可能是一种起重要作用的抑癌因子。第四部分 miR-34a-5p靶基因预测及生物信息学分析目的:通过miRNA数据库来预测miR-34a-5p潜在靶基因及信号通路。方法:通过 miRanda、miRTarBase、miRDB 和 TargetScan 网站分别预测miR-34a-5p靶基因,并将每个网站预测到的靶基因取交集。对交集部分的靶基因进行GO和KEGG富集分析,得出可能参与的细胞过程、细胞组分、分子功能及潜在的调控通路。结果:GO分析结果中,Notch信号通路、细胞免疫、凋亡、细胞增殖、有丝分裂、DNA复制等被富集。而KEGG分析也富集到Notch signaling pathway、miRNAs in cancer等信号通路。通过靶基因预测网站查询到miR-34a-5p与NOTCH1有结合位点。结论:通过生物信息学的方法推测出NOTCH1基因的3’UTR含有预测的miR-34a-5p的结合位点。提示miR-34a-5p靶基因很可能是NOTCH1,并通过NOTCH信号通路来调控细胞。第五部分 miR-34a-5p靶向调控NOTCH1对鼻咽癌抑癌作用的分子机制探讨目的:探讨miR-34a-5p靶向调控NOTCH1对鼻咽癌抑癌作用的分子机制。方法:采用慢病毒包装的miR-34a-5p、PCDH感染C666-1、CNE1,将感染后细胞分为CNE1 PCDH对照组（A组）、CNE1 miR-34a-5p感染组（B 组）、C666-1 PCDH 对照组（C 组）、C666-1 miR-34a-5p 感染组（D组）,采用qRT-PCR法检测NOTCH 1基因表达,采用western blot检测NOTCH1、Hes-1蛋白表达;采用慢病毒包装的miR-34a-5p、PCDH感染C666-1,裸鼠随机分为C666-1 miR-34a-5p感染组、C666-1 PCDH对照组,将感染后细胞悬液注射到裸鼠左腋皮下,构建裸鼠鼻咽癌移植瘤模型。结果:（1）与A组和C组（对照组）相比,B组和D组（miR-34a-5p感染组）的NOTCH1基因表达和NOTCH1、Hes-1蛋白表达水平明显降低,差异有统计学意义。（2）与C666-1 PCDH裸鼠对照组相比,C666-1 miR-34a-5p组的裸鼠的NOTCH1基因和NOTCH1、Hes-1蛋白水平显着降低,差异具有统计学意义。（3）荧光素酶报告实验结果说明,NOTCH1是miR-34a-5p的一个靶基因。而且当miR-34a-5p表达量上升时,NOTCH 1的表达会相应降低。结论:miR-34a-5p抑制鼻咽癌生长的主要分子机制是降低了靶基因Notch1的表达,并可能影响NOTCH通路下游基因。
郑小辉[5]（2020）在《鼻咽部EB病毒核酸标志物检测在鼻咽癌分子诊断中的应用研究》文中认为目的:鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma,NPC）是一种高侵袭性、高转移性的恶性肿瘤,在中国南方和东南亚地区广泛流行。临床上鼻咽癌的早诊早治成为提高患者生存率、改善预后的关键突破口。寻找和建立简单可靠的生物学标志物应用于高发区鼻咽癌的早期诊断和筛查是亟待解决的重要问题。已有充分的研究表明,EB病毒（Epstein-barr virus,EBV）感染在鼻咽癌的发病中扮演着非常重要的角色,鼻咽刷取样结合EB病毒核酸标志物检测可能会为高发区鼻咽癌的诊断和筛查提供新的研究思路。我们开展该项研究的目的主要有:（1）探讨鼻咽刷取样结合EBV DNA检测对中国华南区高发的鼻咽癌是否具有较好的诊断应用价值。（2）明确鼻咽刷样本中EBV的产生来源,以确定是否是肿瘤细胞来源反应鼻咽癌的发生,为鼻咽部EB病毒核酸标志物的发掘和利用提供清晰的理论基础。（3）发掘适用于辅助鼻咽癌诊断的核酸标志物,尤其适用于在高发现场不依赖临床医生和医疗设备的盲刷取样条件下的标志物,以利于在高发现场人群筛查中的应用。方法:本项研究以鼻咽癌作为研究疾病模型,通过与地处中国华南地区鼻咽癌高发区的中山大学肿瘤防治中心人员合作开展进行,便于充分利用当地丰富的病例资源。（1）首先招募了129例的鼻咽癌患者,116例的对照受试者,58例接受治疗后的复查患者（训练集人群）,对每例受试者通过已建立的鼻咽刷取样体系刷取鼻咽部样本,对鼻咽刷样本中EBV DNA load进行q-PCR检测,对配对血液样本中的EBV VCA-IgA抗体滴度和EBV DNA load分别进行免疫酶法和q-PCR定量检测,评估鼻咽刷EBV DNA load的诊断价值。（2）进一步对上述训练集人群刷取的鼻咽刷样本,同时提取了样本中的总DNA和RNA,对获得鼻咽刷样本中的EBV DNA进行了比较PCR实验,即同时检测EBV基因组中EBNA1基因的99bp和213bp的片段,以判断DNA是否是凋亡裂解的DNA片段;对获得的RNA中EBV转录的六个潜伏期基因（包括EBER1,BART,LMP1,LMP2A,EBNA1和EBNA2）,五个裂解期基因（包括立早期ZEBRA和RTA,早期基因PK和TK以及晚期基因VCA-p18）以及转录的四个Bart miRNAs（mir-bart1-5p,mir-bart5,mir-bart16,mir-bart17-5p）的转录表达进行了q-PCR检测,与EBV DNA load进行了相关性分析,并与49例活检组织（包括36例鼻咽癌和13例黏膜炎症）中这11个EBV mRNA和4个miRNA的表达进行了比较研究;对鼻咽刷样本中EBV DNA C-promoter区甲基化状态,包括甲基化程度（methylated degree）和甲基化类型（methylated type）进行了甲基化特异的PCR检测,通过这些实验的开展明确EBV的产生来源,以确定鼻咽刷EBV是否是鼻咽癌来源。（3）最后通过受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve,ROC）曲线,相关性分析等分析方法确定截断值（Cut off value,COV）,评价了训练集样本中检测的EBV miRNA,EBV methylated degree,EBV methylated type等多个其它核酸标志物单个及联合应用于鼻咽癌诊断的诊断准确性,并在另一包含424例样本的独立验证集人群（215例鼻咽癌患者和209例非鼻咽癌受试者）中进行验证。此外,又对38例鼻咽癌患者和48例对照受试者平行进行了不依赖内镜引导的取样,获得了配对的盲刷条件下的鼻咽刷样本,评价了这些核酸标志物在盲刷下应用于诊断的价值。结果:（1）对鼻咽刷样本中EBV DNA load的检测显示在鼻咽癌组,所有的鼻咽刷样本中都显示阳性结果并且EBV DNA load显着升高（平均值为46360 copies/ng DNA,表达范围为40–1395000 copies/ng DNA）。在非鼻咽癌的对照组和现场人群对照组,EBV DNA load阳性率和拷贝数值分别为70.6%（平均值28 copies/ng DNA,表达范围0158 copies/ng DNA）和87.8%（平均值50 copies/ng DNA,表达范围0469copies/ng DNA）,治疗之后,阳性率为63.8%（平均值27 copies/ng DNA,表达范围0417 copies/ng DNA）。通过ROC曲线确定截断值,鼻咽刷样本中EBV DNA load的检测应用于鼻咽癌诊断的敏感度和特异性分别达到了96%和97%,平行试验显示诊断效果优于EB病毒血清VCA-IgA抗体（敏感度89%,特异度77%）和血浆EBV DNA load（敏感度为76%,特异度为87%）的检测。与11例病人（约为8.5%）需要多次活检不同的是,这11例病例在接受首次刷检时,EBV DNA load都高于设定的截断值,有效弥补传统指标的不足。（2）对EBV DNA进行比较PCR的结果显示,104例鼻咽癌患者鼻咽刷样本中,只在12例样本中检测到EBNA1基因99bp短片段数量的显着增多,提示只有少量样本中有明显的EBV DNA的降解;对EBV六个潜伏期和五个裂解期基因的转录检测结果显示在鼻咽癌鼻咽刷样本中EBV RNA转录是典型的II型EBV潜伏感染,即高表达EBER1,BART,LMP1,LMP2A和EBNA1基因,而不表达EBNA2,同时也检测到一定频率（从31.4%到93%）的裂解期基因的表达,这与鼻咽活检组织表达情况类似,提示鼻咽刷样本标志物能反应鼻咽部鼻咽癌的生长情况。在对照组鼻咽刷样本中,主要在49.3%的样本中检测到少量的EBER1基因的表达,但同时也在0%到15.5%的样本中检测到少量的几个裂解期基因的表达。相关性分析显示无论是在鼻咽癌组还是对照组,潜伏期和裂解期基因的表达频率都与EBV DNA load具有显着的相关性,但EBV DNA load与EBV转录产物EBER1表达的相关性只在鼻咽癌患者中观察到,而在对照组两者不存在显着相关。对EBV miRNAs的检测也得到了相似的结果。EBV DNA C-promoter区甲基化检测结果显示在鼻咽癌组,鼻咽刷样本中EBV DNA C-promoter区主要是以methylated type为主,methylated degree较高,而在对照组鼻咽刷样本中则以non-methylated type为主,methylated degree较低,结果提示鼻咽癌患者鼻咽刷样本中EBV DNA load主要来自感染EBV的肿瘤细胞贡献,而在对照组鼻咽刷样本中主要来自游离EBV的贡献。（3）基于EBV DNA load,EBV DNA methylated degree,EBV DNA methylated type和EBV miRNA在鼻咽癌和对照组中表达的显着不同,进一步分析显示EBV mir-bart1-5p（敏感度93.94%,特异度100%）,EBV DNA methylated degree（敏感度95.2%,特异度94.7%）和EBV DNA methylated type（敏感度100%,特异度81.6%）应用于鼻咽癌的诊断均具有较高的准确性。EBV mir-bart-1-5p的诊断价值在另一包含424例样本的独立人群中得到了验证,对于鼻咽癌诊断的敏感度为93.5%,特异度为100%。基于EBV DNA methylated type在鼻咽癌和对照组的性质不同,即在鼻咽癌患者中,EBV DNA C-promoter区域主要呈现甲基化的状态,即启动子区发生甲基化EBV DNA的数量（定义为A类EBV DNA）多于非甲基化DNA的数量（定义为B类EBV DNA）,即A/B>1。而在对照组中,EBV DNA C-promoter区主要呈现非甲基化的状态,即发生甲基化EBV DNA的数量（A类EBV DNA）少于非甲基化DNA的数量（B类EBV DNA）,即A/B<1。这为鼻咽刷刷检发展到不依赖于临床的盲刷取样提供了可能,我们的结果显示在盲刷的取样条件下,由于取样部位失去了电子鼻咽镜的引导,取样的精度降低,这导致鼻咽刷样本中的EBV DNA load（敏感度由95.2%下降到55.3%）和EBV DNA methylated degree（敏感度由95.2%下降到57.9%）等定量指标的诊断敏感度会有很大程度的降低,但获取的总EBV DNA中A/B是大于或小于1的特性是基本不变的（敏感度由100%变为89.5%）。结论:鼻咽部EB病毒核酸标志物,包括EBV DNA load,EBV miRNA,EBV methylated degree,EBV methylated type作为高效的分子标志物,应用于鼻咽癌诊断具有较好准确性;通过对鼻咽刷样本中EBV多个潜伏和裂解期基因转录表达谱的研究,以及对EBV miRNA和EBV DNA C-promoter区甲基化的研究,间接和直接两方面充分表明鼻咽癌患者鼻咽刷样本中的EBV DNA主要来自潜伏感染EBV的肿瘤细胞,反应了鼻咽部鼻咽癌的生长情况,而对照组鼻咽刷样本中的EBV DNA主要来自裂解释放的游离EBV颗粒;基于鼻咽刷样本中EBV DNA在病例组和对照组产生途径的不同及所引起的EBV DNA C-promoter区甲基化性质的不同,我们提出检测methylated type这一适用于盲刷取样的定性标志物,突破了鼻咽刷刷检在现场广泛开展应用的瓶颈。通过开展的这三方面的研究,为中国鼻咽癌高发区的鼻咽癌诊断和筛查提供了新思路,对于完善鼻咽癌的病因理论具有重要价值。
桂勋[6]（2014）在《鼻咽癌早期诊断和治疗新型标志物的探索研究》文中指出鼻咽癌是我国南部地区及东南亚常见的恶性肿瘤之一,给人类健康及经济稳定造成了极大的危害。由于鼻咽癌发生部位的解剖结构较复杂,不易于手术治疗,而且对化学药物不敏感,因此,当前鼻咽癌的治疗主要依赖放射治疗。目前的临床放射治疗对早期鼻咽癌治愈效果可达90%以上,但由于缺乏有效的早期诊断方法,大部分鼻咽癌患者被确诊时都接近中、晚期,错过了放射治疗的最佳时机,导致了患者五年生存率的大大降低。因此,寻找适合鼻咽癌早期诊断的血清学诊断标志物已成为目前鼻咽癌临床与基础研究的一个重要研究方向。此外,经初次放射治疗后的鼻咽癌患者,部分容易出现复发,部分容易出现远端转移,且对放射治疗不再敏感,此类复发或转移患者的预后生存率极低,因此,寻找适合易复发或易转移鼻咽癌患者个性化诊断的血清学标志物并探索适合鼻咽癌治疗的生物治疗靶标也日渐成为重要的鼻咽癌研究方向。为此,本研究针对鼻咽癌的早期诊断、个性化诊断以及治疗性抗体药物研发等三部分进行有意义的前期探索。本论文的第一部分旨在寻找高特异性的鼻咽癌诊断标志物,建立鼻咽癌的血清学早期诊断方法及组织学特异性检测工具。鼻咽癌的发生及发展过程与EB病毒的感染密切相关,EB病毒相关标志物已被用于开发鼻咽癌临床诊断试剂,如EBNA1/IgA、VCA/IgA等,此类标志物对鼻咽癌的早期筛查有很好的检测灵敏度,但特异性尚达不到临床检测的要求。鉴于EB病毒主要以II型潜伏态的形式存在于鼻咽癌细胞中,本研究拟以EB病毒II型潜伏态特异性表达蛋白LMP1、LMP2A及BARF1为研究对象,探索此类标志物应用于鼻咽癌早期筛查的可能性。首先,利用原核表达的方式制备了 LMP1、LMP2A不同亲水区基因及BARF1全长基因的重组蛋白,并分别用于检测鼻咽癌患者及健康人血清中针对上述三种抗原的IgA及IgG抗体水平,结果发现,仅鼻咽癌患者血清中抗LMP1第3个胞外区（LMP1-EX3）的IgA抗体和抗LMP2A第5个胞外区（LMP2A-EX5）的IgA抗体水平显着高于健康人,提示LMP1-EX3/IgA和LMP2A-EX5/IgA有望成为鼻咽癌特异诊断的标志物;其次,利用LMP1羧基端重组蛋白（rLMP1-C.ter,aa187-aa386）及LMP2A氨基端重组蛋白（rLMP2A-N.ter,aal-aa119）免疫BALB/c小鼠,分别制备了抗LMP1-C.ter单抗25株和抗LMP2A-N.ter单抗16株,Western blot及免疫荧光的鉴定结果显示,抗LMP1-C.ter单抗14B6和5H8对过表达LMP1的293T细胞有反应,抗LMP2A-N.ter单抗13A12和12A 2对过表达LMP2A的293T细胞有反应,提示这些单抗能识别天然构象的EB病毒表达抗原,有望成为鼻咽癌检测的研究工具;最后,选取抗LMP1-C.ter单抗代表株14B6和抗LMP2A-N.ter单抗代表株13A12,分别测试它们在免疫组化实验中对临床鼻咽癌患者组织切片的检测效果,结果显示,上述两个单抗对鼻咽癌组织切片有良好的免疫组化活性和特异性,有望成为鼻咽癌临床组织学诊断工具。综上,本研究发现EB病毒的潜伏期膜蛋白LMP1和LMP2A是两个重要的鼻咽癌特异性诊断标志物,其一是证明LMP1-EX3/IgA及LMP2A-EX5/IgA可用于建立适合鼻咽癌血清学特异筛查的免疫诊断试剂,其二是证明LMPI单抗14B6及LMP2A单抗13A12可用于建立适合鼻咽癌组织学特异诊断的免疫组化检测试剂,这些发现为研究EB病毒潜伏期膜蛋白在鼻咽癌发生发展中的作用机制和临床诊断意义奠定良好的工作基础。本研究的第二部分旨在寻找适合鼻咽癌个性化诊断的标志物,探索研制易复发或易转移性鼻咽癌的早期诊断试剂的可能性。尽管当前放射治疗对原发性鼻咽癌已取得很好的治疗效果,但仍有15-58%的患者预后容易复发或转移,并产生放疗抗性,此类病人的再次治疗的预后很差,成为鼻咽癌临床治疗中的一个难点。因此,研究适合复发性鼻咽癌早期诊断用的诊断标志物,有助于高度个性化治疗方案的制定,对提高复发性鼻咽癌的治疗效果具有重要意义。文献报道EB病毒II型潜伏态BARTs区的转录产物与鼻咽癌的发生发展密切相关,可能与鼻咽癌预后发展有关。为此,本研究拟以EB病毒II型潜伏态BARTs区的转录产物A73为研究对象,探索其作为鼻咽癌个性化诊断标志物的可能性。首先,利用原核表达方式制备了高纯度的A73重组蛋白rGST-A73-NP9,并用于检测鼻咽癌患者血清中抗A73的IgA及IgG抗体水平,结果发现,A73/IgA的检测值可以将鼻咽癌患者分成两类,提示A73/IgA是一个不同类型鼻咽癌的分类诊断靶标;其次,利用rGST-A73-NP9免疫BALB/c小鼠,制备了抗A73的特异性单抗18株,并采用Western blot及免疫荧光方法证明A73单抗6A2对过表达A73的293T细胞有良好反应,提示A73单抗能识别自然状态下的A73抗原,为利用A73单抗研究A73表达产物提供了有用的研究工具;然后,利用单抗6A2分别对EB病毒感染的淋巴细胞系B95-8及上皮细胞系C666-1进行了 Western blot及免疫荧光的检测,结果显示,在这两种传代细胞系中均未检测到A73蛋白的表达,但在部分鼻咽癌组织中检测到A73蛋白的存在,提示A73蛋白有可能作为一个鼻咽癌分类诊断用的免疫组化检测靶标;最后,通过分离鼻咽癌细胞系C666-1细胞培养上清及鼻咽癌患者血清中的外泌体,用RT-PCR检测方法首次在外泌体中发现了 A73 mRNA的存在,提示鼻咽癌细胞中高表达的A73 mRNA很可能通过外泌体的方式转运至胞外,而此种转运方式和鼻咽癌患者血清中A73 mRNA的水平可能与鼻咽癌的复发和转移有关。综上,可能存在A73高表达和低表达两种鼻咽癌类型,而此两种鼻咽癌的转归结果是否存在差异还需要进一步鉴定。本研究的第三部分是研究LMP1和LMP2A抗体治疗鼻咽癌的效果探索LMP1及LMP2A作为鼻咽癌抗体治疗靶标的可行性。抗体药物由于具有毒副作用小及特异性强等特性,在肿瘤的治疗上表现出了明显的优势。LMP1及LMP2A是EB病毒在鼻咽癌细胞中表达的膜蛋白,具有很强的肿瘤组织表达特异性,而且在肿瘤的发生及发展过程中起重要作用,本研究拟通过实验证明其作为鼻咽癌抗体治疗靶标的潜在可能性。首先,基于鼻咽癌细胞系CNE-2Z构建了同时表达虫荧光素酶的LMP1及LMP2A稳定表达细胞株CNE-2Z-Luc-LMP1及CNE-2Z-Luc-LMP2A;其次,通过以白喉毒素为载体的展示肽免疫BALB/c小鼠,分别制备了抗LMP1-EX3特异性单抗25株及抗LMP2A-EX5特异性单抗6株,并用Western blot及免疫荧光检测方法证明抗LMPI-EX3单抗14H5和12AI与过表达LMP1的293T细胞有反应,抗LMP2A-EX5单抗5E9和7H3与过表达LMP2A的293T细胞有反应,在此基础上鉴定出LMP2A-EX5单抗所识别的线性B细胞表位382SLSSTEFIP390;最后,用肿瘤细胞体外生长抑制实验评估了抗LMP1-EX3单抗及抗LMP2A-EX5单抗对鼻咽癌细胞系CNE-2Z-Luc-LMPI及CNE-2Z-Luc-LMP2A的生长抑制效果,结果显示抗LMP1-EX3单抗2B8、5D4及7G9,抗LMP2A单抗5E9及7H3在体外对鼻咽癌细胞系有很好的生长抑制活性,从而初步证明LMP1-EX3及LMP2A-EX5作为鼻咽癌抗体治疗靶标的可行性。总之,本论文针对EB病毒II型潜伏态的基因转录产物进行鼻咽癌诊断靶标及治疗靶标的的探索研究,发现LMP1-EX3及LMP2A-EX5是很好的鼻咽癌诊断及治疗靶标,还发现A73是一个潜在的鼻咽癌个性化诊断靶标,为研制鼻咽癌特异性早期诊断试剂和鼻咽癌治疗性抗体药物奠定了基础。
王路[7]（2011）在《EBNA1在鼻咽癌转移中的作用及分子机制研究》文中认为在鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma, NPC）发病机制研究中,EB病毒（Epstein-Barr virus, EBV）因与鼻咽癌的发病密切相关而倍受关注,研究证实95%以上未分化型鼻咽癌组织中均可检出EBV感染,因此,EBV在鼻咽癌发生发展中的作用一直是鼻咽癌发病机制研究的重点,也是寻找鼻咽癌早期诊断、治疗新方法、判断预后的突破点。鼻咽癌细胞的EBV感染主要为Ⅱ型潜伏感染,仅表达EBV编码的EB病毒核抗原1 （EB nuclear antigen 1, EBNA1）、潜伏膜蛋白1 （Latent membrane protein-1, LMP-1）、潜伏膜蛋白2 （Latent membrane protein-2, LMP-2）及EB病毒编码小RNAs （Epstein-Barr viral encoded RNAs, EBERs）。目前的研究表明,EBNA1的作用主要是调节EBV基因的复制,增强病毒基因的转录,维持病毒附加子的存在；另外也可与EBV潜伏感染时的复制起始点（Origin of replication,Orip）中的重复序列家族（Family of repeats, FR）结合,激活LMP1的启动子,促进其转录。在我们另一课题研究中,试图通过EBNA1靶向基因治疗鼻咽癌,在培养EBNA1过表达鼻咽癌细胞株时我们意外发现,在培养到一定代数的时候,这个细胞从原来典型的鹅卵石形状变成梭形,类似于成纤维细胞的形态,这个惊喜的发现,使我们推测到EBNA1基因是否引起鼻咽癌细胞发生上皮细胞间质转化。因鼻咽癌发病的地域性限制,国外对于鼻咽癌中EBNA1的研究甚少,仅局限于病毒学领域,而国内的研究多集中于EBNA1作为一个诊断指标在鼻咽癌患者血清中的检出价值讨论,并没报告EBNA1对鼻咽癌细胞有直接作用,深入探讨EBNA1对鼻咽癌细胞的作用,对了解EB病毒在鼻咽癌中的发病作用,分析鼻咽癌的发病机制,寻找治疗鼻咽癌的新途径都有积极的意义。上皮间质转化（Epithelial-Mesenchymal Transitions, EMT）是指上皮细胞在形态学上发生成纤维细胞或间充质细胞表型的转变,并获得迁移能力,它是一种基本的生理病理现象,在胚胎发育、组织发生中起重要作用。此外,EMT也存在于多种病理过程中,如伤口愈合过程、肾脏纤维化、肿瘤发生及转移。越来越多的研究显示EMT在肿瘤细胞的侵袭和转移中起着重要作用,肿瘤细胞从原发部位游离是转移最初始步骤,也是转移发生的先决条件,近年来EMT是肿瘤转移机制研究的热点。基于我们在培养EBNA1过表达鼻咽癌细胞株时的意外发现,本研究将探讨EBNA1对鼻咽癌细胞的直接作用；EBNA1是否通过EMT参与鼻咽癌转移；EBNA1参与EMT途径及机制。方法：1.鼻咽癌组织中EBNA1的检测：选取2006-2010年南方医院耳鼻喉科头颈肿瘤标本库中鼻咽癌组织标本48例,慢性鼻咽炎12例作为对照。常规石蜡包埋,免疫组织化学法检测EBNA1表达。2. EBNA1表达变化对鼻咽癌细胞株转移能力的影响：2.1过表达或沉默EBNA1鼻咽癌细胞株的构建：利用lipofectamine2000转染含EBNA1编码片段的pCEP4质粒入CNE1、CNE2、5-8F细胞,转染48小时后加300μg的潮霉素B（终浓度150μg/ml）进行抗性筛选,2周后形成单细胞克隆,潮霉素B半量维持培养。通过荧光定量PCR和Western Blotting鉴定EBNA1的转录和翻译水平的表达,构建过表达EBNA1的CNE1/EBNA1、CNE2/EBNA1、5-8F/EBNA1细胞。将化学合成的转录EBNA1干扰模板的双链DNA片段shRNA EBNA1（以下简称shEBNAl）插入shRNA的表达载体pAVU6+27,获得pAVU6+27/shEBNA1重组质粒,将此质粒的U6+shEBNA1片段克隆至克隆载体pBlueScript SK+（以下简称BSSK）,获得BSSK/shEBNA1重组质粒,再从该质粒中将U6+shEBNA1片段克隆至慢病毒载体pLVTHM中,获得pLVTHM/shEBNA1质粒。将慢病毒载体质粒（pLVTHM或带有目的片段的pLVTHM/shRNA EBNA1）与辅助质粒（psPAX2质粒,pMD2.G质粒）共转染,按lipofectamine2000说明书包装慢病毒LV/Control和LV/shEBNA1。将此两种慢病毒分别感染CNE1/EBNA1、CNE2/EBNA1细胞,获得携带绿色荧光蛋白的CNE1/EBNA1、Control、CNE1/EBNA1/shEBNA1、和CNE2/EBNA1/Control、CNE2/EBNA1/shEBNA1四株细胞。荧光定量PCR和Western Blotting检测四株细胞中EBNA1表达情况。2.2过表达或沉默EBNA1对鼻咽癌细胞株转移功能的影响：利用划痕实验检测EBNA1对鼻咽癌细胞迁徙能力的影响；利用侵袭小室检测EBNA1对鼻咽癌细胞侵袭能力的影响；利用平板克隆形成实验检测EBNA1对细胞低浓度下增殖能力的影响。3.EBNA1诱导鼻咽癌发生EMT:3.1 EBNA1和EMT标志物在鼻咽癌组织中的表达及其相关性:免疫组化检测48例鼻咽癌和12例慢性鼻咽炎组织中EMT上皮标记物（CK18）与间质标记物（Vimentin）蛋白的表达情况,分析其与EBNA1相关性。3.2 EMT标志物在鼻咽癌细胞中的检测：在过表达EBNA1及其相应对照的3组鼻咽癌细胞中应用荧光定量PCR、Western Blotting、免疫荧光染色法检测EMT上皮标志物（E-cadherin、CK18）与间质标志物（Vimentin、β-catenin和N-cadherin）的（?）mRNA和蛋白水平表达情况。4.EBNA1参与鼻咽癌EMT的可能信号通路：运用荧光定量PCR对TGF-β1/Smad.Wnt/β-catenin两条信号通路上的相关基因及转录抑制因子ZEB1、ZEB2进行检测,验证EBNAl对其表达变化的影响。结果：1. EBNA1在鼻咽癌组织中的高表达促进鼻咽癌转移：免疫组化结果显示EBNA1在鼻咽癌组织中的阳性率为87.5%（42/48）,慢性鼻咽炎组织中EBNA1均未检出（0/12）,两组间差异有统计学意义（Z=-4.823,P=0.000）。EBNA1在不同N分期中表达有显着统计学差异（X2=14.174,P=0.003）,伴颈部淋巴结组的EBNA1表达高于未伴淋巴结转移组（Z=-2.713,P=0.007）,且在N3组中,EBNA1的表达明显高于N2和N1组。EBNA1的表达在不同临床分期（X2=17.219,P=0.000）和不同T分期（X2=10.047,P=0.018）中,随着分期数增高而表达增高。2. EBNA1基因过表达及沉默后对鼻咽癌细胞生物学特性的影响2.1建立稳定表达EBNA1的鼻咽癌细胞株：经潮霉素抗性筛选得到过表达EBNA1的三株鼻咽癌细胞株：CNE1/EBNA1、CNE2/EBNA1、5-8F/EBNA1。荧光定量PCR和Western Blotting在mRNA和蛋白水平均可检测到EBNA1表达,其中以5-8F/EBNA1中的表达最高。2.2过表达EBNA1促进鼻咽癌细胞移动,增强侵袭性及低浓度下增殖能力：划痕实验结果显示：划痕后12小时、24小时,在CNE1组（F=68.295,P=0.000）、CNE2组（F=24.242,P=0.000）和5-8F组（F=80.977,P=0.000）中,过表达EBNA1细胞较相应对照组细胞的移动能力均增强,尤其对于CNE1细胞株,过表达EBNA1后使其移动能力增强3.65倍（12小时）和2.75倍（24小时）,而在CNE2和5-8F组,过表达EBNA1后移动能力分别增加了1.5倍和2.5倍。侵袭实验结果表明：本身具有转移能力的CNE2和5-8F细胞均可见细胞穿透Matrigel,进一步过表达EBNA1后,其穿透能力更分别增强2.11倍和3.92倍。而本身不具有转移能力的CNE1细胞（仅极少数细胞透过Matrigel）,穿透力更增强4.24倍。三组细胞中过表达EBNA1的细胞较相应对照细胞侵袭力明显增强（CNE1组：t=-6.506,P=0.000；CNE2组：t=-7.834,P=0.000；5-8F组：t=-12.498,P=0.000）。平板克隆形成实验提示：在种植后14天,过表达EBNA1组克隆形成数较相应对照组增加至2.44、2.00和2.10倍（CNE1组：t=-2.848, P=0.046; CNE2组：t=-2.961,P=0.042；5-8F组：t=-11.015,P=0.000）。2.3建立稳定沉默EBNA1的鼻咽癌细胞株：双酶切及DNA测序结果表明,我们成功获得含有shEBNA1的慢病毒干扰载体,包装慢病毒后感染CNE1/EBNA1和CNE2/EBNA1细胞株荧光显微镜下观察GFP阳性率达90%以上；荧光定量PCR和Western blot结果证实EBNA1的表达在干扰亚株较对照组下调70%-80%不等。2.4沉默EBNA1减慢鼻咽癌细胞移动,抑制侵袭性及低浓度下增殖能力：划痕实验结果表明：沉默EBNA1在12小时和24小时均减慢鼻咽癌细胞移动能力（CNE1/EBNA1组F=8.816, P=0.000; CNE2/EBNA1组：F=7.258,P=0.002）,沉默EBNA1后使其移动能力分别下降了50-60%不等。侵袭实验结果显示：沉默EBNA1降低鼻咽癌细胞的侵袭力（CNE1/EBNA1组：t=7.174, P=0.000; CNE2/EBNA1组：t=9.111,P=0.000）,两组细胞侵袭力分别下降了66%-72%不等。平板克隆形成实验结果提示：沉默EBNA1后,CNE1/EBNA1组形成克隆数由78.000±12.000降低为41.667±12.342（t=3.656,P=0.022）,下降了46%；CNE2/EBNA1组细胞数由101.333±9.292降低为49.333±14.012（t=5.357,P=0.006）,减少了52%。3. EBNA1诱导鼻咽癌发生EMT：3.1 EBNA1对鼻咽癌细胞株形态学影响：经潮霉素抗性筛选后,5-8F细胞株由原本的圆形变为狭长的梭形,CNE1细胞株由原本的圆形变为多边形,边缘伸出长角,而CNE2细胞株则更加异型性明显,由原本的圆形变为不规则多边形,触角伸长。而在CNE1/EBNA1、CNE2/EBNA1的基础进行了EBNA1干扰后发现,相对于对照组,干扰后的细胞又有大部分再次回缩为原始的圆形,说明过表达EBNA1后可使鼻咽癌由上皮细胞向间质细胞转化,而干扰EBNA1后则可逆转该过程。3.2 EBNA1的表达与EMT标志物的关系：3.2.1 EBNA1在鼻咽癌组织中与CK18呈负相关,与Vimentin呈正相关：在鼻咽癌组织中,上皮标志物CK18的阳性率达到70.83%（34/48）,在慢性鼻咽炎中,CK18的阳性率为50%（6/12）。在鼻咽癌和慢性鼻咽炎中CK18的表达无统计学差异（Z=-0.720,P=0.471）。但是在鼻咽癌组织中,CK18的表达在鼻咽癌的T分期、N分期及临床分期的不同组中均有显着统计学差异（T分期：X2=13.985,P=0.003；N分期：X2=10.349,P=0.016；临床分期：X2=21.080,P=0.000）。同时,随着鼻咽癌的各分期数的增高,CK18的平均秩次呈下降趋势。在鼻咽癌组织中,间质标志物Vimentin的阳性率79.17%（38/48）,在慢性鼻咽炎中,Vimentin的阳性率66.67%（8/12）。Vimentin在慢性鼻咽炎组织与鼻咽癌组织中表达有统计学差异（Z=-2.428,P=0.015）。而在鼻咽癌组织内,Vimentin在不同N分期中表达有统计学差异（X2=13.064,P=0.005）,淋巴结已发生转移的鼻咽癌组织表达高于未发生转移的鼻咽癌组织（Z=-2.228,P=0.026）,但是在不同T分期中差异无显着统计学意义（X2=3.756,P=-0.289）。在鼻咽癌中EBNA1表达与CK表达呈负相关（Correlation Coefficient=-0.331,P=0.021）,与Vimentin表达呈正相关（Correlation Coefficient=0.311, P=0.031）,而CK18与Vimentin亦呈负相关（Correlation Coefficient=-0.329, P=0.022）。3.2.2 EBNA1过表达在鼻咽癌细胞株中上调间质标记物,下调上皮标志物：荧光定量PCR。Western Blotting和免疫荧光染色后激光共聚焦图片分析均显示,过表达EBNA1后,三组鼻咽癌细胞株中上皮标志E-cadherin、CK18T调而间质标志Vimentin。N-cadherin上调。同时,免疫荧光染色显示过表达EBNA1后,β-catenin的表达在部分细胞中由细胞膜转移至细胞核,出现了核聚集现象。4. EBNA1参与EMT通路研究：荧光定量PCR法检测结果显示,TGF-β1/SMADs通路中,TGF-β1的表达在三个细胞株中上升了3.75倍（CNE1）、1.57倍（CNE2）、25.49倍（5-8F）, Smad4平均升高了2.43倍（CNE1）、1.64倍（5-8F）,而在CNE2细胞中Smad4变化不明显。说明在CNE1和5-8F细胞株中,EBNA1在转录水平可能与TGF-β1/Smad通路相关。对于Wnt/β-catenin通路中的GSK-3β及其调控的下游c-myc的检测我们发现,过表达EBNA1后GSK-3β的表达在三个细胞株中平均升高了1.58倍（CNE1）、1.47倍（CNE2）,8.70倍（5-8F）, c-myc上调了1.21倍（CNE1）、61.98倍（5-8F）。结合E-cadherin下调、β-catenin上调的结果,说明EBNA1在转录水平与Wnt/β-catenin通路相关。另外,过表达EBNA1后转录抑制因子ZEB1的mRNA水平表达在过表达EBNA1后分别上调2.92倍（CNE1）、2.83倍（CNE2）、381.01倍（5-8F）,ZEB2平均升高了3.78倍（CNE1）、1.83倍（CNE2）、65.39倍（5-8F）,说明EBNA1在转录水平与转录抑制因子ZEB1、ZEB2相关。结论：1.EBNA1在鼻咽癌组织中高表达,表达水平与鼻咽癌的T分期、N分期和临床分期相关；EBNA1的表达在鼻咽癌中亦与上皮标志物（CK18）呈负相关,与间质标志物（Vimentin）呈正相关；2. EBNA1的过表达可促进鼻咽癌细胞体外的移动、侵袭及低浓度下增殖能力,使鼻咽癌细胞转移能力增强；沉默EBNA1可抑制移动、侵袭和低浓度下增殖能力,使鼻咽癌细胞转移能力下降；3. EBNA1诱导鼻咽癌细胞发生EMT,可能通过TGF-β1/Smad、Wnt/β-catenin信号通路及ZEB1、ZEB2转录因子参与鼻咽癌EMT过程从而影响其转移能力。
雷芳红[8]（2020）在《circFIP1L1通过海绵吸附miR-1253靶向SFN调控EMT抑制鼻咽癌迁移和侵袭》文中研究说明目的:前期研究中发现,circFIP1L1-miR-1253-SFN信号轴在鼻咽癌（NPC）放疗中起着重要作用,本课题拟研究circFIP1L1-miR-1253-SFN信号轴通路在NPC转移及上皮间质转化（EMT）中的具体作用机制,为临床鼻咽癌转移治疗研究提供有效的靶点。方法:（1）收集鼻咽癌患者和正常人血清,qRT-PCR检测血清中circFIP1L1和miR-1253的表达水平;（2）qRT-PCR检测鼻咽部永生化上皮细胞NP69、NPC细胞株5-8F及6-10B中circFIP1L1、miR-1253、SFN的表达水平;（3）构建circFIP1L1、circFIP1L1 NC载体转染鼻咽癌细胞株5-8F及6-10B,qRT-PCR检测circFIP1L1、miR-1253、SFN表达水平;（4）NPC细胞株5-8F、6-10B瞬时转染miR-1253-mimic,miR-1253-inhibitor及其空载体组,经qRT-PCR检测circFIP1L1、SFN表达水平;（5）NPC细胞6-10B瞬时转染miR-1253-mimic,miR-1253-inhibitor,Western blot实验检测14-3-3σ及EMT相关蛋白E-cadherin,N-cadherin,Vimentin的表达情况;（6）NPC细胞株5-8F、6-10B共同转染circFIP1L1,circFIP1L1+miR-1253 mimic,circFIP1L1-NC,经qRT-PCR检测SFN表达情况,同时进行Western Blot实验检测14-3-3σ及EMT相关蛋白E-cadherin,N-cadherin,Vimentin表达情况;（7）NPC细胞株5-8F,6-10B瞬时转染circFIP1L1、circFIP1L1NC进行划痕愈合及Transwell迁移、侵袭实验,探究NPC细胞侵袭转移能力;（8）NPC细胞株5-8F,6-10B分别瞬时转染miR-1253-mimc、miR-1253 inhibitor及其空载体进行划痕愈合及Transwell迁移侵袭实验,探究NPC细胞迁移和侵袭能力;（9）NPC细胞株5-8F,6-10B分别瞬时转染circFIP1L1-NC,circFIP1L1、circFIP1L1+miR-1253mimic,进行划痕愈合及Transwell迁移、侵袭实验,探究NPC细胞迁移和侵袭能力;（10）动物体内实验探究circFIP1L1对鼻咽癌体内成瘤的影响:在裸鼠皮下注射鼻咽癌5-8F细胞形成肿瘤;观察circFIP1L1组、circFIP1L1-NC组、生理盐水组三组鼻咽癌移植瘤生长情况,比较每组形成鼻咽癌肿瘤大小,探究circFIP1L1对NPC体内成瘤的影响。结果:（1）正常人血清中circFIP1L1表达水平与NPC患者相比上升（P<0.05）,而miR-1253表达水平与NPC患者相比下降（P<0.05）;（2）NPC细胞5-8F、6-10B,与鼻咽部永生化上皮细胞NP69组相比,circFIP1L1、SFN表达水平下降,而miR-1253表达水平上升（P<0.05）;（3）5-8F、6-10B转染circFIP1L1后,qPCR结果显示过表达circFIP1L1组miR-1253表达水平下降,SFN表达水平上升（P<0.05）;（4）转染miR-1253 mimic及miR-1253 inhibitor后,qPCR结果显示与对照组相比,miR-1253 mimic组SFN表达水平下降,而miR-1253 inhibitor组SFN表达水平上升（P<0.05）,circFIP1L1表达水平变化无统计学意义（P>0.05）;（5）Western blot结果显示,miR-1253 mimic组与对照组相比,E-cadherin、14-3-3σ蛋白表达水平下降（P<0.05）;N-cadherin、Vimentin蛋白表达水平上升（P<0.05）;miR-1253 inhibitor组与对照组相比,E-cadherin、14-3-3σ蛋白表达水平上升（P<0.05）;N-cadherin,Vimentin蛋白表达水平下降（P<0.05）;（6）circFIP1L1组与circFIP1L1+miR-1253mimic组、circFIP1L1 NC组比,14-3-3σ、E-cadherin蛋白表达水平上升,而N-cadherin,Vimentin蛋白表达水平下降（P<0.05）;circFIP1L1+miR-1253 mimic组与circFIP1L1组相比14-3-3σ、E-cadherin蛋白表达水平下降,而N-cadherin,Vimentin蛋白表达水平上升（P<0.05）;其中,circFIP1L1+miR-1253 mimic组与circFIP1L1-NC组相比14-3-3σ、E-cadherin、N-cadherin,Vimentin蛋白表达水平变化无明显差异（P>0.05）;（7）细胞划痕愈合实验及Transwell迁移侵袭实验结果显示,circFIP1L1组细胞迁移距离及迁移侵袭数量与对照组相比减短及减少（P<0.05）;（8）细胞划痕愈合实验及Transwell迁移侵袭实验结果显示,miR-1253mimic的迁移距离及迁移侵袭细胞数量与对照组相比增长及增多（P<0.05）;miR-1253 inhibitor组细胞迁移距离及迁移侵袭细胞数量与对照组相比减短及减少（P<0.05）;（9）细胞划痕愈合实验及Transwell迁移侵袭实验结果显示,circFIP1L1组与circFIP1L1+miR-1253mimic组与circFIP1L1 NC组比,迁移距离及迁移侵袭细胞数量相比减短及减少（P<0.05）;circFIP1L1+miR-1253mimic组与circFIP1L1组相比迁移距离及迁移侵袭细胞数量增长及增多（P<0.05）,而circFIP1L1+miR-1253mimic组与circFIP1L1NC组相比迁移距离及迁移侵袭细胞数量变化无明显差异（P>0.05）;（10）裸鼠成瘤实验显示,与对照组相比,circFIP1L1组体内形成的NPC肿瘤体积减小、重量减轻（P<0.05）。结论:（1）过表达circFIP1L1可以使miR-1253表达量降低,SFN表达量升高。（2）circFIP1L1通过海绵吸附miR-1253靶向SFN调控EMT抑制鼻咽癌迁移和侵袭。
宋青翠[9]（2014）在《CD21在鼻咽上皮的表达及介导游离EBV发生潜伏性感染的研究》文中指出研究背景和目的鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma, NPC）是发生于鼻咽粘膜的一种上皮来源的恶性肿瘤,具有明显的地区聚集性,高发于我国南方和东南亚地区。流行病学研究表明鼻咽癌的发生受环境和遗传双重因素的影响,其中EB病毒（Epstein-Barr virus, EBV）既是诱发鼻咽癌发生的环境因素,在感染后又可整合到基因组影响基因表达。在高发区未分化的鼻咽癌（WHO Ⅲ型）占绝大多数,并且均与EBV的感染有关。研究表明EBV的潜伏感染可能是NPC发生的第一步。EBV在体内主要感染两类细胞：B淋巴细胞和上皮细胞。EBV可高效感染B淋巴细胞且机制已非常明确,即EBV通过其表面糖蛋白gp350/220与B淋巴细胞上的表面抗原CD21 （CR2）结合进入淋巴细胞而发生感染,对B细胞的增值、分化及记忆均起重要的调节作用。CR2,即CD21,又名EB病毒受体,是补体激活调节剂家族的一员。CR2是一个分子量为145kD的单链糖蛋白,其N端在胞外,含20个氨基酸的疏水信号肽及1005个氨基酸的膜外区,接着是24个氨基酸的疏水跨膜区,C端由34个氨基酸构成胞浆尾。CR2膜外部分有15个（或16个）短的同源重复序列（SCRs）,每个SCR含60-75个氨基酸。CR2与EBV结合表位基本清楚,SCR1-2为CR2与EBV的gp350/220, C3dg结合所必需的表位,SCR3-4对诱导CR2与EBV的结合也起一定作用。研究表明CD21是B淋巴细胞系最早期的表面标志物,最早开始表达于B细胞的前体细胞,并且CD21在一些祖细胞及肿瘤干细胞中表达,如在祖细胞中与SOX2等共表达。EBV能有效感染B淋巴细胞,特别是CD21在EBV感染B淋巴细胞的干细胞中起着决定性的作用,且胎儿骨髓中的B淋巴细胞系认为是B细胞祖细胞及前体细胞,研究证实这些细胞更容易被EBV感染。但是EBV很难感染上皮细胞,即便是EBV成功感染上皮细胞,也很容易造成EBV的丢失,而EBV在上皮组织中的稳定维持需要未分化的细胞环境。EBV感染上皮细胞的效率很低,特别是游离的EBV很难感染上皮细胞,EBV感染上皮的机制有待进一步研究。到目前为止,认为EBV能感染上皮的方式主要通过细胞与细胞间接触感染,即EBV首先通过B淋巴细胞表面抗原CD21而感染B淋巴细胞,被感染的B淋巴细胞游走至上皮细胞,通过细胞间接触（EBV可能通过B细胞上的CD21通道）进而感染上皮细胞。即首先在活体内EBV是通过唾液感染口咽部的B淋巴细胞,再通过细胞间接触感染毗邻的复层鳞状上皮,从而导致鼻咽上皮细胞的EBV感染。而游离的EB病毒则很难进入上皮细胞,只有当基底膜破损时,可以通过破损处进入上皮细胞发生感染。CR2在B淋巴细胞表达率很高但是在上皮中的表达很低,甚至有报道是阴性表达,然而在上皮细胞中过表达CR2可以提高EBV对上皮细胞的感染效率,这说明CR2对EBV感染上皮细胞起到重要作用。CR2在上皮细胞的表达情况目前尚有争议,游离的EBV是否可以通过CR2途径进入上皮细胞发生感染而促进鼻咽癌的发生尚未明确。因此我们首先要证实正常人体鼻咽上皮细胞是否有CR2（CD21）的表达。由于鼻咽癌患者通常伴随鼻咽炎的发生,而炎症处必然有大量B淋巴细胞的聚集,这对检测鼻咽上皮细胞CR2的表达情况造成干扰。因此本研究采用免疫组化技术检测不同胎龄胎儿鼻咽上皮细胞中CR2的表达情况,同时与上皮干细胞标志物CD133的表达情况及上皮细胞分化标志物CK5的表达情况进行比较,从而在体内证实鼻咽上皮中是否有CD21的表达及其与干细胞可能的关系。由于使用普通的实验方法如Western Blot,Q-PCR等方法很难检测到CD21表达的阳性结果,所以在体外实验我们利用流式细胞仪检测（具有高精确度）并比较鼻咽癌细胞株CNE1、CNE2中及正常上皮细胞株NP69中CD133及CD21的含量；使用细胞免疫荧光及其双标实验、肿瘤球免疫荧光实验、肿瘤球的分化及Brdu标记滞留细胞实验等多种方法验证CD21在鼻咽癌细胞或鼻咽正常上皮细胞中的表达情况。如果能检测CD21阳性表达的结果,接下来用游离的EBV感染以上各细胞系,EBV感染一段时间后检测EBV潜伏感染时表达的核蛋白EBNA1的表达情况。为了进一步确定EBV是否通过结合CD21而进行上皮细胞潜伏感染,我们使用免疫荧光双标方法检测EBNA1与CD21的共表达情况,并将各细胞株中CD21抗原进行封闭,封闭后再用游离EBV感染各细胞系,并检测EBNA1表达。同时观察封闭后与未封闭细胞被EBV感染后各细胞株形态学变化及相关恶性表型的改变。研究内容与方法1、不同胎龄的胎儿鼻咽上皮各壁中CD21、CD133及CK5的表达分布特点使用免疫组化的方法检测不同胎龄胎儿的鼻咽上皮组织各个壁中CD21、 CD133及CK5的表达情况及随着上皮细胞的分化这些指标的变化情况,根据免疫组化的结果分析鼻咽上皮各壁中CD21、CD133及CK5的表达含量,并推测鼻咽上皮干细胞可能的所在部位,初步确定CD21与鼻咽上皮干细胞及其分化的关系。2、体外实验证实CD21在鼻咽上皮细胞和鼻咽癌细胞株中及其干细胞中的表达1)流式细胞仪分别检测CD21+及CD133+的细胞含量采用流式细胞仪分别检测正常鼻咽上皮细胞株NP69及人高分化鼻咽癌细胞株CNE1、人低分化鼻咽癌细胞株CNE2中CD21+、CD133+细胞的含量,并进行比较分析。2)细胞免疫荧光实验免疫荧光实验检测NP69及鼻咽癌细胞株CNE1、CNE2中CD21、CD133的表达情况,并用免疫荧光双标的实验方法检测与观察CD21与CD133在这些细胞株中是否共表达。3)细胞株体外标记滞留（Label Retaining cells, LRCs）实验鼻咽癌细胞株CNE1、CNE2及鼻咽上皮细胞株NP69细胞生长至指数期时,向培养基中加入Brdu（10ng/ml）,培养2小时后,撤除Brdu继续培养14天,培养过程中,分别在Brdu加入后2h及撤除Brdu后的第14天进行细胞免疫荧光染色。4)检测LRCs细胞与表达CD21、CD133的细胞是否吻合使用细胞免疫荧光的方法分别同时标记LRCs与CD21, LRCs与CD133,并检测及分析。5)肿瘤球的免疫荧光实验培养鼻咽癌细胞株的肿瘤球,然后采用免疫荧光的方法检测肿瘤球上CD21、CD133及CK5的表达,并用免疫荧光双标的方法检测CD21及CD133在肿瘤球中的共表达情况。6)肿瘤球分化实验培养肿瘤球并使其分化,用免疫荧光的方法检测随着肿瘤球的分化CD21、 CD133及CK5的表达的变化。3、游离的EBV感染鼻咽上皮细胞1)游离EBV抽提实验培养B95-8细胞,培养一段时间后收集B95-8细胞培养液,在4℃离心机离心,取上清,将上清用0.22μm一次性过滤器过滤得到纯的EBV浓缩液。2) EBV感染实验游离的EBV分别使用相同的病毒滴度感染正常鼻咽上皮细胞NP69及鼻咽癌细胞株CNE1、CNE2。3) EBV感染后EBNA1的检测EBV感染5-10天后,采用细胞免疫荧光的方法分别检测NP69、CNE1及CNE2中EBNA1的表达。4) EBV感染后细胞形态学的观察EBV感染后的细胞,在光学显微镜下观察各细胞株形态学的改变,并与对照组进行比较。5) EBV感染后细胞骨架的检测检测EBV感染后及对照组细胞的细胞骨架,观察细胞骨架迁移性伪足及刺突的改变情况。4、证实游离的EBV是否通过CD21途径发生感染1)细胞免疫荧光双标实验EBV感染10天左右,采用细胞免疫荧光方法检测EBNA1与CD21的共表达情况。2)CD21封闭实验首先用CD21抗体将各细胞株中的CD21抗原进行封闭,封闭后再行EBV感染。3)CD21被封闭的细胞株在EBV感染后EBNA1、细胞骨架的检测及细胞形态学观察5、统计学分析：采用SPSS20.0统计软件进行数据分析。鼻咽上皮各壁中不同抗原的阳性表达量及比较采用重复测量的方差分析,不同细胞株中各检测抗原的阳性表达量及不同抗原间表达量的比较等均采用两独立样本t检验,以P<0.05为差异具有统计学意义；计量资料结果用mean±s表示。结果：1、胎儿鼻咽上皮各部位CD21与CD133表达特点1)胎儿鼻咽上皮的CD21表达具有时空差异结果发现CD21在小胎龄胎儿鼻咽上皮呈强阳性高表达,且细胞浆及细胞核均表达,14w、20w及26w时在鼻咽各壁表达总量分别为32.15±27.06%,16.96±16.96%,7.74±8.32%,随着胎龄的增加CD21表达降低,各胎龄之间有显着性差异（F=607.296,P=0.000）；将鼻咽分为9个部位,在前段顶壁、前段侧壁、前段底壁、中段顶壁、中段侧壁、中段底壁、后段顶壁、后段侧壁及后段底壁的表达总量分别为10.00±5.43%,0.78±0.97%,0.00±0.00%,39.00±20.04%,24.56Q14.83%,3.89±2.98%,51.22±23.82%,25.22±16.02%,15.55±15.06%,各部位之间有显着性差异（F=604.844,P=0.000）。其中CD21在顶后壁表达最高,且所有皱襞陷凹部位的细胞呈阳性表达,陷凹接近顶部处及非陷凹处呈阴性表达。2)胎儿鼻咽上皮的CD133表达具有时空差异CD133在14w、20w及26w鼻咽上皮的表达分别为31.15±26.48%,16.96±17.12%,7.52±8.17%,各胎龄之间有显着性差异（F=480.029,P=0.000）；在前段顶壁、前段侧壁、前段底壁、中段顶壁、中段侧壁、中段底壁、后段顶壁、后段侧壁及后段底壁的表达总量分别为9.67±5.70%,0.78±1.09%,0.00±0.00%,39.00±20.00%,25.22±14.29%,3.78±2.82%,50.78±24.00%,23.22±13.92%,14.444±13.35%,部位之间有显着性差异（F=637.724,P=0.000）。 CD133在顶后壁表达最高,且所有皱襞陷凹部位的细胞呈阳性表达,陷凹接近顶部处及非陷凹处呈阴性表达。3)CD21与CD133在不同胎龄鼻咽上皮各部位表达比较14w时,CD21与CD133在的鼻咽前段顶壁、前段侧壁、前段底壁、中段顶壁、中段侧壁、中段底壁、后段顶壁、后段侧壁及后段底壁的表达均无显着差异（F=0.500,1.000,-,0.180,0.000,0.000,0.756,1.512,1.387；P=0.667,0.423,-,0.874,1.000,1.000,0.529,0.270,0.300）；20w时,CD21与CD133在的鼻咽前段顶壁、前段侧壁、前段底壁、中段顶壁、中段侧壁、中段底壁、后段顶壁、后段侧壁及后段底壁的表达均无显着差异（F=1.000,1.000,-,0.555,0.394,0.000,0.500,0.378,0.500；P=0.423,0.423,-,0.635,0.732,1.000,0.667,0.742,0.667）；26w时,CD21与CD133在的鼻咽前段顶壁、前段侧壁、前段底壁、中段顶壁、中段侧壁、中段底壁、后段顶壁、后段侧壁及后段底壁的表达均无显着差异（F=1.000,-,-,0.000,2.000,1.000,0.346.1.000,1.000：P=0.423,-,-,1.000,0.184,0.423,0.762,0.423,0.423）。4)胎儿鼻咽上皮各部位CK5表达不同步CK5在14w、20w及26w鼻咽后段的表达总量分别为29.22±8.67%,70.33±16.71%,49.22±33.38%,不同胎龄间有显着差异（F=151.252,P=0.000）；在鼻咽后段顶壁、侧壁及底壁的表达分别是35.44±16.93%,46.67±18.87%,66.67±34.85%,不同部位间有显着差异（F=114.898,P=0.000）。且所有皱襞陷凹部位的细胞呈阴性表达,陷凹接近顶部处及非陷凹处呈阳性表达。胎儿鼻咽上皮免疫组化结果显示CD21的表达变化特点与CD133同步,而CD133已作为广泛的成体干细胞标志物,特别是最近有报道认为CD133可作为鼻咽癌的干细胞标志物之一,根据我们的实验结果显示CD133在早期胎儿的鼻咽上皮高表达,随着分化成熟,CD133的表达下调,且同时检测的CK5（上皮组织早中期分化指标）,CD133一直表达的部位CK5是不表达的,可见CD133表达的部位可能是未分化部位,同时CD21可能也在鼻咽上皮未分化的细胞表达。但是随着胚胎的发育成熟,在胎儿出生后甚至成人的鼻咽上皮组织中,CD21是逐渐消失还是仍表达会少量表达尚未知,为此我们进一步探讨及研究。2、体外实验检测CD21在鼻咽上皮细胞及鼻咽癌细胞株上的表达1)流式细胞仪检测结果显示在鼻咽正常上皮细胞NP69中CD21+、CD133+的含量分别为0.53±0.06%、0.50±0.1%,两者间无显着差异（t=0.500,P=0.643）；鼻咽癌高分化细胞株CNE1中CD21+、CD133+的含量分别为0.17±0.06%、0.23±0.1%,两者间无显着差异（t=-1.414,P=0.230）；鼻咽癌低分化细胞株CNE2中CD21+、CD133+的含量分别为1.03±0.15%、1.3±0.2%,两者间无显着差异（t=-1.835,P=0.140）。2)细胞免疫荧光显示在NP69及CNE2中分别可见少量的CD133+、CD21+细胞,且阳性细胞大小显着小于阴性细胞,均表达与细胞的胞浆及胞膜。免疫荧光双标实验显示CD133+、CD21+细胞是完全重合的。3)细胞株体NP69及CNE2的LRCs特点为细胞核显着小于非LRCs的细胞核,且CD133+和CD21+细胞分别与LRCs完全重合。4)鼻咽癌细胞株的肿瘤球表达CD133及CD21,且二者可重合,而不表达CK5。5)随着肿瘤球的分化CD133及CD21的表达逐渐下调,最终只在肿瘤球中心少量细胞仍可表达CD133及CD21,而CK5随着肿瘤球的分化表达逐渐增多。3、游离EBV依赖CD21途径潜伏性感染鼻咽上皮细胞并导致恶性表型1)游离EBV感染NP69、CNE1及CNE2后检测EBNA1的表达,结果NP69及CNE2显示只有少量的细胞（1%左右）可检测到EBNA1的表达,而CNE1细胞在感染EBV后发生裂解性死亡。2)游离EBV感染后NP69及CNE2细胞中有少量细胞共表达CD21与EBNA1, CD133与EBNA1,并发生显着的形态改变,NP69有少量细胞由长梭形变成多角形,即细胞伪足增多,CNE2由类圆形变成长梭形。3)游离EBV感染后NP69及CNE2细胞中有少量细胞的细胞骨架发生显着变化,被感染的NP69及CNE2细胞侵袭性伪足均增多,刺突增多,出现显着的恶性表型。4)NP69、CNE1及CNE2细胞株的CD21被封闭后进行EBV感染,结果显示NP69及CNE2均检测不到EBNA1的表达,也未观察到细胞形态及细胞骨架的改变,而CNE1仍然会发生裂解性坏死。鼻咽癌细胞的感染感染主要为Ⅱ型潜伏感染,可表达EBV编码的EB病毒核抗原1（EBNA1）。我们的实验结果显示EBV可以通过CD21途径造成少量细胞的潜伏性感染进从而造成细胞恶性表型的发生。
任艳鑫[10]（2014）在《病毒IL-10通过“MHC-I类分子抗原加工提呈操纵子”致鼻咽癌免疫逃逸的机制研究》文中提出[背景和目的]鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma,NPC）是中国南方及东南亚地区常见的恶性肿瘤之一,其起病隐匿、转移早、治疗后容易复发,五年生存率始终在60%以下。鼻咽癌发病主要与EB病毒（Epstein-Barr virus,EBV）感染、环境（主要为化学致癌物）及遗传等多种因素相关。EBV病毒感染是目前公认的鼻咽癌发生、发展的重要因素之一,其编码蛋白从致瘤、抑制免疫、促进肿瘤转移、抑制肿瘤细胞调亡等方面促进肿瘤的发生。EB病毒的BCRF-1基因片段编码vIL-10与人IL-10有83%的同源性,具有和人IL-10类似的免疫抑制作用,但缺乏免疫调节作用,vIL-10可通过多种途径抑制肿瘤免疫应答,从而促使肿瘤逃逸机体免疫监视。在肿瘤免疫应答过程中,MHC-Ⅰ类分子限制的CD8+细胞毒性T淋巴细胞在阻止肿瘤的发生、发展过程中起关键作用。肿瘤抗原是内源性抗原,首先由低分子量多肽(（low molecular weightpolypeptide,LMP）-2、7消化.加工成一定分子量的抗原肽,然后与抗原处理相关转运体蛋白（Transporter association antigen processing,TAP）-1.2结合转运至内质网。在内质网中,MHC（主要是HLA-Ⅰ）结合抗原肽后将其呈递至细胞表面供CD8+细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）识别,从而启动细胞免疫。由于MHC-Ⅰ类基因、TAP基因、LMP基因位置靠近,转录活性同时受干扰素的诱导,能够协调三者基因产物的量,有效提呈抗原,故三者构成的系统被比喻成真核生物MHC-Ⅰ类分子抗原加工和提呈的“操纵子”。在一系列抗原呈递过程中,无论哪个环节出现异常都会影响肿瘤抗原的提呈,抑制机体对肿瘤的免疫杀伤。因此,明确鼻咽癌中vIL-10是否对MHC-Ⅰ类分子抗原加工和提呈的“操纵子”表达具有影响以及导致这种影响的机制可以帮助我们更加进一步理解鼻咽癌患者的免疫状态。本文主要目的：通过石蜡切片了解鼻咽癌组织中“MHC-Ⅰ类分子抗原加工提呈操纵子”（即TAP-1,TAP-2,LMP-2, LMP-7及HLA-Ⅰ）表达的变化及其与临床因素的关系；通过研究鼻咽癌组织中BCRF-1mRNA及vIL-10蛋白质的表达,明确vIL-10对鼻咽癌患者免疫细胞的影响；通过体外实验了解vIL-10对鼻咽癌细胞株“MHC-Ⅰ类分子抗原加工提呈操纵子”表达的影响；阐明vIL-10对NF-κB通路相关蛋白表达影响以及对其下游“MHC-Ⅰ类分子抗原加工提呈操纵子”基因表达的影响。[方法]本研究分四部分：1、鼻咽癌组织“MHC-Ⅰ类分子抗原加工提呈操纵子”表达的研究收集昆明医科大学第三附属医院（云南省肿瘤医院）头颈外科住院患者,病理证实为鼻咽低分化鳞癌,同期因鼻咽部肿块至云南省肿瘤医院头颈外科就诊,并行鼻咽部取材病理证实为鼻咽部非特异性炎症为对照组,免疫组织化学法（IHC）检测鼻咽癌石蜡切片中TAP-1, TAP-2,LMP-2, LMP-7及HLA-Ⅰ的表达,流式细胞仪（FCM）检测鼻咽癌患者及对照组外周血中CD4+T、CD8+T细胞比例,酶联免疫吸附法（ELISA）检测空腹外周静脉血IL-10含量,并对以上结果进行统计分析。2、鼻咽癌组织中BCRF-1基因表达及其对免疫功能影响的研究RT-PCR检测鼻咽癌组织中BCRF-1mRNA, Western Blot检测鼻咽癌组织中vIL-10蛋白质；流式细胞术检测鼻咽癌患者外周血CD4+T、CD8+T细胞的比例。3、vIL-10对鼻咽癌细胞“MHC-Ⅰ类分子抗原加工提呈操纵子”表达影响的研究收集不同时间段vIL-10处理的鼻咽癌细胞,RT-PCR、Western Bolt方法检测vIL-10处理的鼻咽癌细胞中“MHC-Ⅰ类分子抗原加工提呈操纵子”（即TAP-1,TAP-2,LMP-2, LMP-7及HLA-I）表达的变化。4、vIL-10通过NF-κB通路对“MHC-Ⅰ类分子抗原加工提呈操纵子”基因表达影响的研究（1）重组质粒pEGFP-N1-TNFα转染鼻咽癌细胞并检测转染后细胞分泌TNF-α的浓度,不同浓度TNF-a作用鼻咽癌细胞,Western Blot检测不同时间段TNF-a对NF-κB的活性的影响；（2）不同浓度的vIL-10预处理鼻咽癌细胞株2小时后,15ng/mLTNF-α再刺激鼻咽癌细胞,Western Blot检测NF-κB通路各个蛋白的变化；（3）免疫荧光方法观察vIL-10对NF-κBp65核转位活性的影响；（4） EMS A法检测NF-κB p65在细胞核内的DNA结合活性；（5）CHIP法检测vIL-10对NF-κB目的基因（即MHC-Ⅰ类分子抗原加工和提呈“操纵子”）表达的影响。[结果]1、鼻咽癌组织“MHC-Ⅰ类分子抗原加工提呈操纵子”的低表达及其与临床因素的关系：①TAP-1, TAP-2,LMP-2, LMP-7及HLA-Ⅰ在鼻咽癌组织中表达分别为43.1%、46.55%、41.38%、44.83%、50.00%（25/58、27/58、24/58、26/58、29/58）均低于鼻咽非肿瘤组织中的表达90.00%、95.00%、95.00%、95.00%、95.00%（18/20、19/20、19/20、19/20、19/20）（P<0.05）；②鼻咽癌组CD4+T细胞比例明显低于对照组（33.41±10.04%vs40.15±3.56%,P<0.05）,CD8+T细胞比例与对照组比较无统计学差异（25.32±8.29%vs22.89±2.24%,P>0.05）,鼻咽癌组IL-10表达明显高于对照组（13.12±1.23vs3.69±1.03ng/ml,P<0.05）；③鼻咽癌中TAP-1, TAP-2,LMP-2, LMP-7及HLA-Ⅰ表达与年龄、性别无相关性（P>0.05）,与TNM分期、有无淋巴结转移及有无远处转移密切相关（P<0.05）；④CD8+T细胞与TAP-1, TAP-2,LMP-2, LMP-7及HLA-Ⅰ表达成正比,IL-10表达与TAP-1,TAP-2,LMP-2, LMP-7及HLA-Ⅰ表达成反比,CD4+T细胞与TAP-1, TAP-2,LMP-2,LMP-7及HLA-Ⅰ表达无明显相关性；⑤Kaplan-Meier分析提示：临床分期、有无淋巴结转移、有无远处转移、病理分型、TAP-1表达、TAP-2表达、LMP-2表达、LMP-7表达、HLA-Ⅰ表达与鼻咽癌患者预后相关,具有统计学差异（P<0.05）。多因素Cox回归模型分析：有无远处转移及HLA-Ⅰ表达为鼻咽癌患者独立预后因素（P分别为0.041,0.042）。2、鼻咽癌组织vIL-10的高表达及其与免疫细胞的关系：①34例鼻咽癌组织BCRF-1mRNA呈阳性（34/40,85%）,16例鼻咽正常组织BCRF-1mRNA呈阳性（16/20,80%）,两者比较无统计学差异（P>0.05）；②30例鼻咽癌组织vIL-10呈阳性（30/40,75%）,10例鼻咽正常组织vIL-10呈阳性（10/20,50%）,两者比较有统计学差异（P<0.05）；③40例鼻咽癌患者分为vIL-10阳性组和vIL-10阴性组,vIL-10阳性组CD4+T细胞及CD4+T/CD8+T比值明显低于vIL-10阴性组（24.99±3.88%VS35.92±6.31%,0.86VS1.99,P<0.05）,vIL-10阳性组CD8+T细胞也明显低于vIL-10阴性组（20.10±7.68%VS30.61±3.34%,P<0.05）。3、vIL-10抑制鼻咽癌细胞株“MHC-Ⅰ类分子抗原加工提呈操纵子”的表达：（1）mRNA水平上：①CNE-1和CNE-2的TAP-1在不同时间点水平均未表现出显着差异；②vIL-10作用1h、4h、6h、12h时,CNE-1和CNE-2的TAP-2的mRNA均未出现变化,在24h时,TAP-2出现显着下降甚至消失；③LMP-2的mRNA在24h时,CNE-1的LMP-2mRNA出现减弱,CNE-2的LMP-2mRNA甚至消失；④CNE-1细胞在vIL-10作用后1h即出现LMP-7下降,而CNE-2细胞在vIL-10作用后6h出现下降；⑤在24h时CNE-1和CNE-2的HLA-I mRNA水平出现显着下降。（2）蛋白水平上：①CNE-1在vIL-10作用后6h时,TAP-1蛋白水平出现略微下降,12h时并未延续该下降趋势反而有所上升,24h时TAP-1蛋白水平出现显着下降（P<0.05）,CNE-2细胞在vIL-10作用后6h、12h时,TAP-1蛋白水平比1h增高,在24h时蛋白水平显着下降（P<0.05）；②CNE-1和CNE-2细胞在vIL-10作用后1h、6h、12h、24h,TAP-2蛋白水平逐渐下降（P值均<0.05）；③vIL-10作用CNE-1细胞后,LMP-2蛋白水平在12h时出现显着下降。CNE-2细胞中则表现为随时间逐渐下降趋势（P值均<0.05）；④CNE-1细胞的LMP-7蛋白在vIL-10作用后12h时出现显着下降。CNE-2细胞中LMP-7蛋白出现随时间逐渐下降趋势（P值均<0.05）；⑤CNE-1和CNE-2细胞在vIL-10作用后,HLA-Ⅰ出现下降趋势,但是在CNE-1细胞中各时间段变化无统计学差异（P>0.05）,CNE-2细胞在24h出现显着下降,差异有统计学意义（P<0.05）。4、vIL-10通过NF-κB通路对“MHC-Ⅰ类分子抗原加工提呈操纵子”基因表达影响：（1）vIL-10抑制NF-κ,B通路的活性：①纳米材料介导TNF-α转染鼻咽癌细胞,转染后细胞分泌TNF-α增加,但是未达到实验所需浓度；②TNF-α作用后,CNE-1,CNE-2细胞的NF-κB p-p65表达量均增加,并且并且与TNF-α浓度变化成正比；③CNE-2细胞的IKKa、IKKβ在TNF-α诱导后表达增加,而CNE-1细胞未发现此种变化,两种细胞的p-IKK a/β在TNF-a诱导后表达均增加；④CNE-1、CNE-2细胞的IKB a受到TNF-a刺激后表达减少,并且与TNF-a浓度成反比,两种细胞在TNF-α诱导后p-IKB a表达均增加；⑤CNE-1、CNE-2细胞的p-IKK a/β、NF-κB p-p65的表达与vIL-10浓度呈反比,而IKB蛋白表达与vIL-10浓度呈正比；⑥vIL-10作用CNE-1,CNE-2细胞后,胞浆中NF-kB p65核转位活性减弱。⑦vIL-10可以抑制鼻咽癌细胞中NF-κB的DNA结合活性,在CNE-2中抑制作用呈剂量依赖性。（2）vIL-10抑制NF-κB目的基因“MHC-Ⅰ类分子抗原加工提呈操纵子”的表达：ChIP结果显示CNE-2细胞中vIL-10可以通过NF-κB抑制TAP-1,TAP-2,LMP-2,LMP-7及HLA-Ⅰ基因表达。[结论]1、鼻咽癌组织中TAP-1, TAP-2,LMP-2, LMP-7及HLA-Ⅰ低表达,且与患者免疫抑制相关,HLA-Ⅰ低表达预示鼻咽癌患者不良预后。2、鼻咽癌组织中高表达BCRF-1基因及其蛋白产物vIL-10；vIL-10可以使鼻咽癌患者的免疫细胞发生偏移,发挥免疫抑制。3、vIL-10可明显抑制鼻咽癌MHC-Ⅰ类分子抗原加工和提呈的“操纵子”的表达,并且呈一定的时间依赖性。4、vIL-10可以抑制NF-κBp65活化、核转位及细胞核内NF-κB与DNA结合活性,进而抑制NF-κB目的基因TAP-1,TAP-2,LMP-2,LMP-7及HLA-Ⅰ的转录激活,降低鼻咽癌抗原提呈能力。
二、鼻咽癌细胞株中Epstein-Barr病毒编码的RNAs的检测（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、鼻咽癌细胞株中Epstein-Barr病毒编码的RNAs的检测（论文提纲范文）
（1）EBV-miR-BART7-3p在鼻咽癌中的功能及分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 EBV-MIR-BART7-3P靶向抑制PTEN的表达而促进鼻咽癌细胞的转移及EMT |
| 第一节 EBV-miR-BART7-3p在鼻咽癌组织中高表达 |
| 第二节 EBV-miR-BART7-3p促进鼻咽癌细胞的转移、侵袭及EMT |
| 第三节 探究EBV-miR-BART7-3p调控的靶基因及其分子机制 |
| 第四节 沉默内源性EBV-miR-BART7-3p的表达抑制鼻咽癌细胞的EMT和迁移 |
| 讨论 |
| 补充数据 |
| 参考文献 |
| 第二章 EBV-MIR-BART7-3P通过PTEN/PI3K/AKT/C-MYC和C-JUN通路促进鼻咽癌细胞的增殖 |
| 第一节 EBV-miR-BART7-3p促进鼻咽癌细胞的生长、增殖 |
| 第二节 探究EBV-miR-BART7-3p促进鼻咽癌细胞生长及增殖的分子机制 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 EBV-MIR-BART7-3P通过抑制SMAD7而促进鼻咽癌细胞的干性 |
| 第一节 EBV-miR-BART7-3p促进鼻咽癌细胞的“干性” |
| 第二节 EBV-miR-BART7-3p降低鼻咽癌细胞对化疗药物的敏感性 |
| 第三节 探究EBV-miR-BART7-3p促进鼻咽癌细胞干性的分子机制 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 利用纳米技术构建的反义核苷酸可以抑制EBV阳性的鼻咽癌细胞的生长 |
| 第一节 纳米基因载体的制备 |
| 第二节 纳米基因药物的体内外实验 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 英文缩写注解 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
| 统计学证明 |
（2）EBV miR-BART13参与鼻咽癌免疫逃逸和侵袭转移的机制研究（论文提纲范文）
| 附录 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 第一部分 EBV miR-BART13 参与鼻咽癌免疫逃逸的机制研究 |
| (一)EBV miR-BART13对NK细胞杀伤功能的影响 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| (二)EBV miR-BART13 通过下调ULBP4 促使鼻咽癌细胞逃避NK细胞的杀伤 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 EBV miR-BART13 参与鼻咽癌侵袭转移的机制研究 |
| (一)EBV miR-BART13 对鼻咽癌细胞侵袭转移的影响 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| (二)EBV miR-BART13 通过活化NF-κB信号通路促进鼻咽癌细胞的侵袭转移 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（3）EBV-miR-BART7-3p参与鼻咽癌免疫逃逸的初步机制探讨（论文提纲范文）
| 附录 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 第一部分 EBV-miR-BART7-3p对 NK细胞杀伤敏感性的影响 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 EBV-miR-BART7-3p在鼻咽癌中靶基因的确定及验证 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 EBV-miR-BART7-3p通过调控ULBP4 逃避NK细胞的杀伤作用研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（4）miR-34a-5p靶向调控NOTCH1对鼻咽癌生物学功能的影响及机制研究（论文提纲范文）
| 个人简历 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 miR-34a-5p在鼻咽癌组织中的表达及与鼻咽癌患者预后间的关系 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 第二部分 而R-34a-5p在体外对鼻咽癌细胞牛物学功能的影响 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 第三部分 miR-34a-5p在体内对鼻咽癌细胞裸鼠移植瘤生长的影响 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 第四部分 miR-34a-5p靶基因预测及生物信息学分析 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 第五部分 miR-34a-5p靶向调控NOTCH1对鼻咽癌抑癌作用的分子机制的探讨 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 全文总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
（5）鼻咽部EB病毒核酸标志物检测在鼻咽癌分子诊断中的应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 鼻咽部EBV DNA load的检测及其作为鼻咽癌诊断标志物的准确性评价 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 内容与方法 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 鼻咽部EBV的产生来源研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 内容与方法 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 鼻咽部EB病毒其它核酸标志物的诊断价值评价及在盲刷取样下分子标志物的发掘 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 内容与方法 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（6）鼻咽癌早期诊断和治疗新型标志物的探索研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 鼻咽癌概述 |
| 1.1.1 鼻咽癌的流行病学 |
| 1.1.2 鼻咽癌的致病因子 |
| 1.1.3 鼻咽癌的临床特征 |
| 1.1.4 鼻咽癌的诊断 |
| 1.1.5 鼻咽癌的治疗 |
| 1.2 EB病毒概述 |
| 1.2.1 EB病毒的发现 |
| 1.2.2 EB病毒的分类 |
| 1.2.3 EB病毒的形态学和生物学特征 |
| 1.2.4 EB病毒的生活周期 |
| 1.2.5 EB病毒的流行病学 |
| 1.2.6 EB病毒的治疗 |
| 1.2.7 EB病毒潜伏态的主要转录产物 |
| 1.2.8 EB病毒相关肿瘤 |
| 1.3 本研究的目的、意义及思路 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 主要仪器 |
| 2.2 主要耗材 |
| 2.3 主要试剂及实验动物 |
| 2.3.1 E.coli菌株 |
| 2.3.2 质粒 |
| 2.3.3 细胞株 |
| 2.3.4 实验动物 |
| 2.3.5 分子及细胞生物学实验用常规试剂 |
| 2.3.6 其他常规试剂 |
| 2.3.7 临床标本 |
| 2.4 实验用溶液及培养基配制 |
| 2.4.1 常规分子生物学实验溶液的配制 |
| 2.4.2 细胞培养/转染用溶液的配制 |
| 2.4.3 病毒抗原及抗体检测用溶液的配置 |
| 2.5 实验方法 |
| 2.5.1 常规分子克隆实验方法 |
| 2.5.2 常规细胞生物学实验方法 |
| 2.5.3 稳定细胞株的构建 |
| 2.5.4 单克隆抗体的制备和纯化 |
| 2.5.5 肿瘤细胞的生长抑制实验 |
| 2.5.6 免疫学相关实验方法 |
| 2.5.7 本研究中用到的其他实验方法 |
| 2.6 数据处理及统计学分析 |
| 第三章 结果与分析 |
| 第一部分: 鼻咽癌特异性诊断试剂的研发探索 |
| 3.1 三种鼻咽癌血清诊断试剂的研发探索 |
| 3.1.1 鼻咽癌LMP1/IgA检测试剂雏形的初步建立 |
| 3.1.2 鼻咽癌LMP2A/IgA检测试剂雏形的初步建立 |
| 3.1.3 鼻咽癌BARFI/IgA及BARF1/IgG检测试剂的研发探索 |
| 3.2 鼻咽癌免疫组化检测试剂的建立 |
| 3.2.1 LMP1免疫组化检测试剂的初步建立 |
| 3.2.2 LMP2A免疫组化检测试剂的初步建立 |
| 3.3 第一部分小结 |
| 第二部分: 鼻咽癌个性化诊断靶标的探索 |
| 3.4 A73蛋白的鉴定及其作为鼻咽癌个性化诊断靶标的探索 |
| 3.4.1 血清中抗A73的抗体作为鼻咽癌个性诊断靶标的评估 |
| 3.4.2 细胞或组织中A73蛋白作为鼻咽癌个性诊断靶标的评估 |
| 3.4.3 血清中A73 mRNA作为鼻咽癌个性诊断靶标的探索 |
| 3.5 第二部分小结 |
| 第三部分: 鼻咽癌免疫治疗靶标的探索 |
| 3.6 基于EB病毒蛋白靶标的治疗性抗体探索 |
| 3.6.1 以LMPI为靶标的鼻咽癌治疗性抗体研发探索 |
| 3.6.2 以LMP2A为靶标的鼻咽癌治疗性抗体研发探索 |
| 3.7 第三部分小结 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 鼻咽癌的血清学早期诊断极为重要 |
| 4.2 EB病毒II型潜伏态的基因转录产物为鼻咽癌提供了很好的早期诊断靶标 |
| 4.3 鼻咽癌个性化诊断试剂研发的必要性 |
| 4.4 抗体药物治疗是鼻咽癌治疗的一个重要发展方向 |
| 第五章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 在校期间的科研成果 |
| 致谢 |
（7）EBNA1在鼻咽癌转移中的作用及分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 技术路线 |
| 第一章 鼻咽癌和慢性鼻咽炎组织中EBNA1的表达及意义 |
| 一、材料和方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 EBNA1表达变化对鼻咽癌细胞转移的影响 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 EBNA1诱导EMT促进鼻咽癌转移 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 EBNA1参与EMT调控机制的初步研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 英文缩略语对照表 |
| 攻读学位期间发表文章 |
| 致谢 |
| 统计合格证明 |
（8）circFIP1L1通过海绵吸附miR-1253靶向SFN调控EMT抑制鼻咽癌迁移和侵袭（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要英文缩略词索引 |
| 第1章 前言 |
| 1.1 鼻咽癌病因及与治疗现状 |
| 1.2 14-3-3σ蛋白与肿瘤 |
| 1.3 miRNA与肿瘤 |
| 1.4 circRNA与肿瘤 |
| 1.5 上皮间质转化(EMT)与肿瘤 |
| 1.6 前期工作基础 |
| 1.7 研究内容 |
| 第2章 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞株 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 实验仪器和设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 质粒载体的构建 |
| 2.2.3 细胞瞬时转染 |
| 2.2.4 qRT-PCR实验 |
| 2.2.5 蛋白免疫印迹(Western blot)实验 |
| 2.2.6 细胞划痕愈合实验 |
| 2.2.7 Transwell迁移实验 |
| 2.2.8 Transwell侵袭实验 |
| 2.2.9 裸鼠成瘤实验 |
| 2.2.10 统计分析实验结果 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 circFIP1L1/miR-1253/SFN的表达情况 |
| 3.1.1 血清中circFIP1L1/miR-1253 的表达情况 |
| 3.1.2 鼻咽部永生化上皮细胞(NP69)、鼻咽癌细胞5-8F、6-10B中circFIP1L1、miR-1253、SFN mRNA的表达情况 |
| 3.1.3 circFIP1L1对miR-1253、SFN表达水平的影响 |
| 3.2 .miR-1253与SFN的关系 |
| 3.2.1 双荧光素酶实验验证miR-1253与SFN结合情况 |
| 3.2.2 miR-1253对SFN表达水平的影响 |
| 3.2.3 miR-1253与鼻咽癌EMT关系 |
| 3.3 circFIP1L1和miR-1253对SFN表达 |
| 3.4 circFIP1L和 miR-1253对14-3-3σ及鼻咽癌EMT的影响 |
| 3.5 circFIP1L1、miR-1253 对鼻咽癌细胞迁移侵袭的影响 |
| 3.5.1 鼻咽癌细胞迁移侵袭与miR-1253的关系 |
| 3.5.2 circFIP1L1 对鼻咽癌细胞迁移侵袭的影响 |
| 3.5.3 circFIP1L1和miR-1253 对鼻咽癌细胞迁移侵袭的影响 |
| 3.6 动物实验探究circFIP1L1 对鼻咽癌的影响 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 circFIP1L1 与鼻咽癌 |
| 4.2 miR-1253与肿瘤 |
| 4.3 circFIP1L1与miR-1253及SFN的关系 |
| 4.4 circFIP1L1/miR-1253/SFN对鼻咽癌EMT表达的调控作用 |
| 4.5 circFIP1L1/miR-1253/SFN对鼻咽癌迁移侵袭的影响 |
| 4.6 研究不足之处 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| References |
| 本研究基金资助项目 |
| 攻读学位期间的科研成果 |
| 致谢 |
（9）CD21在鼻咽上皮的表达及介导游离EBV发生潜伏性感染的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一章 CD21在人类胎儿鼻咽上皮发育过程中的表达特点 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 鼻咽上皮细胞和鼻咽癌细胞株中CD21的表达 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 CD21介导游离EBV潜伏性感染鼻咽上皮细胞 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 游离EBV潜伏性感染鼻咽上皮细胞导致的恶性表型 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 英文缩写词简表 |
| 学习期间发表的论文 |
| 致谢 |
| 统计学审稿证明 |
（10）病毒IL-10通过“MHC-I类分子抗原加工提呈操纵子”致鼻咽癌免疫逃逸的机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩略语 |
| 中文摘要 |
| Abstracts |
| 第一部分 鼻咽癌组织“MHC-Ⅰ类分子抗原加工提呈操纵子”表达的实验研究 |
| 第一节 前言 |
| 第二节 材料与方法 |
| 第三节 结果 |
| 第四节 讨论 |
| 第五节 小结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 第二部分 鼻咽癌组织中BCRF-1基因表达及其对免疫功能影响的实验研究 |
| 第一节 前言 |
| 第二节 材料与方法 |
| 第三节 结果 |
| 第四节 讨论 |
| 第五节 小结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 第三部分 vIL-10对鼻咽癌细胞株“MHC-Ⅰ类分子抗原加工提呈操纵子”表达影响的研究 |
| 第一节 前言 |
| 第二节 材料与方法 |
| 第三节 结果 |
| 第四节 讨论 |
| 第五节 小结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 第四部分 vIL-10通过NF-κB通路对“MHC-Ⅰ类分子抗原加工提呈操纵子”基因表达影响的实验研究 |
| 第一节 前言 |
| 第二节 材料与方法 |
| 第三节 结果 |
| 第四节 讨论 |
| 第五节 小结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 总结 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 在读博士期间发表论文 |
| 在读博士期间参加课题 |
| 致谢 |
四、鼻咽癌细胞株中Epstein-Barr病毒编码的RNAs的检测（论文参考文献）
- [1]EBV-miR-BART7-3p在鼻咽癌中的功能及分子机制研究[D]. 蔡隆梅. 南方医科大学, 2015
- [2]EBV miR-BART13参与鼻咽癌免疫逃逸和侵袭转移的机制研究[D]. 许元基. 福建医科大学, 2017(04)
- [3]EBV-miR-BART7-3p参与鼻咽癌免疫逃逸的初步机制探讨[D]. 周琳. 福建医科大学, 2017(04)
- [4]miR-34a-5p靶向调控NOTCH1对鼻咽癌生物学功能的影响及机制研究[D]. 刘康. 广西医科大学, 2019(08)
- [5]鼻咽部EB病毒核酸标志物检测在鼻咽癌分子诊断中的应用研究[D]. 郑小辉. 新疆医科大学, 2020(07)
- [6]鼻咽癌早期诊断和治疗新型标志物的探索研究[D]. 桂勋. 厦门大学, 2014(04)
- [7]EBNA1在鼻咽癌转移中的作用及分子机制研究[D]. 王路. 南方医科大学, 2011(04)
- [8]circFIP1L1通过海绵吸附miR-1253靶向SFN调控EMT抑制鼻咽癌迁移和侵袭[D]. 雷芳红. 南华大学, 2020
- [9]CD21在鼻咽上皮的表达及介导游离EBV发生潜伏性感染的研究[D]. 宋青翠. 南方医科大学, 2014(08)
- [10]病毒IL-10通过“MHC-I类分子抗原加工提呈操纵子”致鼻咽癌免疫逃逸的机制研究[D]. 任艳鑫. 昆明医科大学, 2014(11)